CN117903260A - Ppv多肽抗原和组合物及其应用、ppv疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种PPV多肽抗原和组合物及其应用、PPV疫苗，涉及分子免疫学的技术领域。该PPV多肽抗原来源于猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)的VP2蛋白，选自氨基酸序列如Seq_1～11所示的多肽中的任意一条，该PPV多肽抗原具有B细胞表位和/或T细胞表位，可作为PPV疫苗的抗原成分，缓解了现有技术中存在的PPV疫苗有效性和安全性不佳的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及分子免疫学技术领域，尤其是涉及一种PPV多肽抗原和组合物及其应用、PPV疫苗。
背景技术
猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是细小病毒属的微生物，为无囊膜单链DNA病毒。能够引起母猪繁殖障碍疾病。PPV感染不造成母猪生病，但导致母猪产死胎、木乃伊胎、早期胚胎死亡和母猪不育等。母猪怀孕期感染后，其胚胎死亡率可达80％～100％。猪感染PPV后l～6d可出现病毒血症，1～2h后随粪便排出病毒，污染环境，造成种群内的传播。目前该病已呈世界性分布，给养猪业造成了严重的经济损失。
迄今，PPV感染无药物可治，免疫接种是防止感染的最佳途径。国内外已上市PPV疫苗主要有两种，灭活疫苗和亚单位疫苗。国产疫苗均是PPV全病毒灭活疫苗。灭活疫苗虽然生产工艺成熟，价格低廉，但也存在明显的缺点。首先，灭活疫苗诱导的免疫应答主要是体液免疫应答，细胞免疫应答较弱。而且免疫应答持续的时间较短，因此需要多次接种。其次，灭活疫苗的生产需要活病毒培养，PPV对环境抵抗力强，灭活苗始终有灭活失败和活病毒泄露的风险。在国外，上市的PPV疫苗主要是亚单位疫苗，其诱导的免疫应答显著强于灭活疫苗，但是生产工艺复杂，成本高价格昂贵，增加养猪业的经济负担。一些新型的疫苗如DNA疫苗，基因工程减毒活疫苗等，均处于实验室研究阶段。因此，如何改进PPV疫苗，提高疫苗的安全性和有效性是目前亟待解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种PPV多肽抗原，该PPV多肽抗原的序列选自Seq_1～11中的任意一条多肽序列，该PPV多肽抗原具有B细胞表位和/或T细胞表位，可作为PPV疫苗的抗原成分，缓解了现有技术中存在的PPV疫苗有效性和安全性不佳的技术问题。基于上述PPV多肽抗原的抗原性，本发明的目的还在于提供包含上述PPV多肽抗原的组合物及它们的应用，以及一种PPV疫苗。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种PPV多肽抗原，所述PPV多肽抗原选自如下多肽抗原中的一种：
PPV多肽抗原P1，氨基酸序列如Seq_1所示；PPV多肽抗原P2，氨基酸序列如Seq_2所示；PPV多肽抗原P3，氨基酸序列如Seq_3所示；PPV多肽抗原P5，氨基酸序列如Seq_4所示；PPV多肽抗原P6，氨基酸序列如Seq_5所示；PPV多肽抗原P8，氨基酸序列如Seq_6所示；PPV多肽抗原P9，氨基酸序列如Seq_7所示；PPV多肽抗原P10，氨基酸序列如Seq_8所示；PPV多肽抗原P11，氨基酸序列如Seq_9所示；PPV多肽抗原P12，氨基酸序列如Seq_10所示；或，PPV多肽抗原P14，氨基酸序列如Seq_11所示。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种PPV多肽抗原组合物，所述PPV多肽抗原组合物包含所述的PPV多肽抗原P1、PPV多肽抗原P2、PPV多肽抗原P3、PPV多肽抗原P5、PPV多肽抗原P6、PPV多肽抗原P8、PPV多肽抗原P9、PPV多肽抗原P10、PPV多肽抗原P11、PPV多肽抗原P12和PPV多肽抗原P14中的至少两种。
优选地，所述PPV多肽抗原组合物包括所述PPV多肽抗原P5、所述PPV多肽抗原P6、所述PPV多肽抗原P8、所述PPV多肽抗原P9、所述PPV多肽抗原P10、所述PPV多肽抗原P11、所述PPV多肽抗原P12、和所述PPV多肽抗原P14中的至少两种；
优选地，所述PPV多肽抗原组合物包括所述PPV多肽抗原P6。
优选地，包括所述PPV多肽抗原P1、所述PPV多肽抗原P2、所述PPV多肽抗原P3、所述PPV多肽抗原P5、所述PPV多肽抗原P6、所述PPV多肽抗原P8、所述PPV多肽抗原P9、所述PPV多肽抗原P10、所述PPV多肽抗原P11、所述PPV多肽抗原P12和所述PPV多肽抗原P14。
优选地，包括所述PPV多肽抗原P5、所述PPV多肽抗原P6、所述PPV多肽抗原P8、所述PPV多肽抗原P9、所述PPV多肽抗原P10、所述PPV多肽抗原P11、所述PPV多肽抗原P12和所述PPV多肽抗原P14。
优选地，包括所述PPV多肽抗原P6和所述PPV多肽抗原P9。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述PPV多肽抗原或所述PPV多肽抗原组合物在制备PPV疫苗；或，制备用于检测PPV或PPV抗体试剂盒中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种PPV疫苗，所述PPV疫苗以所述PPV多肽抗原或所述PPV多肽抗原组合物作为主要或辅助的诱导机体产生免疫应答的物质；
