CN112779181B - 常压室温等离子体诱变菌在抗酸奶后酸化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株在抗酸奶后酸化中的应用，通过筛选诱变菌株、对其生长特性、菌株耐酸性活性及抗后酸化验证试验，诱变菌株的H+‑ATP酶活性均低于原始菌株，其中诱变菌株中H+‑ATP酶活性最低为0.57U/mg；将诱变菌株接种于全脂牛乳中，测定发酵乳的pH值及酸度，对照组pH变化最大，10d后下降趋势减缓，菌株BJT‑7变化幅度最小，没有出现急速下降期；菌株BJT‑7在MRS培养基中连续传代培养5代，在12℃条件下储藏6d，测定在储藏6d后pH和滴定酸度，表明常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT‑7具有较好的稳定遗传性，并具有显著的抗酸奶后酸化作用，为适应益生菌开发应用的具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种常压室温等离子体联合新霉素诱变副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)菌株及其在抗酸奶后酸化中的应用。
背景技术
酸奶是一种营养价值丰富的饮品，具有整理肠道、抗菌、缓解乳糖不耐受症、改善便秘、降低胆固醇、抗癌等功效。酸奶是各国人民都非常喜爱的一类发酵乳制品，已逐渐成为日常食品的重要组成部分。酸奶是活菌乳制品，正常发酵结束后，在产品贮存、运输、销售、食用前这一过程中，菌体仍要生长繁殖，发生后酸化现象，即酸奶的pH值继续下降，以致出现消费者不可接受的过酸味和感官质量下降，使酸奶的保质期较短，酸奶中加入的益生菌的存活率大幅下降，后酸化还对酸奶的货架期具有不利影响。酸奶的货架期根据各国家为 30天至50天不等。在此时间期间，后酸化改变酸奶的质量，从而导致酸味产品和高乳清分离。通常通过在储存期间将产品保持在4℃至8℃的温度来尽可能地维持酸奶的质量。在此温度下，细菌仅具有低活性。然而，在很多国家，难以在储存期间维持冷却链。因此，在不断增加酸奶的花色品种和营养价值的同时，酸奶保质期短的问题日益突出，这在一定程度上影响了酸奶产业的发展。
对于抗后酸化的研究，目前主要集中在发酵后快速冷却、高压处理等物理方法，添加防腐剂、细菌素等化学方法以及诱变育种等生物方法。其中物理、化学方法以及两种方法的结合使用虽然已经在一定程度上延缓了酸奶的后酸化，但是还不能从源头上解决酸奶的后酸化问题。对菌种在分子水平进行改造已经成为当前研究的焦点，比物理和化学方法更加经济有效，也能从源头解决酸奶的后酸化问题。对于菌种的改良其实主要还是通过控制乳酸菌的产酸来控制后酸化过程，但是仍存在问题需要进一步研究。一是益生菌的数量级一般要达到106CFU/mL以上才能起到益生作用，对于诱变育种得到的酸敏感性菌株，其耐酸机制减弱，将导致在人肠道增殖能力降低，可能就无法达到应有的益生菌作用。如何在菌株的耐酸性和减弱后酸化之间寻找一个平衡点至关重要。二是诱变育种虽然可能在根本上解决酸奶后酸化的问题，但是传统诱变育种工作量大、耗时长，因此，酸奶后酸化防治中发酵剂的研制至关重要，方法和问题同时存在，需要不断去探索解决。副干酪乳杆菌为乳杆菌属干酪乳杆菌的一个亚种。常被用作乳制品的发酵剂。是近年来广大学者比较关注的乳酪菌。酸奶进入人体内，即使该该菌进入胃肠道中，副干酪乳杆菌在肠道内生产很好，保持良好的生长状态。进而发挥有益于人体的作用，促进人体的健康。
常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)是常压非平衡放电等离子体的一种。常压室温等离子体诱变与传统的诱变方法相比较，其设备更精良，操作方法更简易，安全系数更高，诱变频率高，更重要的是对环境没有污染。ARTP所激发出的活性粒子能够对蛋白质及细胞结构都具有一定的影响，并通过对遗传物质损伤机制的多样性，获得多样的诱变体，在多种微生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)和酵母菌种选育中得到成功运用。目前在国内已有使用其他诱变方法如重离子束辐照法诱变选育高产酸乳酸菌的研究，且目前利用ARTP诱变选育植物乳杆菌细菌素高产菌株的研究较多，但鲜有利用ARTP诱变选育高产酸副干酪乳杆菌的报道，由于副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)自身具有良好的耐酸能力及较强的黏附功能，能够耐受人体胃肠道的防御机制并在肠道内定殖和较优的生理功能等特点，至今未见综合采用经常压室温等离子体联合新霉素诱变获得新菌种并应用在酸奶后酸化中。
发明内容
针对诱变育种在酸奶后酸化控制中的优势和问题并存的技术现状，亟待寻找一种稳定、安全且能有效平衡耐酸性和减弱后酸化的菌株。本发明旨在于提供一种常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌 (Lactobacillus.paracasei)BJT-7及其在抗酸奶后酸化中的应用。采用常压室温等离子体联合新霉素诱变副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)获得一株新菌种副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7，通过优化诱变工艺、调整新霉素浓度、对诱变菌株的生长特性、耐酸性活性及抗后酸化进行对比验证试验，菌株BJT-7的H+-ATP酶活性均低于原始菌株和其他诱变菌株，其H+-ATP酶活性为0.57U/mg；菌株BJT-7在培养基中连续传代培养5代，在12℃条件下储藏 6d，测定在储藏6d后pH和滴定酸度，表明菌株BJT-7具有较好的稳定遗传性；将其应用于全乳发酵，检测发酵乳pH值和酸度变化，菌株BJT-7发酵乳在储藏期间变化幅度最小，没有出现急速下降期，表明本发明筛选出一株安全且有效的抗后酸化菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7，具有显著的抗酸奶后酸化作用，为适应益生菌开发应用的具有重要意义。
