CN106399457B - 基于纳米模拟酶的可视化快速检测生物酶、蛋白质及其抑制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有纳米模拟酶的检测试剂。本发明还公开了基于纳米模拟酶技术对生物酶或者蛋白质及其抑制剂活性的可视化检测方法。该方法基于某些能够模拟天然氧化酶的纳米材料对许多显色剂的氧化反应呈现出良好的pH依赖性，以及许多天然酶或者蛋白质在发生生物催化的过程中能够释放/消耗H⁺的特性，利用反应体系pH的原位变化，影响该纳米材料的催化氧化能力，从而使检测试剂产生不同程度颜色变化，实现对生物酶或者蛋白质活性的可视化检测，并进而实现其对应抑制剂的可视化检测。本发明检测方法所输出的物理信号对待测体系中生物酶/蛋白质活性在一定浓度范围内呈现非常好的线性关系，从而实现对待测目标的高灵敏检测。

Description

基于纳米模拟酶的可视化快速检测生物酶、蛋白质及其抑制 剂的方法

技术领域

本发明属于生物分析领域，具体涉及基于纳米模拟酶的可视化快速检测生物酶、蛋白质及其抑制剂的方法。

背景技术

生物体内一系列的生化反应中无不具有相应的生物酶的参与。正是这些具有高选择性、高催化活性的生物酶的调节，生物体才能完成复杂的高级生命活动。例如，乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)是中枢神经***中非常重要的一种生物酶，能够催化脑内的乙酰胆碱水解生成醋酸和胆碱。研究表明，中枢神经***中乙酰胆碱酯酶的活性过低会导致乙酰胆碱的大量累积，从而造成器官损伤甚至死亡。而乙酰胆碱酯酶的活性如果过高，又会造成中枢神经***内乙酰胆碱含量过低，容易引起阿尔茨海默病以及脑硬化。因此，检测乙酰胆碱酯酶在生理学上和医学上有着极为重要的意义。此外，有机磷类的农药是现代农业中常用的一种高毒性的农药试剂，它们虽然能够有效杀灭农业害虫，但是同样对人体有着剧烈的毒性，因此检测残留在果蔬中的有机磷类的农药对于人们健康极为重要。研究表明，有机磷类农药是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，它们能够高效地抑制其活性，因此，对乙酰胆碱酯酶活性的检测也能被用于有机磷类农药的检测。除了能够产生H⁺的生物酶，还有一些酶能够在生物催化过程中消耗H⁺。例如脲酶(urease)，它通过催化尿素水解产生氨气和二氧化碳。在临床上，细菌导致的脲酶活性上升往往是许多疾病的发病机制，如肝炎、肝昏迷，感染性结石和消化性溃疡等。因此，检测脲酶的活性在临床上同样具有极为重要的生理意义。而脲酶的许多抑制剂多是具有环境毒性的物质，对人体健康亦有伤害，因此对脲酶活性的检测方法同样可以用于这些高毒性物质的检测。综上所述，对生物酶/蛋白质的检测不仅可以帮助人们对于从分子水平探索某些生理病理过程、信号传导过程以及某些疾病的发病机制，而且对于治疗相关疾病的药物研究和开发也极具指导和参考价值，也为某些具有环境毒性的物质的检测提供了新的方法和平台。

传统检测生物酶/蛋白质活性的方法主要集中在高效液相色谱(Highperformance liquid chromatography,HPLC)、毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE)、质谱(mass spectrum)、荧光成像(Fluorescence imaging,FI)等。然而这些经典方法在检测生物酶/蛋白质活性时存在许多不足之处。首先，这些方法大多需要昂贵而复杂的仪器，需要专业化的仪器操作员进行操作，因此难以实现现场分析。其次，生物样品需要复杂的前处理、预富集和分离等步骤，分析时间长，无法实现生物样品中待测物的快速分析，时间分辨率也较差。此外，生理环境异常复杂，许多生物酶/蛋白质在体内的浓度又很低，许多常规检测手段难以实现其快速测定。因此，十分需要发展一种新型的检测技术用于生物酶/蛋白质活性的快速、高灵敏、高选择性检测。