优选地，所述PPV疫苗为核酸疫苗或多肽疫苗；
优选地，所述PPV疫苗为核酸疫苗，所述核酸疫苗含有编码所述PPV多肽抗原，或所述PPV多肽抗原组合物的多核苷酸；
优选地，所述PPV疫苗为多肽疫苗，所述多肽疫苗含有所述PPV多肽抗原，或所述PPV多肽抗原组合物。
优选地，所述PPV疫苗还包含药学上任选的辅料；
优选地，所述多肽疫苗还包含免疫佐剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的PPV多肽抗原选自氨基酸序列如Seq_1～11中任意一条多肽，本发明提供的PPV多肽抗原能够单独的或与其他PPV多肽抗原配合使用诱导机体产生特异性IgG抗体应答和/或肽特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞应答。其中PPV多肽抗原P5(Seq_4)、P6(Seq_5)、P8(Seq_6)、P9(Seq_7)、P10(Seq_8)、P11(Seq_9)、P12(Seq_10)和P14(Seq_11)够诱导机体产生特异性IgG抗体应答，P6和P14能够诱导较强的肽特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞应答。P6具有T细胞和B细胞双重表位，不仅可以刺激显著的肽特异性T细胞应答，也可以刺激高水平的肽特异性IgG抗体应答。
本发明提供的PPV多肽抗原组合物包含上述PPV多肽抗原，将上述PPV多肽抗原组合使用免疫小鼠，小鼠血清中的抗体可以与病毒表面蛋白发生反应，产生对PPV具有中和活性的抗体。
基于上述PPV多肽抗原和PPV多肽抗原组合物取得的技术效果，本发明还将上述PPV多肽抗原以及组合物应用于制备用于检测PPV或PPV抗体试剂盒或应用于制备PPV疫苗。基于上述PPV多肽抗原的抗原性，将它们应用于制备多肽疫苗一方面可以精准定位于病原体的各类免疫细胞表位，同时去除非必要表位，还可以进行不同类型表位的联合，诱导机体产生细胞和体液免疫应答。另一方面，肽疫苗以天然氨基酸为原料,可通过全自动化学合成大规模生产，纯化和质控相对便捷，对于机体和环境相对安全，有极大发展空间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例15提供的PPV多肽疫苗免疫接种后小鼠血清肽特异性IgG抗体应答，横坐标的数字1、2、…14表示编号分别为P1、P2、…P14的多肽；
图2为实施例15提供的PPV多肽疫苗免疫接种后小鼠脾脏肽特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞应答，横坐标的数字1、2、…14表示编号分别为P1、P2、…P14的多肽；
图3为实施例15提供的PPV多肽疫苗三剂免疫接种后小鼠血清中肽特异性IgG抗体滴度；
图4为实施例15提供的PPV多肽疫苗免疫小鼠后血清与纯化PPV病毒的结合活性，M6-M10为小鼠编号；
图5为实施例16、实施例17和实施例18分别免疫小鼠后小鼠血清对多肽抗原P6和P9特异性IgG抗体应答；
图6为实施例16、实施例17和实施例18分别免疫小鼠后，多肽抗原P6和P9诱导的小鼠脾脏的IFN-γ分泌T淋巴细胞应答；
图7为实施例15提供的PPV多肽疫苗免疫小鼠血清中和抗体滴度。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
需要说明的是：
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案；所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案；所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种PPV多肽抗原，该PPV多肽抗原来源于猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)的VP2蛋白，本发明提供的PPV多肽抗原的序列来源于多肽表位筛选芯片与PPV免疫小鼠后的阳性血清具有反应性的多肽得到一系列多肽序列，本发明提供的多肽选自如下PPV多肽抗原中的任意一种：
PPV多肽抗原P1(简称P1)：
HNPVNAGSELSASGNESG(Seq_1)；
PPV多肽抗原P2(简称P2)：
SFNNQSEFQYLGEGL(Seq_2)；
PPV多肽抗原P3(简称P3)：
MVSPWSLVDANAWGVWFNPADWQ(Seq_3)；
PPV多肽抗原P5(简称P5)：
ALDSNNSLPYSPAAPRSESLGFYPWLPSKPSQYRY(Seq_4)；
PPV多肽抗原P6(简称P6)：
NLNPPSYSGQSQQVSDSVQSGLHSDVMFYSVENAVPVHLLRSGDEFSSGV(Seq_5)；
PPV多肽抗原P8(简称P8)：
EASAVRPAQVGYNSPYMNFEYSNGGPFLSPVVPSA(Seq_6)；
PPV多肽抗原P9(简称P9)：
ADSQYNDDEPNGAVRFS(Seq_7)；
PPV多肽抗原P10(简称P10)：
