CN117683676A

CN117683676A - 嫩江乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN117683676A
Application number: CN202311705797.0A
Authority: CN
Inventors: 赵玲艳; 邓放明
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2023-12-12
Filing date: 2023-12-12
Publication date: 2024-03-12

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及嫩江乳杆菌株及其应用。本发明嫩江乳杆菌株(Lactobacillus nenjiangensis)577，于2022年8月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.25612。实验表明，该菌株具有较强的耐酸能力、耐胆盐能力、产氨基酸能力和产香性能力，同时具有良好的肠黏附性、抑菌活性以及抗炎、抗氧化作用，氨基酸态氮和游离氨基酸含量较高，且氨基酸脱羧酶活性为阴性，安全性较高。说明该菌株具备作食品发酵菌株和益生菌的潜力。

Description

嫩江乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及嫩江乳杆菌及其应用。

背景技术

微生物菌种是发酵食品的灵魂，微生物的种类与发酵性能直接影响到发酵食品的质量。益生菌(Probiotic)是一类当给予适当数量时对宿主健康有益的活的微生物。益生菌具有增强免疫功能、预防肿瘤、抗癌等多个方面的功能，已被广泛应用于发酵乳制品(益生菌酸奶、益生菌发酵乳饮料、益生菌奶酪)、发酵蔬菜制品、发酵豆乳制品等食品发酵。目前，我国因具有自主知识产权特别是集优良发酵性能和益生功能于一体的菌株缺乏，大部分益生菌和食品微生物发酵剂大多被国外企业和产品垄断，90％的益生菌和食品微生物发酵剂来自欧洲几大发酵剂公司，如丹尼斯克、科汉森、DSM等。我国市售发酵剂功能单一，产鲜、产香能力差，益生功能缺乏，导致发酵食品风味差、功能单一、存在安全隐患。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了嫩江乳杆菌及其应用。本发明提供的嫩江乳杆菌具有较强的耐酸能力、耐胆盐能力、产氨基酸能力和产香性能力，具有良好的肠黏附性、抑菌活性以及抗炎、抗氧化作用，氨基酸态氮和游离氨基酸含量较高，氨基酸脱羧酶活性为阴性，安全性较高，具备作食品发酵菌株和益生菌的潜力。

本发明分离获得的嫩江乳杆菌(Lactobacillus nenjiangensis)577其形态学特征为：菌落中等大小，凸起，乳白色，边缘整齐，菌落呈圆形，革兰氏染色呈阳性，单个或成链排列，杆状无芽孢。该菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。经比对分析，菌株577与Lactobacillus nenjiangensis同源性为92.96％，因此鉴定为嫩江乳杆菌，于2022年8月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCCNo.25612。

本发明提供了所述的嫩江乳杆菌577或其培养物、裂解物在如下任意一项中的应用：

1)制备发酵剂；和/或

2)制备具有益生功能的产品；和/或

3)制备抗炎、抗氧化和/或抑菌产品。

本发明中，所述发酵剂为蔬菜发酵剂。

本发明中，所述抗炎包括降低细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α中至少一种炎症因子的水平。

本发明中，所述抗氧化包括清除DPPH自由基和/或降低细胞内ROS。

本发明中，所述抑菌为抑制金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和/或藤黄微球菌的生长。

本发明中，所述具有益生功能的产品以及所述抗炎、抗氧化和/或抑菌产品中，所述产品包括但不仅限于食品、保健食品或药品。

本发明还提供一种发酵剂，包括本发明所述的嫩江乳杆菌或其培养物、裂解物。

本发明还提供一种具有益生功能的产品，包括所述的嫩江乳杆菌或其培养物、裂解物。

本发明嫩江乳杆菌株(Lactobacillus nenjiangensis)577，于2022年8月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.25612。实验表明，该菌株具有较强的耐酸能力、耐胆盐能力、产氨基酸能力和产香性能力，同时具有良好的肠黏附性、抑菌活性以及抗炎、抗氧化作用，氨基酸态氮和游离氨基酸含量较高，且氨基酸脱羧酶活性为阴性，安全性较高。说明该菌株具备作食品发酵菌株和益生菌的潜力。

