CN117512121A - 一种嘉积鸭snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种嘉积鸭snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种嘉积鸭SNP分子标记及其应用，所述嘉积鸭SNP分子标记包括20327个SNP分子标记中的至少一种，所述20327个SNP分子标记的物理位置是基于番鸭的参考基因组进行序列比对确定的；本发明利用筛选得到的嘉积鸭SNP分子标记设计合成的芯片，可以实现基因分型，作为嘉积鸭首款全基因组液相芯片，为嘉积鸭全基因组关联分析、全基因组选择、品种鉴定及选育、遗传多样性评估、种质资源和亲缘关系鉴定、遗传图谱构建及基因定位、分子标记辅助育种等提供了重要的工具，有效缩短了嘉积鸭育种进程，提高嘉积鸭育种效率，在嘉积鸭育种中的多个领域具有广泛的应用场景。

Description

一种嘉积鸭SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于家禽遗传育种技术领域，具体涉及一种嘉积鸭SNP分子标记及其应用。
背景技术
DNA分子标记技术是现代分子育种中的重要工具，传统的分子标记在动植物遗传改良等领域发挥着重要作用。例如以分子杂交为基础的DNA标记技术(限制性片段长度多态性标记-RFLP)和以聚合酶链式反应为基础的各种DNA指纹技术(随机扩增多态性DNA标记-RAPD、简单序列重复标记-SSR、序列标志位点-STS等)。但这两种传统的分子标记由于在基因组分布数量少、实验操作复杂，难以实现大规模的商业化育种应用。单核苷酸多态性SNP主要是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性，形式多样，包括单碱基的缺失、***、转换及颠换等。SNP标记作为目前应用最广泛的分子标记，具有遗传稳定性高、位点丰富且分布广泛、富有代表性、检测快速、易实现自动化分析等优点，是目前广泛应用的新一代分子标记，也是用于高通量分子标记开发的理想基因分型目标。
近年来，用于SNP位点分型的主要技术包括全基因组重测序和基因芯片。全基因组重测序是通过对已有参考序列的物种的不同个体进行基因组测序，并以此为基础进行个体或群体水平的遗传差异性分析。虽然测序成本在近年明显下降，但对成百上千的样本数量而言，仍然面临成本昂贵和海量的数据存储分析的巨大挑战。建立新型杂交和测序方法以面对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要。为了解决这类技术难题，基于对目标位点和区域进行基因分型的技术-基因芯片出现并得以广泛运用，以较小的测序量实现覆盖全基因组的高密度分子标记检测。现有的基因芯片主要包括固相芯片和液相芯片两种，固相芯片是将大量的探针分子固定在支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样本的基因分型结果。液相芯片是通过对目标位点或区域附近设计生物素标记探针，然后与样本gDNA进行杂交捕获后再扩增，最后经二代测序和数据分析后获得目标位点的基因型。与固相芯片相比，液相芯片除了检出率高和准确性高外，还具有位点检测灵活、检测周期短、成本低等优势；另外，基于扩增原理而言，液相芯片不仅能对目标位点进行分型，对该位点周围探针覆盖范围内的其它SNP位点也可以进行分型。
嘉积鸭属瘤头鸭，俗称番鸭；是海南省四大名菜之一，被***定为世界遗传多样性保护的物种之一。其优良遗传背景与长期热带岛屿气候条件及独特喂养方式相互作用造就了嘉积鸭脯大肉厚、皮白滑脆、肉嫩、骨软、脂肪少等优异品质特性。但由于嘉积鸭分子育种工具的缺乏，保护和选育工作相对粗放，且没有持续性，导致嘉积鸭品种混杂、优良性状退化严重、直接影响了经济效益。目前在嘉积鸭育种领域，国内外均未见育种芯片的相关报道，随着中国科学院昆明动物科学研究所、中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所和海南省农业科学院畜牧兽医研究所对嘉积鸭参考基因组的组装成功，同时为了缩短嘉积鸭育种进程，提高嘉积鸭选择育种的效率，加快新品种培育步伐，亟需开发一款覆盖全基因组、通量高、灵活性强、单个标记数据成本低的嘉积鸭全基因组SNP液相芯片，以进一步提升我国嘉积鸭行业的国际竞争力。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出本发明提出一种嘉积鸭SNP分子标记。
