CN105169383A - 以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗及其制备方法和应用，属于生物技术领域。所述的疫苗是以杆状病毒为载体，在其表面展示有三拷贝的禽流感病毒基质蛋白M2胞外域和大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位的融合蛋白，并能够表达上述融合蛋白的重组杆状病毒。禽流感病毒快速变异，而现有疫苗交叉保护力弱。本发明将禽流感病毒高度保守、具有交叉保护作用的抗原片段3M2e和粘膜佐剂LTB的编码基因***杆状病毒基因组，制备成经呼吸道免疫的广谱禽流感疫苗。本发明还涉及使用所述广谱禽流感疫苗的免疫接种方案。该疫苗克服了传统禽流感疫苗在研制、生产以及应用方面的不足，从而实现对禽流感疫情经济、有效地防控。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
禽流感(Avianinfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的一种以侵害禽类呼吸***为主的传染性疾病。根据禽流感病毒致病性的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感，低致病性禽流感和非致病性禽流感。其中由H5和H7亚型毒株(以H5N1和H7N7为代表)所引起的疾病称为高致病性禽流感。高致病性禽流感传染性强，发病率和致死率高。自1959年英国首次暴发高致病性禽流感，并分离到H5N1亚型禽流感病毒以来，H5N1亚型禽流感迅速传播到世界各地，给世界养禽业带来了巨大的经济损失。更为严重的是，随着病毒的进化，H5N1亚型禽流感病毒已经突破了禽类与哺乳动物的种间屏障，可直接感染人。1997年香港暴发H5N1亚型禽流感，有18个人感染并有6人死亡，之后H5N1亚型高致病性禽流感感染致人死亡的事件时有发生，发生疫情的地区也逐渐从亚洲蔓延至欧洲和非洲。尽管目前H5N1亚型禽流感尚不具备人传人的特点，但是随着流感病毒的不断进化与广泛传播，H5N1亚型禽流感病毒实现在人群之间的传播存在巨大可能性。因此有效防控H5N1亚型禽流感不仅能够挽回大量的经济损失，而且具有重要的公共卫生意义。
国内外禽流感防治经验表明，控制禽流感大规模流行和降低损失最有效的途径是接种疫苗。禽流感疫苗主要分为全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程疫苗三大类。减毒活疫苗由于存在生物安全隐患，目前尚不允许在禽类中使用。基因工程疫苗中，目前只有以鸡痘病毒和新城疫病毒为载体构建的重组活病毒疫苗获得了国家新兽药证书。当前H5N1亚型禽流感的防控主要依赖全病毒灭活苗，灭活苗安全性好，免疫原性强，但存在一些缺陷：(1)灭活苗保护性抗原主要是囊膜蛋白HA和NA，而HA和NA具有型特异性和高度变异性，所诱导的抗体交叉保护力弱，因此灭活苗很难有效应对不同亚型流感病毒的感染以及H5N1亚型禽流感病毒自身的快速变异；(2)禽流感主要经过呼吸道传染，因此呼吸道粘膜免疫是防止病毒入侵和扩散的关键环节，而灭活苗通过肌肉注射接种，不能有效地诱导粘膜免疫力，而且这种肌肉接种方式效率低，成本高；(3)灭活苗的生产采用鸡胚培养法，疫苗的产量过度依赖于鸡胚。此外，除了疫苗株种子批的建立是使用SPF鸡胚，疫苗临床生产主要依靠健康鸡群来源的普通鸡胚，而普通鸡胚可能含有一些其他病毒，因此疫苗存在其他病原污染的可能性。(4)灭活苗主要激活体液免疫应答，无法诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)，而CTL的杀伤和清除功能对于流感的恢复非常重要。这些特点极大地影响了禽流感灭活苗的安全性、有效性和经济性，因此迫切需要研制一种新型广谱的、可诱导呼吸道粘膜免疫反应的禽流感疫苗来预防H5N1亚型禽流感，以填补传统疫苗的缺陷。
目前，广谱流感疫苗的研究都集中在流感病毒保守蛋白。流感病毒基质蛋白M2为流感病毒的跨膜蛋白之一，M2的氨基酸序列高度保守，其胞外域的24个氨基酸(M2e)在禽流感病毒中几乎完全相同。研究表明，M2e含有M2的主要保护性抗原决定簇，其作为抗原可以诱导免疫保护，并且具有一定程度的交叉保护力。此外，关于M2e的免疫保护机制也很清楚。M2e特异性抗体不具有中和活性，但可以通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibodydependentcellmediatedcytotoxicity,ADCC)消灭被感染的细胞，限制病毒的复制，从而降低流感的发病率和死亡率。目前，基于M2e的广谱流感疫苗研究进展迅速，某些产品现在已经进入临床试验，比如赛诺菲巴斯德公司研发的表面展示M2e的病毒样颗粒(VLP)疫苗，以及VaxInnate公司的M2e与鞭毛蛋白融合表达的疫苗。