本发明中，菌种副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7是副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)经常压室温等离子体联合新霉素诱变获得，并经过本领域熟知公认的菌种***分子水平鉴定及菌种的生理生化***试验验证，证实获得的副干酪乳杆菌范畴内属于一种典型的新菌种，该菌种副干酪乳杆菌 (Lactobacillus.paracasei)BJT-7已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCCNo.20834，保藏日期：2020年9月27日。
本发明中，副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7的基因序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明中，副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7的培养基为：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸取物10.0g/L，酵母提取液5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸二胺2.0g/L，吐温801.0g/L，七水硫酸镁0.05g/L，碳酸钙 20.0g/L，琼脂20.0g/L，pH＝6.8。
同时，本发明提供上述常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7的培养方法，具体包括如下步骤：
(1)将保存的副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)接种至培养基中进行活化和扩大培养，离心收集对数生长期的菌体，将菌体稀释为5×106CFU/mL 菌悬液。
(2)取10μL步骤(1)所得菌悬液，均匀涂布于金属板上,置于ARTP诱变***样品处理室，金属板与气流端口间距调整到2mm。ARTP的工作参数为：射频功率输入为100W；工作气体纯氦的流量为10L/min，处理时间0～90s，测定诱变菌株致死率，确定最佳诱变时间。
(3)在步骤(2)确定的诱变时间的基础上，将诱变样品用无菌生理盐水洗脱，梯度稀释成10-6～10-8的菌悬液，取100μL菌悬液涂布固体培养基平板上，并在培养基上添加浓度为100～500mg/L新霉素溶液，于37℃下培养48h，记录单菌落数，筛选诱变菌株。
(4)将步骤(3)筛选的诱变菌株接种于培养基中，进行诱变菌株生化特性和酶活性验证，筛选具有抗后酸化潜力的诱变菌株。
(5)将步骤(4)筛选的具有抗后酸化潜力的诱变菌株接种于培养基中，进行抗后酸化能力和遗传稳定性验证，最终即得抗后酸能力强且遗传稳定的经常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei) BJT-7。
本发明一种常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7的培养方法中，所述ARTP的工作参数为诱变时间30s。
本发明一种常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7的培养方法中，所述新霉素添加浓度为 300mg/L。
进一步地，本发明提供一种常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7在抗酸奶后酸化中的应用，包括如下步骤：
(1)将菌株经常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7活化后接种于培养基中，37℃富集培养48h，离心弃上清液，按照体积比1:1磷酸缓冲溶液(PBS，pH7.4)制备菌悬液，放入4℃环境下进行保存。
(2)将制备好的菌悬液(5×106CFU/mL)接种于42℃预热的全脂牛奶中，搅拌均匀后42℃培养至完全凝乳，发酵完成后4℃进行贮藏。
通过本发明提供的上述技术方案实施本发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)本发明提供菌种副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7经过本领域熟知公认的菌种***分子水平鉴定及菌种的生理生化***试验验证，证实获得的副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)范畴内菌种编号为BJT-7属于一种具有抗酸奶后酸化典型功能的新菌种，进而有必要进行按照法律要求的保藏。
