CN117069860A - 一种分子佐剂、嵌合型禽流感病毒样颗粒、疫苗及其制备与应用 - Google Patents

一种分子佐剂、嵌合型禽流感病毒样颗粒、疫苗及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种分子佐剂、嵌合型禽流感病毒样颗粒、疫苗及其制备与应用，属于基因工程疫苗技术领域。本发明提供了一种具有膜锚定特性的分子佐剂，主要由鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的氨基酸残基(Flic△174‑400)和IIb型大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LTB)的氨基酸残基(LTB△1‑23)重组嵌合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。还提供了一种嵌合分子佐剂的H5N1亚型禽流感病毒样颗粒及其疫苗，该疫苗诱导了更高水平的细胞和Th17型免疫应答，提供了更优的攻毒保护效果，为H5N1亚型禽流感的防控提供更好的疫苗选择。

Description

一种分子佐剂、嵌合型禽流感病毒样颗粒、疫苗及其制备与 应用
技术领域
本发明属于基因工程疫苗技术领域，特别涉及一种分子佐剂、嵌合型禽流感病毒样颗粒、疫苗及其制备与应用。
背景技术
H5N1亚型高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)作为一类***共患病，对食品安全、家禽养殖和人类健康造成巨大威胁。疫苗接种是防控禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)传播的主要措施。但AIV具有易变异和重组的特性，当前主要使用的禽流感灭活疫苗主要诱导毒株特异性免疫应答，当流行株和疫苗株抗原性不匹配时，就会造成现有免疫的失败，导致新的禽流感流行。因此开发一种新型、安全、有效和广谱的禽流感疫苗十分迫切。
天然免疫***是机体抵抗病原体入侵的第一道防线，宿主细胞表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptors，PRRs)通过识别病原体的病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)激活该***，产生针对病原体的免疫应答。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)和NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)是PRRs中的两个重要家族，在识别病原体和诱导天然免疫方面发挥重要作用。鞭毛蛋白(Flagellin，Flic)是TLR5的配体，能够激活机体先天免疫***。但鞭毛蛋白自身具有高抗原性和促炎反应(Lopez-Yglesias et al.,2019；Nempont et al.,2008)，这些因素限制了其应用。研究表明，删除鞭毛蛋白部分D2和全部D3结构域(FlicΔ174-400)可显著降低其自身免疫原性且不影响其TLR5刺激活性(Nempont et al.,2008；Biedma et al.,2019)。并且鞭毛蛋白的D2和D3结构域可被其它蛋白分子替换，保留鞭毛蛋白TLR5刺激活性的同时，又可增强替换蛋白分子的免疫原性(Yang et al.,2013)。也有研究表明，IIb型大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LTB)能够激活TLR2/1，诱导先天免疫应答(Liang et al.,2009；Liang etal.,2010)。因此，鞭毛蛋白和LTB作为免疫刺激分子具有潜在的佐剂应用前景。
病毒样颗粒(Virus-like particles，VLP)保留了类似天然病毒粒子的结构和免疫原性，具有安全性高、能够同时诱导体液和细胞免疫应答的特性，是当前开发新型禽流感疫苗的研究热点。杆状病毒表达载体***(Baculovirus Expression Vector System，BEVS)具有安全性高、操作简便、易扩大生产等优点，广泛应用于疫苗开发等领域。免疫刺激分子能够激活天然免疫***、增强抗原免疫原性以及调节疫苗免疫应答类型。因此基于BEVS开发嵌合分子佐剂的禽流感病毒样颗粒疫苗具有广阔的前景。
参考文献：
Biedma M E,Cayet D,Tabareau J,et al.Recombinant flagellins withdeletions in domains d1,d2,
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Lopez-Yglesias AH,Lu C C,Zhao X,et al.Flic's hypervariable D3domainis required for robust anti-flagellin primary antibody responses[J].Immunohorizons,2019,3(9):422-432.
