CN113373087B - 一种用于制备全株玉米精细青贮饲料用菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备全株玉米精细青贮饲料用菌剂。所述菌剂通过将布氏乳杆菌LB与益生菌保护剂混合制得。每克所述菌剂中，所述布氏乳杆菌LB的含量大于1×1010CFU。实验结果表明：布氏乳杆菌LB可作为全株玉米精细青贮添加剂，显著提高乳酸产出，显著降低pH值，有效提高全株玉米精细青贮发酵品质；并能减少青贮饲料中抗性基因种类；同时布氏乳杆菌LB具有发酵效率高、成本低廉等优点，可应用于绿色环保生物饲料的生产中。

Description

一种用于制备全株玉米精细青贮饲料用菌剂
技术领域
本发明属于饲料领域，涉及一种制备全株玉米精细青贮饲料用菌剂，具体地，提供一种用于全株玉米精细青贮的乳酸菌，更具体地提供一种布氏乳杆菌，该布氏乳杆菌能够消减玉米调制的各类青贮饲料中的抗性基因及病毒。
背景技术
青贮及半干青贮是将含水量在45％-75％的青绿饲料经切碎后，密封后通过乳酸菌为主的发酵，实现营养物质有效保存的一种加工手段，青贮饲料具有降低杂草种子萌发率，减少病毒的作用，且能够长期保存。
青贮添加剂是在青贮过程中加入的促进乳酸发酵或抑制不良微生物发酵的物质，如乳酸菌、酶制剂、复合菌制剂和化学添加剂等。一般能够起到减少营养损失，提高发酵速度的效果。
玉米是目前应用最广泛的饲料，玉米可以调制成全株玉米青贮饲料、玉米籽粒青贮饲料、以及不同留茬高度的玉米青贮饲料。
青贮饲料占日粮粗饲料组成的较大部分，近年来，由于超级细菌对抗生素有强大的抵抗作用，能逃避被杀灭的危险，它的传播造成了对人类健康的威胁。因此，人们对抗性基因的关注度增加，但是针对青贮饲料中抗性基因的研究较少。牲畜肠道中的细菌可以摄取饲料中的抗性基因，经过***，有可能成为能够耐受多种药物的细菌，也就是超级细菌。而养殖场已经成为除医院外超级细菌的最大诞生地，因此减少饲料中抗性基因的种类及数量有可能减少养殖场中超级细菌的数量，因此，筛选并应用能够消减饲料中抗性基因的添加剂是目前新兴的研究热点。
发明内容
本发明的目的之一是提供布氏乳杆菌(Lactobacillus brevis)LB的新用途。
所述布氏乳杆菌(Lactobacillus brevis)LB已于2017年6月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.14269；简称为布氏乳杆菌LB。
本发明所提供的布氏乳杆菌LB的新用途，为：布氏乳杆菌LB在制备全株玉米精细牧草青贮饲料中的应用。
所述应用，具体可为：布氏乳杆菌LB在消减全株玉米精细牧草青贮饲料中抗性基因中的应用，更具体可为：布氏乳杆菌LB在减少全株玉米精细牧草青贮饲料中抗性基因的种类中的应用。
所述全株玉米包括玉米全株、籽粒及不同留茬高度收获的玉米。
本发明的目的之二是提供一种菌剂。
本发明所提供的菌剂，通过将布氏乳杆菌LB与益生菌保护剂混合制得。
所述菌剂具体可为将布氏乳杆菌LB与益生菌保护剂混合冻干制得。
每克所述菌剂中，所述布氏乳杆菌LB的含量大于1×1010CFU。
具体地，每克所述菌剂中含1×1012CFU布氏乳杆菌LB。
所述益生菌保护剂具体可为脱脂奶。
所述脱脂奶具体可通过将固态奶粉按10％质量体积比(w/v)溶解于水制得。
所述固态奶粉具体可为高蛋白脱脂高钙奶粉，更具体可为购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司，货号为6907992440071的高蛋白脱脂高钙奶粉。
上述菌剂通过包括如下步骤的方法制备得到：将布氏乳杆菌LB与益生菌保护剂混合，即得。
具体地，所述菌剂通过包括如下步骤的方法制备得到：将布氏乳杆菌LB菌体与益生菌保护剂混合后冻干，得到所述菌剂。
所述布氏乳杆菌LB菌体通过包括如下步骤的方法制备得到：将布氏乳杆菌LB接种至MRS液体培养基中培养，培养结束时将培养体系离心，收集沉淀，即为布氏乳杆菌LB菌体。
所述方法中，培养结束时培养体系的OD260nm＝4；
所述方法中，接种后培养体系的初始OD260nm＝1.8；
所述方法中，培养条件为37℃、250rpm振荡培养；
每克所述菌剂中，所述布氏乳杆菌LB的含量大于1×1010CFU。