KVAPNLSDDFNADSPQQPRVVSYSNFWWKGSLSFSAK(Seq_8)；
PPV多肽抗原P11(简称P11)：
NSNNGSLLPSDPVGGKSNMHFMNSLNSYGPLSALNNSAPV(Seq_9)；
PPV多肽抗原P12(简称P12)：
VFPNGQVWDKELDSDLKPRLHVSAPFVCKNNP(Seq_10)；
PPV多肽抗原P14(简称P14)：
WNPVQQHSTTAENVGNYVPSNVGGVRMFPEYSQLV(Seq_11)。
本发明提供的PPV多肽抗原单独使用或与其他PPV多肽抗原配合使用能够诱导机体产生特异性IgG抗体应答，其中PPV多肽抗原P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14能够诱导机体产生特异性IgG抗体应答；P6和P14能够诱导较强的肽特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞应答。将上述11种多肽抗原混合使用免疫小鼠，其免疫诱导的抗体对PPV病毒有中和活性，血清对PPV病毒几何平均抗体滴度可达1：2352。
在一些可选的实施方式中，基于PPV多肽抗原P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14能够诱导机体产生特异性IgG抗体应答，所述PPV多肽抗原选自上述PPV多肽抗原中的P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14中的任意一条。
在一些可选的实施方式中，所述PPV多肽抗原为PPV多肽抗原P6。经实验证实，P6不仅可以刺激显著的肽特异性T细胞应答，也可以刺激高水平的肽特异性IgG抗体应答，说明P6上具有T细胞和B细胞双重表位。同时P6也可以促进P9肽的IgG应答能力，说明P6可能具有提高其他多肽抗原免疫原性的能力。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种PPV多肽抗原组合物，所述PPV多肽抗原组合物包含上述PPV多肽抗原P1(Seq_1)、P2(Seq_2)、P3(Seq_3)、P5(Seq_4)、P6(Seq_5)、P8(Seq_6)、P9(Seq_7)、P10(Seq_8)、P11(Seq_9)、P12(Seq_10)和P14(Seq_11)中的至少两种。
在一些可选的实施方式中，由于PPV多肽抗原P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14能够诱导机体产生特异性IgG抗体应答，因此优选PPV多肽抗原组合物中的至少一个多肽抗原选自P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14中的其中一种，更优选PPV多肽抗原组合物同时包括P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14。
在一些可选的实施方式中，由于PPV多肽抗原P6具有T细胞和B细胞双重表位，而且经实验验证P6能够促进P9的IgG应答能力，说明P6可能具有提高其他多肽抗原免疫原性的能力，因此优选PPV多肽抗原组合物中至少包括PPV多肽抗原P6，优选包括P6和P9。
在一些可选的实施方式中，PPV多肽抗原组合物包括P1、P2、P3、P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14。经实验验证将上述11种多肽抗原混合免疫小鼠，小鼠血清中的抗体可以与病毒表面蛋白发生反应，ELISA检测抗体滴度最高可达1:2352；噬斑减少实验证实上述11种多肽抗原混合免疫小鼠能够诱导小鼠产生对PPV具有中和活性的抗体。
基于上述PPV多肽抗原，或PPV多肽抗原组合物的免疫原性，以及它们能够诱导机体产生体液免疫和/或细胞免疫反应，本发明还提供了上述PPV多肽抗原，或PPV多肽抗原组合物的应用，所述应用主要包括以下几个方面：
在一些可选的实施方式中，将上述PPV多肽抗原，或PPV多肽抗原组合物应用于制备PPV疫苗。可选地，上述PPV多肽抗原，例如PPV多肽抗原P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14能够诱导机体产生特异性IgG抗体应答，P6和P14能够诱导较强的肽特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞应答，因此可选地将上述PPV多肽抗原应用于制备PPV疫苗，上述PPV多肽抗原可以作为疫苗的主要或辅助抗原成分。可选地，也可以将上述PPV多肽抗原组合物，即将上述多种PPV多肽抗原组合使用作为疫苗的主要或辅助抗原成分。
在一些可选的实施方式中，将上述PPV多肽抗原，或PPV多肽抗原组合物应用于制备用于检测PPV或PPV抗体试剂盒。可选地，当所述检测试剂盒为用于检测PPV的试剂盒，上述PPV多肽抗原或PPV多肽抗原组合物可作为对照试剂，也可选地用于生产试剂盒中与PPV结合的抗体。当所述检测试剂盒为用于检测PPV抗体的试剂盒，上述PPV多肽抗原，或PPV多肽抗原组合物可以作为捕获PPV抗体的抗原。所述试剂盒还可选地包括本领域可接受的其他的检测试剂或耗材，具体的实例例如可以为但不限于为缓冲液、标记物、抗体、固相载体、用于催化反应的酶、引物和显色剂等。