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发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种分子佐剂。
本发明的另一个目的在于提供嵌合上述分子佐剂的H5N1亚型禽流感病毒样颗粒。
本发明的再一个目的在于提供上述嵌合分子佐剂的H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供一种嵌合型禽流感病毒样颗粒疫苗。
本发明的第五个目的在于提供上述分子佐剂、嵌合型禽流感病毒样颗粒和嵌合型禽流感病毒样颗粒疫苗的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种分子佐剂，由Flag标签蛋白、蜂毒信号肽、鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的氨基酸残基(Flic△174-400)、IIb型大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基的氨基酸残基(LTB△1-23)、H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的跨膜区(TM)和胞质尾区(CT)以及6×His标签蛋白重组嵌合而成；
所述的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的氨基酸残基(Flic△174-400)的氨基酸序列如SEQID NO：1所示；其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10中自5′端第91bp～606bp、964bp～1248bp所示。
所述的IIb型大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基的氨基酸残基(LTB△1-23)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10中自5′端第637bp～933bp所示。
所述的H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的跨膜区(TM)的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10中自5′端第1249bp～1326bp所示。
所述的H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的胞质尾区(CT)的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10中自5′端第1327bp～1356bp所示。
所述的蜂毒信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10中自5′端第28bp～90bp所示。
所述的Flag标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10中自5′端第4bp～27bp所示。
所述的6×His标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10中自5′端第1357bp～1374bp所示。
所述的分子佐剂还包括柔性连接分子linker，所述的柔性连接分子linker实现对鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的氨基酸残基(Flic△174-400)和IIb型大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基的氨基酸残基(LTB△1-23)之间的连接，所述的柔性连接分子linker的氨基酸序列如SEQID NO：8所示；其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10中自5′端第607bp～636bp所示。
所述的分子佐剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述的分子佐剂的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
一种嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒，包含上述所述的分子佐剂(FL)蛋白、H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白和H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白；
优选的，所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒由分子佐剂(FL)、H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白和H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白组装而成；
所述的H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列如专利“202310079761.X”中的SEQ ID NO：3所示；其编码基因的核苷酸序列如专利“202310079761.X”中的SEQ ID NO：1所示；
所述的H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白的氨基酸序列如专利“202310079761.X”中的SEQ ID NO：4所示；其编码基因的核苷酸序列如专利“202310079761.X”中的SEQ ID NO：2所示；