布氏乳杆菌LB或上述含有布氏乳杆菌LB的菌剂在制备全株玉米精细青贮饲料中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种以玉米(全株、籽粒及不同留茬高度收获的玉米)为原料青贮饲料的制备方法(方法A)，包括如下步骤：将所述菌剂施加到玉米原料上，进行青贮，得到全株玉米精细青贮饲料。
所述方法A中，所述玉米原料的收获时期可为乳熟期至蜡熟期。
所述方法A中，所述玉米原料的含水量具体可为35％-75％。
所述方法A中，所述玉米原料在施加菌剂前经过预处理；
所述预处理方法为：将玉米茎叶切碎至2-3cm，玉米籽实破碎至无完整颗粒；
所述方法A中，将所述菌剂施加到玉米原料前，还包括如下步骤：将菌剂采用水溶解，室温活化50-70min(具体可为60min)，所述水为蒸馏水。
所述方法A中，所述菌剂施加量为每克玉米原料接种0.5-20×105CFU的布氏乳杆菌LB；所述菌剂施加量具体可为每克玉米原料接种8×105CFU的布氏乳杆菌LB；
所述方法A中，所述青贮的温度可为20℃-40℃，具体可为20℃、30℃或40℃。
所述青贮的时间可为30-50天，具体可为45天。
本发明还保护一种全株玉米精细青贮饲料的制备方法(方法B)，包括如下步骤：将布氏乳杆菌LB施加到玉米原料上，进行青贮，得到全株玉米精细青贮饲料。
所述方法B中，所述玉米原料可为乳熟期至完熟期全株玉米、玉米籽粒、及玉米穗和部分玉米茎杆(含叶片)。
所述方法B中，所述玉米原料的含水量具体可为35％-75％。
所述方法B中，所述玉米原料在施加菌剂前经过预处理；
所述预处理方法为：将玉米茎叶切碎至2-3cm，玉米籽实破碎至无完整颗粒；
所述方法B中，将所述菌剂施加到玉米原料前，还包括如下步骤：将菌剂采用水溶解，室温活化50-70min(具体可为60min)，所述水为蒸馏水。
所述方法B中，所述菌剂施加量为每克玉米原料接种0.5-20×105CFU的布氏乳杆菌LB；所述菌剂施加量具体可为每克玉米原料接种8×105CFU的布氏乳杆菌LB；
所述方法B中，所述青贮的温度可为20℃-40℃，具体可为20℃、30℃或40℃。
所述青贮的时间可为30-50天，具体可为45天。
由上述方法制备得到的全株玉米精细青贮饲料也属于本发明的保护范围。
所述全株玉米精细青贮饲料含有较少种类及数量的抗性基因。
本发明提供了一种布氏乳杆菌LB，布氏乳杆菌LB可作为全株玉米精细青贮添加剂，显著提高乳酸产出，显著降低pH值，有效提高全株玉米精细青贮发酵品质；并能减少青贮饲料中抗性基因的种类；同时布氏乳杆菌LB具有发酵效率高、成本低廉等优点，可应用于绿色环保生物饲料的生产中。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
MRS液体培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在MRS液体培养基中的浓度为：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，吐温801mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L；所述溶剂为水。
全株玉米精细鲜草提取液培养基：1kg全株玉米精细鲜草，切碎加5L水中，50℃水浴2h，得到提取液；将提取液先用四层纱布过滤，然后用定量滤纸(杭州特种纸业有限公司，新星201型)过滤，收集滤液；将滤液121℃高压灭菌15分钟，然后分装到已灭菌的试管中备用。
脱脂奶：固态奶粉按10％质量体积比(w/v)溶解于蒸馏水。
固态奶粉：高蛋白脱脂高钙奶粉，内蒙古伊利实业集团股份有限公司，货号：6907992440071。
实施例1、布氏乳杆菌(Lactobacillus brevis)LB的分离、筛选与鉴定
一、菌株的分离筛选
采集内蒙古呼和浩特市羊皮浸泡液(羊皮制作过程中，清水浸泡生皮后的液体)，用振荡器震荡30min，采用蒸馏水10-1-10-6梯度稀释，分别从各稀释梯度稀释液中取1mL接种至培养皿中，加入10-15ml灭菌后的MRS固体培养基，摇匀，待其冷却凝固，静置厌氧培养48h。挑取菌落形态、大小、颜色和光泽度有明显差别的单菌落，重复划线，并直至得到纯菌落。挑取单菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。凡是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株初步认定为乳酸菌，然后用全株玉米精细鲜草提取液培养基筛选出一株生长能力和产酸能力高的乳酸菌，命名为菌株LB，其生长能力和产酸能力如表1所示。