发明内容

发明目的：本发明针对目前一些生物酶/蛋白质活性检测方法存在的操作复杂、耗时长、灵敏度较差等现状，通过利用某些可以模拟天然酶活性的纳米材料，发展新原理实现对相关生物酶/蛋白质活性的快速、高选择性、高灵敏性检测。

本发明提供了一种可以模拟天然氧化酶活性的纳米材料。该纳米材料可以像某些天然酶一样，无需额外的氧化剂(如过氧化氢等)直接利用氧气实现对某些常用显色剂的催化氧化，并产生颜色的变化。因此，我们也将该种纳米材料称之为纳米模拟酶。利用这类纳米模拟酶在模拟天然酶催化氧化显色剂时其催化能力对pH依赖的特性，通过待测生物酶/蛋白质催化底物反应过程中对检测试剂的pH值产生的变化，影响纳米模拟酶的催化活性，从而得到相应的输出信号，并通过合理的手段将这种输出信号读出，从而实现对待测物的分析。我们还发现在该检测过程中如果加入某些反应促进剂，可以加速显色反应的进行，并进一步提高检测的灵敏度，减低检测限。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种含有纳米模拟酶的检测试剂，该检测试剂中包括有纳米材料、显色剂和反应促进剂。

其中，上述纳米材料含有金属或金属氧化物中的一种或两种。

其中，上述显色剂为具有氧化还原特性的化合物。

其中，上述反应促进剂为含有高能磷酸键的生物分子，包括腺嘌呤核苷三磷酸，鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷三磷酸、尿嘧啶核苷三磷酸和其类似物中的一种或几种，优选为ATP。

一种基于纳米模拟酶的可视化快速检测生物酶、蛋白质活性的方法，包括以下步骤：

1)纳米模拟酶的制备：利用湿法化学制备能够模拟天然酶的含有金属或金属氧化物的纳米材料，经分离、纯化并测定其浓度后备用；

2)检测试剂缓冲液的制备：配制适合pH值及浓度的缓冲溶液待用；

3)检测生物酶/蛋白质活性的检测试剂的制备：取一定量的显色剂、反应促进剂以及被测生物酶/蛋白质的反应底物加入到配制好的缓冲液中，混合均匀后待用；对于能够释放H⁺的生物酶/蛋白质，选用pH为7.0的磷酸缓冲液，而对于能够消耗H⁺的生物酶/蛋白质，则选用pH为4.5的磷酸缓冲液；

4)生物酶/蛋白质活性的可视化检测：将上述检测试剂与含有待测检测生物酶/蛋白质的样品以及一定量的纳米模拟酶混合后在37℃下孵育反应，然后根据检测试剂颜色的变化或通过肉眼观察对待测生物酶/蛋白质的活性进行半定量的判断；或通过相应的仪器对待测生物酶/蛋白质的活性进行精确的测定和定量。

其中，上述步骤2)中缓冲溶液为pH为7.0或4.5，浓度为5mM的磷酸缓冲溶液。

其中，上述步骤3)中显色剂为3,3,5,5-四甲基联苯胺。

其中，上述生物酶为乙酰胆碱酯酶和脲酶中的一种。

其中，上述反应促进剂为ATP。

一种基于纳米氧化酶可视化生物酶/蛋白质抑制剂活性的方法，所述方法包括步骤1)～3)，还包括步骤4)生物酶/蛋白质对应抑制剂的可视化检测：将已知活性的生物酶/蛋白质与对应的抑制剂混合后作用一段时间得到混合物，然后将该混合物与上述检测试剂以及一定量的纳米模拟酶混合后在37℃下孵育反应，最后根据检测试剂颜色的变化或通过肉眼观察对待测生物酶/蛋白质的抑制剂进行半定量的判断；或通过相应的仪器对待测生物酶/蛋白质的抑制剂进行精确的测定和定量。

本发明的抑制剂为乙酰胆碱酯酶抑制剂甲基对氧膦和他克林以及脲酶抑制剂F^-。

本发明对待测生理活性小分子的定量检测原理：该纳米材料即纳米模拟酶可以利用氧气直接实现对显色剂的催化氧化，产生颜色的变化。但是该催化氧化的能力在一定pH范围内呈现出pH依赖的特性。一般而言，在pH偏中性时，催化能力较弱，产生的颜色较浅，而在pH偏酸性时，催化能力较强，产生的颜色较深。在某些反应促进剂如ATP的存在下，这种催化能力能够得到有效增强，因此催化反应时间可以大大缩短。利用该特性，通过待测生物酶/蛋白质在催化相应底物反应过程中对溶液pH值的影响，对所用纳米模拟酶活性原位进行调控，进行产生不同程度的颜色变化作为信号输出，最终实现待测生物酶/蛋白质及其抑制剂的分析。