所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过人工合成上述分子佐剂FL的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；将H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的编码基因和H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白的编码基因经密码子优化后，人工合成，分别得到密码子优化后的HA蛋白的编码基因和M1蛋白的编码基因，核苷酸序列如专利“202310079761.X”中的SEQ ID NO：1～2所示；
(2)将步骤(1)中的分子佐剂FL的编码基因、HA蛋白的编码基因和M1蛋白的编码基因分别***到杆状病毒表达***的转递质粒中，分别得到FL基因重组转递质粒、HA基因重组转递质粒以及M1基因重组转递质粒；
(3)将步骤(2)中得到的FL基因重组转递质粒、HA基因重组转递质粒以及M1基因重组转递质粒经转化重组，分别得到FL基因重组杆状病毒质粒、HA基因重组杆状病毒质粒以及M1基因重组杆状病毒质粒；
(4)将步骤(3)中得到的FL基因重组杆状病毒质粒、HA基因重组杆状病毒质粒以及M1基因重组杆状病毒质粒经脂质体介导转染sf9昆虫细胞，收获培养上清，分别得到P1代FL基因重组杆状病毒、HA基因重组杆状病毒以及M1基因重组杆状病毒；
(5)将步骤(4)中得到的P1代FL基因重组杆状病毒、HA基因重组杆状病毒以及M1基因重组杆状病毒感染sf9昆虫细胞进行传代，连续传代2次，分别得到P3代FL基因重组杆状病毒、HA基因重组杆状病毒以及M1基因重组杆状病毒；
(6)将步骤(5)中得到的P3代FL基因重组杆状病毒、HA基因重组杆状病毒以及M1基因重组杆状病毒以共感染的方式感染昆虫细胞，收取细胞外培养上清，得到由FL蛋白、HA蛋白以及M1蛋白组装而成的病毒样颗粒，即所述嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒。
步骤(2)中所述的转递质粒优选为pACEBac1。
步骤(3)中所述的转化为转化DH10bac大肠杆菌感受态细胞。
步骤(6)中所述的昆虫细胞优选为High five昆虫细胞。
步骤(6)中P3代FL基因重组杆状病毒、HA基因重组杆状病毒以及M1基因重组杆状病毒共感染昆虫细胞时，感染复数(MOI)比例优选为2：1：2。
步骤(6)中所述共感染的时间优选为96h。
所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，在步骤(6)之后还包括进一步将病毒样颗粒纯化的步骤；具体为：
将离心管从上至下分别加入浓度为质量体积比20％、30％、45％、60％的蔗糖溶液，最上方加入病毒样颗粒样品，离心，收取蔗糖层间白色透明带，再次离心去除蔗糖，最后用PBS缓冲液重悬病毒样颗粒样品。
所述的离心的条件优选为：4℃，100 000×g离心1h。
所述的再次离心去除蔗糖的条件优选为：4℃、10 000×g离心1.5h。
所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒在制备嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗中的应用。
一种嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗，包括免疫量的上述嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒以及药学上可以接受的载体。
所述的药学上可以接受的载体包括佐剂。
所述的佐剂优选为MontanideTM ISA系列佐剂，进一步优选为MontanideTM ISA71VG佐剂。
所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：将上述佐剂和免疫量的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒混合乳化，得到嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗。
所述的佐剂为MontanideTM ISA 71VG佐剂时，佐剂与病毒样颗粒的体积比70：30。
所述的分子佐剂、嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒和嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗中的至少一种在制备预防和/或治疗H5N1亚型禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。
所述的预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物的施用对象包括家禽，优选包括鸡。
本发明的原理：为提高禽流感病毒样颗粒的免疫原性，本发明设计了一种具有膜锚定特性的免疫刺激分子佐剂FL，旨在激活机体天然免疫***，提升嵌合分子佐剂的禽流感病毒样颗粒疫苗的免疫效力。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明设计了一种分子佐剂FL，主要由鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的氨基酸残基(Flic△174-400)和IIb型大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LTB)的氨基酸残基(LTB△1-23)重组嵌合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。鞭毛蛋白是细菌鞭毛的组成成分，也是TLR5和NLRs的配体，能够激活机体先天免疫***。LTB蛋白能够激活TLR2/1，诱导先天免疫应答，同时能够刺激树突状细胞活化和成熟以及诱导CD4+T淋巴细胞增殖。因此鞭毛蛋白和LTB蛋白都是非常有效的免疫刺激分子佐剂。