(2)本发明提供的经常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7是将从当地采集的自制酸奶样品中分离出具有优良性状的副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)，经常压室温等离子体联合新霉素诱变，具有最低的H+-ATP酶活性，将其进行全脂牛乳发酵，在储藏期间几乎无明显酸度上升；将诱变株BJT-7在培养基中连续传代培养5代，在12℃条件下储藏6d，测定在储藏6d后pH和滴定酸度，体现出优良的稳定遗传性，表明本发明提供的常压室温等离子体联合新霉素诱变获得的新菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7在抗酸奶后酸化中的应用获得显著的抗酸奶后酸化的技术效果。
附图说明
图1为基于16SrDNA基因构建的常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7的***发育树。
图2为诱变菌株的生长曲线图。
图3为诱变菌株在培养阶段的pH变化曲线图。
图4为ARTP不同处理时间下菌株的致死率变化图。
图5为ARTP处理30s的菌株添加不同浓度新霉素的阳性筛选曲线图。
图6为诱变菌株H+-ATP酶活性比较图。
图7为诱变菌株发酵乳pH值变化曲线比较图。
图8为诱变菌株发酵乳酸度变化曲线比较图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
实施例1：常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株的制备
一种常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7的培养方法，具体包括如下步骤：
(1)将保存的副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)接种至培养基中进行活化和扩大培养，离心收集对数生长期的菌体，将菌体稀释为5×106CFU/mL 菌悬液。
(2)取10μL步骤(1)所得菌悬液，均匀涂布于金属板上，置于ARTP诱变***样品处理室，金属板与气流端口间距调整到2mm，ARTP的工作参数为：射频功率输入为100W；工作气体纯氦的流量为10L/min，处理时间0～90s，测定诱变菌株致死率，确定最佳诱变时间。
(3)在步骤(2)确定的诱变时间的基础上，将诱变样品用无菌生理盐水洗脱，梯度稀释成10-6～10-8的菌悬液，取100μL菌悬液涂布固体培养基平板上，并在培养基上添加浓度为100～500mg/L新霉素溶液，于37℃下培养48h，记录单菌落数，筛选诱变菌株。
(4)将步骤(3)筛选的诱变菌株接种于培养基中，进行诱变菌株生化特性和酶活性验证，筛选具有抗后酸化潜力的诱变菌株。
(5)将步骤(4)筛选的具有抗后酸化潜力的诱变菌株接种于培养基中，进行抗后酸化能力和遗传稳定性验证，最终即得抗后酸能力强且遗传稳定的经常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei) BJT-7。
实施例2：常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株的鉴定
(一)副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7的诱变
在上述实施例一的基础上，经过上述将从当地采集的自制酸奶样品中分离出具有优良性状的副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)经常压室温等离子体联合新霉素诱变获得，经活化利用富集培养法进行定向富集获得常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7。于专用培养基37℃恒温培养48h。
常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7采用的专用培养基为：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸取物10.0g/L，酵母提取液5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸二胺 2.0g/L，吐温801.0g/L，七水硫酸镁0.05g/L，碳酸钙20.0g/L，琼脂20.0g/L，pH＝6.8。
(二)分类鉴定
副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7(以下简称为“菌株BJT-7”)16SrDNA的序列测定与分析：
