CN109731100A - 基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗及制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程及病毒疫苗技术领域，具体涉及一种基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗及制备与应用。本发明选择H7N9和/或H5N1亚型禽流感病毒流行毒株的HA基因作为靶抗原，使用MultiBac杆状病毒表达***快速高效表达H7N9和H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白，进一步制备得到禽流感疫苗，该疫苗克服了现有流感灭活疫苗在生产及灭活过程中存在散毒风险的问题，提供了一种防控H7N9和H5N1禽流感病毒流行传播的候选疫苗。

Description

基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗及制备与应用

技术领域

本发明涉及生物工程及病毒疫苗技术领域，具体涉及一种基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗及制备与应用。

背景技术

目前禽流感病毒防控主要以预防为主，当前使用最广泛的是多价灭活禽流感疫苗。当前禽流感灭活疫苗主要以鸡胚生产为主，在生产和灭活病毒过程中容易造成病毒扩散，引起生物安全问题，因此开发一种更加安全、快速、有效的候选疫苗迫在眉睫。基因工程疫苗因其安全、快速、有效的特性引起人们的重视，成为开发禽流感候选疫苗的热点。禽流感病毒的血凝素(hemagglutinin，HA)基因表达的HA蛋白是其最重要的靶抗原，并且HA基因在同一亚型的禽流感病毒中核苷酸同源性较高，所以大多数基因工程疫苗开发主要以HA基因为主，生产特异性禽流感疫苗。

杆状病毒表达载体***是基因工程疫苗开发的热门，作为一种真核表达***，其表达的外源基因产物和天然产物具有相似的生物学活性，具有极高的应用价值。MultiBac杆状病毒表达***因其能将多种外源基因同时***到杆状病毒基因组中的特性引起人们的重视，通过该***同时表达多种外源基因，对于开发多价禽流感疫苗具有重要应用价值。并且通过该***表达的外源蛋白生物活性好，具有多种应用价值。

因此本发明基于现有流感疫苗存在的弊端，旨在开发一种基于杆状病毒表达载体***的禽流感基因工程疫苗，以其安全、快速、有效的特性防控H7N9和H5N1亚型禽流感病毒的流行。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗。

本发明的另一目的在于提供上述基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗的制备方法，该方法选择H7N9和/或H5N1亚型禽流感病毒流行毒株的HA基因作为靶抗原，使用MultiBac杆状病毒表达***分别表达H7N9和H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白，进一步制备得到禽流感疫苗。

本发明的再一目的在于提供上述基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗，包含可溶性HA蛋白(hemagglutinin，HA)，该可溶性HA蛋白由能够表达禽流感病毒HA蛋白的重组修饰的杆状病毒表达；

所述的禽流感病毒为H7N9亚型禽流感病毒和H5N1亚型禽流感病毒中的至少一种；

所述的H7N9亚型禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

编码上述H7N9亚型禽流感病毒的HA蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

编码上述H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的重组修饰的杆状病毒的基因组中v-cath基因和chiA基因被破坏失去功能作用并且在基因组中***了单启动子基因盒；

所述的单启动子基因盒自上游至下游包括如下组件：多角体蛋白(Polyhedron，PH)启动子和编码禽流感病毒的HA蛋白的基因；

用于构建上述重组修饰的杆状病毒的出发载体为pACEBac1；

所述的可溶性HA蛋白由MultiBac杆状病毒表达***表达；

所述的杆状病毒优选为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)；

所述的重组修饰的杆状病毒的制备方法，优选包含如下步骤：

将禽流感病毒的HA基因***到转递质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染昆虫细胞，在昆虫细胞内包装，得到重组修饰的杆状病毒；

所述的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗的制备方法，包含如下步骤：

(1)提取禽流感病毒的基因组，将其反转为cDNA；设计引物，以禽流感病毒cDNA为模板，扩增得到HA基因；将HA基因***到转递质粒pACEBac1的PH启动子后面，得到重组转递质粒；将重组转移质粒转化DH10MultiBac大肠杆菌，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒；最后用脂质体法分别将重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，得到重组杆状病毒；

(2)将P1代重组杆状病毒(转染后收取的第一代重组杆状病毒)以MOI＝0.1感染细胞密度为1.5×10⁶cell/ml的sf9细胞，27℃悬浮培养72h后收取细胞培养上清即为P2代重组杆状病毒，将P2代重组杆状病毒以MOI＝1感染细胞密度为2.5×10⁶cell/ml的sf9细胞，27℃悬浮培养96h后收集细胞，经超声波处理，得到可溶性HA蛋白；