(2)本发明提供了一种嵌合分子佐剂的H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法：分子佐剂FL包含H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的跨膜区(TM)和胞质尾区(CT)，具有膜锚定特性。FL重组杆状病毒、HA重组杆状病毒以及M1重组杆状病毒以共感染的方式感染昆虫细胞生产组装嵌合型禽流感病毒样颗粒。嵌合型禽流感病毒样颗粒经SDS-PAGE、Western blot以及透射电镜鉴定，血凝实验表明，嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的血凝效价达13log2。
(3)本发明将嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒(H5-FL-VLP)与MontanideTM ISA71VG佐剂(简称ISA 71)混合乳化制备疫苗，通过SPF鸡试验评估该疫苗的免疫效力。结果表明，针对异源H5N1-D889毒株，H5-VLP疫苗、H5-FL-VLP疫苗和H5-VLP+FL-VLP混合疫苗诱导的HI和中和抗体效价无显著差异，但H5-FL-VLP疫苗诱导了显著高水平的Th17型免疫应答，提供了更优的攻毒保护效果，为H5N1亚型禽流感的防控提供更好的疫苗选择。异源毒株攻击后，H5-FL-VLP疫苗组试验鸡存活率为100％。作为对比，H5-VLP疫苗组有90％的鸡存活，而H5-VLP+FL-VLP疫苗组只有70％的鸡存活。
附图说明
图1是分子佐剂结构示意图。
图2是通过间接免疫荧光试验鉴定目的基因表达的结果图；其中，a为rBV-HA感染sf9昆虫细胞结果图；b为对照(sf9昆虫细胞)；c为BV-FL感染sf9昆虫细胞结果图；d为对照(sf9昆虫细胞)；e为rBV-M1感染sf9昆虫细胞结果图；f为对照(sf9昆虫细胞)。
图3是H5N1-VLP、FL-VLP和H5-FL-VLP的SDS-PAGE和Western blot鉴定结果图；其中，a为H5N1-VLP的SDS-PAGE和Western blot鉴定结果；b为FL-VLP的SDS-PAGE和Westernblot鉴定结果；c为H5-FL-VLP的SDS-PAGE和Western blot鉴定结果。
图4是H5N1-VLP、FL-VLP和H5-FL-VLP的电镜观察结果图；其中，a为H5N1-VLP的电镜观察结果；b为FL-VLP的电镜观察结果；c为H5-FL-VLP的电镜观察结果。
图5是PBMCs细胞增殖结果图。
图6是PBMCs细胞因子检测结果图；其中，a，b，c为H5N1-D889病毒刺激后各疫苗组中IFN-γ，IL-4和IL-17的mRNA表达水平；d，e，f为H5-FL-VLP抗原刺激后各疫苗组中IFN-γ，IL-4和IL-17的mRNA表达水平。
图7是各疫苗组HI和中和抗体检测结果图；其中，a为以H5N1-SD57毒株为4HAU的HI结果；b为以H5N1-D889毒株为4HAU的HI结果；c为以H5N1-D889毒株为检测毒株的中和抗体结果。
图8是攻毒后各疫苗组鸡的存活率结果图。
图9是攻毒后各疫苗组鸡肺脏组织病理变化结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和实验材料均可通过商业途径获得。
本发明实施例中涉及的H5N1-SD57毒株为A/Chicken/Shandong/WFZC/2017(H5N1)，该病毒株以及HA蛋白已在中国专利(申请号为“202310079761.X”、名称为“一种抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用”)中公开。
本发明实施例中涉及的H5N1-D889毒株为A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)，该毒株已在中国专利申请(申请号为“202310079761.X”、名称为“一种抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用”)中公开。
本发明实施例中涉及的H7N9亚型禽流感病毒为A/Chicken/Guangdong/16876/2016(H7N9)，该病毒株以及M1蛋白已在中国专利(申请号为“202310079761.X”、名称为“一种抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用”)中公开。
实施例1FL、HA和M1基因的重组杆状病毒质粒的构建
(1)本实施例设计了一种具有膜锚定特性的重组嵌合分子佐剂FL(氨基酸序列如SEQ ID NO：9)，该分子佐剂FL由鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(GenBank：ACY88831.1)的氨基酸残基(Flic△174-400)、IIb型大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(GenBank：P43529.1)的氨基酸残基(LTB△1-23)、H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的跨膜区(TM)和胞质尾区(CT)、蜂毒信号肽、Flag标签蛋白以及6×His标签蛋白重组嵌合而成；Flic△174-400的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，LTB△1-23的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的跨膜区(TM)和胞质尾区(CT)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3～4所示，蜂毒信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，Flag标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，6×His标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；其中，Flic△174-400和LTB△1-23之间由柔性连接分子linker进行连接，linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。重组嵌合分子佐剂FL的相关蛋白及linker氨基酸序列见表1，重组嵌合分子佐剂FL的结构示意图见图1。重组嵌合分子佐剂FL的氨基酸序列经北京六合华大基因科技有限公司分析后合成其编码基因(SEQ ID NO：10)，基因序列根据物种粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)进行优化并***到pACEBac1质粒(GenevaBiotech公司)中，从而得到重组转递质粒pACEBac-FL。