有益效果：本发明中该基于模拟天然酶的纳米模拟酶的检测方法所输出的物理信号对待测体系中生物酶/蛋白质活性在一定浓度范围内呈现非常好的线性关系，从而实现对待测目标的高灵敏检测。该检测体系几乎不受其他常见的生物酶/蛋白质的干扰，因此对目标待测物的检测有着高度选择性。此外该方法仪器简单、操作简便、成本低廉、需样量少，既可以实现生物体内相关生物酶/蛋白质的快速可视化检测，又能够用于某些对人体健康具有威胁的有毒、有害物质的快速检测，因此具有很高的实际应用价值。该技术用于这些生理物质检测具有以下优点：1)该检测方法对相应生物酶/蛋白质的检测有着很高的灵敏度，可以满足生物体内相关生物酶/蛋白质活性的检测要求；2)选择性好，其他生物酶/蛋白质活性没有干扰；3)反应快速，仅需5-10分钟即可通过肉眼观察到检测试剂颜色的变化；4)操作简便，仅凭肉眼就可以实现对待测物的半定量分析，依靠仪器则可以实现更加精准的定量；5)成本低廉，一方面，无需特意设计和合成对待测生物酶/蛋白质活性有选择性响应的荧光探针分子或者其他生物识别单元，另一方面，所使用的纳米材料取代了常用的天然酶试剂，使检测成本得到了极大的降低；6)需样量很小，检测操作简便，分析速度较快，可以实现床旁检测以及临场检测。

附图说明

图1纳米模拟酶nanoceria对乙酰胆碱酯酶检测的工作曲线；

图2纳米模拟酶nanoceria对乙酰胆碱酯酶抑制剂甲基对氧膦检测的工作曲线；

图3纳米模拟酶nanoceria对乙酰胆碱酯酶抑制剂他克林检测的工作曲线；

图4纳米模拟酶nanoceria对脲酶检测的工作曲线；

图5纳米模拟酶nanoceria对脲酶抑制剂F^-检测的工作曲线。

具体实施方式

下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

以纳米氧化铈(nanoceria)为所述纳米模拟酶的例子，其化学式为CeO₂。

以乙酰胆碱酯酶及其抑制剂甲基对氧膦(methyl-paraoxon)、他克林(tacrine)和脲酶及其抑制剂氟离子(F^-)所述生物酶/蛋白质及其抑制剂的例子。本发明所用试剂均可通过市售获得。

所用显色剂为3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)，所用反应促进剂优选为ATP。

本发明实施例中的U为酶活力单位，mU＝10^-3U。

实施例1

1)纳米模拟酶nanoceria制备：

将2.52g Ce(NO₃)₃溶解于100mL水和乙二醇的1:1混合溶液中，并加热搅拌至60℃。然后在搅拌的条件下快速加入16mL新鲜氨水，在60℃下继续搅拌3小时。将产物离心，并依次用水洗涤并离心3次后得到nanoceria粗产品。将该nanoceria粗产品分散于100mL浓度为15mg/mL的柠檬酸钠溶液中，超声30分钟，待nanoceria与柠檬酸钠充分作用之后，加入100mL乙醇，搅拌后离心分离，所得产物依次用1:1水和乙醇的混合液洗涤并离心3次后，分散于纯水中。待计算、测量得到该分散液中nanoceria的浓度为14mg/mL，将得到的浓度为14mg/mL nanoceria分散液进行稀释得到浓度为2.5mg/mL的nanoceria储备液后保存，待用。