(3)将可溶性HA蛋白与佐剂混合，得到基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗；

步骤(3)中所述的佐剂优选为SEPPIC MONTANIDETM ISA 201VG；

步骤(3)中所述的可溶性HA蛋白来自H7N9亚型禽流感病毒时，可溶性HA蛋白的血凝效价为2¹⁰～2¹⁴，与佐剂按照体积比1:1的比例混合；

步骤(3)中所述的可溶性HA蛋白来自H5N1亚型禽流感病毒时，可溶性HA蛋白的血凝效价优选为2¹⁰～2¹⁴，与佐剂按照体积比1:1的比例混合；

所述的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗在制备预防禽流感产品中的应用；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供了一种基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗，其中，MultiBac杆状病毒表达***包含多种转递质粒，可方便***多个外源基因，有制备多价流感疫苗的潜力；并且该***包含的杆状病毒基因组中破坏了v-cath和chiA基因的功能作用，更有利于外源基因的大量表达。由于外源基因是真核表达，保持了和天然产物相似的生物活性，具有极高的应用价值。

(2)本发明提供的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗的制备方法与现有技术不同，是将合适血凝效价的HA蛋白与佐剂混合，这就使得疫苗得以快速制备，具备省时省力的优点。

(3)本发明利用MultiBac杆状病毒表达***快速表达禽流感流行毒株的HA蛋白，并使用表达的高生物活性HA蛋白制备禽流感基因工程疫苗，在SPF鸡免疫攻毒实验中评估该疫苗的保护效力，有利于防控禽流感病毒的流行传播。

(4)本发明实施例中利用摇瓶悬浮培养昆虫细胞的方式表达HA蛋白，摇瓶培养20ml细胞量即能获得HA效价≥2¹⁶的蛋白液，所得HA蛋白具有表达量高及生物活性好的特点，日后可利用发酵罐等方式大量表达HA蛋白，能极大地降低疫苗成本。

(5)本发明提供的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗具有免疫原性好和安全可靠的特点。通过实验证实，该禽流感疫苗的具体优点如下：①该流感疫苗安全可靠，经皮下注射方式免疫SPF鸡后，疫苗吸收快，并且注射部位无病变现象。②以HA效价为2¹⁴和2¹⁰的蛋白液制备成高低剂量组的禽流感疫苗，实验结果表明高低剂量组疫苗取得相似的免疫效果，低剂量组禽流感疫苗即能保护实验鸡免受同源禽流感病毒的攻击。③SPF鸡免疫后攻毒实验结果表明：免疫H7N9禽流感疫苗后，实验鸡几乎无排毒，并且14天内无任何发病现象，体重增加明显，单次免疫高低剂量的H7N9疫苗均获得100％的保护率；免疫H5N1禽流感疫苗后，实验鸡虽有几天排毒，但14天内无发病现象，体重增加明显，单次免疫高低剂量的H5N1疫苗均获得89％的保护率。

附图说明

图1是重组质粒pACE-HA7的鉴定结果图；其中，M：DNA Marker(DL5000Marker)，1：以质粒pACE-HA7为模板扩增HA片段，2：以ddH₂O为模板的阴性对照，3：saII、Not I双酶切质粒pACE-HA7获得的DNA片段。

图2是重组质粒pACE-HA5的鉴定结果图；其中，M：DNA Marker(DL5000Marker)，1：以质粒pACE-HA5为模板扩增HA片段，2：以ddH₂O为模板的阴性对照，3：saII、Xba I双酶切质粒pACE-HA7获得的DNA片段。

图3是重组杆状病毒Bacmid-HA7和Bacmid-HA5的鉴定结果图；其中，A：M13引物鉴定Bacmid-HA7质粒，B：M13引物鉴定Bacmid-HA5质粒。

图4是H7N9亚型禽流感HA蛋白经Western Blot实验鉴定结果图；其中，M：proteinmaker(大小170Kda)，1，3：P2代Bv-HA7感染细胞处理后上清，2，4：P2代Bv-HA7感染细胞处理后沉淀，5：全细胞处理后对照(mock)。

图5是H5N1亚型禽流感HA蛋白经Western Blot实验鉴定结果图；其中，M：proteinmaker(大小170Kda)，1，3：P2代Bv-HA5感染细胞处理后上清，2，4：P2代Bv-HA5感染细胞处理后沉淀，5为全细胞处理后对照(mock)。

图6是H7N9疫苗组免疫SPF鸡后HI水平结果分析图。

图7是H5N1疫苗组免疫SPF鸡后HI水平结果分析图。

图8是攻毒后鸡的存活率结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中的试验材料，若无特别说明，均是来源于商业途径。所述的试验方法，若无特别说明，均为常规试验方法。

实施例1重组杆状病毒质粒(Bacmid)的构建与鉴定

(1)H7N9和H5N1亚型禽流感病毒基因组RNA的提取：

本实验中使用的H7亚型禽流感病毒H7N9(E157)和H5亚型禽流感病毒H5N1以及由其制备的阳性血清均由华南农业大学***共患病防控制剂国家地方联合工程实验室提供。将含有禽流感病毒的鸡胚尿囊液12000r/min离心5min，取上清液500μL到DEPC处理过的Eppendorf管中提取RNA；

①加入500μL Trizol LS Reagent，剧烈震荡后室温放置10min，加入200μL氯仿，充分混合，待乳化溶液呈乳白状后，室温静置10min后离心(13000rpm，15min，4℃)；

