CN116802276A - 用于扩增培养肾元祖细胞的培养基、扩增培养肾元祖细胞的方法以及肾脏类器官的制造方法 - Google Patents

用于扩增培养肾元祖细胞的培养基、扩增培养肾元祖细胞的方法以及肾脏类器官的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种包含GSK‑3β抑制剂、ROCK抑制剂、以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子的用于扩增培养肾元祖细胞的培养基。此外，提供一种使用所述培养基来扩增培养肾元祖细胞的方法。此外，提供一种包括通过扩增培养所述肾元祖细胞的方法，来扩增培养肾元祖细胞的工序，和使所述扩增培养的肾元祖细胞分化为肾脏类器官的工序的肾脏类器官的制造方法。

Description

用于扩增培养肾元祖细胞的培养基、扩增培养肾元祖细胞的 方法以及肾脏类器官的制造方法
技术领域
本发明涉及用于扩增培养肾元祖细胞的培养基、扩增培养肾元祖细胞的方法以及肾脏类器官的制造方法。
本申请要求在2021年01月08日提交日本专利局的日本特愿2021-002203号的优先权，该申请的全部内容通过引用结合在本申请中。
背景技术
目前，据推算，日本的慢性肾脏病(CKD)的患者数量约为1300万人，被称为新的国民病。针对慢性肾脏病的根治性治疗方法很少，根据其进展需要透析疗法的晚期慢性肾衰竭患者有34万人以上，不仅在医学上，而且在医疗经济上也成为了很大的问题。虽然作为包括晚期慢性肾衰竭在内的慢性肾脏病的根治疗法，可以列举出肾移植，但是由于供体脏器严重不足，供给完全跟不上需求。
肾脏来源于作为胎生初期组织的间介中胚层，在脊椎动物中，由间介中胚层形成前肾、中肾、后肾3个肾脏，在哺乳动物中，后肾成为成体的肾脏。后肾是通过将来分化成被称为间叶的成体肾的肾单位和间质的组织和将来从被称为输尿管芽的成体肾的集合管分化为下部的肾盂、输尿管、膀胱的一部分的组织这两个组织的相互作用而产生的。而且，示出了在后肾间叶中存在构成肾单位的肾小球和具有分化为数种肾小管上皮细胞的多分化能力的肾元祖细胞(Nephron Progenitor Cell:NPC)(非专利文献1、2)。
小鼠肾元祖细胞(mouse Nephron Progenitor Cell:mNPC)的扩增培养法，报告了使用骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein:BMP)7的方法。例如，在非专利文献3中，报告了以下内容，即，使用了含有BMP7、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growthfactor:FGF)2、肝素、Y-27632、CHIR99021、白血病抑制因子(Leukemia inhibitoryfactor:LIF)、A83-01、LDN193189的培养基(NPSR培养基)，使mNPC增殖了1年以上。
在先技术文献
非专利文献
非专利文献1：Osafune K.,et al.,Identification of multipotentprogenitors in theembryonic mouse kidney by a novel colony-formingassay.Development 2006；133:151-61.
非专利文献2：Kobayashi A.,et al.,Six2 defines and regulates amultipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammaliankidney development.Cell Stem Cell 2008；3:169-81.
非专利文献3：Z.Li,T.Araoka,J.C.I.Belmonte,Gene Editing in 3D CulturedNephron Progenitor Cell Lines,in:S.Vainio(Ed.),Kidney Organog MethodsProtoc,Hummana Press,New York,2019:pp.151-159.
发明内容
发明所要解决的问题
为了将扩增培养的肾元祖细胞用于再生医疗等，在扩增培养中，需要维持分化能力等肾元祖细胞的性质。因此，希望开发出能够在维持肾元祖细胞的性质的状态下，有效地扩增培养肾元祖细胞的培养方法。
于是，本发明的课题在于，提供能够在维持分化能力的状态下扩增培养肾元祖细胞的用于扩增培养肾元祖细胞的培养基，使用了所述培养基的肾元祖细胞的扩增培养方法，以及由通过所述扩增培养方法得到的肾元祖细胞制造肾脏类器官的方法。
用于解决课题的方法
本发明包括以下方式。
(1)一种用于扩增培养肾元祖细胞的培养基，其含有GSK-3β抑制剂、ROCK抑制剂、以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子。
(2)(1)所记载的用于扩增培养肾元祖细胞的培养基还含有JAK抑制剂。
(3)在(2)所记载的培养基中，所述JAK抑制剂为JAK2抑制剂。
(4)在(3)所记载的培养基中，所述JAK2抑制剂为TG101348。
(5)在(1)～(4)中任一所述的培养基中，所述GSK-3β抑制剂为CHIR99021。
(6)在(1)～(5)中任一所述的培养基中，所述ROCK抑制剂为Y-27632。
(7)(1)～(6)中任一所述的培养基还含有相对于所述培养基的总体积，10体积％的AS401。
(8)在(1)～(7)中任一所述的培养基中，所述肾元祖细胞为人类的肾元祖细胞。
(9)在(1)～(8)中任一所述的培养基中，所述肾元祖细胞为从多能干细胞诱导出的肾元祖细胞。
(10)在(9)所记载的培养基中，所述多能干细胞为iPS细胞。
(11)一种扩增培养肾元祖细胞的方法，其包括在(1)至(10)中任一所述的培养基中培养肾元祖细胞的工序。
(12)在(11)所记载的扩增培养肾元祖细胞的方法中，培养所述肾元祖细胞的工序包括传代培养所述肾元祖细胞。
(13)一种扩增培养肾元祖细胞的方法，其包括：(A)在(1)～(10)中任一所述的培养基中培养肾元祖细胞30～60小时的工序；(B)在含有GSK-3β抑制剂以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子，且不含有ROCK抑制剂的培养基中，培养在所述工序(A)中得到的细胞的工序。
(14)(13)所记载的扩增培养肾元祖细胞的方法还包括(C)将在所述工序(B)中得到的细胞传代至(1)～(10)中任一所述的培养基的工序。
(15)(14)所记载的扩增培养肾元祖细胞的方法还包括：(D)在(1)～(10)中任一所述的培养基中，培养在所述工序(C)中传代的细胞30～60小时的工序；(E)在含有GSK-3β抑制剂以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子，且不含有ROCK抑制剂的培养基中，培养在所述工序(D)中得到的细胞的工序。
