CN116855414B - 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在发酵豆制品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵食品技术领域，尤其涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其在发酵豆制品中的应用。所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，菌株编号为GZUA1，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2023666。本发明以GZUA1纯种发酵豆豉，豆豉产品氨基酸态氮达0.94％，较自然发酵豆豉提高了1.12倍；蛋白酶活力达538.28U/g；总生物胺水平显著下降，仅为10.65mg/kg，较传统自然发酵降低了10.68倍，其中苯乙胺、酪胺、精胺与自然发酵豆豉相比分别降低了2.60倍、10.54倍、42.61倍。该菌株在最优发酵工艺参数下应用，可全面提升发酵豆制品品质及食用安全性，为发酵豆制品工业化安全生产提供优质菌株及技术支撑。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌及其在发酵豆制品中的应用
技术领域
本发明属于微生物发酵食品技术领域，尤其涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其在发酵豆制品中的应用。
背景技术
豆豉是一种传统的发酵豆制品，一般采用黄豆或黑豆浸泡、蒸/煮熟后，经微生物发酵而制成。多用于调味，也可入药，深受百姓喜爱。目前，以细菌型发酵豆豉最为常见，传统生产又多以自然发酵为主，存在菌相复杂、菌源难控等工艺问题，且产品品质稳定性差、受季节温/湿度、环境卫生状况/微生物区系等因素影响大。因此，采用人工接种或菌群强化发酵技术，成为有效控制杂菌生长，实现标准化生产，稳定产品品质的科学路径与方法；另一方面，自然发酵，复杂的菌相及野生菌株随机参与，也带来了安全隐患，尤其以蛋白质为主的发酵豆制品生产中，氨基酸脱羧酶阳性菌株发酵形成的生物胺问题，越来越受到广泛关注。
生物胺是一种低分子量的有机含氮化合物，分为脂肪族、芳香族和杂环胺等；脂肪族包括腐胺、尸胺、精胺和亚精胺，芳香族包括酪胺和苯乙胺，而组胺和色胺等则为杂环胺。生物胺可由蛋白质分解产生的氨基酸，经微生物代谢产生的氨基酸脱羧酶脱羧形成。生物胺多产生于高蛋白发酵食品中，如奶酪、啤酒、发酵大豆食品等，现已成为发酵食品潜在的安全问题之一。研究表明，过量的生物胺会损害人体神经***，甚至导致致癌物质亚硝酸胺形成，产生头疼、恶心、皮疹、腹泻等不良反应，甚至诱发高血压、偏头疼、癌症等。
因此，筛选豆制品优良发酵菌株，利用其高蛋白酶活力及不产或低产生物胺特性，构建发酵豆制品生产模型，通过菌群强化、人工控酵，从工艺上品控发酵过程，提升产品品质；从生产菌株上科学管控安全风险因子，是实现豆制品科学化、规范化、安全化生产的有效路径，可为产业发展提供优质菌株和可行性方案与技术参数。
现有一些针对发酵豆制品及相应菌种的筛选技术研究，如专利号为CN201710279437.7的专利文件公开了一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用，其筛选的贝莱斯芽孢杆菌SN-14来源于贵州本土豆豉，菌株的安全性高，产纳豆激酶活力高。专利号为CN201810063421.7的专利文件公开了一种贝莱斯芽孢杆菌及其分离筛选方法与应用，在进行发酵的时候，具备高产蛋白酶、淀粉酶和豆豉纤溶酶的能力。文献《高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学稳定性的研究》(高泽鑫，硕士论文，2018)采用酪蛋白平板法和琼脂糖—纤维蛋白原平板法从贵州本土特色食品(豆豉)的样品中分离得到15株高产纳豆激酶菌株，其中得到SN-14菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。通过测试，各纳豆产品的生物胺含量在49.09～73.71mg/kg，SN-14产生物胺含量较低。