菌株生长能力和产酸能力的测定方法：将待测菌株接种到10mL的MRS液体培养基中，培养2代后按3％(体积比)的接种量接种到全株玉米精细鲜草提取液培养基中，37℃、250rpm振荡培养。每间隔12h取出一次培养的样品，取3次，最后一次为培养36h后取样，所有样品在波长620nm下测量样品的吸光度值，并测定发酵液的pH值。以未接种菌株的全株玉米精细提取液培养基为对照，比较不同菌株在全株玉米精细提取液培养基中振荡培养36h内在波长620nm下的吸光度值与对照之间的最大差值，以及发酵液的pH值与对照之间的最大差值，筛选出吸光度值升高最大，pH值下降最大的乳酸菌菌株。
表1菌株LB的生长能力和产酸能力
\ 生长能力<sup>a</sup> 产酸能力<sup>b</sup>
菌株LB 2.44 2.61
注：a，乳酸菌菌株在全株玉米精细提取液培养基中培养36h内在波长620nm下的吸光度值与对照之间的最大差值；b，乳酸菌菌株在全株玉米精细提取液培养基中培养36h内发酵液的pH值与对照之间的最大差值。
二、菌株LB的鉴定
菌株LB的生物学特性：菌株LB在MRS固体培养基上培养24h，菌株生长良好，可形成边缘整齐的乳白色菌落；菌株革兰氏染色呈阳性，显微镜下的细胞形态为短杆状、无芽孢；氧化酶阴性，在全株玉米精细提取液培养基中具有较强的生长及产酸性能。
根据GB4789.35-2010对菌株不同碳源的同化能力进行检测，其对碳源发酵的实验结果如表2所示。
表2 LB菌株的碳源发酵实验结果
碳源 菌株LB
***糖 +
果糖 +
蔗糖 +
乳醇 +
麦芽糖 +
七叶苷 +
核糖 +
棉子糖 +
注：“+”为阳性；“-”为阴性
将菌株LB的16S rDNA序列进行扩增并测序，测序结果如序列表的序列1所示。16srDNA鉴定结果显示菌株LB与NCBI数据库中的多株布氏乳杆菌的相似性为99％。
经过以上鉴定，可以确定菌株LB属于布氏乳杆菌，因此重新将其命名为布氏乳杆菌LB。
三、布氏乳杆菌LB的保藏
布氏乳杆菌(Lactobacillus brevis)LB，已于2017年6月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.14269。布氏乳杆菌(Lactobacillus brevis)LB简称为布氏乳杆菌LB。
四、布氏乳杆菌LB在不同pH、温度及盐浓度环境条件下的生长测定
1、将布氏乳杆菌LB接种于不同初始pH(3、4、4.5、5、6、7和8)的MRS液体培养基中，37℃静置培养2天，培养结束后，与空白MRS液体培养基比对生长情况。结果如表3所示。结果显示，布氏乳杆菌LB能够在起始pH值为4.0-8.0的培养条件下能生长。
表3布氏乳杆菌LB在不同初始pH环境中的生长情况
培养基初始pH 菌株LB
3.0 +
4.0 +
4.5 +
5.0 +
6.0 +
7.0 +
8.0 +
注：“+”为阳性；“-”为阴性
2、将布氏乳杆菌LB接种于MRS液体培养基中，进行如下分组操作：
组A：4℃静置培养14天；
组B：10℃静置培养2天；
组C：20℃静置培养2天；
组D：30℃静置培养2天；
组F：40℃静置培养2天；
组G：50℃静置培养7天；
组H：60℃静置培养7天。
培养结束后与空白MRS液体培养基比对生长情况。结果如表4所示。结果显示，布氏乳杆菌LB在4℃、50℃和60℃温度下不能生长，在10℃-40℃条件下生长状况良好。
表4布氏乳杆菌LB在不同初始pH环境中的生长情况
Figure GDA0003877413170000061
Figure GDA0003877413170000071
注：“+”为阳性；“-”为阴性
3、将布氏乳杆菌LB分别接种于含有3％(质量百分比)氯化钠的MRS液体培养基和含有6.5％(质量百分比)氯化钠的MRS液体培养基中，37℃静置培养4天，观察乳酸菌生长状况。结果如表5所示。结果显示，布氏乳杆菌LB能够在含3％(质量百分比)和6.5％(质量百分比)氯化钠的条件下生长。