2)配制磷酸缓冲液：配制pH分别为7.0和4.5，浓度为5mM的磷酸缓冲溶液待用。

3)配制检测生物酶/蛋白质活性的检测试剂：将4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL乙酰胆碱溶液(1.0M)加入180μL所制备的pH为7.0的浓度为5mM的磷酸缓冲溶液中，混合均匀后加入不同浓度的乙酰胆碱酯酶(0、7、14、35、70、175、350、700、1400mU)以及1.5μL nanoceria储备液(14mg/mL)，混合均匀后得到检测试剂，将该检测试剂置于37℃的水浴中反应，并利用紫外-可见分光光度计实时记录652nm处吸光度值的变化。

由图1可见，在存在乙酰胆碱酯酶的情况下，652nm处的吸光度值不断上升，说明所用TMB显色剂被不断氧化而显色。其显色速度随着乙酰胆碱酯酶的浓度上升而上升，说明随着乙酰胆碱酯酶浓度的提高，溶液pH的变化加快，TMB被纳米模拟酶催化氧化的速度也随之加快。以检测时间为600s时，溶液在652nm处的吸光度值作为信号响应输出(A₆₅₂)，并将其对乙酰胆碱酯酶的浓度作图，其结果如图1B所示。该检测试剂在652nm处的吸光度值与所加入的乙酰胆碱酯酶浓度在一定浓度范围内呈现出非常好的线性关系(A₆₅₂＝0.0024×[AChE]mU^-1+0.137)，线性范围为7mU～135mU，其最低检测限为3.5mU(在该浓度下，其信号响应为噪音的3倍)。此外，通过对照实验我们也同样看到在不加入ATP的情况下，该方法对乙酰胆碱酯酶的检测灵敏度下降了一半(0.0012vs.0.0024)，检测限也较高(25mU)，证明了反应促进剂ATP的加入可以显著提高该方法的检测性能。

实施例2纳米模拟酶技术在乙酰胆碱酯酶抑制剂甲基对氧膦和他克林检测中的应用

先将1.5U乙酰胆碱酯酶与不同浓度的甲基对氧膦(0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μM)或他克林(0、0.5、5、50μM)混合后用浓度为5mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)定容至50μL，在室温下反应30分钟。待酶活性被充分抑制后，用浓度为5mM的磷酸缓冲液(pH7.0)稀释该混合液至180μL，随后加入4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL乙酰胆碱溶液(1.0M)以及1.5μL nanoceria储备液(14mg/mL)。混合均匀后将该试剂置于37℃的水浴中反应，并利用紫外-可见分光光度计实时记录652nm处吸光度值的变化。

从图2A中我们可以看到，随着有机磷农药甲基对氧膦浓度的上升，溶液的颜色也越浅，说明乙酰胆碱酯酶的活性被甲基对氧膦所抑制，难以催化乙酰胆碱的水解。以检测时间为600s时，溶液在652nm处的吸光度值作为信号响应输出(A₆₅₂)，并将其与不加抑制剂时所记录得到的A₆₅₂的比值对甲基对氧膦的浓度作图，其结果如图2B所示。通过A₆₅₂吸光度值的记录，我们可以得到甲基对氧膦的准确浓度。利用该方法，如图2B所示，即使10nM的甲基对氧膦也可以产生明显的吸光度值的变化，说明该方法对甲基对氧膦的检测有着很高的灵敏度。

他克林是另一种乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用于阿尔茨海默病的临床治疗。从图3中我们同样可以看到，随着他克林浓度的上升，检测试剂的颜色依次变浅，652nm处的吸光度值也随之下降，说明该方法还能用于相关疾病药物的筛选。

实施例3纳米模拟酶技术在脲酶检测中的应用

将4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL尿素(1.0M)加入180μL所制备的浓度为5mM的pH为4.5的磷酸缓冲溶液中，混合均匀后加入不同量的脲酶(0、7.5、15、37、5、75、187.5、375、750、1500mU)以及3μL nanoceria储备液(2.5mg/mL)，混合均匀后将该试剂置于37℃的水浴中反应，并利用紫外-可见分光光度计实时记录652nm处吸光度值的变化。