生物保藏说明

577(Lactobacillus nenjiangensis)，于2022年8月29日保藏在在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.25612。

附图说明

图1示菌株577的形态；

图2示菌株577的革兰氏染色结果；

图3示菌株577的***发育树；

图4示菌株577的溶血性试验结果；

图5示菌株577对细胞内白细胞介素(IL-1β及IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量；

图6示菌株577对H₂O₂诱导氧化损伤的Caco-2细胞内ROS产生的影响；

图7示菌株577抗炎果蝇模型验证结果；

图8示菌株577抗氧化果蝇模型验证结果。

具体实施方式

本发明公开了嫩江乳杆菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1菌株577的鉴定

1.1菌落形态观察：

将菌株从菌种库取出，以2％(v/v)的接种量接入到新鲜MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养24h，传代活化三次，使用无菌生理盐水进行梯度稀释后涂布于MRS固体平板中，37℃静置培养24h，观察菌落形态，577菌落中等大小，凸起，乳白色，边缘整齐，菌落呈圆形，如图1所示。

1.2革兰氏染色：

制片，取少量无菌水于载玻片上，接种环挑取单个菌落与载玻片上的无菌水混合均匀，酒精灯加热固定。(2)涂片固定后滴加结晶紫染色液，染色1min，流动水小心冲洗，避免水流直接冲洗菌落。(3)滴加革兰氏碘液，作用1min，流动水小心冲洗。(4)滴加脱色酒精，30s左右；或在整个涂片上涂满脱色酒精，立即冲洗，再次在涂片上滴加脱色酒精，脱色10s左右，流动水小心冲洗。(5)滴加沙黄复染液，复染1min，流动水冲洗，晾干。(6)油镜观察。577革兰氏染色呈阳性，单个或成链排列，杆状无芽孢，如图2所示。

1.316S rRNA基因序列分析

将菌株活化后以2％(v/v)接种比例接种于新鲜MRS液体培养基，37℃静置培养12h；在4℃条件下10000r/min离心15min，弃去发酵上清液取菌泥，使用无菌水洗涤后相同条件下再次离心，重复三次后用按细菌基因组DNA提取试剂盒(默克公司)步骤提取DNA后进行扩增，乳杆菌引物为通用引物:(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，如SEQ ID NO.2所示；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，如SEQ ID NO.3所示)，经过电泳检测扩增产物后，送至上海派森诺生物科技股份有限公司测序。综合测序峰图将测序结果截取800bp的区域，将测序得到的序列在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝Bla stSearch&LINK_LOC＝blasthome)中比对，选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果。

菌株57716SrDNA序列见SED ID NO：1。

TGCTATACATGCAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAACTCGCGAGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCTAAGGT(SED ID NO：1)。

将所测16S rRNA基因序列提交到NCBI数据库，用BLAST工具进行序列的同源性分析，并通过MEGA6软件构建***发育树。

结果显示，菌株577与Lactobacillus nenjiangensis同源性为92.96％，鉴定为嫩江乳杆菌，其***发育树如图3所示。

实施例2

将菌株577活化至稳定，最后一代培养12h后以1％的接种量接入浓硫酸调节至pH2.5的酸性MRS培养基中，分别在0h和4h进行稀释涂布，待长出后进行平板计数，按下方公式计算存活率，并按照国标GB 4789.2-2016方法分别进行活菌数计数，参照以下公式计算存活率，结果如表1所示。

表1菌株577对pH 2.5MRS培养基耐受能力

益生菌要在肠道中发挥作用，必须通过胃液环境。人体空腹时胃液pH约为1.3-2.0，进食后pH约为3.0-5.0。益生菌必须在pH值为3.0的条件下存活1.5-2小时，故益生菌在胃肠道中的生存和持久性是至关重要的。耐酸试验表明：菌株577在pH2.5 MRS培养基中培养4h后活菌数较之前增加，存活率达到287.51％，表明菌株具有极强的耐酸能力，能在酸度较大的发酵食品和人体胃液中生长，在耐酸能力方面，具备作为蔬菜发酵剂和益生菌的潜力。