根据上述PPV多肽抗原，或PPV多肽抗原组合物应用于制备PPV疫苗的发明构思，本发明还提供了一种PPV疫苗，该PPV疫苗以上述PPV多肽抗原或上述PPV多肽抗原组合物作为主要或辅助的诱导机体产生免疫应答的物质。所述PPV疫苗中可选地直接含有上述PPV多肽抗原，或PPV多肽抗原组合物；或可选地含有能够产生上述PPV多肽抗原，或PPV多肽抗原组合物的前体物质，例如可以为但不限于为编码PPV多肽抗原，或PPV多肽抗原组合物的多核苷酸。
在一些可选的实施方式中，所述PPV疫苗为核酸疫苗，所述核酸疫苗含有编码所述PPV多肽抗原，或PPV多肽抗原组合物的多核苷酸，所述多核苷酸指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物，编码可选地为编码正义链或反义链。
在一些可选的实施方式中，所述PPV疫苗为多肽疫苗，所述多肽疫苗含有上述PPV多肽抗原，或PPV多肽抗原组合物。多肽疫苗具有如下优势：首先多肽疫苗可以精准定位于各类免疫细胞表位，而且去除了非必要表位，还可以进行不同类型表位的联合，诱导机体产生细胞和体液免疫应答。例如上述PPV多肽抗原P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14能够诱导机体产生特异性IgG抗体应答，而P6和P14能够诱导较强的肽特异性脾IFN-γ分泌T淋巴细胞应答。其次，肽疫苗以天然氨基酸为原料，可通过全自动化学合成大规模生产，纯化和质控相对便捷，对于机体和环境相对安全，因此受到广泛重视并有极大发展空间。
所述多肽疫苗中优选含有如下PPV多肽抗原或其组合：PPV多肽抗原P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14；或PPV多肽抗原P1、P2、P3、P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14；或PPV多肽抗原P6和P9；或PPV多肽抗原P6。
可以理解的是，所述PPV疫苗还可选地含有药学上可接受的任选的辅料，包括但不限于溶剂、缓冲试剂、乳化剂、防腐剂、pH调节剂和免疫佐剂中的一种或多种。
在一些优选的实施方式中，PPV多肽疫苗含有免疫佐剂，免疫佐剂可选择本领域可接受的任何用于增加疫苗抗原免疫原性的物质，包括但不限氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙胞壁酰二肽、细菌外毒素、细菌DNA、鞭毛蛋白、矿物油佐剂和细胞因子中的一种或多种。
在一些优选的实施方式中，PPV多肽疫苗的免疫佐剂选自矿物油佐剂和CpG ODN；更优选地，PPV多肽疫苗含有如下免疫佐剂：矿物油佐剂MONTANIDETM ISA61VG和CpG ODN1286。
在一些优选的实施方式中，PPV多肽疫苗中，各多肽抗原的质量、矿物油佐剂MONTANIDETM ISA61VG和CpG ODN 1286的质量比为2：(10～15)：(2～5)，例如可以为但不限于为2:10:2、2:10:5、2:15:2、2:15:5、2:13:2、2:13:5、2:10:3、2:15:3或2:13:3，优选为2:13:3。各多肽抗原的质量指的是每种多肽抗原的质量，即多肽疫苗中单独一种多肽抗原与矿物油佐剂MONTANIDETM ISA61VG和CpG ODN 1286的质量比如上所述。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和技术效果。
实施例1
实施例1提供了一种PPV多肽抗原P1，氨基酸序列见表1，如Seq_1所示。
实施例2
实施例2提供了一种PPV多肽抗原P2，氨基酸序列见表1，如Seq_2所示。
实施例3
实施例3提供了一种PPV多肽抗原P3，氨基酸序列见表1，如Seq_3所示。
实施例4
实施例4提供了一种PPV多肽抗原P5，氨基酸序列见表1，如Seq_4所示。
实施例5
实施例2提供了一种PPV多肽抗原P6，氨基酸序列见表1，如Seq_5所示。
实施例6
实施例2提供了一种PPV多肽抗原P8，氨基酸序列见表1，如Seq_6所示。
实施例7
实施例2提供了一种PPV多肽抗原P9，氨基酸序列见表1，如Seq_7所示。
实施例8
实施例2提供了一种PPV多肽抗原P10，氨基酸序列见表1，如Seq_8所示。
实施例9
实施例2提供了一种PPV多肽抗原P11，氨基酸序列见表1，如Seq_9所示。
实施例10
实施例2提供了一种PPV多肽抗原P12，氨基酸序列见表1，如Seq_10所示。
实施例11
实施例2提供了一种PPV多肽抗原P14，氨基酸序列见表1，如Seq_11所示。
实施例1～11的多肽抗原按照如下方法得到：
1.PPV多克隆抗体的制备
蔗糖密度超离心纯化PPV病毒免疫Balb/C小鼠，三剂免疫后7天，小鼠眼球取血，分离血清，ELISA筛选滴度高于1：12800的血清，用于免疫芯片实验。
2.基于免疫多肽芯片的PPV病毒VP2蛋白多肽表位的筛选
适当稀释的滴度≥1:12800的PPV抗血清、正常小鼠血清分别与多肽芯片杂交，用1：20000稀释的FITC标记抗鼠IgG二抗显色，芯片荧光检测***，读取荧光信号，通过软件分析只在PPV阳性血清反应芯片上出现的荧光斑点的位置和强度，来确定与PPV抗体反应的肽表位的氨基酸序列(方法可参照已公开的专利CN112557645B)。结果共筛选出106个肽表位，其中35个表位位于PPV病毒外壳蛋白VP2上。