上述技术研究仅能够说明贝莱斯芽孢杆菌具有安全高、产生物胺含量较低的特性，但由于生物胺的形成原因是非常繁杂的，当来源不同、筛选方法不同时，菌株间的差异也会比较明显，文献中测试的各纳豆产品的生物胺含量在49.09～73.71mg/kg，生物胺含量依然较高，本发明研究人员通过对贝莱斯芽孢杆菌进行科学筛选，意在进一步降低发酵豆制品所产生的生物胺含量。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了一种贝莱斯芽孢杆菌及其在发酵豆制品中的应用。
具体是通过以下技术方案实现的：
一种用于发酵豆制品的专用菌，其特征在于，所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，菌株编号为GZUA1，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2023666，保藏日期为2023年04月28日。
进一步，所述贝莱斯芽孢杆菌GZUA1于优质发酵豆豉中分离得到。
进一步，所述贝莱斯芽孢杆菌GZUA1于20-45℃在营养琼脂培养基上生长，呈微黄色、表面干燥、不透明，呈形状不规则、边缘不齐整；其革兰氏染色试验呈阳性(+)，显微镜下观察其菌体为杆状、芽孢中生；不产H2S、吲哚、氨气。
进一步，所述贝莱斯芽孢杆菌GZUA1具有高蛋白酶活、低产生物胺的特性。
进一步，所述贝莱斯芽孢杆菌GZUA1对磺胺类、大环内酚类、哇诺酮类及氨基糖昔类抗生素表现出高度敏感；且对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有较强的抑制能力。
本发明还提供上述菌株在豆制品发酵中的应用。
所述应用中，将贝莱斯芽孢杆菌GZUA1应用于豆制品发酵，不但能显著提升发酵豆制品品质，还能有效降低豆制品中生物胺总量与组成，提高其食用安全性。
所述应用具体包括如下步骤：
(1)菌种活化：将经分离纯化及鉴定获得的贝莱斯芽孢杆菌GZUA1进行活化、纯检合格后斜面培养，备用；
(2)种子液制备：随后将贝莱斯芽孢杆菌GZUA1接种于营养肉汤液体培养基内，于20-45℃、100-200r/min下摇瓶培养12-72h，获得扩培种子液，备用；
(3)发酵：将步骤(2)所制的种子液，按4-12％的接种量，接种于经过挑选、清洗与高压蒸汽灭菌的黄豆基质中，混合均匀，置于20-45℃恒温培养箱中培养发酵1-5d。
进一步，上述步骤(2)中的扩培种子液的活菌数≥108CFU/m L。
本发明的有益效果在于：
本发明从发酵豆制品中筛选获得一株贝莱斯芽孢杆菌GZUA1，该菌具有高蛋白酶活、低产生物胺的特性，且不产H2S、吲哚、氨气，对磺胺类、大环内酚类、哇诺酮类及氨基糖昔类抗生素高度敏感，还对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见致病菌具有较强的抑制能力。