流感病毒主要是通过呼吸道粘膜感染机体，因此通过粘膜***进行免疫的流感疫苗具有很大优势。首先，疫苗接种后能够激发局部粘膜免疫应答，可以有效限制病毒的复制和扩散。此外，与传统肌肉注射类疫苗相比，经粘膜***免疫的疫苗使用方便，喷雾，滴鼻均可，能极大地提高工作效率，节约成本。因此，研发粘膜疫苗对于禽流感的防控意义重大，而如何增强疫苗诱导粘膜免疫的能力成为粘膜疫苗研究的关键。TakayukiAbe等研究发现，杆状病毒经滴鼻免疫后，可以针对流感病毒产生很好的免疫保护。研究人员将重组了流感病毒HA基因的重组杆状病毒和野生型的杆状病毒分别经肌肉注射和滴鼻途径免疫小鼠，然后用致死剂量的流感病毒攻击小鼠。结果表明，含HA基因的重组杆状病毒滴鼻免疫的保护效果优于肌肉注射免疫组，而野生型杆状病毒经滴鼻免疫后，能够激活宿主的天然免疫反应，其保护效果甚至优于重组杆状病毒肌肉注射组。除了选用合适的疫苗载体，通过引入粘膜免疫佐剂，也可以达到增强粘膜疫苗保护力的目的。大肠杆菌热不稳定肠毒素(Heat-labileenterotoxin,LT)是目前研究较多的粘膜佐剂之一，特别是其B亚单位不具有LT的肠毒素毒性，但仍然保持高粘膜佐剂活性。此外，LTB能够在多个表达***中进行表达(大肠杆菌、酵母、杆状病毒等)，并且与抗原融合表达后仍具有很好的佐剂活性。
以上内容为研制经粘膜免疫的广谱禽流感疫苗提供了新的思路。但是新一代的禽流感疫苗，不仅要广谱、有效、使用方便，还要注重疫苗对机体免疫资源利用的有效性以及疫苗的生产成本。因此，必须使用新的研究方法改变传统灭活苗在生产上对鸡胚的依赖，弥补灭活苗诱导CTL能力的缺陷。杆状病毒作为一种新型的疫苗载体，除了具有很好的诱导粘膜免疫的能力，还具备以下优点：(1)可作为外源基因传递载体，主动进入真核细胞，并在相应启动子的调控下表达外源蛋白，启动内源性提呈途径，诱导功能性CTL产生；(2)可作为表面展示***，将外源蛋白展示在病毒粒子表面，启动外源性提呈途径，诱导辅助性T细胞和抗体的产生；(3)传统灭活苗疫苗毒株多是通过反向遗传技术进行基因重组获得，然后采用鸡胚培养法生产疫苗，与之相比重组杆状病毒制备过程简单，通过细胞发酵培养，即可获得大批量的疫苗。目前，杆状病毒已经广泛应用于流感、SARS等疫苗的研究。
发明内容
本发明的目的之一是克服传统禽流感灭活苗在研制、生产以及应用方面的不足，提供一种以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗。本发明的疫苗可提供针对不同分支H5N1亚型AIV的广谱交叉保护力；可经呼吸道粘膜免疫，使用方便；既能诱导体液免疫，又能诱导细胞免疫；疫苗制备简单，便于大批量生产。
本发明的另一目的在于提供上述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗，包括重组修饰的昆虫杆状病毒，所述的昆虫杆状病毒表面展示有禽流感病毒保守抗原分子和粘膜佐剂分子的融合蛋白，并能够表达禽流感病毒保守抗原分子和粘膜佐剂分子的融合蛋白。
所述的禽流感病毒保守抗原分子包括禽流感病毒基质蛋白M2胞外域(M2e)24个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
所述的禽流感病毒基质蛋白M2胞外域(M2e)24个氨基酸残基优选为具有三个拷贝的串联重复。
所述的禽流感病毒保守抗原分子还包括柔性连接分子，所述的柔性连接分子实现对三个重复的禽流感病毒基质蛋白M2胞外域(M2e)24个氨基酸残基的连接，所述的柔性连接分子的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
所述的禽流感病毒保守抗原分子的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
所述粘膜佐剂分子为大肠杆菌热不稳定肠毒素(Heat-labileenterotoxin,LT)的B亚单位(LTB)，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
所述的重组修饰的昆虫杆状病毒的基因组中***双启动子基因盒，所述双启动子基因盒自上游至下游包括如下组件：多角体蛋白(Polyhedron,PH)启动子，人巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子，杆状病毒自身的囊膜糖蛋白GP64的信号肽编码基因，3个拷贝的M2e编码基因，LTB编码基因，杆状病毒自身的囊膜糖蛋白GP64的跨膜区和胞内区的编码基因。
所述的重组修饰的昆虫杆状病毒的构建时所用的出发载体为pFastBacTMDual-VSV-G，所述出发载体的p10启动子下游含有水泡口炎病毒的G蛋白(VesicularStomaTitisVirusGlycoprotein，VSV-G)的编码基因。
所述的杆状病毒为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)。
所述的重组修饰的昆虫杆状病毒命名为重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB。