本申请中所用多肽芯片为Health Tell公司V16芯片，该芯片上有4个重复的多肽阵列，每个阵列上分别有3200000种多肽，这3200000种多肽是分别由5-16个无偏差的随机氨基酸组合形成的多肽序列，能够对五聚体(5肽)的多样覆盖率达到99.9％。同时，在该版本的芯片多肽阵列中，还包含了部分靶标序列，例如包含了1,328,926条靶标序列(其中包括了部分药物靶点蛋白的潜力治疗序列、表位序列、抗体序列和流感蛋白治疗序列等)。
3.PPV多肽疫苗抗原的设计
为了提高多肽疫苗的免疫原性，将芯片筛选出的位于PPV病毒VP2蛋白上的35个肽表位，在多肽可以合成的长度范围内，根据表位在VP2肽链上的位置，进行合并，共得到11个多肽，多肽氨基酸序列如表1。
表1 PPV多肽抗原氨基酸序列
| 名称 | 序列 | Seq_ID |
| P1 | HNPVNAGSELSASGNESG | Seq_1 |
| P2 | SFNNQSEFQYLGEGL | Seq_2 |
| P3 | MVSPWSLVDANAWGVWFNPADWQ | Seq_3 |
| P5 | ALDSNNSLPYSPAAPRSESLGFYPWLPSKPSQYRY | Seq_4 |
| P6 | NLNPPSYSGQSQQVSDSVQSGLHSDVMFYSVENAVPVHLLRSGDEFSSGV | Seq_5 |
| P8 | EASAVRPAQVGYNSPYMNFEYSNGGPFLSPVVPSA | Seq_6 |
| P9 | ADSQYNDDEPNGAVRFS | Seq_7 |
| P10 | KVAPNLSDDFNADSPQQPRVVSYSNFWWKGSLSFSAK | Seq_8 |
| P11 | NSNNGSLLPSDPVGGKSNMHFMNSLNSYGPLSALNNSAPV | Seq_9 |
| P12 | VFPNGQVWDKELDSDLKPRLHVSAPFVCKNNP | Seq_10 |
| P14 | WNPVQQHSTTAENVGNYVPSNVGGVRMFPEYSQLV | Seq_11 |
实施例12
实施例12提供了一种PPV多肽抗原组合物，包括多肽抗原P6和P9(即实施例5和实施例7提供的多肽抗原)。
实施例13
实施例13提供了一种PPV多肽抗原组合物，包括多肽抗原P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14(即实施例4、5、6、7、8、9、10和11的多肽抗原)。
实施例14
实施例14提供了一种PPV多肽抗原组合物，包括多肽抗原P1、P2、P3、P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14(即实施例1～11的多肽抗原)。
实施例15
实施例15提供了一种PPV多肽疫苗，包含实施例14提供的PPV多肽抗原组合物，还包含矿物油佐剂MONTANIDETM ISA61VG(Seppic)、免疫刺激剂CpG ODN 1286(Inovogen)，混合后乳化成稳定的油包水免疫原。
本实施例提供的疫苗免疫小鼠，各组分的剂量为矿物油佐剂MONTANIDETM ISA61VG(Seppic)130μl/剂/鼠；免疫刺激剂CpG ODN 1286(Inovogen)30μg/剂/鼠；PPV多肽抗原组合物220μg/剂/鼠，共200μl/剂/鼠，其中PPV多肽抗原组合物以组合物中肽的总量计，各PPV多肽抗原的用量为20μg/剂/鼠。
实施例16
实施例16提供了一种PPV多肽疫苗，与实施例15的区别仅在于，以实施例7提供的PPV多肽抗原P9替代实施例14提供的PPV多肽抗原组合物，即本实施例的PPV疫苗只含有一种多肽抗原(P9)，多肽抗原P9的用量为20μg/剂/鼠。
实施例17
实施例17提供了一种PPV多肽疫苗，与实施例15的区别仅在于，以实施例5提供的PPV多肽抗原P6替代实施例14提供的PPV多肽抗原组合物，即本实施例的PPV疫苗只含有一种多肽抗原(P6)，多肽抗原P6的用量为20μg/剂/鼠。
实施例18
实施例18提供了一种PPV多肽疫苗，与实施例15的区别仅在于，以实施例12提供的PPV多肽抗原组合物替代实施例14提供的PPV多肽抗原组合物，多肽抗原P6和P9的用量分别为20μg/剂/鼠。
对比例1
对比例1与实施例15的区别仅在于，以PBS替代实施例14提供的PPV多肽抗原组合物。
下述效果例的实验分组以及免疫方法如下：
16.5g～17.5g雌性无特定病原体Balb/C小鼠，40只，随机分为5组，见表2。前后肢腋窝四点皮下免疫接种实施例15～18提供的PPV多肽疫苗和佐剂对照组，每点50μl。
表2免疫小鼠分组
| 组别 | 组名称 | 小鼠数量 | 免疫原 |
| 第一组 | 多肽实验组 | 10只 | 实施例15 |
| 第二组 | 佐剂对照组 | 6只 | 对比例1 |
| 第三组 | P9单肽免疫组 | 8只 | 实施例16 |
| 第四组 | P6单肽免疫组 | 8只 | 实施例17 |
| 第五组 | P6/P9肽混合免疫组 | 8只 | 实施例18 |
间隔21天接种一剂，共接种3剂。2剂和3剂接种后7天分别收取小鼠血清，进行如下验证：