本发明以贝莱斯芽孢杆菌GZUA1纯种发酵豆豉，并以发酵剂，接种量、发酵时间和发酵温度为影响因素构建发酵模型，获得最优发酵工艺及参数。在该工艺及参数条件下，相比于传统自然发酵，豆豉产品颗粒饱满、色泽深黄、粘丝短而丰富，且豉香浓郁、无氨臭、发黑现象；豆豉产品氨基酸态氮达0.94％，较自然发酵豆豉提高了1.12倍；蛋白酶活力达538.28U/g；且总生物胺水平显著下降，仅为10.65mg/kg，较传统自然发酵降低了10.68倍，其中苯乙胺、酪胺、精胺与自然发酵豆豉相比分别降低了2.60倍、10.54倍、42.61倍。该菌株在最优发酵工艺参数下应用，可全面提升发酵豆制品品质及食用安全性，为发酵豆制品工业化安全生产提供优质菌株及技术支撑。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌GZUA1的菌落形态。
图2为贝莱斯芽孢杆菌GZUA1的菌体形态。
图3为菌株16SrDNA PCR扩增结果。
图4为菌株的16SrDNA***发育树，鉴定结果为：A1，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)；A2，甘氨酸芽孢杆菌(Bacillus glycinifermentans)；A3，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
图5为贝莱斯芽孢杆菌GZUA1发酵生产的豆豉产品照片。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
贝莱斯芽孢杆菌GZUA1的筛选
(1)分离和纯化：称取10g优质发酵豆制品放进80-110mL无菌水中，置于摇床上混合均匀，得到样液。将样液按1:9的比例加入无菌生理盐水中，依次进行梯度稀释，再取80-120μL涂布于营养琼脂平板上，于20-45℃下培养12-72h，挑取单菌落，多次划线纯化菌株，并接于斜面培养基保存备用。
(2)安全性能测评：将上述步骤(1)初筛出的菌株进行安全性能测评，内容包括硫化氢、吲哚、氨气试验：1)硫化氢试验：将菌株接种于硫酸亚铁半固体培养基中，于35～37℃培养24h，若产生黑色则为阳性，表明菌株产硫化氢；2)吲哚试验：将菌株小量接种于试验培养基管，于35～37℃培养24h后，取约2mL培养液，加入吲哚试剂2～3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，表明菌株产吲哚；3)氨气试验：对其发酵气体进行收集，检测有无氨气。
(3)蛋白酶活测评：将上述步骤(2)初筛出的菌株采用福林酚法进行酶活性测定。
(4)抗生素敏感性评价：将上述步骤(2)初筛出的菌株采用平板-纸片法进行抗生素敏感性评价。使用时无菌操作，将抗生素纸片贴附于涂布被检菌的培养基表面，37℃培养48h后，测量抑菌圈直径大小。抗生素种类包括氧派嗪青霉素、氯霉素、阿米卡星、红霉素、氟呱酸和复方新诺明。
(5)抑菌能力检验：将上述步骤(2)初筛出的菌株进行抑菌能力检验。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为抑菌实验的指示菌，用无菌生理盐水稀释至菌悬液浓度为1mL108CFU/mL。吸取0.1mL稀释后的指示菌菌悬液涂布于营养琼脂培养基上，静置5min后，用直径为6mm的无菌打孔器打孔，取50μL分离菌株离心后的发酵液，于4℃，12000r，冷冻离心10min，加入孔中，培养24～48h，观察是否出现抑菌圈，准确记录出现的抑菌圈直径，每株菌做2个平行实验。
生物胺形成测评：挑取经上述步骤(2)至(5)筛选得到的优质、安全菌株，接种于营养肉汤培养基内，37℃、150r/min下摇瓶培养24h。称取优质的大豆，洗净后，按一定比例加水，置于121℃高压蒸煮38min，蒸煮完成后滤水冷却，使用上述菌液进行接种。接种量约为每100g黄豆接种1mL 108CFU/mL的菌液，并在37℃下发酵3天。采用高效液相色谱法对发酵豆制品中生物胺进行定量分析。
实施例2
贝莱斯芽孢杆菌GZUA1的鉴定