上述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗的制备方法，包括以下步骤：首先通过人工合成3个拷贝的M2e核苷酸序列(3M2e)，然后构建3个拷贝的M2e核苷酸序列和LTB的融合基因，并将融合基因***到杆状病毒展示质粒pBACsurf-1中的GP64信号肽(signalpeptide,SP)与成熟蛋白(maturedomain,MD)之间，构建重组质粒pBACsurf-3M2e-LTB，再将GP64SP-3M2e-LTB-GP64MD基因片段***pcDNA3.1(+)的CMV启动子后，获得重组质粒pcDNA-GP64-3M2e-LTB；然后将包含CMV-GP64SP-3M2e-LTB-GP64MD的基因片段***到Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达***的pFastBacTMDual-VSV-G转移质粒的PH启动子下游，构建重组转移质粒pFast-G-CMV-GP64-3M2e-LTB；将重组转移质粒转化DH10Bac大肠杆菌，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-G-3M2e-LTB；最后用脂质体法将Bacmid-G-3M2e-LTB转染sf9昆虫细胞从而获得重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB，即获得以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗。
上述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗在制备禽流感广谱疫苗中的应用。
所述的禽流感广谱疫苗为滴鼻施用的禽流感广谱疫苗。
本发明与现有技术相比具有如下的优点：
本发明针对现有技术中传统禽流感灭活苗在研制、生产以及应用方面的不足，提供一种以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗，该广谱禽流感疫苗包括重组修饰的昆虫杆状病毒，所述的昆虫杆状病毒表面展示有禽流感病毒保守抗原分子和粘膜佐剂分子的融合蛋白，并能够表达禽流感病毒保守抗原分子和粘膜佐剂分子的融合蛋白。本发明的疫苗可提供针对不同分支H5N1亚型AIV的广谱交叉保护力；可经呼吸道粘膜免疫，使用方便；既能诱导体液免疫，又能诱导细胞免疫；疫苗制备简单，便于大批量生产。
本发明选择禽流感病毒高度保守的蛋白M2e以及粘膜免疫佐剂LTB作为抗原，以昆虫杆状病毒作为载体，制备了经呼吸道免疫的广谱禽流感疫苗。该疫苗具有以下特点：(1)表面展示抗原，具有亚单位疫苗特点；(2)能够进入哺乳动物细胞介导抗原表达，具有核酸疫苗的特点；(3)可诱导针对H5N1亚型不同分支毒株的交叉保护；(4)疫苗经呼吸道粘膜免疫，使用方便；(5)重组杆状病毒制备简单，便于大规模生产。
附图说明
图1为重组质粒pMD18-T-3M2e-LTB的鉴定结果图，其中M为DNAmaker，DL2000Marker(left)orDL10000Marker(right)；1：以质粒pET-LTB为模版扩增LTB；2:菌液PCR扩增LTB；3:以ddH2O为模板的阴性对照；4:XmaI单酶切质粒pMD18-T-3M2e-LTB；5:质粒pMD18-T-3M2e-LTB。
图2为含双KpnI位点质粒pBACsurf-LTB的鉴定结果图，其中M为DNAmaker，DL2000Marker(left)orDL10000Marker(right)；1:以质粒2pET-LTB为模版扩增LTB；2:菌液PCR扩增LTB；3:以ddH2O为模板的阴性对照；4:KpnI单酶切质粒pBACsurf-LTB。
图3为重组质粒pBACsurf-3M2e-LTB和pBACsurf-3M2e的鉴定结果图，其中M为DNAmaker，DL2000Marker(left)orDL10000Marker(right)；1:以质粒pMD18-T-3M2e-LTB为模板扩增3M2e-LTB；2:以质粒pMD18-T-3M2e-LTB为模板扩增3M2e；3/4:分别为菌液PCR扩增3M2e-LTB、3M2e；5/6:以ddH2O为模板的阴性对照；7:PstI、KpnI双酶切质粒pBACsurf-3M2e-LTB；8:PstI、KpnI双酶切质粒pBACsurf-3M2e。
图4为重组质粒pcDNA3.1-GP64-3M2e-LTB和pcDNA3.1-GP64-3M2e的鉴定结果图，其中M为DNAmaker，DL5000Marker(left)orDL10000Marker(right)；1:以质粒pBACsurf-3M2e-LTB为模板扩增gp64SP-3M2e-LTB-gp64TM-gp64CTD；2:以质粒pBACsurf-3M2e为模板扩增gp64SP-3M2e-gp64TM-gp64CTD；3/4:分别为菌液PCR扩增gp64SP-3M2e-LTB-gp64TM-gp64CTD、gp64SP-3M2e-gp64TM-gp64CTD；5:以ddH2O为模板的阴性对照；6:NheI、HindIII双酶切质粒pcDNA-GP64-3M2e-LTB；7:NheI、HindIII双酶切质粒pcDNA-GP64-3M2e。