表1FL相关蛋白及linker氨基酸序列
蛋白或linker 氨基酸序列(5′-3′) 编号
H7N9-HA TM区 ILWFSFGASCFILLAIVMGLVFICVK SEQ ID NO：3
H7N9-HA CT区 NGNMRCTICI SEQ ID NO：4
蜂毒信号肽 KFLVNVALVFMVVYISYIYAD SEQ ID NO：5
Flag标签蛋白 DYKDDDDK SEQ ID NO：6
6×His标签蛋白 HHHHHH SEQ ID NO：7
linker GGGGSGGGGS SEQ ID NO：8
Flic△174-400的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
LTB△1-23的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
重组嵌合分子佐剂FL的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；
重组嵌合分子佐剂FL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
(2)将来源于A/Chicken/Shandong/WFZC/2017(H5N1)的HA基因和来源于A/Chicken/Guangdong/16876/2016(H7N9)的M1基因经密码子优化、基因合成后委托北京六合华大基因科技有限公司进行人工合成后连接到转递质粒pACEBac1中，分别得到重组转递质粒pACEBac-HA和pACEBac-M1。其中，密码子优化后的HA基因和密码子优化后的M1基因的序列均已在申请号为“202310079761.X”的专利中已公开，具体的，密码子优化后的HA基因的核苷酸序列如专利“202310079761.X”中的SEQ ID NO：1所示，HA蛋白氨基酸序列如专利“202310079761.X”中的SEQ ID NO：3所示；密码子优化后的M1基因的核苷酸序列如专利“202310079761.X”中的SEQ ID NO：2所示，M1蛋白氨基酸序列如专利“202310079761.X”中的SEQ ID NO：4所示。
(3)构建重组杆状病毒质粒
将重组转递质粒pACEBac-FL、pACEBac-HA和pACEBac-M1分别转化DH10bac大肠杆菌感受态细胞(北京博迈德生物)，具体步骤如下：DH10Bac感受态细胞取出后放置于冰上解冻；吸取1μL的重组转递质粒加入到DH10Bac感受态细胞中，轻微混匀；冰浴30min，42℃水浴热激45s，冰浴2min；向管中加入900μL的无抗LB液体培养基，置于37℃摇床，220rpm，振荡培养4h；使用无抗LB液体培养基对菌液进行10倍连续稀释，得到10-1、10-2、10-3稀释度的菌液，吸取400μL各稀释度菌液均匀涂布在三抗LB平板(庆大霉素(7μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、四环素(10μg/mL))中，静置10min；避光倒置放于37℃培养箱，培养48h；培养48h后，挑取白色单克隆菌落进行扩大培养，经PCR鉴定正确后提取质粒，得到重组杆状病毒质粒，分别命名为Bacmid-FL、Bacmid-HA和Bacmid-M1。
实施例2rBV-FL、rBV-HA和rBV-M1重组杆状病毒的获得
(1)将实施例1中获得的重组杆状病毒质粒(Bacmid-FL、Bacmid-HA和Bacmid-M1)使用脂质体介导转染法分别转染sf9昆虫细胞(草地贪夜蛾细胞)(Invitrogen公司)。转染的具体步骤如下：准备六孔板，将sf9昆虫细胞(0.8～1×106个细胞/mL)铺于六孔板中，每孔2mL，将六孔板置于27℃培养箱中培养，待细胞贴壁后进行转染；取两支1.5mL灭菌EP管，分别加入100μL的Grace’s Insect Medium；一支加入6～8μL的II Regent脂质体，脂质体使用前震荡混匀；另一支加入1μL的重组杆状病毒质粒，轻轻混匀；将稀释后的重组杆状病毒质粒和/>II Regent混合(总体积约210μL)，室温静置，孵育15～30min，得到质粒-脂质体混合液；去除六孔板中的培养基，使用Grace’sInsect Medium清洗一次；吸取800μL的Grace’s Insect Medium至质粒-脂质体混合液中，震荡混匀，得到转染混合物；将约1mL的转染混合物加入到sf9昆虫细胞中，置于27℃培养箱中孵育3～5h；孵育结束后，弃去转染混合物，使用Grace’s Insect Medium清洗一次，每孔添加2mL的Sf-900TMII SFM昆虫细胞培养基，置于27℃培养箱中培养72h；期间观察细胞病变，培养72h后，收取细胞培养上清，即获取第一代(P1)重组杆状病毒。
(2)P1代重组杆状病毒通过感染sf9昆虫细胞进行传代。具体步骤如下：准备T75细胞培养瓶，将sf9昆虫细胞平铺于瓶中；待细胞长满底部约80％左右，将P1代重组杆状病毒接种到瓶中，置于27℃培养箱中，培养72～96h；待细胞病变明显时，收集细胞培养液，500r/min离心5min，收取离心后上清即P2代重组杆状病毒。重复上述步骤获取P3代重组杆状病毒，4℃避光保存；将其分别命名为rBV-FL、rBV-HA和rBV-M1。
(3)使用间接免疫荧光试验(IFA)鉴定重组杆状病毒在sf9昆虫细胞中的表达，具体步骤如下：
1)将生长状态良好的sf9昆虫细胞铺于六孔板中，待细胞铺满底部85％时，以MOI＝0.1接种P3代重组杆状病毒(rBV-FL、rBV-HA、rBV-M1)，27℃培养48h；
2)弃尽六孔板内的液体，每孔加入1mL预冷的甲醇溶液，轻放于4℃冰箱固定10min；
3)弃去固定液，加入PBS缓冲液进行清洗，每次5min，重复清洗3次；