表5布氏乳杆菌LB在盐环境中的生长情况
Figure GDA0003877413170000072
注：“+”为阳性；“-”为阴性
实施例2、布氏乳杆菌(Lactobacillus brevis)LB制备全株玉米精细青贮饲料
一、菌粉制备
将布氏乳杆菌LB接种于10ml MRS液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养，培养2代后按3％(体积比)的接种量接种到60ml MRS液体培养基中(菌液初始OD260nm＝1.8)，37℃、250rpm振荡培养18-24h(菌液最终OD260nm＝4)，将培养体系离心，收集菌体沉淀，将菌体沉淀与10ml灭菌后的脱脂奶混匀后冻干，得到固态菌剂，固态菌剂中的布氏乳杆菌浓度为1×1012CFU g-1(需大于1×1010CFU g-1)。
二、全株玉米精细青贮制备
全株玉米精细：全株玉米包括全株玉米、玉米籽粒、玉米穗、玉米穗及部分茎秆(含叶片)等。分别切碎至2-3cm，籽粒经过破碎，含水量为35％-75％。
1、取步骤一制备的固态菌剂，采用5ml蒸馏水溶解，室温活化25min，得到液态菌剂(5ml液态菌剂中布氏乳杆菌LB的含量为2×109CFU)。
2、将步骤1得到的5ml液态菌剂全部喷洒在2500g玉米原料上(含水量为35％-75％)，每克玉米原料接种8×105CFU的布氏乳杆菌LB。对照组(CK)喷洒5ml无菌水。采用聚乙烯袋(180×260mm)抽真空密封制作青贮，每袋约250g，然后分别贮藏至20、30和40℃下的恒温箱中，青贮45天。
三、全株玉米精细青贮效果检测
1、分别打开每袋青贮样品，称取充分混匀的青贮料20g，加入180mL蒸馏水，用搅拌机搅碎1min，先后用4层纱布和定性滤纸(杭州特种纸业有限公司，新星102)过滤，收集滤液。
对滤液进行如下指标检测：pH值、乳酸(lactic acid,LA)、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)、丁酸(butyrate acid,BA)、氨态氮(ammonia nitrogen,AN)和游离氨基酸氮(amino acid nitrogen,AA-N)。
pH值采用雷磁PHS-3C型pH计测定。
乳酸、乙酸、丙酸和丁酸采用高效液相色谱法分析。仪器：岛津20A高效液相色谱仪；检测器：岛津SPD-M20A检测器；色谱柱：ShodexRSpak KC-811色谱柱(8mm×300mm)；流动相：3mmol·L-1高氯酸(优级纯)；检测波长：210nm；流速：1mL·min-1；进样量：5μL；柱温50℃。待测滤液用0.45μm水系滤膜过滤后上机检测。
乳酸、乙酸、丙酸和丁酸标准品(Geel，Belgium)购自北京百灵威化学技术有限公司。
乳酸标准品的出峰时间为8.1min；在相同条件下出峰位置为±0.2min以内，可以认定为同一物质。
乙酸标准品的出峰时间为9.6min；在相同条件下出峰位置为±0.2min以内，可以认定为同一物质。
丙酸标准品的出峰时间为11.2min；在相同条件下出峰位置为±0.2min以内，可以认定为同一物质。
丁酸标准品的出峰时间为13.8min；在相同条件下出峰位置为±0.2min以内，可以认定为同一物质。
AN采用苯酚-次氯酸比色法测定。
AA-N采用茚三铜比色法测定。
从青贮饲料中提取的DNA样本低温运输(0℃以下)送往基因测序公司。公司将对接收到的样品进行样品检测。
检测合格的DNA样品，进行文库构建以及文库检测，检测合格的文库将采用Illumina PE150进行测序，测序得到的下机数据(Raw Data)将用于后期信息分析。
检测合格的DNA样品用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度约为350bp的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至2ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞3nM)，以保证文库质量。
库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina PE150测序。