图5为重组质粒pFast-G-CMV-GP64-3M2e-LTB和pFast-G-CMV-GP64-3M2e的鉴定结果图，其中M为DNAmaker，DL5000Marker(left)orDL10000Marker(right)；1:以质粒pcDNA-3M2e-LTB为模板扩增gp64SP-3M2e-LTB-gp64TM-gp64CTD；2:以质粒pcDNA-3M2e为模板扩增gp64SP-3M2e-gp64TM-gp64CTD；3/4:分别为菌液PCR扩增gp64SP-3M2e-LTB-gp64TM-gp64CTD、gp64SP-3M2e-gp64TM-gp64CTD；5:以ddH2O为模板的阴性对照；6:SalI、HindIII双酶切质粒pFast-CMV-GP64-3M2e-LTB；7:SalI、HindIII双酶切质粒pFast-CMV-GP64-3M2e。
图6为重组杆状病毒质粒Bacmid-G-3M2e-LTB和Bacmid-G-3M2e的鉴定结果图，其中M为DNAmaker，DL10000Marker(left)orDL10000Marker(right)；1:以重组杆状病毒质粒Bacmid-Dual-3M2e-LTB为模板扩增外源基因；2:以重组杆状病毒质粒Bacmid-Dual-3M2e为模板扩增外源基因；3:以ddH2O为模板的阴性对照。
图7为重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e转染sf9昆虫细胞的结果图，其中A为正常的sf9细胞；B为转染重组杆状病毒Bacmid-3M2e-LTB的sf9细胞；C:为转染重组杆状病毒Bacmid-3M2e的sf9细胞。
图8为重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e转染的sf9细胞产生特异性免疫荧光的结果图，其中A:转染野生杆状病毒质粒的sf9细胞；B:转染重组杆状病毒质粒Bacmid-Dual-3M2e-LTB的sf9细胞表达M2e蛋白；C:转染重组杆状病毒质粒Bacmid-Dual-3M2e的sf9细胞表达M2e蛋白；D:正常sf9细胞。
图9为重组病毒BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e转染的PK15细胞能产生特异性免疫荧光的结果图，其中A：检测转导重组杆状病毒BV-Dual-3M2e的PK-15细胞表达M2e蛋白；B：检测转导重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB的PK-15细胞表达LTB蛋白；C:检测转导重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB的PK-15细胞表达M2e蛋白；D:检测转导野生杆状病毒的PK-15细胞表达LTB蛋白；E:检测转导野生杆状病毒的PK-15细胞表达M2e蛋白。
图10为金标颗粒结合到重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e的囊膜上的电镜结果图，其中A:检测LTB展示到重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB的囊膜表面；B:检测M2e展示到重组杆状病毒BV-Dual-3M2e的囊膜表面；C:检测LTB展示到重组杆状病毒BV-Dual-3M2e。
图11为免疫后小鼠黏膜IgA抗体水平的检测结果图。
图12为免疫后小鼠脾脏T细胞细胞亚群检测结果图。
图13为攻毒后小鼠肺脏病毒滴度的检测结果图。
图14为攻毒后小鼠的体重变化结果图，其中(A)为A/Ck/ZH/88/02毒株攻毒免疫组后,小鼠体重变化；(B)为A/Gy/GD/73/02毒株攻毒免疫组后,小鼠体重变化；(C)为A/Ck/GD/348/08毒株攻毒免疫组后,小鼠体重变化；(D)为A/Dk/GD/343/08毒株攻毒免疫组后,小鼠体重变化。
图15为攻毒后小鼠的存活率结果图，其中(A)为A/Ck/ZH/88/02毒株攻毒免疫组后,小鼠存活率；(B)为A/Gy/GD/73/02毒株攻毒免疫组后,小鼠存活率；(C)为A/Ck/GD/348/08毒株攻毒免疫组后,小鼠存活率；(D)为A/Dk/GD/343/08毒株攻毒免疫组后,小鼠存活率。
具体实施方式
本发明的实施方案通过下列实施例举例说明，所述实施例是为了举例说明本发明，而本发明的实施方案不限于实施例的特定细节。本发明的范围由附属的权利要求限定。
下述实施例中的试验材料，若无特别说明，均是来源于商业途径。所述的试验方法，若无特别说明，均为常规试验方法。
实施例1：重组杆状病毒质粒(Bacmid)的构建与鉴定
(1)重组质粒pMD18-T-3M2e-LTB的构建与鉴定
含linker序列的3M2e基因为上海英俊合成，并***pMD18-TSimpleVector，载体中引入三个酶切位点PstI、XbaI和KpnI。以pET-32a(+)-LTB(本实验构建，保存)为模板，利用引物P1,P2扩增LTB基因，并在上、下游引物中分别引入XbaⅠ和KpnⅠ位点，引物序列如下：
P1：5’-GCTCTAGAATGAATAAAGTAAAATGTTATGTTT-3’
P2：5’-GGTGGTACCCTAGTTTTCCATACTGATT-3’