4)加入一抗进行孵育，鉴定FL蛋白的一抗为稀释的Flag-tag(1A8)mousemonoclonal antibody(Bioword公司)，鉴定HA蛋白的一抗为H5亚型HA鼠单克隆抗体(溯本源和生物)，鉴定M1蛋白的一抗为His-tag(4C2)mouse monoclonal antibody(Bioword公司)，37℃孵育1h；
5)弃一抗，加入PBS缓冲液进行清洗，每次5min，重复清洗3次；
6)加入二抗，二抗为稀释的FITC偶联羊抗鼠IgG抗体(Bioword公司)，37℃避光孵育1h；
7)弃二抗，加入PBS缓冲液进行清洗，每次5min，重复清洗3次；
8)使用荧光显微镜观察结果，以sf9昆虫细胞为空白对照，结果显示，HA、FL和M1重组杆状病毒感染孔均可检测到特异性荧光，而空白对照孔无特异性荧光产生(图2)。
实施例3H5N1-VLP、H5-FL-VLP和FL-VLP的组装和鉴定
(1)H5N1-VLP的组装：P3代rBV-HA和rBV-M1按照MOI＝2：1的比例共感染High Five细胞，悬浮培养，培养96h后，收集细胞培养上清，4℃，2000×g离心30min去除细胞碎片；再经4℃，30 000×g离心60min收获病毒样颗粒。将收获的H5N1-VLP进行SDS-PAGE和Westernblot鉴定。Western blot实验中，使用的一抗分别为His-tag(4C2)mouse monoclonalantibody(Bioword公司)和H5亚型HA鼠单克隆抗体(溯本源和生物，北京)；二抗为荧光标记的鼠二抗(800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody，LI-CORBiosciences公司)，以正常High five昆虫细胞上清作为阴性对照。结果如图3a所示，HA和M1蛋白成功表达，HA蛋白约为65kDa，M1蛋白约为28kDa。
(2)FL-VLP的组装：P3代rBV-FL和rBV-M1按照MOI＝1：1的比例共感染High Five细胞生产FL-VLP，具体步骤同H5N1-VLP的组装。将收获的FL-VLP进行SDS-PAGE和Westernblot鉴定。Western blot实验中，使用的一抗分别为His-tag(4C2)mouse monoclonalantibody(Bioword公司)和Flag-tag(1A8)mouse monoclonal antibody(Bioword公司)；二抗为荧光标记的鼠二抗(800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)SecondaryAntibody，LI-COR Biosciences公司)，以正常High five昆虫细胞上清作为阴性对照。结果如图3b所示，FL和M1蛋白成功表达，FL蛋白约62kDa，M1蛋白约为28kDa。
(3)H5-FL-VLP的组装：P3代rBV-HA、rBV-FL和rBV-M1按照MOI＝2：1：2的比例共感染High Five细胞生产H5-FL-VLP，具体步骤同H5N1-VLP的组装。将收获的H5-FL-VLP进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。Western blot实验中，使用的一抗分别为His-tag(4C2)mouse monoclonal antibody(Bioword公司)、Flag-tag(1A8)mouse monoclonal antibody(Bioword公司)和H5亚型HA鼠单克隆抗体(溯本源和生物，北京)；二抗为荧光标记的鼠二抗(800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody，LI-COR Biosciences公司)，以正常High five昆虫细胞上清作为阴性对照。结果如图3c所示，HA、FL和M1蛋白均成功表达。血凝实验表明，嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒H5-FL-VLP的血凝效价达13log2。
实施例4H5N1-VLP、H5-FL-VLP和FL-VLP的纯化和电镜观察
(1)病毒样颗粒的纯化
配制20％、30％、45％、60％(w/v)的蔗糖溶液，0.22μm滤器过滤；离心管从上至下分别加入20％、30％、45％、60％的蔗糖溶液，最上方加入病毒样颗粒样品，经4℃，100 000×g离心1h；离心结束后，收取蔗糖层间白色透明带；10 000×g，4℃离心1.5h去除蔗糖；使用PBS缓冲液重悬病毒样颗粒样品。
(2)透射电镜观察病毒样颗粒的形态结构
将纯化后的病毒样颗粒样品滴加到碳涂层铜网上吸附，在室温下孵育2min。用吸水纸轻轻吸去铜网上的多余液体，干燥后用1wt.％的磷钨酸负染样品，并在室温下孵育10min；再用吸水纸缓慢吸弃铜网上多余的磷钨酸，室温晾干。透射电子显微镜观察结果如图4所示：H5N1-VLP、FL-VLP和H5-FL-VLP在透射电子显微镜下均可观察到直径约100nm，有囊膜的圆形颗粒，囊膜表面可见明显纤突。
实施例5免疫效力评估
(1)疫苗的制备
抗原定量：使用纯化的已知浓度的H5N1-VLP作为标准抗原与收获的病毒样颗粒进行Western blot，使用ImageJ软件对Western blot结果进行灰度值分析，估算病毒样颗粒的浓度。分子佐剂FL在H5-FL-VLP中的含量同样使用该方法进行估算。
H5-VLP疫苗：将收获的H5N1-VLP以免疫剂量与ISA 71佐剂(即MontanideTM ISA71VG佐剂)按照30：70(v/v)的比例混合乳化制备疫苗，每0.3mL H5-VLP疫苗含有60μg的H5N1-VLP抗原。
H5-FL-VLP疫苗：将收获的H5-FL-VLP以免疫剂量与ISA 71佐剂按照30：70(v/v)的比例混合乳化制备疫苗，每0.3mL H5-FL-VLP疫苗含有60μg的H5-FL-VLP抗原(嵌合15μg的FL抗原)。
H5-VLP+FL-VLP疫苗：将收获的H5N1-VLP和FL-VLP混合后以免疫剂量与ISA 71佐剂按照30：70(v/v)的比例混合乳化制备疫苗。每0.3mL H5-VLP+FL-VLP疫苗含有60μg的H5N1-VLP和15μg的FL-VLP抗原。