本发明还提出一种具有上述嘉积鸭SNP分子标记的基因芯片。
本发明还提出一种具有上述嘉积鸭SNP分子标记的试剂盒。
本发明还提出一种上述嘉积鸭SNP分子标记、基因芯片和试剂盒的应用。
根据本发明的一个方面，提出了一种嘉积鸭SNP分子标记，包括20327个SNP分子标记中的至少一种，所述20327个SNP分子标记的物理位置是基于番鸭的参考基因组进行序列比对确定的，位点信息具体如下：
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在本发明的一些实施方式中，所述SNP位点的位置信息采用染色体编号：物理位置的形式进行表示。
在本发明的一些实施方式中，所述20327个SNP分子标记如SNP00001-20327所示；SNP00001-20327的具***点信息如上表从上至下，从左至右依次排序。
根据本发明的第二方面，提出了一种嘉积鸭SNP芯片，所述SNP芯片包括用于检测上述的嘉积鸭SNP分子标记的引物组和/或液相探针。
根据本发明的第三方面，提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测上述的嘉积鸭SNP分子标记的引物组和/或液相探针。
根据本发明的第四方面，提出了上述嘉积鸭SNP分子标记、试剂盒或嘉积鸭SNP芯片的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在嘉积鸭基因分型中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在嘉积鸭全基因组关联分析中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在嘉积鸭聚类分析及亲缘关系鉴定中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在嘉积鸭遗传多样性鉴定中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在嘉积鸭育种或辅助育种中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述育种或辅助育种包括辅助的主效基因选择、分子辅助育种、全基因组选择育种、嘉积鸭品种鉴定、遗传图谱构建、基因定位、物种进化分析和种质资源鉴定中的至少一种。
根据本发明的第五方面，提出了一种嘉积鸭育种方法，包括如下步骤：利用上述嘉积鸭SNP分子标记、试剂盒或嘉积鸭SNP芯片中的至少一种对待测样本的DNA进行检测，选择合适的嘉积鸭进行后续育种；所述嘉积鸭育种方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
在本发明的一些实施方式中，所述检测基于靶向捕获测序技术进行。
根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明基于165份测序数据中挖掘并筛选得到高多态全基因组位点18942个和群体分化指数高的位点1385个，利用这些位点设计合成的芯片可以实现基因分型，作为嘉积鸭首款全基因组液相芯片，为嘉积鸭全基因组关联分析、全基因组选择、品种鉴定及选育、遗传多样性评估、种质资源和亲缘关系鉴定、遗传图谱构建及基因定位、分子标记辅助育种等提供了重要的工具，有效缩短了嘉积鸭育种进程，提高嘉积鸭育种效率，在嘉积鸭育种中的多个领域具有广泛的应用场景。同时，本发明所述的嘉积鸭20K液相芯片基于靶向捕获测序技术，不仅能对目标位点进行分型，对该位点周围探针覆盖范围内的其它SNP位点也可以进行分型，因此可以得到比目标位点更多的SNP分型信息。与固相芯片相比，本发明在位点选择和样本检测数量上灵活性强，分型成本低等，同时依托二代测序平台，为大规模分型提供技术手段。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例2中的嘉积鸭20K cGPS液相芯片SNP位点在染色体上的分布图；