按照形态学鉴定→生理生化鉴定→分子生物学鉴定的顺序，对实施例1筛选出的高酶活、低产生物胺的安全、优质菌株进行鉴定。
(1)形态学鉴定：观察筛选出来的菌株在营养琼脂平板上生长24h后菌落形态，并加以记录；再对其菌株革兰氏染色，观察菌株在显微镜下形态、排列方式、特殊结构及染色反应，拟初步鉴定至科、属。
(2)生理生化鉴定：进行糖发酵(葡萄糖、蔗糖、乳糖)产酸产气、硝酸盐还原、过氧化氢酶、液化明胶、柠檬酸盐利用、甲基红试验、水解淀粉等试验，拟鉴定至属、种。
(3)分子生物学鉴定：将纯化好的菌种进行16S rDNA测序，测序结果在核糖体数据库上进行序列比对，并将该序列在NCBI中的相关菌株的序列进行同源性比较，用MAGA7.0软件构建***发育树。
菌株GZUA1在营养琼脂平板上生长快速，菌落呈微黄色、表面干燥、不透明，呈形状不规则、边缘不齐整(如图1所示)，光学显微镜下观察其菌体为杆状、芽孢中生(如图2所示)，同时接触酶试验、氧化酶试验、V-P试验等均呈阳性，且均能利用淀粉、明胶等，经形态学和生理生化鉴定，拟鉴定为革兰氏阳性芽孢杆菌；经分子生物学鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(如图3、图4所示)。
实施例3
贝莱斯芽孢杆菌GZUA1在发酵豆豉中的应用
(1)菌株活化：将贝莱斯芽孢杆菌GZUA1活化、纯检合格后斜面培养，保藏备用。
(2)种子液制备：将贝莱斯芽孢杆菌GZUA1接种于营养肉汤液体培养基内，37℃、150r/min下摇瓶培养48h，获得扩培种子液，备用。
(3)发酵：将步骤(2)所制的种子液，按8％的接种量，接种于经过挑选、清洗与高压蒸汽灭菌的黄豆基质中，混合均匀，置于37℃恒温培养箱中培养发酵3d。
实施例4
贝莱斯芽孢杆菌GZUA1在发酵豆豉中的应用
(1)菌株活化：将贝莱斯芽孢杆菌GZUA1活化、纯检合格后斜面培养，保藏备用。
(2)种子液制备：将贝莱斯芽孢杆菌GZUA1接种于营养肉汤液体培养基内，37℃、150r/min下摇瓶培养48h，获得扩培种子液，备用。
(3)发酵：将步骤(2)所制的种子液，按6％的接种量，接种于经过挑选、清洗与高压蒸汽灭菌的黄豆基质中，混合均匀，置于39℃恒温培养箱中培养发酵3d。
实施例5
贝莱斯芽孢杆菌GZUA1发酵豆豉应用
(1)菌株活化：将贝莱斯芽孢杆菌GZUA1活化、纯检合格后斜面培养，保藏备用。
(2)种子液制备：将贝莱斯芽孢杆菌GZUA1接种于营养肉汤液体培养基内，37℃、150r/min下摇瓶培养48h，获得扩培种子液，备用。
(3)发酵：将步骤(2)所制的种子液，按10％的接种量，接种于经过挑选、清洗与高压蒸汽灭菌的黄豆基质中，混合均匀，置于37℃恒温培养箱中培养发酵2d。
对比例1
自然发酵
将黄豆洗净，置于高压蒸锅内以120℃蒸煮40min蒸熟。将蒸熟的黄豆从锅内放出后置于竹筛上，随即放入35-40℃发酵室中，依靠空气中自然存在的各种微生物进行制曲，发酵3d即可。
对比例2
菌株A2的筛选
(1)分离和纯化：称取10g发酵豆制品放进80-110mL无菌水中，置于摇床上混合均匀，得到样液。将样液按1:9的比例加入无菌生理盐水中，依次进行梯度稀释，再取80-120μL涂布于营养琼脂平板上，于20-45℃下培养12-72h，挑取单菌落，多次划线纯化菌株，并接于斜面培养基保存备用。
(2)安全性能测评：将上述步骤(1)初筛出的菌株进行安全性能测评，内容包括：硫化氢、吲哚、氨气试验：1)硫化氢试验：将菌株接种于硫酸亚铁半固体培养基中，于35～37℃培养24h，若产生黑色则为阳性；2)吲哚试验：将菌株小量接种于试验培养基管，于35～37℃培养24h后，取约2mL培养液，加入吲哚试剂2～3滴，轻摇试管，呈红色为阳性；3)氨气试验：对其发酵气体进行收集，检测有无氨气。
(3)蛋白酶活测评：将上述步骤(2)初筛出的菌株采用福林酚法进行酶活性测定。