2.2577耐胆盐能力结果

菌株培养至稳定，最后一代培养12h后，离心去上清液，加入事先配制好的含0.3％牛胆盐的生理盐水制成菌悬液，在0h和2h分别进行稀释涂布，48h后平板计数，按照国标GB4789.2-2016方法分别进行活菌数计数，按下方公式计算存活率，结果如表2所示。

表2菌株对0.3％牛胆盐溶液耐受能

正常人小肠内胆盐浓度在0.3～3.0g/L之间。发酵食品的含盐量较高，高浓度的钠离子会抑制乳酸菌的生长，人体肠道中高浓度的胆盐可以拮抗益生菌的生长，会改变细胞膜的通透性，分解膜蛋白，从而导致细胞破裂和死亡。因此，作为蔬菜发酵剂和益生菌开发的菌株必须具有良好的耐胆盐能力。耐胆盐能力试验结果表明：菌株577耐胆盐能力极强，在0.3％牛胆盐溶液中培养2h后菌落反而数增加，菌体的存活率达到271.87％。

2.3菌株577肠黏附性试验

向6孔细胞培养板中转入1mL传代培养3次的Caco-2细胞悬液(5×10⁴cells/mL)，并于5％CO₂、37℃培养箱中培养，直至细胞长至单层。将培养基吸出，用无菌磷酸盐缓冲液洗2次，加入菌悬液于二氧化碳培养箱中孵育2h；然后除去培养板各孔的悬液，无菌磷酸盐缓冲液洗3次以除去未黏附的菌体，细胞刮获取细胞，采用血球计数板测定每孔的Caco-2细胞数和平板计数法计算黏附细菌数。按公式计算黏附能力(个/cell)＝黏附细菌个数/细胞个数，得菌株577肠黏附性为46个/细胞。

2.3菌株577的抑菌能力

在无菌培养平皿上倒入15mL已灭菌的2％(v/v)素琼脂，待其充分冷却凝固后放入灭菌后的牛津杯数个，摆放均匀，将致病菌稀释到最适浓度，取其菌悬液与冷却到50℃左右的营养肉汤培养基混匀，使致病菌(李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)的最终浓度分别达到10⁶CFU/mL，将混有致病菌的培养基20mL加入到放有牛津杯的平板上，完全凝固之后用无菌镊子取出牛津杯，在形成的孔洞中加入200μL菌株577的无菌上清液，置于4℃冰箱扩散4h之后37℃静置培养12h，用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径，结果见表3所示。

表3菌株577对致病菌的抑菌直径(mm)

菌株577发酵上清液对革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)均表现出较强的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、李斯特菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌的抑菌直径分别达到21.94mm、20.88mm、19.99mm、19.98mm。

2.4 577安全特性研究结果

2.4.1577对抗生素的耐药性研究

采用纸片扩散法，菌株活化三代离心洗去上清液后，用生理盐水重悬。用分光光度计调节至密度为1×10⁸CFU/mL左右(A600＝0.5±0.5)，吸取1mL菌悬液于培养皿后，倒入15mL固体培养基(50℃)混匀，待培养基凝固后取药敏纸片贴于琼脂表面，每个培养皿贴3张间隔均匀适中的药物纸片，微需氧条件下37℃恒温培养。48h后测量并记录抑菌圈的直径，并根据药片说明书标准进行药物敏感性判定。微生物药物敏感试验执行标准如表4所示。

表4微生物药物敏感试验执行标准

药敏性实验结果如表5所示。

表5菌株对抗生素耐药性

注：耐药R、中介I、敏感S。

微生物的抗生素耐药基因可转移到某些病原体上，导致病原体耐药性提高。因此，对菌株577进行全面的药敏测试以了解其药敏是非常必要。由表5可知，菌株577对表中20种抗生素均表现出中介或敏感。