从图4中可以看到，在存在脲酶的情况下，检测溶液652nm处的吸光度值不断下降。这是因为脲酶水解尿素产生氨而消耗H⁺，溶液体系pH逐渐升高，纳米模拟酶nanoceria的催化氧化能力被逐渐抑制，TMB被催化氧化的速度也随之减弱。同样，652nm处的吸光度值与所加入的脲酶浓度在一定浓度范围内呈现出非常好的线性关系。以检测时间为600s时，溶液在652nm处的吸光度值作为信号响应输出(A₆₅₂)，并将其对脲酶的浓度作图，其结果如图4B所示，其线性范围为0～750mU。此外，比较图4B以及图4D我们还发现，不使用ATP时所记录得到的A₆₅₂仅为使用ATP时的十分之一，显示该方法对脲酶的检测灵敏度下降至原来的十分之一，线性范围也很窄(0～75mU)，证明了反应促进剂ATP的加入可以显著提高该方法的检测性能。

实施例4纳米模拟酶技术在脲酶抑制剂F^-检测中的应用

先将1.5U脲酶与不同浓度的F^-(0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5mM)混合后用浓度为5mM的磷酸缓冲液(pH 4.5)定容至50μL，在室温下反应30分钟。待酶活性被充分抑制后，用浓度为5mM的磷酸缓冲液(pH 4.5)稀释该混合液至180μL，随后加入4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL尿素(1.0M)以及3μL nanoceria储备液(2.5mg/mL)。混合均匀后将该试剂置于37℃的水浴中反应，并利用紫外-可见分光光度计实时记录652nm处吸光度值的变化。

从图5中我们可以看到，随着有F^-浓度的上升，检测溶液的颜色逐渐上升，说明脲酶的活性被F^-所抑制，难以催化尿素的水解，检测体系的pH变化也当然随之减弱。以检测时间为600s时，溶液在652nm处的吸光度值作为信号响应输出(A₆₅₂)，并将其与不加F^-时的A₆₅₂的比值对F^-的浓度作图，其结果如图5B所示。利用该比值，我们可以得到F^-的准确浓度。由图5B所示，我们检测得到F^-能够对1.5U脲酶的活力抑制一半的浓度约为750μM。这种方法也可以用于其他脲酶抑制剂的筛选。

Claims (2)

1.一种非治疗诊断目的的基于纳米模拟酶的可视化快速检测生物酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）纳米模拟酶的制备：利用湿法化学制备纳米氧化铈，经分离、纯化并测定其浓度后备用；

2）检测试剂缓冲液的制备：配制pH分别为7.0或4.5，浓度为5 mM 的磷酸缓冲溶液待用；

3）检测生物酶活性的检测试剂的制备：取一定量的3,3,5,5-四甲基联苯胺、ATP以及待测生物酶的反应底物乙酰胆碱溶液或尿素溶液加入到配制好的磷酸缓冲溶液中，混合均匀后待用；

4）生物酶活性的可视化检测：将上述检测试剂与含有待测检测生物酶的样品以及一定量的所述纳米模拟酶混合后在37℃下孵育反应，然后根据检测试剂颜色的变化或通过肉眼观察对待测生物酶的活性进行半定量的判断；或通过相应的仪器对待测生物酶的活性进行精确的测定和定量；

其中，所述生物酶为乙酰胆碱酯酶和脲酶中的一种，当所述生物酶为乙酰胆碱酯酶时，所述反应底物为乙酰胆碱溶液，所述检测试剂缓冲液的pH为7.0；当所述生物酶为脲酶时，所述反应底物为尿素溶液，所述检测试剂缓冲液的pH为4.5。

2.一种非治疗诊断目的的基于纳米氧化酶可视化快速检测生物酶抑制剂活性的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1所述的步骤1）~3），还包括步骤4）生物酶对应抑制剂的可视化检测：将已知活性的生物酶与对应的抑制剂混合后作用一段时间得到混合物，然后将该混合物与步骤2）的检测试剂缓冲液、步骤3）的检测试剂以及一定量的步骤1）的纳米模拟酶混合后在37℃下孵育反应，最后根据检测试剂颜色的变化或通过肉眼观察对待测生物酶的抑制剂进行半定量的判断；或通过相应的仪器对待测生物酶的抑制剂进行精确的测定和定量；

其中，所述生物酶为乙酰胆碱酯酶和脲酶中的一种，当所述生物酶为乙酰胆碱酯酶时，所述反应底物为乙酰胆碱溶液，所述检测试剂缓冲液的pH为7.0；当所述生物酶为脲酶时，所述反应底物为尿素溶液，所述检测试剂缓冲液的pH为4.5。