将菌株BJT-7接种于培养基中，转速3000r/min，37℃震荡培养24h，离心收集菌体，采用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒进行基因组DNA提取。提取菌株BJT-7总DNA为模板进行PCR扩增，引物为F968 (5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和L1401 (5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3')。PCR反应体系为50μL：DNA模板 2.0μL，F968/L1401各2.0μL，dNTP缓冲溶液4.0μL，10×PCR Buffer 5.0μL，Taq TM DNA聚合酶0.4μL，补足灭菌超纯水至50μL。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸1.0min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，并对PCR产物进行克隆测序，测序结果见SEQ ID No:1。
将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)进行BLAST检索，选择相似性高的模式菌株作为参比菌株，利用MEGA5.0软件中的邻接法 (Neighbor-joining)构建16SrDNA基因***发育树，自展值(Bootstrap)1000。结果参见附图1所示，菌株BJT-7与副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)多个菌株形成一个分支，16S rDNA基因序列与副干酪乳杆菌 (Lactobacillus.paracasei)ATCC 334T的模式菌株具有较高的相似性，其中与副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)ATCC 334T菌株的同源性最高，相似性达 100％，Bootstrap支持率为100％，通过菌种的相似性和同源性的综合判定，经过本领域熟知公认的菌种***分子水平鉴定，证实获得的副干酪乳杆菌 (Lactobacillus.paracasei)属范畴内菌种编号为BJT-7属于一种典型的新菌种。
基于以上生物学特征，将菌株BJT-7鉴定为副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期是2020年 9月27日，保藏编号为CGMCCNO.20834。
实施例3：副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7的生理化试验
将经ARPT诱变菌株和对照组均接种于同样培养条件下的培养基中，接种量按质量体积比3％，37℃培养24h，每隔2h取样一次，测定OD660nm与pH 值的变化，具体结果如附图2-3所示。
由附图2数据可知，通过ARTP诱变结合300mg/L新霉素筛选，共获得7 株突变株。从附图2中可以看出，BJT-5、BJT-6和BJT-7的生长速度与其他菌株区别较为明显，平台期对应的生物量是其他菌株的1/2左右。诱变菌株的对数生长期均出现在培养8h后，晚于对照组2h左右。对照组平台期所对应的生物量是生长速度最慢菌株BJT-7的2.2倍左右。可见，菌株BJT-7与常见的副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)同属范围内菌种具有鲜明的区别，属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)同属内新菌种的特性。
由附图3数据可知，菌株BJT-7在24h内pH值的变化与对照组相比，培养 8h后，诱变菌株的pH值均出现下降。结合附图2数据分析可知，pH出现大幅下降的时间与各菌株对数生长期的出现时间一致。其中BJT-7在培养24h后，pH 值下降到4.74。与其他菌株相比，pH值变化最小，与初始pH相较下降了约1/2 左右。其他诱变菌株的pH值在培养24h后为4.16左右。由此推测，菌株生长能力可能与H+-ATP酶活性有关，诱变株H+-ATP酶活性的降低，降低了菌株底物的磷酸化水平，导致ATP产量下降，生长速率降低，产酸能力降低。可见，菌株BJT-7与常见的副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)同属范围内菌种具有鲜明的区别，属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)同属内新菌种的特性。
实施例4：常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株的筛选
在实施例1-3的基础上，对诱变时间和新霉素添加浓度进行了筛选，通过考察不同条件下诱变菌株的生化特性和酶活性，确定最佳诱变时间和新霉素添加浓度。
(1)诱变时间确定试验
将副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)接种至培养基中进行活化与扩大培养，离心收集对数生长期的菌体，将菌体稀释为5×106CFU/mL后进行ARTP 诱变。将10μL菌悬液均匀涂布于金属板上，置于ARTP诱变***样品处理室，与气流端口间距调整到2mm。ARTP的工作参数为：射频功率为100W；工作气体纯氦的流量为10L/min。设置对照组，将涂有菌悬液的金属板以不同处理时间 (0、10、15、20、30、45、60、90s)暴露在处理端口下。结束诱变后，用无菌生理盐水洗脱样品，再以梯度稀释方法将不同浓度的悬液涂布于平板上，从而测定ARTP诱变剂量。对照组和实验组均将在37℃培养48h，计算致死率：致死率(％)＝(S-M)/S×100％；其中S为对照培养基上的单菌落数，M为每个处理组培养基上的菌落数，单位均为菌落形成单位(colony formal units,CFUs)，具体结果见附图4。