2.4.2菌株577溶血性研究结果

取血琼脂培养基，采用点种法，中心以金黄色葡萄球菌为对照，***取菌株577点种3次。37℃培养48h，观察菌株577与对照菌溶血情况。结果如图6所示。

一些菌株在血平板上培养时，菌落周围会形成明显的透明溶血环，根据使绵羊血细胞琼脂溶血的能力分类为：完全溶血(β溶血)、部分溶血(α溶血)和不溶血(γ溶血)，α-溶血的链球菌呈现半透明草绿色溶血环，β-溶血的链球菌呈现透明溶血环，大多数溶血性菌株是致病性的。菌株577的溶血性试验结果见图6，可看出平板中心的指示菌(金黄色葡萄球菌)产生了明显的溶血环，周围的菌株577菌落无溶血环，故菌株577无溶血性，不会产生机会性毒力，是安全的共生菌，符合食品安全的要求。

2.4.3菌株577氨基酸脱羧酶活性

试剂盒法：菌株活化三代，培养18h后，取0.05mL菌液添加至不同试剂瓶中，并加0.5mL灭菌液体石蜡封层。37℃培养24h后根据说明书观察变色情况。

食品中的生物胺大部分由微生物脱羧氨基酸形成的，它的产生需耍3个条件：足够的氨基酸、有氨基酸脱羧酶活性的微生物和利于微生物生长的低酸环境，常见产生物胺菌株有乳酸杆菌属、肠杆菌属、肠球菌属和乳杆菌属。适量的生物胺有利于人体的正常生理活动，一旦过量则会对人体产生不利影响，故产生物胺能力也是选择发酵乳酸菌和益生菌的标准之一。由于对人体健康威胁较大的组胺、酪胺、腐胺和尸胺的前提物质分别为组氨酸、酪氨酸、精氨酸与赖氨酸，因此本试验对供试菌株这四种氨基酸脱羧酶活性进行检测，发现菌株577组氨酸、酪氨酸、精氨酸与赖氨酸四种氨基酸脱羧酶活性均为阴性，具备作食品发酵菌株和益生菌的潜力。

2.5菌株577的优良发酵性能

2.5.1菌株577发酵液氨基酸态氮研究

将菌株577和市售某商业化泡菜发酵剂活化后，用无菌生理盐水调节菌悬液浓度为0.5麦氏比浊管，接种1％到MRS液体培养基中，以未接种菌株培养基作为空白，发酵24h，参照GB 5009.235-2016测定氨基酸态氮。结果表明：菌株577发酵24h后，其发酵液氨基酸态氮含量为0.45g±0.01/100g；市售某商业化泡菜发酵剂发酵液氨基酸态氮含量为0.28g±0.02/100g；。

2.5.2菌株577发酵液游离氨基酸含量测定

样品前处理：称取菌株577发酵后的培养基、发酵前培养基(对照组1)、市售某商业化泡菜发酵剂发酵后的培养基(对照组2)各1.000g于10mL离心管中，加0.01mol/L盐酸5mL，混匀，沸水浴15min，超声提取10min，4000rpm离心5min取上清液；沉淀再加4mL 0.01mol/L盐酸悬浮超声10min，离心，合并上清液，定容至10mL。过膜测定。

在线柱前衍生：采用安捷伦公司自动在线衍生化方法，一级氨基酸与邻苯二甲醛(OPA)、二级氨基酸与芴甲氧羰酰氯(FMOC)衍生后过柱检测。色谱条件:ZORBAX EclipseAAA(4.6x75mm，3.5μm)；检测信号：紫外338nm(0～19min),266nm(19.01～25min)；流动相A：40mmol/L磷酸二氢钠(pH7.8)；流动相B：甲醇/乙腈/水＝45/45/10；流速:1.0mL/min；