(4)抗生素敏感性评价：将上述步骤(2)初筛出的菌株采用平板-纸片法进行抗生素敏感性评价。使用时无菌操作贴附于己涂布被检菌的培养基表面，37℃培养48h后，测量抑菌圈直径大小。抗生素种类包括氧派嗪青霉素、氯霉素、阿米卡星、红霉素、氟呱酸和复方新诺明。
(5)抑菌能力检验：将上述步骤(2)初筛出的菌株进行抑菌能力检验。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为抑菌实验的指示菌，用无菌生理盐水稀释至菌悬液浓度为1mL108CFU/mL。吸取0.1mL稀释后的指示菌菌悬液涂布于营养琼脂培养基上，静置5min后，用直径为6mm的无菌打孔器打孔，取50μL分离菌株离心后的发酵液，于4℃，12000r，冷冻离心10min，加入孔中，培养24～48h，观察是否出现抑菌圈，准确记录出现的抑菌圈直径，每株菌做2个平行实验。
生物胺形成测评：挑取经上述步骤(2)至(5)筛选得到的菌株，接种于营养肉汤培养基内，37℃、150r/min下摇瓶培养24h。称取优质的大豆，洗净后置于121℃高压蒸煮38min，蒸煮完成后将其滤干冷却，使用上述菌液进行接种。接种量约为每100g黄豆接种1mL108CFU/mL的菌液，并在37℃下发酵3天。采用高效液相色谱法对发酵豆豉中生物胺进行定量分析。
对比例3
菌株A3的筛选
(1)分离和纯化：称取10g发酵豆制品放进80-110mL无菌水中，置于摇床上混合均匀，得到样液。将样液按1:9的比例加入无菌生理盐水中，依次进行梯度稀释，再取80-120μL涂布于营养琼脂平板上，于20-45℃下培养12-72h，挑取单菌落，多次划线纯化菌株，并接于斜面培养基保存备用。
(2)安全性能测评：将上述步骤(1)初筛出的菌株进行安全性能测评，内容包括硫化氢、吲哚、氨气试验：1)硫化氢试验：将菌株接种于硫酸亚铁半固体培养基中，于35～37℃培养24h，若产生黑色则为阳性，证明菌株产硫化氢；2)吲哚试验：将菌株小量接种于试验培养基管，于35～37℃培养24h后，取约2mL培养液，加入吲哚试剂2～3滴，轻摇试管，呈红色为阳性；3)氨气试验：对其发酵气体进行收集，检测有无氨气。
(3)蛋白酶活测评：将上述步骤(2)初筛出的菌株采用福林酚法进行酶活性测定。
(4)抗生素敏感性评价：将上述步骤(2)初筛出的菌株采用平板一纸片法进行抗生素敏感性评价。使用时无菌操作贴附于己涂布被检菌的培养基表面，37℃培养48h后，测量抑菌圈直径大小。抗生素种类包括氧派嗪青霉素、氯霉素、阿米卡星、红霉素、氟呱酸和复方新诺明。
(5)抑菌能力检验：将上述步骤(2)初筛出的菌株进行抑菌能力检验。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为抑菌实验的指示菌，用无菌生理盐水稀释至菌悬液浓度为1mL108CFU/mL。吸取0.1mL稀释后的指示菌菌悬液涂布于营养琼脂培养基上，静置5min后，用直径为6mm的无菌打孔器打孔，取50μL分离菌株离心后的发酵液，于4℃，12000r，冷冻离心10min，加入孔中，培养24～48h，观察是否出现抑菌圈，准确记录出现的抑菌圈直径，每株菌做2个平行实验。
(6)生物胺形成测评：挑取经上述步骤(2)至(5)筛选得到的菌株，接种于营养肉汤培养基内，37℃、150r/min下摇瓶培养24h。称取优质的大豆，洗净后置于121℃高压蒸煮38min，蒸煮完成后将其滤干使用上述菌液进行接种。接种量约为每100g黄豆接种1mL108CFU/mL的菌液，并在37℃下发酵3天。采用高效液相色谱法对发酵的豆豉中生物胺进行定量分析。
下面将具体实施例与对比例进行比较
实施例1与对比例1-3进行对比分析
(1)不同菌株发酵安全性能测评
表1菌株安全性能