引物P1,P2扩增条件为：94℃变性5min后进入循环；循环参数为：94℃50s，56℃50s，72℃1min；30个循环后72℃延伸10min。将PCR产物回收并用XbaI和KpnI双酶切，纯化回收后，将此LTB基因亚克隆到用同样方法处理过的pMD18-T-3M2e载体，转化E.coliDH5a感受态细胞，获得载体pMD18-T-3M2e-LTB。用XbaI和KpnI对获得的质粒进行酶切鉴定，并对该质粒进行序列测定，鉴定结果证实构建正确(图1)。
(2)含双KpnI位点质粒pBACsurf-LTB的构建与鉴定
鉴于表面展示载体pBACsurf-1的PstI和KpnI位点相连，无法进行双酶切克隆，因此对载体进行改造，以期引入两个KpnI位点。以pET-32a(+)-LTB为模板，利用引物P3,P4扩增LTB基因，并在上、下游引物中都引入KpnⅠ位点，引物序列如下：
P3：5’-GGTGGTACCCATGAATAAAGTAAAATGTTATGTTT-3’
P4：5’-GGTGGTACCCTAGTTTTCCATACTGATT-3’
引物P3,P4扩增条件为：94℃变性5min后进入循环；循环参数为：94℃50s，56℃50s，72℃1min；30个循环后72℃延伸10min。将PCR产物回收并用KpnI单酶切，与预先进行KpnI酶切和去磷酸化处理的表面展示载体pBACsurf-1使用T4DNA连接酶连接，转化E.coliDH5a感受态细胞，获得含双KpnI位点的载体pBACsurf-LTB。用KpnI对获得的质粒进行酶切鉴定，并对该质粒进行序列测定，鉴定结果证实构建正确(图2)。
(3)重组质粒pBACsurf-3M2e-LTB和pBACsurf-3M2e的构建与鉴定
以获得的重组质粒pMD18-T-3M2e-LTB为模板，分别利用引物P5/P6和P7/P8扩增3M2e-LTB和3M2e基因，并在上、下游引物中分别引入PstⅠ和KpnI位点，引物序列如下：
P5:5’-GCGCTGCAGATGACGGCAAGTGGACGATT-3’
P6:5’-GGTGGTACCCTAGTTTTCCATACTGATT-3’
P7:5’-GCGCTGCAGATGACGGCAAGTGGACGATT-3’
P8:5’-GGTGGTACCGGAGCCCCCACCACCC-3’
引物P5/P6和P7/P8扩增条件为：：94℃变性5min后进入循环；循环参数为：94℃50s，56℃50s，72℃1min；30个循环后72℃延伸10min。将PCR产物回收并用PstⅠ和KpnI双酶切后，纯化回收后-20℃保存备用。含双KpnI位点的载体pBACsurf-LTB先进行PstI单酶切处理，回收后再进行KpnI单酶切处理，回收载体片段，然后将3M2e-LTB和3M2e基因分别亚克隆到回收的载体中，转化E.coliDH5a感受态细胞，获得重组转移载体pBACsurf-3M2e-LTB和pBACsurf-3M2e。用PstI和KpnI双酶切对其进行大小鉴定，并对该质粒进行序列测定，鉴定结果证实构建正确(图3)。
(4)重组质粒pcDNA3.1-GP64-3M2e-LTB和pcDNA3.1-GP64-3M2e的构建与鉴定
分别以重组质粒pBACsurf-GP64-3M2e-LTB和pBACsurf-GP64-3M2e为模板，利用引物P9,P10扩增GP64SP-3M2e-LTB-GP64MD和GP64SP-3M2e-GP64MD基因，并分别在上、下游引物中引入NheⅠ和HindIII位点，引物序列如下：
P9：5’-CTAGCTAGCATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATG-3’
P10：5’-CCCAAGCTTTTAATATTGTCTATTACGGTT-3’
引物P9/P10的扩增条件均为：94℃变性5min后进入循环；循环参数为：94℃50s，56℃50s，72℃2.5min；30个循环后72℃延伸10min。将PCR产物回收并用NheⅠ和HindIII双酶切后，分别***到载体pcDNA3.1(+)的NheⅠ和HindIII位点，转化E.coliDH5a感受态细胞，获得载体pcDNA-GP64-3M2e-LTB和pcDNA-GP64-3M2e。用NheⅠ和HindIII对获得的质粒进行酶切鉴定，并对该质粒进行序列测定，鉴定结果证实构建正确(图4)。
(5)重组质粒pFast-G-CMV-GP64-3M2e-LTB和pFast-G-CMV-GP64-3M2e的构建与鉴定
分别以重组质粒pcDNA-GP64-3M2e-LTB和pcDNA-GP64-3M2e为模板，利用引物P11,P12扩增CMV-GP64SP-3M2e-LTB-GP64MD和CMV-GP64SP-3M2e-GP64MD基因，并分别在上、下游引物中引入SalⅠ和HindIII位点，引物序列如下：
P11：5’-ACGCGTCGACGTTGACATTGATTATTGACTAGTT-3’
P12：5’-CCCAAGCTTTTAATATTGTCTATTACGGTT-3’
引物P11/P12的扩增条件均为：94℃变性5min后进入循环；循环参数为：94℃50s，56℃50s，72℃3min；30个循环后72℃延伸10min。将PCR产物回收并用SalⅠ和HindIII双酶切后，分别***到载体pFastBacTMDual-VSV-G的SalⅠ和HindIII位点，转化E.coliDH5a感受态细胞，获得载体pFast-G-CMV-GP64-3M2e-LTB和pFast-G-CMV-GP64-3M2e。用SalⅠ和HindIII对质粒进行酶切鉴定，并对该质粒进行序列测定，鉴定结果证实构建正确(图5)。