图2为本发明实施例3中的cGPS液相芯片流程检测示意图；
图3为本发明实施例4中的嘉积鸭20K cGPS液相育种芯片样本检出率结果图；
图4为本发明实施例4中的嘉积鸭20K cGPS液相育种芯片重复样本基因型一致率结果图；
图5为本发明实施例5中的嘉积鸭20K cGPS液相芯片聚类分析图；
图6为本发明实施例6中的嘉积鸭20K cGPS液相芯片GWAS应用结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种嘉积鸭SNP分子标记，包括20327个SNP位点，所述20327个SNP位点的物理位置是基于番鸭的参考基因组(序列参考文章Chromosome-level genomeassembly of the Muscovy duck provides insight into fatty liversusceptibility，生物项目登录号:PRJCA009398(登录号:GWHBJBF0000000))进行序列比对确定的，所述20327个SNP分子标记如发明内容部分(具体信息如发明内容表格中)所示。其筛选过程具体如下：
1、嘉积鸭全基因组重测序
嘉积鸭多样性样本收集和全基因组重测序：选择丰富多样的不同嘉积鸭种群165只进行全基因组重测序，使用磁珠法从鸭血中提取DNA，并利用1％的琼脂糖凝胶电泳和Qubit对DNA的完整性和浓度进行测定分析。每个gDNA样本随机打断后加上测序接头后进行检测，采用MGI的DNBSEQ-T7高通量测序平台对文库进行上机测序。
经测序后获得原始数据后，利用基因组比对软件BWA，比对算法为bwa mem默认参数。将每个样本的过滤后的Clean Reads比对到参考基因组上，统计比对结果。基于比对后的BAM文件；然后用Picard-Mark Duplicates去重；再通过GATK检测每个样品全基因组中所有的潜在多态性SNP位点和INDEL位点，得到单样本的GVCF；最后采用GATK-CombineGVCFs对所有样本GVCF进行合并。对于合并后的SNP位点再通过以下标准进行初步过滤：“QD<2.0||FS>60.0||MQ<35.0||MQRankSum<-12.5||Read PosRankSum<-8.0||DP>6950”；经过滤，获得包含所有样本SNP变异信息的.vcf文件。
2、位点筛选
从包含所有样本SNP变异信息的.vcf文件中对位点的MAF值、检出率、杂合率及测序深度进行计算与统计，按照MAF＞0.05、SNP位点检出率≥90％、杂合率≤35％、测序深度≥10X筛选到目标位点集648895个(包括群体分化指数高的位点1385个)。
对筛选到目标位点集进行探针设计，探针设计原理是，针对所有的目标位点在其左右100bp范围内设计探针，探针长度一般为100bp，GC含量在20％-80％之间。根据探针设计结果，去除在基因组上无法唯一比对、侧翼序列中包含重复序列的探针。基于均匀分布的原则，优选出20327个SNP位点作为目标位点进行合成，平均间距为45Kb。
实施例2
本实施例提供一种嘉积鸭全基因组液相基因芯片。
根据实施例1制备得到的探针，制备得到嘉积鸭全基因组液相基因芯片(20K芯片)，嘉积鸭20K cGPS液相芯片SNP位点在染色体上的分布图如图1所示，平均间距为45Kb。
实施例3 20K SNP液相芯片在检测嘉积鸭DNA样本中的应用
为验证20K SNP液相芯片的基因分型效果，利用实施例2获得的20K SNP液相芯片对51份嘉积鸭材料进行基因分型检测，实验中设置7次重复，共产生58份数据。具体步骤如下：
1、嘉积鸭gDNA提取和检测
采集51份嘉积鸭的新鲜血液，利用磁珠法从鸭血中提取gDNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳方法分析gDNA的完整性和纯度，使用Qubit对浓度进行准确定量。
2、cGPS实验流程
(1)取定量质检合格的gDNA 200ng，利用酶切试剂将DNA酶切成100-500bp大小片段后，加入Taq酶进行末端修复；