由附图4结果可知，当辐照时间达到45s时，菌株的致死率为96％；当ARTP 诱变时间延长至60s以上后，细胞的致死率约为99％。当ARTP诱变的致死率在90％左右时，阳性诱变率较其他致死率对应的处理时间更高。因此，选择87％致死率对应的30s作为ARTP诱变的最佳处理时间。
(2)诱变菌株初筛
在试验1的诱变时间确定为30S的基础上，基于新霉素对高H+-ATP酶活性菌株的抑制作用，本试验将不同浓度的新霉素溶液加入平板培养基作为选择培养基。将可在平板上生长的菌株记录为阳性菌株，设置不添加新霉素的空白对照组计算阳性筛选和概率。将处理后的菌株进行梯度稀释，取100μL稀释后的悬液涂布于添加了不同浓度新霉素(100、200、300、400、500mg/L)溶液的平板上，同时设置未添加新霉素溶液的平板为空白对照。每组处理设置3个平行组，在相同条件下37℃，培养48h，记录单菌落数，计算阳性筛选率：阳性筛选率(％)＝M1'/S'×100％；其中S'为对照组平板菌落计数，M'为不同浓度新霉素平板单菌落数，具体结果见附图5。
由附图5数据可知，当新霉素浓度为300mg/L时，阳性率可达62％。表明联合诱变处理的诱变率和阳性诱变率显著高于单处理诱变。在ARTP诱变的基础上，向培养基添加300mg/L新霉素可以认定是筛选H+-ATP酶活性较低的诱变菌株的合适方法，通过ARTP诱变结合300mg/L新霉素筛选，共获得7株诱变菌株，分别为BJT-1～7。
(3)诱变菌株酶活性验证试验
本试验在试验(1)-(2)的基础上，将对照组与诱变株均接种到培养基(3mL) 中进行活化，于37℃培养48h，取10mL菌液于4℃转速为8000rpm/min离心 10min，弃上清液，加入50μL甲苯和500μL含10mmol/LMgSO4溶液的Tris-HCl 缓冲液。37℃静置5min，于-80℃冷冻2h。重复完成冻融操作后9000rpm/min 离心10min，重悬溶液后再次加入400μLTris-HCl缓冲液，按照H+-ATP酶活性检测试剂盒测定酶活性，将50μL浓度为0.1mol/L的Na2ATP加入酶提取液中反应，37℃静置20min，加入600μL浓度为0.1mol/L的HCl终止反应。将溶液置于冰浴中冷却，于4℃转速6000rpm/min离心10min后收集上清液，加入2.0mL 着色剂，30min后测定OD660nm，得到磷的含量。测定诱变菌株的H+-ATP酶活性，本试验中蛋白定量测定采用Bradford蛋白检测试剂盒进行检测。H+-ATP 酶活性以U/mg表示，即每个活性单位U定义为1mgH+-ATP酶粗提物在1min 内将ATP分解成1mol无机磷酸盐，具体结果见附图6。
由附图6数据可知，诱变菌株的H+-ATP酶活性均低于对照组的原始菌株。除BJT-1和BJT-2外，其余各菌株H+-ATP酶活性均低于1U/mg。诱变菌株中H+-ATP酶活性最低的是BJT-7，为0.57U/mg，对照组原始菌株的H+-ATP酶活性，是BJT-7的3倍。诱变株BJT-3和BJT-4的H+-ATP酶活性相近，而BJT-5 和BJT-6的活性一致，均为0.67U/mg。这表明，ARTP联合新霉素的筛选方法能够有效筛选出H+-ATP酶活性较低的菌株。
实施例5：本发明菌株的在酸奶后酸化中的应用
将筛选得到的具有抗后酸化潜力的诱变株活化后接种于3mL培养基中，37℃培养24h。将1ml菌液接种于相同条件下的300mL培养基中，扩增培养48h。取30mL培养液,5000rpm离心10min后弃上清液，并加入30mL磷酸缓冲溶液 (PBS，pH7.4)。菌体和PBS溶液以1：1的比例制备菌悬液，放入4℃环境下进行保存。
量取100mL全脂牛奶于42℃预热，加入制备好的活菌数为5x106CFU/mL 的菌悬液进行接种，搅拌均匀后42℃培养至完全凝乳。发酵完成后4℃进行贮藏。使用精密pH计(±0.01)在室温条件下测定发酵0h、24h、5d、10d、15d、 20d的发酵乳pH值变化。酸度则选择国标法检测：将10.0ml的发酵乳样品与 20.0ml蒸馏水和2.0ml的酚酞乙醇(0.5％)混合均匀，使用NaOH(0.100mol/L) 标准溶液进行滴定，指示反应终点为微红并30秒内不褪色。记录整个反应过程中NaOH标准滴定液(mL)的消耗量。计算发酵乳的酸度：酸度(°T)＝ C×V(NaOH)×100/V(Sample)×0.100，其中C为NaOH标准溶液的浓度(mol/L)， V(NaOH)为滴定过程中消耗的NaOH标准溶液的体积(mL)，V(样品)为发酵乳样品的体积(mL)，常数0.100为酸性理论定义的NaOH溶液的浓度/(mol/L)。即滴定酸度(°T)为发酵牛奶消耗的0.100mol/LNaOH标准溶液的体积；测定结果见附图7-8，其中，附图7为各诱变菌株发酵乳pH值的变化图，附图8为各诱变菌株发酵乳的酸度变化图。