(2)动物实验分组
将3周龄SPF鸡(购于广东省新兴大华农禽蛋有限公司)随机分为4组，动物分组方案见表2。第1组注射PBS缓冲液作为空白对照；第2组经颈部皮下注射H5-VLP疫苗，0.3mL/只；第3组经颈部皮下注射H5-FL-VLP疫苗，0.3mL/只；第4组经颈部皮下注射H5-VLP+FL-VLP疫苗，0.3mL/只。
表2动物实验分组
组别 抗原 佐剂 剂量 数量(只)
1 PBS - 0.3mL 11
2 H5N1-VLP ISA 71 60μg H5N1-VLP 16
3 H5-FL-VLP ISA 71 60μg H5-FL-VLP(嵌合15μg FL) 16
4 H5N1-VLP+FL-VLP ISA 71 60μg H5N1-VLP+15μg FL-VLP 16
(3)PBMCs细胞增殖实验和细胞因子实验结果
免疫后第19天，每组随机选取3只鸡采集外周血，根据外周血单个核细胞分离试剂盒(天津灏洋生物制品有限责任公司)操作说明分离PBMCs。
PBMCs细胞增殖实验结果：将分离的PBMCs使用完全培养基(完全培养基：RPMI1640培养基(Invitrogen公司)含有10％FBS(Invitrogen公司)和1％双抗(Bioword公司))调整密度至5×104cell/mL，将单细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，每个样品重复三次，同时设置空白孔(与试验平行不加细胞只加培养液)，每孔再加入10μL的刀豆素A(ConA)(Sigma-Aldrich公司)溶液(10mg/mL)，将96孔板放置在37℃，含5％CO2的培养箱中培养48h。使用MTT细胞活性检测试剂盒(锐博生物)检测PBMCs细胞增殖结果。结果见图5，结果显示，H5-FL-VLP疫苗组PBMCs的细胞增殖水平高于H5-VLP疫苗组和H5-VLP+FL-VLP疫苗组，但各疫苗组之间细胞增殖水平无显著差异。
PBMCs细胞因子实验结果：将分离的PBMCs使用完全培养基调整密度至1×106cell/mL，将单细胞悬液加入到六孔板中，每孔2mL。向六孔板中分别加入103TCID50的H5N1-D889病毒或20μg的H5-FL-VLP抗原刺激细胞。将六孔板放置在37℃，含5％CO2的培养箱中培养。培养8h后收集细胞，提取RNA并反转成cDNA，使用qRT-PCR方法检测细胞因子IFN-γ，IL-4和IL-17的表达水平(RNA提取、反转录及qRT-PCR检测细胞因子参考文献进行：KongD,Chen T,Hu X,Lin S,Gao Y,Ju C,et al.Supplementation of H7N9Virus-LikeParticle Vaccine With Recombinant Epitope Antigen Confers Full ProtectionAgainst Antigenically Divergent H7N9Virus in Chickens.2022,13:785975.doi:10.3389/fimmu.2022.785975.)。细胞因子结果见图6，结果显示，病毒刺激后，各疫苗组之间IFN-γ和IL-4的mRNA表达水平无显著差异(图6a，b)；然而H5-FL-VLP疫苗组IL-17的mRNA表达水平显著高于H5-VLP疫苗组和H5-VLP+FL-VLP疫苗组(图6c)。抗原刺激后，各疫苗组之间IFN-γ、IL-4和IL-17的mRNA表达水平无显著差异(图6d，e，f)。
(4)血清抗体检测结果
免疫后第3周对各组试验鸡采血并分离血清，利用HI试验和微量中和试验检测血清抗体(检测方法参考文献进行：Kong D,Chen T,Hu X,Lin S,Gao Y,Ju C,etal.Supplementation of H7N9Virus-Like Particle Vaccine With RecombinantEpitope Antigen Confers Full Protection Against Antigenically DivergentH7N9Virus in Chickens.2022,13:785975.doi:10.3389/fimmu.2022.785975.)。使用H5N1-SD57毒株制备同源四单位抗原(4HAU)，使用H5N1-D889毒株制备异源4HAU。HI结果见图7，结果显示，针对同源毒株，各疫苗组均诱导高水平的HI抗体效价，平均HI效价均超过8log2，但各疫苗组之间无显著差异(图7a)。针对异源毒株，各疫苗组均未成功诱导HI抗体效价(图7b)。针对异源毒株的中和抗体结果见图7c，结果显示，H5-VLP和H5-FL-VLP疫苗组平均中和抗体效价均为1：56，略高于H5-VLP+FL-VLP疫苗组(1：41)，但各疫苗组之间无显著差异(图7c)。
(5)攻毒保护结果
免疫后3周，对各组试验鸡使用异源毒株H5N1-D889进行攻毒，滴鼻接种，0.2mL/只(含106.0EID50)。攻毒后每日观察试验鸡的发病或死亡情况并及时记录，连续观察14天。攻毒后各试验组SPF鸡存活结果见图8，结果显示，攻毒后PBS组试验鸡在2天内迅速死亡，H5-VLP疫苗组攻毒后有90％(9/10)的鸡存活，H5-VLP+FL-VLP疫苗组只有70％(7/10)的鸡存活，作为对比，H5-FL-VLP疫苗组试验鸡攻毒后全部存活。
攻毒后第2天，每组随机选取3只鸡采集肺组织，制备组织切片进行组织病理学观察。结果见图9，结果显示，各疫苗组试验鸡的肺脏均未观察到明显的病理变化，而PBS组鸡的肺脏观察到严重的组织损伤，包括肺出血和淋巴细胞浸润等。
攻毒后第3，5和7天采集各组试验鸡咽喉和泄殖腔拭子进行病毒分离和滴定，结果见表3。结果显示，攻毒后，H5-VLP疫苗组检测到2只鸡排毒，且在攻毒后第5天采集的泄殖腔拭子中测得病毒滴度为101.0EID50/0.1mL；H5-FL-VLP疫苗组检测到2只鸡排毒，未测出病毒滴度；H5-VLP+FL-VLP检测到3只鸡排毒，且在攻毒后第5天采集的泄殖腔拭子中测得病毒滴度为101.25EID50/0.1mL。
表3攻毒后排毒结果
注：dpc：攻毒后；NA：因为鸡只死亡未采集样本；病毒滴度检测下限为101.0EID50/0.1mL。