梯度洗脱过程：100％A：0％B(0-1min)；46％A；57％B(23min)；0％A：100％B(27-34min)；100％A：0％B(40-41min)。

称取菌株577发酵后的培养基、发酵前培养基(对照组1)、市售某商业化泡菜发酵剂发酵后的培养基(对照组2)中各游离氨基酸的含量见表6所示。

表6游离氨基酸含量表(mg/g)

从表6可以看出，经菌株577发酵后的培养基中24种游离氨基酸的含量均比发酵前培养基(对照组1)和市售某商业化泡菜发酵剂发酵后的培养基(对照组2)中24种游离氨基酸的含量高，说明菌株577具有良好的产氨基酸能力。

2.5.3菌株577发酵产香气物质含量测定

将萃取头于270℃老化0.5h。

固相微萃取：分别取2g菌株577发酵后的培养基、发酵前培养基(对照组1)、市售某商业化泡菜发酵剂发酵后的培养基(对照组2)于20mL的顶空瓶中，加入3mL的水，放入小磁力子，快速拧紧带有硅橡胶隔垫的瓶盖，在恒温磁力加热搅拌器上以70℃恒温条件下预热15min后，将已老化的萃取头***顶空瓶中后推出萃取头于距液面0.7cm左右的顶空处，吸附40min；进样、解析2min。

色谱条件：色谱柱：RTX-5ms弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)载气：高纯流He(99.999％)，流速：1.0mL/min；进样口温度：250℃；分流进样。升温程序：柱温50℃，以4℃/min升温至180℃，保持4min，以6℃升温至250℃，保持1min。

质谱条件：离子源：EI源；GC/MS接口温度：220°；离子源温度：200℃；电子能量：70eV，质量扫描范围：35～500amu。

保留指数(RI)：按照上述方法对C₇～C₄₀正构烷烃混合对照品进行GC-MS分析，记录各正构烷烃的保留时间，根据程序程序计算各组分的RI。计算公式：t_x为被分析组分析流出峰的保留时间；t_n和t_n+1是碳原子数为n和n+1的正构烷烃流出峰的保留时间(min)，且tn＜tx＜tn+1。

定性分析：以将各组分纯质谱图与NIST2017标准库作相似性检索进行定性分析，结合保留指数RI值对比进行定性，以相似度＞80％且保留指数RI值接近度最高的化合物为准使用内标法确定各组分百分比含量。

定量分析：采用内标法对剁辣椒挥发性物质进行定量分析，以邻二氯苯为内标，由下列计算挥发性物质的含量。

计算公式：

式中：C_j——待测风味物质含量，μg/kg；

A_j——样品中待测物对应色谱峰面积；

A_i——内标物测定色谱峰面积；

V——内标物体积，μL；

C_i——内标物浓度，μg/mL；

M_j——样品质量，g。

菌株577发酵后的培养基、发酵前培养基(对照组1)、市售某商业化泡菜发酵剂发酵后的培养基(对照组2)香气物质含量见表7所示。

表7香气物质含量见表(μg/kg)

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从表7可以看出：菌株577发酵后的培养基中共检测出64种香气物质，总香气物质含量达到4366.66μg/kg，香气物质的种类数、大部分香气物质的含量及总香气物质含量均远远高于对照组1和对照组2，说菌株577具有优良的产香性能。

2.5.4菌株577产黑芥子酶(myrosinase enzyme)能力测定

样品处理：

将菌株577和市售某商业化泡菜发酵剂(对照组2)接入华容大叶芥菜中发酵24h后，同时以不接菌的华容大叶芥菜(对照组1)作为空白，4000g离心15min。

取培养基上清液2ml，加2.5mL二氯甲烷。用旋涡混合器混合均匀，在室温下振荡0.5h。混合后样品4000rmp/min下离心20min。

取6ml80％氨乙醇于具塞试管用移液枪取离心管下层有机相50uL加入到装有80％氨乙醇的具塞试管，加盖。旋涡混合均匀，将具塞试管放入水浴锅50℃下加热0.5h，取出冷却至室温测定光密度值。详见《油菜饼粕中异硫氰酸酯的测定硫脲比色法(NY/T1596-2008)》。由表8可以看出，接种菌株577发酵后芥菜中异硫氰酸酯含量达到0.76mg/g，明显高于对照组1和对照组2。