由附图7-8数据可知，各处理发酵乳起始pH相近，24h内除对照组外，其余组pH变化均不明显。24h至10d间，pH均逐步下降，而对照组pH值变化最大，pH值降至0.67；BJT-7变化最小，pH终值为0.23，变化趋势平缓。发酵20d 时，对照组pH值最低，为3.79；BJT-7pH值最高，为4.27。从pH值总体变化趋势上看，对照组pH变化最大，发酵10d后下降趋势减缓；BJT-7变化最小，没有出现急速下降期；其他诱变株则在24h至10d之间出现大幅度的下降。进一步对比图8各菌株发酵乳在储存期内酸度的变化，对照组的酸度在储存期间始终上升，储存20d酸度达到88左右；BJT-5和BJT-6在储存0h至5d期间酸度变化较小，变化趋势平稳，在储存5d至10d间酸度出现较大幅度的升高。BJT-3、 BJT-4及BJT-7均在储存24h后出现较大的酸度变化，其中，BJT-7变化幅度最小，为诱变组内储存20d时最低组。这表明，通过ARTP结合新霉素筛选能够得到储藏期间无明显酸度上升或延迟出现较大酸度变化的菌株，即能够得到具有抗后酸化特性的菌株常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7。
实施例6：常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株BJT-7遗传稳定性
将诱变菌株BJT-7在培养基中连续传代培养5代，在12℃条件下储藏6d，测定在储藏6d后pH和滴定酸度，结果如表1所示。
表1：菌株BJT-7的遗传稳定性
| 传代次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 酸度/°T | 62 | 62 | 63 | 65 | 64 |
| pH值 | 4.51 | 4.53 | 4.50 | 4.47 | 4.49 |
由表1数据可知，诱变菌株BJT-7在储藏6d后的pH值和滴定酸度均没有出现较大的变化，其中，pH值从4.51变化至4.49，滴定酸度由62变化至64，表明诱变菌株BJT-7具有较好的稳定遗传性。
上述实施例表明，本发明从自制酸奶样品中分离出具有优良性状的乳酸菌株，初步筛选原始菌株，选择在培养过程中pH变化较小的菌株作为出发菌株，确定87％致死率所对应的最佳ARTP诱变处理时间为30s，结合阳性率确定新霉素浓度为300mg/L，最终筛选获得7株诱变菌株。进一步验证诱变菌株的生化特性和酶活性，采用ARTP联合新霉素诱变法筛选率可达到57％；诱变菌株BJT-3、 BJT-4、BJT-5、BJT-6和BJT-7与原始菌株相比，表现出了较低的H+-ATP酶活性。同时通过全脂牛乳发酵，检测发酵乳pH和酸度变化，得到在储藏期间几乎无明显酸度上升的诱变菌株BJT-7和储藏延迟至5d出现较大的酸度变化的菌株BJT-5和BJT-6。结果表明，ARTP诱变联合新霉素筛选策略是一种筛选抗后酸化菌株的可行方法，为适应益生菌开发应用的巨大需求提供了理论参考依据，本发明获得常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌 (Lactobacillus.paracasei)BJT-7对于在抗酸奶后酸化中的应用，获得显著突出的技术效果。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 新疆塔里木农业综合开发股份有限公司
<120> 常压室温等离子体诱变菌在抗酸奶后酸化中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1477
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌BJT-7(Lactobacillus.paracasei)
<400> 1
cggctcgctc cctttagtcg gatataatct gcgtttcgac atgggatttc tttcggcagc 60
gggtcgtgaa actgggttaa cgtcttttgg gaatcagact tttgatttac taccgcttgt 120
taagaaatcc agtcgctttc tggataatta caagcttagt acagtgctgg cacattatca 180
gatcgataac gagcaaccgc atcacgcgtt gtctgatgcg acggcaacaa tggcactggc 240
ggacaaactc ataaaaaaag ggatcttaac gattggcaaa cgttgatggg atagggattt 300
tttagtgttt tccccgcaca tgcgggggtg atcccttctc tgactggctt accgcttctt 360
tgcatttgtt ttccccgcac atgcgggggt gatcccgctt ttataacatt tatgccgcat 420
aaaaacacgt tttccccgca catgcggggg tgatccctgg cgacaattcg atttctaaac 480
gtactaccgg ttttccccgc acatgcgggg gtgatccctg gcgacaattc gatttctaaa 540
cgtactaccg gttttccccg cacatgcggg ggtgatcccc agccattgta attcctccta 600
atgcgaattt cgttttcccc gcacatgcgg gggtgatccc gcgtttgatg atggcagcgc 660
ggcaacttta acgttttccc cgcactcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 720
gtcattttgc ccccgaaggg gaaacctgat ctctcaggtg atcaaaagat gtcaagacct 780
ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 840
cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc caggcggaat gcttaatgcg 900
ttagctgcgg cactgaaggg cggaaaccct ccaacaccta gcattcatcg tttacggcat 960
ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccatgctt tcgagcctca gcgtcagtta 1020
cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata tatctacgca tttcaccgct 1080
acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc ccagtttccg atgcgcttcc 1140
tcggttaagc cgagggcttt cacatcagac ttaaaaaacc gcctgcgctc gctttacgcc 1200
caataaatcc ggataacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 1260
ccgtggcttt ctggttggat accgtcacgc cgacaacagt tactctgccg accattcttc 1320
tccaacaaca gagttttacg acccgaaagc cttcttcact cacgcggcgt tgctccatca 1380
gacttgcgtc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtt tgggccgtgt 1440
ctcagtccca atgtggccga tcaacctctc agttcgg 1477
Claims (4)
1.一种常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)BJT-7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No. 20834，保藏日期：2020年9月27日。
2.如权利要求1所述一种常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei) BJT- 7，其特征在于，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei) BJT-7的培养基为：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸取物10.0g/L，酵母提取液5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸二胺2.0g/L，吐温80 1.0g/L，七水硫酸镁0.05g/L，碳酸钙20.0g/L，琼脂20.0g/L，p H＝6.8。
3.一种如权利要求1所述的常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei) BJT-7在抗酸奶后酸化中的应用。
4.如 权 利 要 求 3 所 述 常 压 室 温 等 离 子 体 联 合 新 霉 素 诱 变 菌株 副 干 酪 乳 杆 菌(Lactobacillus.paracasei) BJT-7在抗酸奶后酸化中的应用，其特征在于，具体应用步骤如下：
(1)将常压室温等离子体联合新霉素诱变菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei) BJT-7活化后接种于培养基中，37℃富集培养48h，离心弃上清液，按照体积比1:1与pH为7.4的磷酸缓冲溶液制备菌悬液，放入4℃环境下进行保存；
(2)将制备好的活菌数为5×106CFU/mL的菌悬液接种于42℃预热的全脂牛奶中，搅拌均匀后42℃培养至完全凝乳，发酵完成后4℃进行贮藏。
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| EP2957180A1 (en) * | 2014-06-19 | 2015-12-23 | Chr. Hansen A/S | Method of producing a fermented milk product with improved control of post acidification |
| CN106857834A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-06-20 | 石家庄君乐宝乳业有限公司 | 具有抑制后酸化功能的发酵乳及其制备方法 |
| CN111979222A (zh) * | 2020-09-03 | 2020-11-24 | 青海雪峰牦牛乳业有限责任公司 | 一种高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 常压室温等离子体诱变选育抗后酸化的乳酸菌;周虹瑾 等;食品与发酵工业;第47卷(第23期);112-117 * |
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