(6)重组杆状病毒质粒Bacmid-G-3M2e-LTB和Bacmid-G-3M2e的构建与鉴定
分别将重组供体质粒pFast-G-CMV-GP64-3M2e-LTB和pFast-G-CMV-GP64-3M2e转化DH10Bac大肠杆菌，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-G-3M2e-LTB和Bacmid-G-3M2e。运用PCR方法对其进行鉴定，以M13为引物，按照Invitrogen公司Bac-to-Bac杆状病毒操作手册进行鉴定，鉴定结果证实构建正确(图6)。
实施例2：重组杆状病毒的获得与鉴定
(1)重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e的获得与初步鉴定
利用脂质体介导转染法，将重组杆状病毒质粒Bacmid-G-3M2e-LTB和Bacmid-G-3M2e转染sf9昆虫细胞，于27℃培养。培养至72h时，细胞出现病变，主要表现为细胞变大、变圆、细胞间出现膜融合，正常细胞则没有这种变化(图7)。收集细胞培养上清，即可获得第一代重组杆状病毒(P1)BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e。
转染后72h，每孔用PBS洗3次，4％多聚甲醛室温固定15min，PBS洗3次。在对应的细胞孔分别加入鼠抗流感病毒M2单克隆抗体(14C2)和鼠抗霍乱毒素(CT)单克隆抗体为一抗，37℃作用30min，PBS洗3次。加入FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，37℃作用30min，PBS洗3次。在倒置荧光显微镜下观察转染细胞的荧光并照相。重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e转染的sf9细胞能产生特异性免疫荧光(图8)，说明外源基因已经导入重组杆状病毒，并能在PH启动子的诱导下进行表达。
(2)BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e转导哺乳动物细胞及其表达能力鉴定
转导前1d，将形态良好的PK15细胞以1×105个/孔的量接入6孔细胞培养板，在37℃培养箱中培养，待细胞长至70％～80％单层，去除培养基，用含钙、镁离子的PBS洗细胞。将重组杆状病毒与PBS按照1﹕4的比例混和后(总体积为1mL)，将此病毒感染液加入到PK15细胞中，室温摇床上转导6小时。然后弃去感染液，用PBS洗一遍，加入2mL的细胞维持液，37℃培养。48小时后按照6的方法进行间接免疫荧光试验。重组病毒BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e转染的PK15细胞能产生特异性免疫荧光(图9)，说明重组杆状病毒能够转导PK15细胞，并在CMV启动子的作用下表达外源蛋白。
(3)重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e的免疫电镜分析
使用蔗糖密度梯度离心法对重组杆状病毒进行超离浓缩。具体操作如下：收集病毒液，35,000rpm4℃离心2h,用1mlPBS重悬沉淀。然后使用10-60％(w/v)的蔗糖，35,000rpm4℃离心2h，用1mlPBS重悬病毒。35,000rpm4℃离心2h，最后沉淀用1mlPBS重悬，分装后-80℃保存备用。
免疫电镜方法如下：取纯化的重组杆状病毒15ul滴在EP手套上，将镍网贴在液滴上，室温避光吸附1h。同时设置杆状病毒野毒对照组。吸附完成后，用滤纸在网缘将多余液体吸干，取10ul14C2单抗(1:1000稀释)与镍网进行孵育，室温静置1h。用PBS洗2次，用滤纸吸干多余液体，取10ul胶体金标记的二抗(1:25)与镍网进行孵育，室温静置1h。用PBS洗3次，滤纸吸干多余液体。最后将镍网贴在4％磷钨酸液滴上负染1min，室温干燥后，电镜观察，照相。
电镜结果显示，金标颗粒结合到重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e的囊膜上(图10)，说明在重组杆状病毒囊膜上展示了外源蛋白。
实施例3：重组杆状病毒的免疫原性分析
(1)重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e基因工程疫苗的制备
用Clontech公司的杆状病毒快速滴定试剂盒对10中所述经过超离浓缩的杆状病毒进行滴度测定，调整病毒的滴度为2×1010pfu/mL，用于动物试验或置于-80℃保存备用。
(2)免疫程序
5周龄的SPF雌性BALB/c小鼠随机分为4个免疫组，每组10只小鼠，每组免疫两次，间隔三周，免疫方式为小鼠滴鼻免疫。分组情况和免疫情况为：第一组为重组杆状病毒组BV-Dual-3M2e-LTB，第二组为BV-Dual-3M2e，第三组为杆状病毒野毒(AcMNPV-WT)对照组，第四组为PBS空白对照组。杆状病毒组免疫剂量为50ul/只(109pfu/只)，PBS免疫剂量为100μL/只。在二免后三周，每组随机麻醉处死3只小鼠，采集支气管肺泡灌洗液(BronchialAlveolarLavageFluid，BALF)，并分离脾脏淋巴细胞。