效果例1
ELISA方法检测肽特异性血清IgG抗体
1.实验方法：
1.1采用免疫原免疫小鼠，二剂和三剂免疫后7天小鼠分别眼球取血，分离血清待检测。
1.2酶标板的包被和封闭：免疫小鼠用的多肽(PPV多肽抗原P1、P2、P3、P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14)，分别包被96孔酶标板，包被肽浓度10μg/ml，50μl/孔，4℃过夜，空板。加入明胶封闭液(上海生工)，每孔100μl/孔，37℃孵育2小时。将免疫血清用2％FBS-PBST 100×稀释，加入肽包被酶标板，50μl/孔，37℃孵育1小时，空板，PBST洗板5次，空板。
1.3ELISA检测：加入用2％ FBS-PBST 1:5000稀释的抗鼠IgG-HRP，50/孔，37℃孵育1小时，空板，PBST洗板5次，空板。加入显色液A(H2O2)和B(TMB)各50μl/孔，避光显色15分钟，2M硫酸终止反应，50μl/孔。酶标已读取OD450值，OD450>0.18为阳性。
2.实验结果：
将实施例15提供的PPV多肽疫苗(含有11种PPV多肽抗原的多肽疫苗)，进行肽特异性血清IgG抗体的检测，结果如图1所示，与佐剂对照组相比，二剂免疫接种后，P5、P6、P8、P9和P12肽可以诱导显著的肽特异性IgG抗体应答。与二剂相比，三剂免疫接种后，P6、P10、P11、P12和P14肽特异性IgG抗体又有显著性升高，抗体应答的峰值出现在3剂免疫接种后。
效果例2
ELISpot方法检测肽特异性脾IFN-γ分泌T淋巴细胞
1.实验方法：
1.1小鼠脾脏淋巴细胞的分离纯化，实验小鼠眼球取血，拉颈处死，75％乙醇浸泡小鼠5分钟，无菌解刨小鼠，摘取脾脏。将脾脏放于200目细胞筛网中，用3ml小鼠淋巴细胞提取液研磨后，将滤出液加入15ml离心管中，在研磨液上轻轻加入1ml RPMI1640，保持界面清晰。800g离心30min。吸出淋巴细胞层，加入到10mL1640培养基中，颠倒洗涤。室温，250g离心10min，收集细胞。若观察沉淀中红细胞较多，使用3ml无菌去离子水重悬沉淀，11秒之内立即加入1640定容至13ml，400g离心15min。倾倒上清液，用无血清培养基(1640)或其他培养液(HBSS)重悬细胞，细胞计数。
1.2淋巴细胞的稀释：纯化计数的淋巴细胞用淋巴细胞培养液(RPMI1640+1％双抗+1％HEPES)稀释成5×106细胞/ml，待用。
1.3多肽抗原的稀释：用淋巴细胞培养液将各多肽抗原(PPV多肽抗原P1、P2、P3、P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14)稀释成200μg/ml，待用。
1.4 ELISpot板的准备：从Mouse IFN-γELISpot试剂盒(Mabtech，3321-4AST-2)中无菌取出要用的板条，放入板架中。用灭菌PBS洗四次，200μl/well。所用反应孔中加入200μl淋巴细胞培养液，室温至少放置30分钟，待用，用前空板。
1.5淋巴细胞的刺激：取淋巴细胞50μl，步骤1.3的多肽抗原50μl分别加入1.4的板孔中混合，37℃5％CO2孵育40小时。
1.6 ELISpot检测：步骤1.5的ELISpot微孔板，空板，用PBS洗板5次，200μl/well。用0.5％FBS-PBS，将检测抗体(R4-6Ab-Biotin)稀释至1μg/ml，加入板孔，100μl/孔，37℃孵育2小时，空板后PBS洗板5次。用0.5％FBS-PBS，将显色抗体(Streptavidin-ALP)1:1000稀释，加入板孔100μl/孔，37℃孵育1小时，孔板后PBS洗板5次。将底物(BCIP/NBT-plus)用0.45μm滤器过滤后，加入板孔，100μl/孔，避光放置直到出现斑点(10-30min)。ELISpotreader(AID公司)读板。
2.实验结果：
将实施例15提供的PPV多肽疫苗，免疫小鼠，提取小鼠脾淋巴细胞，分别用11种多肽抗原体外刺激T淋巴细胞，ELISpot检测肽特异性脾IFN-γ分泌淋巴细胞的频率，结果如图2所示，与佐剂对照组相比，二剂和三剂免疫接种均可诱导显著的肽特异性脾IFN-γ分泌T淋巴细胞应答，应答的峰值出现在二剂免疫接种后。其中P6和P14诱导的肽特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞应答最强。
效果例3
ELISA方法检测多肽诱导的IgG抗体滴度
1.实验方法：
1.1酶标板的包被和封闭同效果例1的1.2节。
1.2肽免疫小鼠血清的稀释：小鼠血清用2％FBS-PBST先1:100稀释，然后再1:2系列稀释，每个稀释度做复孔，37℃孵育1小时，空板，PBST洗板5次，空板。后续步骤同效果例1的1.3节。
2.实验结果：
将多肽抗原P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14分别包被96孔板，ELISA检测混合多肽免疫小鼠血清肽特异性IgG抗体滴度。结果如图3所示，三剂免疫接种后，8种肽(多肽抗原P5、P6、P8、P9、P10、P11、P12和P14)能够诱导实验小鼠产生显著血清肽特异性IgG抗体应答。其中P6肽诱导的抗体滴度最高，几何平均滴度高于1：40960，P5和P8最低，也达到了1：1114。
效果例4