表8异硫氰酸酯含量

样品	菌株577	对照组1	对照组2
				异硫氰酸酯含量(mg/g)	0.76	0.36	0.44

2.6菌株577的益生功能

2.6.1菌株577抗炎能力细胞模型筛选

基于RAW264.7细胞炎症模型检测菌株抗炎能力

细胞培养：RAW264.7细胞以10％胎牛血清(FBS)+RPMI1640培养基在37℃，5％CO₂的条件中培养。消化时去培养基，加2mLPBS润洗后弃去，随后加入1mL胰酶，消化60s后吸去加入适量培养基，将细胞从壁面吹下制成悬液，移取悬液至新的容器中。注意事项：①待细胞稳定长满细胞瓶后，接入适宜孔板长至90％(6孔板一般18h，24孔板12h，48孔板8h，96孔板6h)，长太满药物可能无法进入；②小鼠巨噬细胞密度较小时易分化长触角此时测炎症因子数据不准确，故接孔时密度不宜过小；③由于胎牛血清含有许多化合物，如LPS和生长因子，它们影响巨噬细胞的生物学特性，接孔后需饥饿处理1-2h排除血清干扰，且试验中所配试剂皆应使用无血清；④培养基中禁添加抗生素以免对试验造成干扰；⑤为得充足上清液，一般不用96孔板进行试验；试验过程保持绝对无菌。

菌悬液制备：乳酸菌活化至第三代，于最大生长期时接入15mL离心管中离心(8000r/min 10min)去上清，用生理盐水清洗至无上清液残留。先加少许1640培养基重悬菌泥，随后用分光光度计或血球计数板调节菌悬液至所需密度。

分组情况：设立空白组(only cell)、模型对照组(cell+LPS)、试验对照组1(cell+菌悬液1×10¹⁰CFU/mL)、试验对照组2(cell+菌悬液1.0×10⁸CFU/mL)、试验对照组3(cell+菌悬液1.0×10⁶CFU/mL)、试验组1(cell+LPS+菌悬液1×10¹⁰CFU/mL)、试验组2(cell+LPS+菌悬液1.0×10⁸CFU/mL)、试验组3(cell+LPS+菌悬液1.0×10⁶CFU/mL)；每组平行3次。

试验过程：细胞培养稳定后，按每孔密度80％～90％接入48孔板，待贴壁后洗板3次，按试验分组情况，加入或者不加入菌悬液前处理4h。随后按分组情况加入用1640培养基配制的浓度为2.5ng/mL的脂多糖(LPS)溶液，刺激12h后离心收集上清。ELISA试剂盒方法测上清液中白细胞介素(IL-1β及IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量。

IL-1β、IL-6、TNF-α是LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症的关键介质。若添加菌株577后，炎症因子下调，表明菌株577能抑制LPS诱导的巨噬细胞活化。本试验通过ELISA试验对炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)检测情况，LPS处理显著增加了IL-1β、IL-6和TNF-α的产生，表明炎症模型建立成功。当菌株577的浓度为10¹⁰CFU/mL时，能显著降低细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α炎症因子的水平。

2.6.2菌株577抗氧化能力细胞模型筛选结果

(1)体外抗氧化实验

制备菌悬液，采用比浊法调节浓度至1×10⁸CFU/mL。配制DPPH-无水乙醇溶液0.2mmol/L，并进行无菌过滤。在避光环境中，按样品+DPPH(Aa)、样品+无水乙醇(Ab)、纯水+DPPH(Ac)分组加入48孔板中，每组三个孔。避光反应40min后，收集液体，离心后取上清液，于517nm处测吸光度。实验结果如图2所示。其中，DPPH自由基清除率计算如下：