②取600μL上层水相移至另一新的DEPC处理过的1.5mL灭菌Eppendorf管；

③向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min离心(13000rpm，15min，4℃)；

④弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入预冷的1mL体积分数为75％的乙醇溶液，缓慢颠倒混匀，离心(8000rpm，5min，4℃)，弃去上清液；

⑤在超净工作台内风干后，加入适量的DEPC处理水溶解RNA，待完全溶解，-70℃保存或直接用于反转录；

⑥取少量RNA溶液检测浓度。

(2)RNA反转录合成cDNA

RT反应体系(20μL)如下：向0.2mL离心管加入10μL模板及2μL引物，72℃水浴10min后，按照TaKaRa公司反转录酶试剂盒的说明书进行反转录，即在20μL的PCR体系中加入以下各组分：4μL 5×Buffer、2μL dNTPMix、1μL M-MLVRT、0.5μL Recombinant RNase，42℃水浴1h。

根据流感病毒H7N9(E157)和H5N1血凝素HA核苷酸序列，分别设计两对引物，P1、P2和P3、P4。其中在P1、P2上下游引入Sal I、Not I酶切位点，并且下游引物中引入6×HIS标签，引物序列如下：

P1：5’-ACGCGTCGACATGAACACTCAAATCCTGGTATTCGCTC-3’；

P2：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTATACAA ATAGTGCACCGCATGTT-3’；

引物P1/P2的扩增条件为：循环参数为：98℃，10s，60℃，5s，72℃，2min；30个循环后72℃终延伸2min。将PCR产物回收并用Sal I和Not I双酶切后，***到转移质粒pACEBac1的Sal I和Not I位点，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，获得载体pACE-HA7。用PCR扩增目的基因和酶切鉴定的方式对重组质粒进行鉴定，并对该质粒进行测序，结果正确(图1)。

而引物P3、P4在上下游引入Sal I、Xba I酶切位点，并且下游引物引入6×HIS标签，引物序列如下：

P3：5’-ACGCGTCGAC ATGGAGAAAATAGTGCTTCTCTTTG-3’；

P4：5’-GCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGAATGCAAATTCTGCA CTGCAAC-3’；

引物P3/P4的扩增条件为：循环参数为：98℃，10s，60℃，5s，72℃，2min；30个循环后72℃终延伸2min。将PCR产物回收并用Sal I和Xba I双酶切后，***到转移质粒pACEBac1的Sal I和Xba I位点，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，获得载体pACE-HA5。用PCR扩增目的基因和酶切鉴定的方式对重组质粒进行鉴定，并对该质粒进行测序，结果正确(图2)。

H7N9(E157)亚型禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列：

MNTQILVFALIAIIPTNADKICLGHHAVSNGIKVNTLTEKGVEVVNATETVERTNTPRICSKGKRTVDLGQCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKESMGLTYNGIRTNGVTSACRRSGSSFYAEMKWLLSNTDNAAFPQMTKSYKNTRESPAIIVWGIHHSVSTAEQTKLYGSGNKLVTVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGQSGRIDFHWLILNPNDTVTFSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSGVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNIDSRAVGKCPRYVKQRSLLLATGMKNVPEVPKGKRTARGLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIAKTNQQFKLIDNEFNEVEKQIGNVINWTRDSITEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMASIRNNTYDHRKYREEAMQNRIQIDPVKLSSGYKDVILWFSFGASCFILLAIVMGLVFICVKNGNMRCTICI.