肽特异性免疫小鼠血清与纯化的PPV病毒的结合活性的检测
1.实验方法：
1.1 PPV病毒培养液的制备：细胞培养法。PPV病毒A31株，按体积比1:1000稀释接种70％铺满T225细胞瓶的猪睾丸细胞(ST细胞)，37℃5％CO2培养箱吸附2小时，弃去上清，加入含2％ FBS的DMEM 100ml。37℃5％CO2培养箱吸附72小时，80％细胞病变脱落。-20℃反复冻融细胞培养液3次。用qPCR检测病毒滴度为4.5×109copies/ml。
1.2 PPV病毒的蔗糖密度超离心纯化：上一步骤制备的PPV病毒培养液，加入50ml超速离心管，每管30ml，用8cm长针头，从离心管底部反推入20ml 50％蔗糖溶液，35000rpm离心4小时(日立CP 70MX)，缓慢吸干上清，用少量TNE缓冲液重悬沉淀，测定蛋白浓度，-20℃冻存备用。
1.3 PPV全病毒包被96孔ELISA板的制备：蔗糖密度离心纯化PPV病毒，碳酸缓冲液稀释至5μg/ml，包被96孔ELISA板，50μl/孔，4℃过夜。弃去包被液，每孔加入100μl 5％FBS-PBST封闭液，37℃封闭2小时，弃去封闭液，空板。
1.4酶标仪检测OD450值
多肽免疫小鼠血清，先用2％ FBS-PBST 100倍稀释，再2×系列稀释，加入上一步制备的酶标板中，50μl/孔，每个稀释度作复孔。37℃孵育1小时，空板，用PBST洗5次，空板。加入用2％ FBS-PBST按1:10000比例稀释的HRP标记的抗小鼠IgG二抗(Invitrogen)，37℃孵育1小时，空板，用PBST洗5次，空板。加入TMB/H2O2底物液，避光显色10分钟，2MH2SO4终止反应，酶标仪检测OD450值。以OD450<0.2作为阴性孔判定阈值，OD<0.2的最大稀释度为抗体滴度。
2.实验结果：
用PPV纯化病毒包被ELISA板，与实施例15免疫小鼠血清反应，进行肽特异性小鼠血清与PPV病毒结合活性的检测。结果如图4所示，所有实验小鼠血清均与PPV病毒发生反应。与二剂免疫接种后相比，三剂免疫接种后，几何平均抗体滴度由1：1024上升到1：2352。说明多肽抗原表位诱导的抗体可以与病毒表面蛋白发生反应。
效果例5
效果例1～4的实验结果显示，P6肽不仅可以刺激显著的肽特异性T细胞应答，也可以刺激高水平的肽特异性IgG抗体应答，说明P6肽上具有T细胞和B细胞双重表位；而P9肽在混合免疫时可以诱导显著的肽特异性IgG免疫应答，但不能诱导肽特异性T细胞应答，说明P9肽上只有B细胞表位，无T细胞表位。
用ELISA检测各免疫组(第三组、第四组和第五组)肽特异性IgG抗体应答，实验方法同效果例1和2。
结果如图5和图6所示，其中，P6表示第四免疫组(采用实施例17提供的PPV多肽疫苗免疫小鼠)免疫后的血清对多肽抗原P6的特异性血清IgG抗体应答；P6(P6+P9)表示第五免疫组(采用实施例18提供的PPV多肽疫苗免疫小鼠)免疫后的血清对多肽抗原P6的特异性血清IgG抗体应答；P9表示第三免疫组(采用实施例16提供的PPV多肽疫苗免疫小鼠)免疫后的血清对多肽抗原P9的特异性血清IgG抗体应答；P9(P6+P9)表示第五免疫组(采用实施例18提供的PPV多肽疫苗免疫小鼠)免疫后的血清对多肽抗原P9的特异性血清IgG抗体应答。
从图5和图6可以看出，单一的多肽抗原P6能诱导显著的P6肽特异性IgG抗体应答和IFN-γ分泌T细胞免疫应答，多肽抗原P9肽单独免疫或两种多肽抗原P6和P9特异性免疫均没有检测到IFN-γ分泌T细胞免疫应答；两种多肽抗原P6和P9混合后免疫小鼠，多肽抗原P9肽特异性IgG抗体应答显著提高，说明P6肽能够促进P9肽的IgG应答能力；而P9肽的T细胞应答则无显著变化，可能是T细胞免疫应答是由免疫表位的氨基酸序列决定的。
效果例6
PPV混合多肽免疫小鼠血清PPV病毒中和抗体滴度检测噬斑减少实验
1.实验方法：
1.1猪睾丸细胞(ST细胞)12孔细胞培养板的制备：100％铺满T75细胞瓶的ST细胞，胰酶消化，悬于含10％FBS DMEM培养液中，细胞计数后，调整细胞浓度至1×106细胞/ml，再用DMEM 5倍稀释至细胞浓度为2×105细胞/ml，接种于12孔细胞培养板，每孔2ml，37℃5％CO2培养箱培养24小时，吸出上清，每孔加1ml DMEM洗一次细胞，待用。
1.2 PPV病毒噬斑实验最佳工作稀释度的测定：PPV病毒(4.5×109拷贝/ml)5×系列稀释，52～57稀释病毒培养液加入上一步ST细胞12孔板，37℃5％ CO2培养箱培养2小时，小心吸出上清液，加入含1％低熔点琼脂糖DMEM 2ml室温凝固后，倒置放入37℃5％ CO2培养箱培养96小时，每孔加入1ml含1％中性红和1％低熔点琼脂糖的DMEM，室温凝固后倒置于37℃5％CO2培养箱培养24小时，观察出斑，以80％细胞出现噬斑的病毒稀释度为最佳工作稀释度。
1.3 PPV多肽疫苗(实施例15)免疫小鼠血清对PPV病毒中和实验：用DMEM 10×稀释多肽免疫小鼠血清，0.22μm针式滤器除菌过滤，再2倍系列稀释，10×，20×，40×，80×，160×，320×，640×，1280×。将系列稀释的血清与等体积最佳工作稀释度稀释的病毒混合，置于37℃5％CO2培养箱2小时，4℃过夜。接种于步骤1.1制备的12孔板ST细胞上，置于37℃5％CO2培养箱吸附2小时，小心吸出上清，加入含1％低熔点琼脂糖DMEM 2ml，室温凝固后，倒置放入37℃5％CO2培养箱培养96小时，每孔加入1ml含1％中性红和1％低熔点琼脂糖的DMEM，室温凝固后倒置于37℃5％CO2培养箱培养24小时，观察出斑。对照孔接种病毒为，10×稀释佐剂免疫小鼠血清中和PPV病毒。噬斑数为佐剂对照组噬斑数一半的血清稀释度为中和抗体滴度。