DPPH自由基清除试验是目前乳酸菌的抗氧化作用研究中最常用的方法。由图2可知，本发明菌株577的DPPH自由基清除率为25.63％，其具有体外抗氧化能力。

(2)基于Caco-2细胞氧化模型检测抗氧化能力

细胞内的ROS水平是衡量细胞氧化应激损伤程度的重要指标。细胞内部过度蓄积的ROS会直接导致DNA断裂，并造成正常细胞周期不同程度的影响甚至直接诱导细胞凋亡。同时，细胞内ROS水平超过正常范围时也能直接诱导细胞凋亡，甚至直接造成细胞死亡。2007年，美国康奈尔大学的刘瑞海教授建立了一种新的评价乳酸菌抗氧化的方法，即细胞抗氧化活性实验。此方法将待测样品与无荧光的指示剂2，7-二氯荧光素二乙酯(DCFH-DA)混合后处理细胞，待测样品和DCFH-DA可以穿越细胞膜进入到细胞中，此时细胞内的酯酶会将指示剂DCFH-DA分解成具有更强极性的DCFH。再用过氧化氢(H₂O₂)处理细胞，H₂O₂会在细胞内自身分解形成过氧化自由基(ROO^-)，ROO^-会对细胞膜造成攻击，生成更多的ROS或自由基。当具有极性的DCFH与ROO^-等自由基结合，便会生成具有荧光的物质DCH，通过分光光度法测定荧光值的大小。另一方面，具有抗氧化性能的待测样品也可在细胞膜的外部直接与ROO^-结合，阻止ROO^-对细胞的进攻，或是被细胞吸收进入细胞内与机体产生的ROS或ROO^-结合，阻止极性很强的DCFH的氧化，进而减少DCF荧光物的产生。

细胞培养：Caco-2以10％胎牛血清(FBS)+MEM-ALPHA培养基在37℃5％CO₂的条件中培养。消化时去培养基，加2mLPBS润洗后弃去，随后加入1mL胰酶，消化30s后吸去加入适量培养基，将细胞从壁面吹下制成悬液，移取悬液至新的容器中。待细胞稳定长满细胞瓶后，接入96孔板，生长24h。洗板时务必轻柔，吹落细胞团后打散成单个细胞。

试验内容：试验分组情况及菌悬液制备同抗炎处理，细胞培养至稳定后，胰酶消化接入96孔黑板中，48h后每孔长满80％～90％且为极化状态时开始试验。加备好的菌悬液前处理4h(高、中、低密度分别为1×10¹⁰、1.0×10⁸、1.0×10⁶CFU/mL)，随后加入MEM-ALPHA培养基稀释的H₂O₂溶液至终浓度为500umol/l，损伤2h后用DCFH-DA探针检测活性氧(ROS)荧光水平水平，按每孔60ul加入DCFH-DA探针，避光反应20min后，于激发波长485nm，发射波长530nm的荧光酶标仪下测波长。根据公式计算：

实验结果如图3所示。由图3可知，经不同浓度菌株577的菌悬液处理后，受损Caco-2细胞中ROS水平呈现显著下降趋势，菌株577菌悬液可对H₂O₂诱发Caco-2细胞氧化应激损伤有一定的抑制作用。

2.6.3基于果蝇炎症及氧化模型检测菌株577抗炎及抗氧化能力

与线虫相比，果蝇肠道结构与人类更相似，故果蝇筛选益生菌开始慢慢被采用。几乎所有的蝇体生长都发生在幼虫阶段，成虫阶段的大小增加或减少可能不清楚地观察到。研究认为，计算接触百草枯后果蝇成虫的死亡率是一种可靠的检测益生菌方法。因此，本发明通过益生菌对果蝇成虫寿命长短的影响，来检测菌株的抗炎或抗氧化能力。