(3)免疫后小鼠粘膜IgA抗体水平的检测
采用endpointELISA方法测定BALF中IgA抗体水平，具体操作如下：将
人工合成的M2e
多肽稀释至5ug/ml，100ul/孔包被酶标板，置4℃过夜；取出酶标板，甩干，用洗涤液洗3次(3min/次)，最后一次在吸水纸上扣干；每孔加封闭液150ul，37℃保湿封闭30min，洗涤同上；用封闭液将BALF进行2倍梯度稀释，100ul/孔，每个稀释度重复3孔；设置封闭液空白对照孔，37℃保湿孵育2h，洗涤同上；用封闭液将HRP标记的兔抗鼠IgA适当稀释，100ul/孔，37℃保湿孵育30min，洗涤同上；加入新鲜TMB显色液100ul/孔，室温避光静置15min；最后加入终止液100ul/孔终止反应，置室温5min，用酶标仪在450nm波长下测定OD值；结果判定：试验组与对照组OD值比值大于或等于2.1的血清最高稀释倍数即为该血清的效价。
免疫组BV-Dual-3M2e-LTB和BV-Dual-3M2e可检测到特异性的IgA抗体。免疫组BV-Dual-3M2e-LTB的抗体水平极显著高于BV-Dual-3M2e组(P<0.001)。结果如图11。
(4)免疫后小鼠脾脏T细胞细胞亚群检测
取制备好的脾脏T淋巴细胞悬液平均分配到A、B2个1.5mlEP管中，250g离心10min收集细胞，并用500ulPBS洗涤2次，然后用200ulPBS重悬细胞；A管进行抗体三标：anti-mouseCD4、anti-mouseCD8、anti-mouseCD3，B管用作阴性对照，置4℃避光孵育30min；4℃，250g离心5min，收集细胞，再用300ulPBS洗涤细胞2次；最后用300ulPBS重悬细胞，流式细胞仪上样检测，分别得到CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞数量，并进行统计学分析。
免疫组BV-Dual-3M2e-LTB的CD3+CD8+T细胞水平显著高于BV-Dual-3M2e组，其CD3+CD4+T细胞水平显著高于AcMNPV-WT组。结果如图12。
实施例4：重组杆状病毒对小鼠攻毒保护试验研究
(1)小鼠攻毒保护试验
分别将每个免疫组剩余小鼠分为四个攻毒组，每组10只小鼠，分别选取四株不同分支的H5N1禽流感病毒进行攻毒保护试验。这些病毒均能致死小鼠，毒株选择如下：DK/GD/383/08(clade2.3.2.1)，CK/GD/348/08(clade2.3.4)，GD/73/02(clade4)，CK/ZH/88(clade1)。小鼠麻醉后，滴鼻攻毒50ul/只，攻毒剂量10MLD50/只。
(2)攻毒后小鼠肺脏病毒滴度的检测
在攻毒后第5d，各组随机挑选3只小鼠；小鼠安乐死后，无菌采集肺脏，加入1mL无菌含双抗的PBS溶液研磨，然后移入1.5mL离心管中，4℃12000r/min离心5min，取上清；上清液用无菌含双抗的PBS10倍梯度稀释(10-1-10-10)，每个稀释度接种3枚9～11日龄非免疫鸡胚，37℃孵化48h；收获鸡胚尿囊液，测定血凝活性，按Reed-Muench方法计算病毒在小鼠肺脏复制的滴度(单位Log10EID50/ml)。
分别用四株病毒攻毒后，小鼠肺脏病毒滴度表现出相似的变化。其中BV-Dual-3M2e-LTB组的肺脏病毒滴度显著低于BV-Dual-3M2e组和对照组。AcMNPV-WT组肺脏病毒滴度低于PBS对照组。BV-Dual-3M2e和AcMNPV-WT组之间无显著差异。结果如图13。
(3)攻毒后小鼠的体重变化
攻毒前称量每组小鼠平均体重，攻毒后每天记录小鼠体重变化，体重损失超过25％的小鼠判定死亡，并进行安乐死。分别用四株病毒攻毒，所有试验组在攻毒后第2-3天体重开始下降，所有杆状病毒免疫组在攻毒后第8-11天体重开始恢复，而PBS对照组体重持续下降，并且在攻毒后第10-12天全部死亡。结果如图14。
(4)攻毒后小鼠的存活率
分别用四株病毒攻毒后，BV-Dual-3M2e-LTB免疫组保护率高于BV-Dual-3M2e免疫组。BV-Dual-3M2e-LTB免疫组的保护率如下：CK/ZH/88攻毒，小鼠获得了70％的保护；GD/73/02攻毒，小鼠获得80％的保护；CK/GD/348/08攻毒，小鼠获得80％的保护；GD/383/08攻毒，小鼠获得50％的保护。BV-Dual-3M2e免疫组的保护率如下：CK/ZH/88攻毒，小鼠获得了30％的保护；GD/73/02攻毒，小鼠获得50％的保护；CK/GD/348/08攻毒，小鼠获得40％的保护；GD/383/08攻毒，小鼠全部死亡。此外，AcMNPV-WT免疫组同样有一部分小鼠获得了保护，保护率如下：CK/ZH/88攻毒，小鼠获得了10％的保护；GD/73/02攻毒，小鼠获得10％的保护；CK/GD/348/08攻毒，小鼠获得20％的保护；GD/383/08攻毒，小鼠全部死亡。PBS对照组小鼠全部死亡。结果如图15。