上述所有的试验结果表明：相比于H5-VLP疫苗，本发明提供的嵌合分子佐剂FL的H5-FL-VLP疫苗诱导更高水平的细胞和Th17型免疫应答，提供更优的攻毒保护效果，是防控H5N1亚型禽流感更好的疫苗选择。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种分子佐剂，其特征在于：所述分子佐剂由Flag标签蛋白、蜂毒信号肽、鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的氨基酸残基Flic△174-400、IIb型大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基的氨基酸残基LTB△1-23、H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的跨膜区TM和胞质尾区CT以及6×His标签蛋白重组嵌合而成。
2.根据权利要求1所述的分子佐剂，其特征在于：
所述的分子佐剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
3.一种权利要求1～2任一项所述的分子佐剂的编码基因，其特征在于：所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
4.一种嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒，其特征在于：包含权利要求1～2任一项所述的分子佐剂蛋白、H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白和H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白。
5.权利要求4所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：
所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒由权利要求1～2任一项所述的分子佐剂、H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白和H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白组装而成；
所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)分子佐剂FL的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；密码子优化后的HA蛋白的编码基因的核苷酸序列如专利“202310079761.X”中的SEQ ID NO：1所示，密码子优化后的M1蛋白的编码基因的核苷酸序列如专利“202310079761.X”中的SEQ ID NO：2所示；
(2)将步骤(1)中的分子佐剂FL的编码基因、HA蛋白的编码基因和M1蛋白的编码基因分别***到杆状病毒表达***的转递质粒中，分别得到FL基因重组转递质粒、HA基因重组转递质粒以及M1基因重组转递质粒；
(3)将步骤(2)中得到的FL基因重组转递质粒、HA基因重组转递质粒以及M1基因重组转递质粒经转化重组，分别得到FL基因重组杆状病毒质粒、HA基因重组杆状病毒质粒以及M1基因基因重组杆状病毒质粒；
(4)将步骤(3)中得到的FL基因重组杆状病毒质粒、HA基因重组杆状病毒质粒以及M1基因重组杆状病毒质粒经脂质体介导转染sf9昆虫细胞，收获培养上清，分别得到P1代FL基因重组杆状病毒、HA基因重组杆状病毒以及M1基因重组杆状病毒；
(5)将步骤(4)中得到的P1代FL基因重组杆状病毒、HA基因重组杆状病毒以及M1基因重组杆状病毒感染sf9昆虫细胞进行传代，连续传代2次，分别得到P3代FL基因重组杆状病毒、HA基因重组杆状病毒以及M1基因重组杆状病毒；
(6)将步骤(5)中得到的P3代FL基因重组杆状病毒、HA基因重组杆状病毒以及M1基因重组杆状病毒以共感染的方式感染昆虫细胞，收取细胞外培养上清，得到由FL蛋白、HA蛋白以及M1蛋白组装而成的病毒样颗粒，即所述嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的转递质粒为pACEBac1；
步骤(3)中所述的转化为转化DH10bac大肠杆菌感受态细胞；
步骤(6)中所述的昆虫细胞为High five昆虫细胞；
步骤(6)中P3代FL基因重组杆状病毒、HA基因重组杆状病毒以及M1基因重组杆状病毒共感染昆虫细胞时，感染复数MOI比例为2：1：2。
7.权利要求4所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒在制备嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗中的应用。
8.一种嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗，其特征在于：包括免疫量的权利要求4所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒以及药学上可以接受的载体。
9.权利要求8所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将佐剂和免疫量的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒混合乳化，得到嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗。
10.权利要求1～2任一项所述的分子佐剂、权利要求4所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒和权利权利要求8所述的嵌合型H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗中的至少一种在制备预防和/或治疗H5N1亚型禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。
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