(2)使用T4连接酶，将接头片段连接至DNA两端，使用片段分选磁珠对连接产物进行纯化和文库扩增，完成文库构建；
(3)将质检合格的文库与封阻试剂、RNA酶抑制剂Rnase Block、20K液相芯片探针置于PCR仪上进行杂交反应，55℃杂交孵育过夜(16-24h)；
(4)利用链霉亲和素将杂交产物进行捕获，将捕获后的文库进行扩增富集，采用华大测序平台进行PE150测序；
(5)高通量测序后的原始数据经过质控过滤等处理，使用fastp软件去除含有接头污染的Reads和低质量的Reads。应用BWA软件与目标基因组进行比对，再利用GATK软件对测序结果进行变异位点分析，获得目的位点的基因型分型结果，流程示意图如图2所示。
经测序与数据分析，结果如图3所示，从图中可以看出，58份样本位点检出率在99.65％-99.85％之间，平均检出率为99.82％。7个重复样本基因型结果比对结果如图4所示，从图中可以看出，一致率在99.39％-99.75％之间，平均一致率为99.59％。通过对20KSNP液相芯片的基因分型效果评估结果显示，本发明制备得到的20K SNP液相芯片检测稳定性好，目标位点检出率高，分型结果准确可靠。
实施例4嘉积鸭20K SNP液相芯片群体结构分析和全基因组关联分析
(1)群体结构分析
利用实施例2制备的嘉积鸭20K SNP液相芯片对世界各地的嘉积鸭(品种已知)进行群体结构分析，分析结果如图5所示，从图中可以看出，实施例2制备的嘉积鸭20KSNP液相芯片能有效的区分不同来源的地方嘉积鸭品种，结果与预期相符。
(2)全基因组关联性分析
实验方法：利用实施例2制备的嘉积鸭20K SNP液相芯片对236份嘉积鸭(品种已知)进行全基因组关联分析，分析结果如图6所示，从图中可以看出，实施例2制备的嘉积鸭20KSNP液相芯片能有效的区分不同来源的地方嘉积鸭品种，结果与预期相符。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种嘉积鸭SNP分子标记，其特征在于，包括：包括20327个SNP分子标记中的至少一种，所述20327个SNP分子标记的物理位置是基于番鸭的参考基因组进行序列比对确定的；所述SNP分子标记位点信息具体如下：
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2.一种嘉积鸭SNP芯片，其特征在于，所述SNP芯片包括用于检测权利要求1所述的嘉积鸭SNP分子标记的引物组和/或液相探针。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测权利要求1所述的嘉积鸭SNP分子标记的引物组和/或液相探针。
4.权利要求1所述的嘉积鸭SNP分子标记、权利要求2所述嘉积鸭SNP芯片和权利要求3所述的试剂盒中的至少一种在嘉积鸭基因分型中的应用。
5.权利要求1所述的嘉积鸭SNP分子标记、权利要求2所述嘉积鸭SNP芯片和权利要求3所述的试剂盒中的至少一种在嘉积鸭全基因组关联分析中的应用。
6.权利要求1所述的嘉积鸭SNP分子标记、权利要求2所述嘉积鸭SNP芯片和权利要求3所述的试剂盒中的至少一种在嘉积鸭聚类分析及亲缘关系鉴定中的应用。
7.权利要求1所述的嘉积鸭SNP分子标记、权利要求2所述嘉积鸭SNP芯片和权利要求3所述的试剂盒中的至少一种在嘉积鸭遗传多样性鉴定中的应用。
8.权利要求1所述的嘉积鸭SNP分子标记、权利要求2所述嘉积鸭SNP芯片和权利要求3所述的试剂盒中的至少一种在嘉积鸭育种或辅助育种中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述育种或辅助育种包括辅助的主效基因选择、分子辅助育种、全基因组选择育种、嘉积鸭品种鉴定、遗传图谱构建、基因定位、物种进化分析和种质资源鉴定中的至少一种。
10.一种嘉积鸭育种方法，其特征在于，包括如下步骤：利用权利要求1所述的嘉积鸭SNP分子标记、权利要求2所述嘉积鸭SNP芯片和权利要求3所述的试剂盒中的至少一种对待测样本的DNA进行检测，选择合适的嘉积鸭进行后续育种。
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