注：“+”90％以上的菌株阳性“-”90％以上的菌株阴性
从表1可知，菌株GZUA1、A2、A3均不产H2S、吲哚、氨气。在豆制品自然发酵过程中，由于微生物的作用，会产生H2S、吲哚以及氨气等有害物质，不仅影响产品的气味和色泽，同时也会降低其适口性以及安全性，成为发酵豆制品的安全隐患，所以将H2S、吲哚以及氨气作为评价发酵豆制品安全性的重要指标之一。因此，菌株GZUA1、A2、A3均可作为豆制品发酵安全初筛菌株备用。
(2)不同菌株蛋白酶活力测评
表2菌株蛋白酶活
从表2可知，GZUA1、A3株菌均表现出高蛋白酶活性。其中，菌株GZUA1与菌株A3的蛋白酶活力差异不显著(p＞0.05)，均高于150U/mL，菌株A2与菌株GZUA1、A3的蛋白酶活差异极显著，其仅为98U/mL(p<0.01)。
(3)不同菌株对抗生素的敏感性及抑菌能力
表3菌株对抗生素药敏试验结果
注：“M”表示敏感；“S”表示高度敏感，抑菌圈直径mm。
表4菌株的抑菌能力
从表3可知，3株菌对7大类常见抗生素均表现出不同程度的敏感性，尤其对磺胺类、大环内酚类、哇诺酮类及氨基糖昔类抗生素表现出高度敏感。这表明作为生产菌株，3株菌均不含常用抗生素的耐药性质粒，故不存在将耐药基因传递给肠道菌群的风险，可作为安全性菌株备用。从表4可知，3株菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用，其中抑制大肠杆菌和抑制金黄色葡萄球菌作用最强的均为GZUA1。由此可见，贝莱斯芽孢杆菌GZUA1的抗菌活性更突出。
(4)不同菌株发酵豆豉的生物胺水平
表5不同菌株发酵豆豉中生物胺含量(mg/kg)
注：ND表示未检出，图中数据里标注不同字母的组别表示具有显著性差异(p<0.05)
从表5可以看出，对比例1条件下的豆豉中检出8种生物胺，对比例2、对比例3豆豉中检出5种生物胺，而实施例3-5发酵豆豉中仅检出4种生物胺。对比例3发酵豆豉中色胺、苯乙胺含量最高，分别为7.06mg/kg、8.78mg/kg；腐胺存在于对比例1和对比例3中；尸胺和亚精胺仅存在于对比例1中，尤其是尸胺高达11.50mg/kg；在对比例1和对比例2中还存在组胺，分别为8.57mg/kg和0.44mg/kg，而实施例3-4中均未检出。实施例3-5与对比例1-3比较，酪胺显著降低，平均值仅为3.29mg/kg(p<0.05)；而人工接种菌群强化发酵的实施例3-5与对比例2-3精胺含量相对较低<4.00mg/kg，对比例1(自然发酵组)则高达57.52mg/kg。由此可知，人工接种菌群强化发酵可有效控制发酵豆制品中生物胺水平，且采用的菌株不同，生物胺含量还会有不同程度的变化。因此，采用优质安全益酵菌株人工接种菌群强化发酵豆制品可有效提升产品安全性。
经鉴定，菌株A2为甘氨酸芽孢杆菌(Bacillus glycinifermentans)，菌株A3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。它们与菌株GZUA1是在相同筛选条件下，筛选出的发酵体系中的优势菌株。但结合安全性能、蛋白酶活、抗生素敏感性、抑菌能力和生物胺形成水平的测试结果，进行综合评价分析，它们的发酵生物胺水水平、抑菌能力以及菌株蛋白酶活与菌株GZUA1存在显著差异，没有GZUA1来得优秀。因此选择菌株GZUA1作为后续豆豉纯种发酵菌株。
(5)不同菌株发酵豆豉的总生物胺水平
表6不同菌株发酵豆豉的总生物胺总量
注：图中数据里标注大写字母的组别表示具有极显著性差异(p<0.01)。
表6结果显示实施例3-5总生物胺水平有效控制在<16.00mg/Kg范围内。自然发酵对比例1总生物胺水平最高，达113.69mg/Kg。对比例2和对比例3分别为27.89mg/Kg和33.29mg/Kg，与实施例3-5和对比例1均存在极显著差异(p<0.01)。因此，实施例3-5采贝莱斯芽孢杆菌GZUA1发酵，可有效控制发酵豆制品总生物胺水平，极显著低于对比例1-3，更适合作为益酵型低生物胺菌株应用于发酵产品。