数据质控：测序得到的原始数据(Raw Data)会存在一定比例的低质量数据，为了保证后续信息分析结果的准确可靠，首先要对原始数据进行质控及宿主过滤，得到有效数据(Clean Data)；
Metagenome组装：从各样品质控后的Clean Data出发，进行Metagenome组装，并将各样品未被利用上的reads放在一起进行混合组装，以期发现样品中的低丰度物种信息；基因预测：从单样品和混合组装后的scaftigs出发，采用MetaGeneMark进行基因预测，并将各样品和混合组装预测产生的基因放在一起，进行去冗余，构建gene catalogue，从genecatalogue出发，综合各样品的Clean Data，可获得gene catalogue在各样品中的丰度信息；抗性基因注释：利用gene catalogue与抗生素抗性基因数据库CARD(TheComprehensive Antibiotic Resistance Database)进行注释，可以获得抗性基因丰度分布情况以及这些抗性基因的物种归属和抗性机制。
结果如表6所示。
表6布氏乳杆菌LB对全株玉米精细青贮发酵品质的影响
添加剂 青贮饲料原料 抗性基因种类数量 pH
CK 全株玉米 138 3.99
CK 玉米籽粒 135 4.01
CK 玉米穗 124 4.08
CK 玉米穗与部分茎秆(含叶片) 117 3.94
LB 全株玉米 105 3.91
LB 玉米籽粒 116 4.11
LB 玉米穗 93 4.05
LB 玉米穗与部分茎秆(含叶片) 87 3.87
LP 全株玉米 119 3.91
LP 玉米籽粒 122 4.03
LP 玉米穗 108 4.05
LP 玉米穗与部分茎秆(含叶片) 104 3.88
LP为植物乳杆菌(LP,Lactobacillus plantarum,参见The effects of stage ofmaturity and lactic acid bacteria inoculants on the ensiling characteristics,aerobic stability and in vitro digestibility of whole-crop oat silages,Tingting Jia,Bing Wang,Zhu Yu,Zhe Wu)，制作方法及添加量与布氏乳杆菌(Lactobacillus brevis)LB相同。
综上所述，布氏乳杆菌LB可作为全株玉米精细青贮添加剂，显著降低pH值，有效提高全株玉米精细青贮发酵品质；消减全株玉米精细青贮中抗性基因的种类；同时布氏乳杆菌LB具有成本低廉等优点，可应用于绿色环保生物饲料的生产中。
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<400> 1
taagatgaga gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcatgccta atacatgcaa 60
gtcgaacgag cttccgttga atgacgtgct tgcactgatt tcaacaatga agctagtggc 120
gaactggtga gtaacacgtg ggaaatctgc ccagaagcag gggataacac ttggaaacag 180
gtgctaatac cgtataacaa caaaatccgc atggattttg tttgaaaggt ggcttcggct 240
atcacttctg gatgatcccg cggcgtatta gttagttggt gaggtaaagg cccaccaaga 300
cgatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat tgggactgag acacggccca 360
aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca 420
atgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttaaa gaagaacacc 480
tttgagagta actgttcaag ggttgacggt atttaaccag aaagccacgg ctaactacgt 540
gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggcn agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc 600
gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg gcttaaccgg agaagtgcat 660
cggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcngtggaa 720
tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctagtctg taactgacgc 780
tgaggctcna aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa 840
cgatgagtgc taagtgatgg agggtttccg cccttcagtg ctgcagctaa cgcattaagc 900
actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggccngca 960
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 1020
atcttctgcc aatcttagag ataagacgtt cccttcgggg acagaatgac aggtggtgca 1080
tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1140
tattatcagt tgccagcatt cagttgggca ctctggtgag actgccggtg acaaaccgga 1200
ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1260
caatggacgg tacaacgagt cgcgaagtcg tgaggctaag ctaatctctt aaagccgttc 1320
tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgcgg 1380
atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga 1440
gagtttgtaa cacccaaagc cggtgagata accttcggga gtcagccgtc taaggtggga 1500
cagatgatta ggg 1513

Claims (1)

1.一种以玉米为原料青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：将菌剂施加到玉米原料上，进行青贮，得到全株玉米精细青贮饲料，或将布氏乳杆菌LB施加到玉米原料上，进行青贮，得到全株玉米精细青贮饲料；
所述菌剂通过将布氏乳杆菌LB与益生菌保护剂混合制得；
每克所述菌剂中，所述布氏乳杆菌LB的含量大于1×1010 CFU；所述益生菌保护剂为脱脂奶；所述脱脂奶通过将固态奶粉按10%质量体积比溶解于水制得；
所述玉米原料为乳熟期至完熟期全株玉米；
所述布氏乳杆菌（Lactobacillus brevis）LB已于2017年8月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101，保藏编号为CGMCC No. 14269；
所述玉米原料的含水量为35%-75%；
所述玉米原料在施加菌剂或布氏乳杆菌LB前经过预处理；
所述预处理方法为：将玉米茎叶切碎至2-3 cm，玉米籽实破碎至无完整颗粒；
将所述菌剂或布氏乳杆菌LB施加到玉米原料前，还包括如下步骤：将菌剂或布氏乳杆菌LB采用水溶解，室温活化50-70 min；
所述菌剂或布氏乳杆菌LB施加量为每克玉米原料接种0.5-20×105 CFU的布氏乳杆菌LB；
所述青贮的温度为20℃-40℃；
所述青贮的时间为30-50天。
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