编码H7N9(E157)亚型禽流感病毒的HA蛋白的基因的核苷酸序列：

ATGAACACTCAAATCCTGGTATTCGCTCTGATTGCGATCATTCCAACAAATGCAGACAAAATCTGCCTCGGACATCATGCCGTGTCAAACGGAATCAAAGTAAACACATTAACTGAAAAAGGAGTGGAAGTCGTCAATGCAACTGAAACAGTGGAACGAACAAACACCCCCAGGATCTGCTCAAAAGGGAAAAGGACAGTTGATCTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGGACCACCTCAATGTGACCAATTCCTAGAATTTTCGGCCGATTTAATTATTGAGAGGCGAGAAGGAAGTGATGTCTGTTATCCTGGAAAATTCGTGAATGAAGAAGCTCTGAGGCAAATTCTCAGAGAATCAGGCGGAATTGACAAGGAATCCATGGGACTCACATACAATGGAATAAGAACTAATGGGGTGACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAAATGAAATGGCTCCTGTCAAACACAGATAATGCTGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAAAAATACAAGAGAAAGCCCAGCTATAATAGTATGGGGGATCCATCATTCCGTTTCAACTGCAGAGCAAACCAAGCTATATGGGAGTGGAAACAAACTGGTGACAGTTGGGAGTTCTAATTATCAACAATCTTTCGTACCGAGTCCAGGAGCAAGACCACAAGTTAATGGTCAATCTGGAAGAATTGACTTTCATTGGCTAATACTAAATCCCAATGATACAGTCACTTTCAGTTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAGACCGTGCAAGCTTCCTGAGAGGAAAATCTATGGGAATCCAGAGTGGAGTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGGACTGCTATCATAGTGGAGGGACAATAATAAGTAACTTGCCATTTCAGAACATAGATAGCAGGGCAGTTGGAAAATGTCCGAGATATGTTAAGCAAAGGAGTCTTCTGCTGGCAACAGGGATGAAGAATGTTCCTGAGGTTCCAAAGGGAAAACGGACTGCGAGAGGCCTATTTGGTGCTATAGCGGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGGCCTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCAGACACCAGAATGCACAGGGAGAGGGAACTGCTGCAGATTACAAAAGCACTCAATCGGCAATTGATCAAATAACAGGGAAATTAAATCGGCTTATAGCAAAAACCAACCAACAATTTAAGTTGATAGACAATGAATTCAATGAGGTAGAGAAGCAAATCGGTAATGTGATAAATTGGACCAGAGATTCTATAACAGAAGTATGGTCATACAATGCTGAACTCTTGGTGGCAATGGAGAACCAGCATACAATTGATCTGGCTGATTCAGAAATGGACAAACTGTACGAACGAGTGAAAAGACAGCTGAGAGAGAATGCTGAAGAAGATGGCACGGGTTGCTTTGAAATATTTCACAAGTGTGATGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGATCACAGAAAATACAGAGAGGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGTAATGGGCCTTGTCTTCATATGTGTGAAGAATGGAAACATGCGGTGCACTATTTGTATATAA

H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列：

MEKIVLLFATISLAKSDHICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLNGVKPLILKDCSVAGWLLGNPWCDEFINVPEWSYIVEKANPVNGLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKDSWSDHEASKGVSAACSYQGKSSFFRNVVWLIKKNDTYPTIKKDYNNTNREDLLVLWGIHHPNDKAEQITLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKINGQSGRIDFFWTILKPNDAIHFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMRSEVEYGNCNTRCQTPVGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPQRERRRKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLKDNAKELGNGCFEFYHKCNNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGVYQILSIYSTVASSLVLAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI.

编码H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白的核苷酸序列：

ATGGAGAAAATAGTGCTTCTCTTTGCAACAATCAGTCTTGCTAAAAGCGATCATATTTGCATTGGATATCATGCAAATAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTTTGCGATCTAAATGGGGTGAAGCCTCTGATTTTAAAAGATTGTAGTGTAGCAGGATGGCTACTCGGAAACCCATGGTGTGACGAATTCATCAATGTACCAGAATGGTCTTACATAGTAGAGAAGGCCAATCCAGTCAATGGCCTCTGTTACCCAGGGAATTTCAACGATTATGAAGAATTGAAACACCTATTGAGCAGGATAAACCATTTTGAGAAAATACAGATCATCCCCAAAGATTCTTGGTCAGATCACGAAGCCTCAAAGGGGGTGAGCGCAGCATGTTCATACCAGGGAAAGTCCTCCTTCTTCAGAAATGTAGTATGGCTTATCAAAAAGAACGATACATATCCAACAATAAAGAAAGATTACAATAATACCAACCGAGAAGATCTCTTGGTACTTTGGGGGATCCACCATCCTAATGATAAAGCAGAGCAAATAACGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCATTGGGACGTCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAAAATAGCCACTAGATCCAAAATAAACGGGCAAAGTGGCAGGATAGATTTCTTCTGGACAATTTTAAAACCGAATGATGCAATCCACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGAGACTCCACAATTATGAGAAGTGAAGTGGAATATGGTAACTGCAACACCAGGTGTCAGACTCCGGTAGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCATAACATACACCCCCTCACCATCGGAGAATGTCCCAAATATGTGAAATCGAACAAATTAGTCCTTGCGACTGGACTCAGAAATAGTCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTCATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCACAGCAATGAGCAGGGGAGTGGATACGCTGCAGACAAAGAATCTACTCAAAAGGCAATAGACGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTAGGAAGGGAATTTAATAACTTAGAGAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGATTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAAAGAACTTTAGACTTCCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGATAAGGTCAGACTACAGCTTAAGGATAATGCAAAAGAGCTGGGCAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTAATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCAAGATTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAGTCAATAGGAGTCTACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGTGCTGGCAATCATGATGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGTTCCAACGGGTCGTTGCAGTGCAGAATTTGCATTTAA

(3)重组杆状病毒质粒Bacmid-HA5和Bacmid-HA7的获得与鉴定

分别将供体质粒pACE-HA5和pACE-HA7转化DH10MultiBac大肠杆菌感受态细胞，通过转座重组，分别获得重组杆状病毒质粒Bacmid-HA5和Bacmid-HA7，按照Invitrogen公司昆虫杆状病毒操作手册，用M13引物扩增片段对其鉴定，结果正确(图3)。