对比文献1《高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学稳定性的研究》(高泽鑫)中贝莱斯芽孢杆菌SN-14发酵总生物胺水平为54.31mg/Kg，而本专利菌株GZUA1的实施例总生物胺水平远低于该数据。生物胺的形成是非常繁杂的。但可以肯定的是，与微生物密切相关。本技术中生物胺的总量之所以低于对比文献1的数据，包含筛选方法、菌株区别和技术目的三大原因。菌株SN-14是从遵义豆豉、贵阳豆豉、大方臭豆腐、铜仁豆豉、毕节臭豆腐、安顺豆豉和青岩豆腐等9种不同贵州本土特色食品中，经由酪蛋白平板法、琼脂糖—纤维蛋白原平板法和紫外分光光度法等方法筛选得到；而在本技术方案中，菌株GZUA1是以贵州特色优质传统发酵细菌型豆豉产品为原料，经由优势菌株筛选、安全性能检测、蛋白酶活测评、抗生素敏感性评价、抑菌能力检验、生物胺水平检测等方法获得的益酵安全性菌株。在分类学上，贝莱斯芽孢杆菌是种名，菌株GZUA1与菌株SN-14分类地位均属于芽孢杆菌属。它们是不同来源的相同种(菌株)。但在长期生境中，自然选择、优胜劣汰、自发突变等，会使不同来源相同种(菌株)之间产生差异，因而使它们具备不同的生产性能。此外，本技术方案的目的是解决自然细菌发酵豆豉产生有害物质生物胺的问题，而对比文献1的目的是筛选一株具有高产纳豆激酶能力的菌株用于纳豆产品生产。因此，本专利筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌GZUA1更具有优势。
综上，采用此发明的益酵安全菌株贝莱斯芽孢杆菌GZUA1，发酵生产豆豉等豆制品，不仅能提高产品品质，使产品颗粒饱满、色泽深黄、粘丝短而丰富，且具有典型的豉香，同时还能有效控制产品中的生物胺组成与含量，获得安全的低生物胺发酵产品(如图5所示)。作为益酵安全生产菌株，贝莱斯芽孢杆菌GZUA1具有极强的应用前景。
在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员做出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。

Claims (3)

1.一种用于发酵豆制品的专用菌，其特征在于，所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），菌株编号为 GZUA1，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCCNO:M 2023666 ，保藏日期为 2023 年 04 月 28 日。
2.如权利要求1所述的专用菌在发酵豆制品中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将经分离纯化及鉴定获得的贝莱斯芽孢杆菌GZUA1进行活化、纯检合格后斜面培养，备用；
（2）种子液制备：随后将贝莱斯芽孢杆菌GZUA1接种于营养肉汤液体培养基内，于20-45℃、100-200r/min下摇瓶培养12-72h，获得扩培种子液，备用；
（3）发酵：将步骤（2）所制的种子液，按4-12%的接种量，接种于经过挑选、清洗与高压蒸汽灭菌的黄豆基质中，混合均匀，置于20-45℃恒温培养箱中培养发酵1-5d。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中的扩培种子液的活菌数≥108CFU/mL。
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