2.实验结果：
为了测定多肽疫苗诱导的免疫应答对PPV病毒的中和活性，用噬斑减少实验检测了本发明的实施例15提供的多肽疫苗免疫的小鼠血清的中和抗体滴度，结果如图7所示，三剂免疫接种后平均中和抗体滴度为1:368，说明实施例15提供的PPV多肽疫苗免疫诱导的抗体对PPV病毒有中和活性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种PPV多肽抗原，其特征在于，选自如下多肽抗原中的一种：
PPV多肽抗原P1，氨基酸序列如Seq_1所示；
PPV多肽抗原P2，氨基酸序列如Seq_2所示；
PPV多肽抗原P3，氨基酸序列如Seq_3所示；
PPV多肽抗原P5，氨基酸序列如Seq_4所示；
PPV多肽抗原P6，氨基酸序列如Seq_5所示；
PPV多肽抗原P8，氨基酸序列如Seq_6所示；
PPV多肽抗原P9，氨基酸序列如Seq_7所示；
PPV多肽抗原P10，氨基酸序列如Seq_8所示；
PPV多肽抗原P11，氨基酸序列如Seq_9所示；
PPV多肽抗原P12，氨基酸序列如Seq_10所示；
或，PPV多肽抗原P14，氨基酸序列如Seq_11所示。
2.根据权利要求1所述的PPV多肽抗原，其特征在于，选自如下多肽抗原中的一种：所述PPV多肽抗原P5、所述PPV多肽抗原P6、所述PPV多肽抗原P8、所述PPV多肽抗原P9、所述PPV多肽抗原P10、所述PPV多肽抗原P11、所述PPV多肽抗原P12、或，所述PPV多肽抗原P14；
优选地，所述PPV多肽抗原为所述PPV多肽抗原P6。
3.PPV多肽抗原组合物，其特征在于，包含权利要求1中所述的PPV多肽抗原P1、PPV多肽抗原P2、PPV多肽抗原P3、PPV多肽抗原P5、PPV多肽抗原P6、PPV多肽抗原P8、PPV多肽抗原P9、PPV多肽抗原P10、PPV多肽抗原P11、PPV多肽抗原P12和PPV多肽抗原P14中的至少两种。
4.根据权利要求3所述的PPV多肽抗原组合物，其特征在于，所述PPV多肽抗原组合物至少包括所述PPV多肽抗原P5、所述PPV多肽抗原P6、所述PPV多肽抗原P8、所述PPV多肽抗原P9、所述PPV多肽抗原P10、所述PPV多肽抗原P11、所述PPV多肽抗原P12和所述PPV多肽抗原P14中的至少一种；
优选地，所述PPV多肽抗原组合物包括所述PPV多肽抗原P5、所述PPV多肽抗原P6、所述PPV多肽抗原P8、所述PPV多肽抗原P9、所述PPV多肽抗原P10、所述PPV多肽抗原P11、所述PPV多肽抗原P12、和所述PPV多肽抗原P14中的至少两种；
优选地，所述PPV多肽抗原组合物包括所述PPV多肽抗原P6。
5.根据权利要求3或4所述的PPV多肽抗原组合物，其特征在于，包括所述PPV多肽抗原P1、所述PPV多肽抗原P2、所述PPV多肽抗原P3、所述PPV多肽抗原P5、所述PPV多肽抗原P6、所述PPV多肽抗原P8、所述PPV多肽抗原P9、所述PPV多肽抗原P10、所述PPV多肽抗原P11、所述PPV多肽抗原P12和所述PPV多肽抗原P14。
6.根据权利要求3或4所述的PPV多肽抗原PPV多肽抗原组合物，其特征在于，包括所述PPV多肽抗原P5、所述PPV多肽抗原P6、所述PPV多肽抗原P8、所述PPV多肽抗原P9、所述PPV多肽抗原P10、所述PPV多肽抗原P11、所述PPV多肽抗原P12和所述PPV多肽抗原P14。
7.根据权利要求3或4所述的PPV多肽抗原PPV多肽抗原组合物，其特征在于，包括所述PPV多肽抗原P6和所述PPV多肽抗原P9。
8.权利要求1或2所述的PPV多肽抗原或权利要求3-7任一项所述的PPV多肽抗原组合物在制备PPV疫苗；或，制备用于检测PPV或PPV抗体试剂盒中的应用。
9.PPV疫苗，其特征在于，所述PPV疫苗以权利要求1或2所述的PPV多肽抗原或权利要求3-7任一项所述的PPV多肽抗原组合物作为主要或辅助的诱导机体产生免疫应答的物质；
优选地，所述PPV疫苗为核酸疫苗或多肽疫苗；
优选地，所述PPV疫苗为核酸疫苗，所述核酸疫苗含有编码所述PPV多肽抗原，或所述PPV多肽抗原组合物的多核苷酸；
优选地，所述PPV疫苗为多肽疫苗，所述多肽疫苗含有所述PPV多肽抗原，或所述PPV多肽抗原组合物；
优选地，所述多肽疫苗包含权利要求5-7任一项所述的PPV多肽抗原组合物；
优选地，所述多肽疫苗包含所述PPV多肽抗原P6。
10.根据权利要求9所述的PPV疫苗，其特征在于，所述PPV疫苗还包含药学上任选的辅料；
优选地，所述多肽疫苗还包含免疫佐剂；
优选地，所述免疫佐剂包括矿物油佐剂和CpG ODN佐剂；
优选地，所述免疫佐剂包括矿物油佐剂MONTANIDETMISA61VG和CpG ODN 1286；
优选地，所述多肽疫苗中各多肽抗原的质量、矿物油佐剂MONTANIDETMISA61VG和CpGODN 1286的质量比为2：(10～15)：(2～5)，优选为2:13:3。
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