试验准备：用无菌水配置5％的蔗糖溶液备用，将适量DSS/PQ溶于5％蔗糖溶液中制成5％DSS蔗糖溶液。乳酸菌活化后挑单克隆在37℃培养箱静止培养13h后，离心取沉淀溶于5％蔗糖中，25℃培养黑腹果蝇，取用同批次5-7天大的雌果蝇进行实验。

试验步骤：第一次筛选将适龄雌果蝇每30只一管，设两个样品对照，观察样本间的稳定性。第二次筛选，菌株基于之前实验的稳定性只有一管对照。该实验为期10天，前三天进行样品处理，对照组每24h只喂食400ul的5％蔗糖溶液，通过浸润在滤纸片上供果蝇取食，各15组实验组喂食相应的5％蔗糖菌悬液液；每天记录果蝇的生存状况；第四天开始对照组每24h喂食400ul的5％DSS蔗糖溶液或5％PQ蔗糖溶液，实验组喂食浓度为5％DSS的5％蔗糖菌悬液溶液，喂食7天，每天计数果蝇的生存状况，本发明中所有菌悬液的浓度均为A₆₀₀＝1。

(1)果蝇炎症模型筛选结果

聚糖硫酸钠(DSS)是一种人工合成的硫酸盐多糖，是一种常见的用来诱导小鼠结肠癌模型的致炎剂。口服葡聚糖硫酸钠可通过破坏肠道内共生菌的分隔，直接损伤结肠上皮细胞，诱发炎症反应，葡聚糖硫酸钠模型已被广泛用于研究结肠炎的免疫机制。通过在果蝇食用的蔗糖溶液中添加DSS使果蝇肠道受损，不同分组食用不同菌液，与未食用菌液组进行对照，每日观察果蝇存活情况，第一次筛选时主要为确定乳酸菌适宜浓度，故结果并未展示，通过第一次筛选，认为，乳酸菌浓度在A₆₀₀＝1时对果蝇生存率基本无影响，并能保持一定功效。第二次筛选结果如图4所示。

由图4可知，菌株577在一定程度上都有延长肠道受损果蝇寿命的能力，这表明菌株577具备抗炎能力。

(2)果蝇氧化模型筛选结果

各种有毒物质，如百草枯能够触发果蝇的氧化应激。百草枯(paraquat，PQ)，化学名称为1-1-二甲基-4-4-联吡啶二氯化物，是过去几十年农业中应用最为广泛的除草剂之一。故意或意外摄入PQ会造成多器官功能损伤，对生命产生非常严重的威胁，死亡率高达60％～70％。研究表明，PQ进入人体后可通过各种途径产生大量的活性氧(ROS)。过量的ROS会导致氧化应激，严重者会造成多脏器功能障碍。目前认为百草枯毒性是通过产生自由基而起破坏作用的。通过产生自由基，间接使体内琉基化合物、含量减少，影响机体的抗氧化作用，诱导脂质过氧化反应，直接损害主要细胞成分，并使毛细血管内皮损害，最终导致一系列病理变化。本发明实验结果如图5所示。

由图5可知，菌株577能有效延长果蝇寿命，这表明菌株577具备抗氧化能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.嫩江乳杆菌(Lactobacillus nenjiangensis)，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.25612。

2.权利要求1所述的嫩江乳杆菌，其特征在于，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.权利要求1或2所述的嫩江乳杆菌或其培养物、裂解物在如下任意一项中的应用：

1)制备发酵剂；和/或

2)制备具有益生功能的产品；和/或

3)制备抗炎、抗氧化和/或抑菌产品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵剂为蔬菜发酵剂。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗炎包括降低IL-6、IL-1β和TNF-α中至少一种炎症因子的水平。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗氧化包括清除DPPH自由基和/或降低细胞内ROS。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑菌为抑制金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和/或藤黄微球菌的生长。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括食品、保健食品或药品。

9.一种发酵剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的嫩江乳杆菌或其培养物、裂解物。

10.一种具有益生功能的产品，其特征在于，包括权利要求1或2所述的嫩江乳杆菌或其培养物、裂解物。