实施例2重组杆状病毒BV-HA5和BV-HA7的获得

利用脂质体介导转染法，分别将重组杆状病毒质粒Bacmid-HA5和Bacmid-HA7转染sf9昆虫细胞，于27℃培养；培养至72h时，细胞出现病变，收集细胞培养上清，即分别获得第一代重组杆状病毒(P1)BV-HA5和BV-HA7。

实施例3H5N1和H7N9亚型流感病毒HA蛋白的获得与鉴定

本发明以重组杆状病毒感染sf9细胞，通过摇瓶悬浮培养的方式表达HA蛋白，具体操作步骤如下：(1)重组杆状病毒传代：细胞经克氏瓶静止培养复苏后，以传代后细胞密度不低于2.5×10⁵cell/ml的接种量逐步放大到250ml摇瓶，摇瓶装液体积为50ml，待细胞密度在1.5×10⁶cell/ml左右时，将P1代重组杆状病毒以MOI＝0.1接种sf9细胞，培养温度为27℃，摇床转速为100～120rpm/min，培养基为sf-900TM II SFM，感染细胞72h后收取细胞上清液并用0.22um的滤器过滤，所得滤液即为第二代重组杆状病毒(P2代)。

(2)重组蛋白表达，具体操作步骤如下：

将P2代重组杆状病毒以MOI＝1接种细胞密度为2.5×10⁶cell/ml的sf9细胞，100ml摇瓶装液体积为20ml，培养温度为27℃，摇床转速为100～120rpm/min，培养96h时收取细胞，将所得细胞沉淀使用PBS磷酸盐缓冲液重悬，将重悬后的细胞悬液使用超声波处理，处理条件为：工作时间3s，间歇时间5s，工作功率100～200w，破碎时间10～15min。经超声波处理后细胞悬液会变得澄清透亮，将处理后的细胞悬液以4℃，13000rpm/min离心8～10min取上清液，处理后的HA蛋白以可溶性蛋白形式存在以上清液中，蛋白液-80℃保存。经血凝实验鉴定：H7N9-HA蛋白液HA效价为2¹⁶，H5N1-HA蛋白液HA效价为2¹⁶。H7N9-HA蛋白经Western Blot实验鉴定正确(见图4)，H5N1-HA蛋白经Western Blot实验鉴定正确(见图5)。

实施例4免疫原性分析

(1)H5N1和H7N9亚型禽流感病毒基因工程疫苗的制备

将实施例3中超声波处理后的H7N9和H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白液进行血凝实验，根据血凝实验结果处理HA蛋白液，最终确定高剂量组蛋白液血凝效价为2¹⁴，低剂量组蛋白液血凝效价为2¹⁰，最后将高低剂量组蛋白液分别于SEPPIC MONTANIDETM ISA 201VG佐剂以体积比1:1的比例混合，最终分别得到H5和H7亚型高低剂量组的禽流感基因工程疫苗。

(2)免疫程序

2周龄SPF鸡随机分为5组并标记，每组10只，免疫分组：第一组为H7N9高剂量组疫苗(2¹⁴)，免疫方式为颈部皮下注射，免疫剂量为500μL/只；第二组为H7N9低剂量组疫苗(2¹⁰)，免疫方式为颈部皮下注射，免疫剂量为500μL/只；第三组为H5N1高剂量组疫苗(2¹⁴)，免疫方式为颈部皮下注射，免疫剂量为500μL/只；第四组为H5N1低剂量组疫苗(2¹⁰)，免疫方式为颈部皮下注射，免疫剂量为500μL/只；免疫后3周内翅静脉采血检测每周HI抗体。

(3)血清HI抗体检测结果

血凝板加入25μL PBS，取25μL血清连续倍比稀释，分别地H7N9疫苗组加入等量甲醛灭活的4单位同源抗原H7N9(E157)，H5N1疫苗组加入等量甲醛灭活的4单位同源抗原H5N1(本实验室分离保存)，混匀室温静置30分钟，加入等量1％(体积百分比)鸡红细胞，室温放置30分钟后观察结果，能完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度为被检血清的HI效价。

H7N9疫苗组在第二周时有抗体产生，在第三周时HI效价达到2⁶以上，H7N9高剂量疫苗组两周HI效价均较高于H7N9低剂量疫苗组，但两者差异不显著(见图6)，说明H7N9高低剂量组疫苗一免后即能使SPF鸡产生HI效价不低于2⁶的抗体水平。

H5N1疫苗组在第二周时抗体水平较低，在第三周时HI效价达到2⁴～2⁵，但H5N1高剂量疫苗组两周HI效价均较高于H5N1低剂量疫苗组，两者差异较显著(见图7)。

实施例5攻毒保护实验研究

(1)攻毒后拭子排毒检测

按照实施例4免疫程序进行免疫，免疫后3周，将PBS对照组随机分为2组，每组各5只SPF鸡；将H7N9高低剂量疫苗组和一组PBS对照组滴鼻攻毒10⁶EID50/200μL H7N9(E157)；将H5N1高低剂量疫苗组和一组PBS对照组滴鼻攻毒10⁶EID50/200μL H5N1；攻毒后3、5、7、9、11天采集口咽和泄殖腔拭子，按照常规方法进行病毒的分离和测定。