上述所有实验结果表明：(1)BV-Dual-3M2e-LTB经滴鼻途径免疫小鼠后，能诱导粘膜IgA抗体的产生以及脾脏CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞水平的上升，且抗体和T细胞水平显著高于BV-Dual-3M2e组；(2)用不同分支毒株进行攻毒后，与BV-Dual-3M2e相比，BV-Dual-3M2e-LTB能更好地抑制病毒在小鼠肺脏的复制，帮助小鼠恢复体重，并可提供不同程度(50％-80％)的交叉保护。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗，其特征在于：包括重组修饰的昆虫杆状病毒，所述的昆虫杆状病毒表面展示有禽流感病毒保守抗原分子和粘膜佐剂分子的融合蛋白，并能够表达禽流感病毒保守抗原分子和粘膜佐剂分子的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗，其特征在于：所述的禽流感病毒保守抗原分子包括禽流感病毒基质蛋白M2胞外域24个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；
所述的禽流感病毒基质蛋白M2胞外域24个氨基酸残基为具有三个拷贝的串联重复。
3.根据权利要求2所述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗，其特征在于：所述的禽流感病毒保守抗原分子还包括柔性连接分子，所述的柔性连接分子实现对三个重复的禽流感病毒基质蛋白M2胞外域24个氨基酸残基的连接，所述的柔性连接分子的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
4.根据权利要求1所述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗，其特征在于：所述的禽流感病毒保守抗原分子的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
5.根据权利要求1所述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗，其特征在于：所述粘膜佐剂分子为大肠杆菌热不稳定肠毒素的B亚单位，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
6.根据权利要求1所述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗，其特征在于：所述的重组修饰的昆虫杆状病毒的基因组中***双启动子基因盒，所述双启动子基因盒自上游至下游包括如下组件：多角体蛋白PH启动子，人巨细胞病毒CMV启动子，杆状病毒自身的囊膜糖蛋白GP64的信号肽编码基因，3个拷贝的M2e编码基因，LTB编码基因，杆状病毒自身的囊膜糖蛋白GP64的跨膜区和胞内区的编码基因。
7.根据权利要求1所述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗，其特征在于：所述的重组修饰的昆虫杆状病毒的构建时所用的出发载体为pFastBacDual-VSV-G，所述出发载体的p10启动子下游含有水泡口炎病毒的G蛋白的编码基因；
所述的杆状病毒为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒。
8.权利要求1～7任一项所述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：首先通过人工合成3个拷贝的M2e核苷酸序列，然后构建3个拷贝的M2e核苷酸序列和LTB的融合基因，并将融合基因***到杆状病毒展示质粒pBACsurf-1中的GP64信号肽与成熟蛋白之间，构建重组质粒pBACsurf-3M2e-LTB，再将GP64SP-3M2e-LTB-GP64MD基因片段***pcDNA3.1(+)的CMV启动子后，获得重组质粒pcDNA-GP64-3M2e-LTB；然后将包含CMV-GP64SP-3M2e-LTB-GP64MD的基因片段***到Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达***的pFastBacDual-VSV-G转移质粒的PH启动子下游，构建重组转移质粒pFast-G-CMV-GP64-3M2e-LTB；将重组转移质粒转化DH10Bac大肠杆菌，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-G-3M2e-LTB；最后用脂质体法将Bacmid-G-3M2e-LTB转染sf9昆虫细胞从而获得重组杆状病毒BV-Dual-3M2e-LTB，即获得以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗。
9.权利要求1～7任一项所述的以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗在制备禽流感广谱疫苗中的应用，其特征在于：所述的禽流感广谱疫苗为滴鼻施用的禽流感广谱疫苗。
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