在攻毒后3天内，H7N9和H5N1对照组实验鸡均死亡。H7N9高剂量组在第3天和第5天各检测到1只鸡排毒，H7N9低剂量组仅在第3天检测到3只鸡排毒；H5N1高剂量组在第3天检测到7只鸡排毒和第5天检测到4只鸡排毒，在第7天检测到一只鸡排毒，并且这只鸡在第8天死亡；H5N1低剂量组在第3天检测到5只鸡排毒和第5天检测到2只鸡排毒，第5天死亡一只鸡(被同笼鸡啄死)，但口咽和泄殖腔拭子均检测到排毒，在此判定为病死。结果如表1。

表1SPF鸡攻毒后排毒情况统计

(2)攻毒后鸡的存活率

攻毒后连续14天观察鸡的死亡情况，H7N9对照组在攻毒后3天内全部死亡，H7N9高低剂量疫苗组均没有鸡死亡，保护率为100％，H5N1对照组在攻毒1天后全部死亡，H5N1疫苗组攻毒时各组仅剩9只SPF鸡，攻毒后各死亡1只，保护率为89％，如图8所示。

上述所有实验结果表明：1、H7N9和H5N1亚型基因工程疫苗仅免疫一次即能产生有效的抗体。2、H7N9高低剂量组疫苗免疫一次即能提供100％的保护抵抗同源H7N9禽流感病毒的攻击，H5N1高低剂量组疫苗免疫一次即能提供89％的保护抵抗同源H5N1禽流感病毒的攻击。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗及制备与应用

<130> 1

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 564

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> H7N9（E157）亚型禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列

<400> 1

Met Asn Thr Gln Ile Leu Val Phe Ala Leu Ile Ala Ile Ile Pro Thr

1 5 10 15

Asn Ala Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Ile

20 25 30

Lys Val Asn Thr Leu Thr Glu Lys Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr

35 40 45

Glu Thr Val Glu Arg Thr Asn Thr Pro Arg Ile Cys Ser Lys Gly Lys

50 55 60

Arg Thr Val Asp Leu Gly Gln Cys Gly Leu Leu Gly Thr Ile Thr Gly

65 70 75 80

Pro Pro Gln Cys Asp Gln Phe Leu Glu Phe Ser Ala Asp Leu Ile Ile

85 90 95

Glu Arg Arg Glu Gly Ser Asp Val Cys Tyr Pro Gly Lys Phe Val Asn

100 105 110

Glu Glu Ala Leu Arg Gln Ile Leu Arg Glu Ser Gly Gly Ile Asp Lys

115 120 125

Glu Ser Met Gly Leu Thr Tyr Asn Gly Ile Arg Thr Asn Gly Val Thr

130 135 140

Ser Ala Cys Arg Arg Ser Gly Ser Ser Phe Tyr Ala Glu Met Lys Trp

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asn Thr Asp Asn Ala Ala Phe Pro Gln Met Thr Lys Ser

165 170 175

Tyr Lys Asn Thr Arg Glu Ser Pro Ala Ile Ile Val Trp Gly Ile His

180 185 190

His Ser Val Ser Thr Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Asn

195 200 205

Lys Leu Val Thr Val Gly Ser Ser Asn Tyr Gln Gln Ser Phe Val Pro

210 215 220

Ser Pro Gly Ala Arg Pro Gln Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Ile Asp

225 230 235 240

Phe His Trp Leu Ile Leu Asn Pro Asn Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe

245 250 255

Asn Gly Ala Phe Ile Ala Pro Asp Arg Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys

260 265 270

Ser Met Gly Ile Gln Ser Gly Val Gln Val Asp Ala Asn Cys Glu Gly

275 280 285

Asp Cys Tyr His Ser Gly Gly Thr Ile Ile Ser Asn Leu Pro Phe Gln

290 295 300

Asn Ile Asp Ser Arg Ala Val Gly Lys Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln

305 310 315 320

Arg Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Val Pro

325 330 335

Lys Gly Lys Arg Thr Ala Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

340 345 350

Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg

355 360 365

His Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr

370 375 380

Gln Ser Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Ala

385 390 395 400

Lys Thr Asn Gln Gln Phe Lys Leu Ile Asp Asn Glu Phe Asn Glu Val

405 410 415

Glu Lys Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr

420 425 430

Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln

435 440 445

His Thr Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg

450 455 460

Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys

465 470 475 480

Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg

485 490 495

Asn Asn Thr Tyr Asp His Arg Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn

500 505 510

Arg Ile Gln Ile Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val

515 520 525

Ile Leu Trp Phe Ser Phe Gly Ala Ser Cys Phe Ile Leu Leu Ala Ile

530 535 540

Val Met Gly Leu Val Phe Ile Cys Val Lys Asn Gly Asn Met Arg Cys

545 550 555 560

Thr Ile Cys Ile

<210> 2

<211> 567

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Thr Ile Ser Leu Ala Lys Ser

1 5 10 15

Asp His Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Trp Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asp Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser

130 135 140

Lys Gly Val Ser Ala Ala Cys Ser Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Lys Asp Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Lys Ala Glu Gln Ile Thr Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Ile Asn Gly Gln Ser Gly

225 230 235 240

Arg Ile Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile His

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Arg Ser Glu Val Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Arg Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

340 345 350

Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly

355 360 365

Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu

370 375 380

Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile

385 390 395 400

Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn

405 410 415

Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly

420 425 430

Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu

435 440 445

Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr

450 455 460

Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Lys Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn

465 470 475 480

Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser

485 490 495

Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg

500 505 510

Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Val

515 520 525

Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu

530 535 540

Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser

545 550 555 560

Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210> 3

<211> 1695

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码H7N9（E157）亚型禽流感病毒的HA蛋白的基因的核苷酸序列

<400> 3

atgaacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60

atctgcctcg gacatcatgc cgtgtcaaac ggaatcaaag taaacacatt aactgaaaaa 120

ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa caaacacccc caggatctgc 180

tcaaaaggga aaaggacagt tgatctcggt caatgtggac tcctggggac aatcactgga 240

ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcggccgatt taattattga gaggcgagaa 300

ggaagtgatg tctgttatcc tggaaaattc gtgaatgaag aagctctgag gcaaattctc 360

agagaatcag gcggaattga caaggaatcc atgggactca catacaatgg aataagaact 420

aatggggtga ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg 480

ctcctgtcaa acacagataa tgctgcattc ccgcagatga ctaagtcata taaaaataca 540

agagaaagcc cagctataat agtatggggg atccatcatt ccgtttcaac tgcagagcaa 600

accaagctat atgggagtgg aaacaaactg gtgacagttg ggagttctaa ttatcaacaa 660

tctttcgtac cgagtccagg agcaagacca caagttaatg gtcaatctgg aagaattgac 720

tttcattggc taatactaaa tcccaatgat acagtcactt tcagtttcaa tggggctttc 780

atagctccag accgtgcaag cttcctgaga ggaaaatcta tgggaatcca gagtggagta 840

caggttgatg ccaattgtga aggggactgc tatcatagtg gagggacaat aataagtaac 900

ttgccatttc agaacataga tagcagggca gttggaaaat gtccgagata tgttaagcaa 960

aggagtcttc tgctggcaac agggatgaag aatgttcctg aggttccaaa gggaaaacgg 1020

actgcgagag gcctatttgg tgctatagcg ggtttcattg aaaatggatg ggaaggccta 1080

attgatggtt ggtatggttt cagacaccag aatgcacagg gagagggaac tgctgcagat 1140

tacaaaagca ctcaatcggc aattgatcaa ataacaggga aattaaatcg gcttatagca 1200

aaaaccaacc aacaatttaa gttgatagac aatgaattca atgaggtaga gaagcaaatc 1260

ggtaatgtga taaattggac cagagattct ataacagaag tatggtcata caatgctgaa 1320

ctcttggtgg caatggagaa ccagcataca attgatctgg ctgattcaga aatggacaaa 1380

ctgtacgaac gagtgaaaag acagctgaga gagaatgctg aagaagatgg cacgggttgc 1440

tttgaaatat ttcacaagtg tgatgatgac tgtatggcca gtattagaaa taacacctat 1500

gatcacagaa aatacagaga ggaggcaatg caaaatagaa tacagattga cccagtcaaa 1560

ctaagcagcg gctacaaaga tgtgatactt tggtttagct tcggggcatc atgtttcata 1620

cttctagcca ttgtaatggg ccttgtcttc atatgtgtga agaatggaaa catgcggtgc 1680

actatttgta tataa 1695

<210> 4

<211> 1704

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白的核苷酸序列

<400> 4

atggagaaaa tagtgcttct ctttgcaaca atcagtcttg ctaaaagcga tcatatttgc 60

attggatatc atgcaaataa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120

actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaagct ttgcgatcta 180

aatggggtga agcctctgat tttaaaagat tgtagtgtag caggatggct actcggaaac 240

ccatggtgtg acgaattcat caatgtacca gaatggtctt acatagtaga gaaggccaat 300

ccagtcaatg gcctctgtta cccagggaat ttcaacgatt atgaagaatt gaaacaccta 360

ttgagcagga taaaccattt tgagaaaata cagatcatcc ccaaagattc ttggtcagat 420

cacgaagcct caaagggggt gagcgcagca tgttcatacc agggaaagtc ctccttcttc 480

agaaatgtag tatggcttat caaaaagaac gatacatatc caacaataaa gaaagattac 540

aataatacca accgagaaga tctcttggta ctttggggga tccaccatcc taatgataaa 600

gcagagcaaa taacgctcta tcaaaaccca accacctata tttccattgg gacgtcaaca 660

ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagcc actagatcca aaataaacgg gcaaagtggc 720

aggatagatt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatccactt cgagagtaat 780

ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaaggaga ctccacaatt 840

atgagaagtg aagtggaata tggtaactgc aacaccaggt gtcagactcc ggtaggggcg 900

ataaactcta gtatgccatt ccataacata caccccctca ccatcggaga atgtcccaaa 960

tatgtgaaat cgaacaaatt agtccttgcg actggactca gaaatagtcc tcaaagagag 1020

agaagaagaa aaagaggact atttggagct atagcaggtt tcatagaggg aggatggcag 1080

ggaatggtag atggttggta tgggtaccac cacagcaatg agcaggggag tggatacgct 1140

gcagacaaag aatctactca aaaggcaata gacggagtca ccaataaggt caactcgatc 1200

attgacaaaa tgaacactca gtttgaggcc gtaggaaggg aatttaataa cttagagagg 1260

agaatagaga atttaaacaa gaagatggaa gacggattcc tagatgtctg gacttataat 1320

gctgaacttc tggttctcat ggaaaatgaa agaactttag acttccatga ctcaaatgtc 1380

aagaaccttt acgataaggt cagactacag cttaaggata atgcaaaaga gctgggcaac 1440

ggttgtttcg agttctatca caaatgtaat aatgaatgta tggaaagtgt aagaaacgga 1500

acgtatgact acccgcagta ttcagaagaa gcaagattaa aaagagagga aataagtgga 1560

gtaaaattgg agtcaatagg agtctaccaa atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt 1620

tccctagtgc tggcaatcat gatggctggt ctatctttat ggatgtgttc caacgggtcg 1680

ttgcagtgca gaatttgcat ttaa 1704

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P1

<400> 5

acgcgtcgac atgaacactc aaatcctggt attcgctc 38

<210> 6

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P2

<400> 6

ataagaatgc ggccgcttag tgatggtgat ggtgatgtat acaaatagtg caccgcatgt 60

t 61

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P3

<400> 7

acgcgtcgac atggagaaaa tagtgcttct ctttg 35

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P4

<400> 8

gctctagatt agtgatggtg atggtgatga atgcaaattc tgcactgcaa c 51

Claims (10)

1.一种基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗，其特征在于包含可溶性HA蛋白，该可溶性HA蛋白由能够表达禽流感病毒HA蛋白的重组修饰的杆状病毒表达；

所述的禽流感病毒为H7N9亚型禽流感病毒和H5N1亚型禽流感病毒中的至少一种；

所述的H7N9亚型禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的可溶性HA蛋白由MultiBac杆状病毒表达***表达。

2.根据权利要1所述的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗，其特征在于：

编码上H7N9亚型禽流感病毒的HA蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

编码H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要1所述的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗，其特征在于：

所述的重组修饰的杆状病毒的基因组中v-cath基因和chiA基因被破坏失去功能作用并且在基因组中***了单启动子基因盒。

4.根据权利要3所述的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗，其特征在于：

所述的单启动子基因盒自上游至下游包括如下组件：多角体蛋白启动子和编码禽流感病毒的HA蛋白的基因。

5.根据权利要1所述的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗，其特征在于：

用于构建重组修饰的杆状病毒的出发载体为pACEBac1。

6.根据权利要1所述的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗，其特征在于：

所述的杆状病毒为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒。

7.根据权利要1所述的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗，其特征在于：

所述的重组修饰的杆状病毒的制备方法，包含如下步骤：

将禽流感病毒的HA基因***到转递质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染昆虫细胞，在昆虫细胞内包装，得到重组修饰的杆状病毒。

8.权利要求1～7任一项所述的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)提取禽流感病毒的基因组，将其反转为cDNA；设计引物，以禽流感病毒cDNA为模板，扩增得到HA基因；将HA基因***到转递质粒pACEBac1的PH启动子后面，得到重组转递质粒；将重组转移质粒转化DH10MultiBac大肠杆菌，通过转座重组，分别获得重组杆状病毒质粒；最后用脂质体法分别将重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，得到重组杆状病毒；

(2)将P1代重组杆状病毒以MOI＝0.1感染细胞密度为1.5×10⁶cell/ml的sf9细胞，27℃悬浮培养72h后收取上清液即为P2代重组杆状病毒，将P2代重组杆状病毒以MOI＝1感染细胞密度为2.5×10⁶cell/ml的sf9细胞，27℃悬浮培养96h后收集细胞，经超声波处理，得到可溶性的HA蛋白；

(3)将可溶性HA蛋白与佐剂混合，得到基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗。

9.根据权利要求8所述的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗的制备方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的佐剂为SEPPIC MONTANIDETM ISA 201VG；

步骤(3)中所述的可溶性HA蛋白来自H7N9亚型禽流感病毒时，可溶性HA蛋白的血凝效价为2¹⁰～2¹⁴，与佐剂按照体积比1:1的比例混合；

步骤(3)中所述的可溶性HA蛋白来自H5N1亚型禽流感病毒时，可溶性HA蛋白的血凝效价优选为2¹⁰～2¹⁴，与佐剂按照体积比1:1的比例混合。

10.权利要求1～7任一项所述的基于MultiBac杆状病毒表达***的禽流感疫苗在制备预防禽流感产品中的应用。