(16)在(11)～(15)中任一所述的扩增培养肾元祖细胞的方法中，所述肾元祖细胞为人类的肾元祖细胞。
(17)在(11)～(16)中任一所述的扩增培养肾元祖细胞的方法中，所述肾元祖细胞为从多能干细胞诱导出的肾元祖细胞。
(18)在(17)所记载的扩增培养肾元祖细胞的方法中，所述多能干细胞为iPS细胞。
(19)在(17)或(18)所记载的扩增培养肾元祖细胞的方法中，所述肾元祖细胞为通过包括下述工序(i)～(vi)的方法得到的肾元祖细胞：(i)在含有FGF2、BMP4、GSK-3β抑制剂以及视黄酸或其衍生物的培养基中，培养多能干细胞的工序；(ii)在含有FGF2、GSK-3β抑制剂以及BMP7的培养基中，培养在所述工序(i)中得到的细胞的工序；(iii)在含有GSK-3β抑制剂、BMP7以及TGFβ抑制剂，且不含有FGF2的培养基中，培养在所述工序(ii)中得到的细胞的工序；(iv)在含有FGF2、GSK-3β抑制剂、激活素以及ROCK抑制剂的培养基中，培养在所述工序(iii)中得到的细胞的工序；(v)在含有视黄酸或其衍生物，且不含有FGF9的培养基中，培养在所述工序(iv)中得到的细胞的工序；以及(vi)在含有GSK-3β抑制剂以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子的培养基中，培养在所述工序(v)中得到的细胞的工序。
(20)在(19)所记载的扩增培养肾元祖细胞的方法中，在所述工序(iv)中使用的培养基为不含有BMP7的培养基。
(21)在(19)或(20)所记载的扩增培养肾元祖细胞的方法中，使用细胞贴壁面大于等于400cm2的培养容器来实施所述工序(i)～(vi)中的至少1个工序。
(22)一种肾脏类器官的制造方法，其包括：通过(11)～(21)中任一所述的扩增培养肾元祖细胞的方法，来扩增培养肾元祖细胞的工序；使所述扩增培养的肾元祖细胞分化为肾脏类器官的工序。
发明效果
本发明起到以下效果，即，可提供能够在维持分化能力的状态下扩增培养肾元祖细胞的用于扩增培养肾元祖细胞的培养基、使用了所述培养基的肾元祖细胞的扩增培养方法、以及由通过所述扩增培养方法得到的肾元祖细胞制造肾脏类器官的方法。
附图说明
图1示出使用hNPSR培养基(参照表1)或CFY培养基(参照表2)实施hNPC(Bulk)的传代培养，并在各传代中确认了SIX2以及OSR1的表达的结果。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图2示出尝试从使用hNPSR培养基或CFY培养基传代培养的hNPC(Bulk)制备肾脏类器官的结果。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图3示出使用在hNPSR培养基或CFY培养基中添加了DMSO的培养基实施hNPC(Bulk)的传代培养，并测定细胞数从而计算出累积细胞数的结果。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图4示出使用在hNPSR培养基或CFY培养基中添加了DMSO的培养基实施hNPC(Bulk)的传代培养，并在各传代中测定了细胞数的结果。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图5示出使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(CFY+DMSO)或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348的培养基(CFY+TG(3))实施hNPC(Bulk)的培养，并测定了细胞数的结果。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图6示出使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(CFY+DMSO)或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348的培养基(CFY+TG(3))实施hNPC(Bulk)的传代培养，并在各传代中确认了SIX2以及OSR1的表达的结果。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图7示出使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(CFY+DMSO)或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348的培养基(CFY+TG(3))实施hNPC(Bulk)的传代培养，并尝试从第二代细胞制备肾脏类器官的结果。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图8示出使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(CFY+DMSO)、或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348的培养基(CFY+TG(3))实施hNPC(c-MET(+))的培养，并在各传代中测定细胞数从而计算出累积细胞数的结果。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图9示出使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(CFY+DMSO)或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348的培养基(CFY+TG(3))实施hNPC(c-MET(+))的传代培养，并在各传代中确认了SIX2以及OSR1的表达的结果。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图10示出使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(CFY+DMSO)或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348的培养基(CFY+TG(3))实施hNPC(c-MET(+))的传代培养，并尝试从第一代细胞制备肾脏类器官的结果。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图11示出针对顺铂给药而引起急性肾损伤(AKI)的免疫缺陷小鼠(AKI小鼠)，将在CFY培养基中1次传代的hNPC(Bulk)的细胞团移植到肾被膜下，并测定了血液中的尿素氮(BUN)以及血清肌酐(S-Cre)的结果。图中，“正常”表示正常小鼠，“生理盐水”表示在肾被膜下输注了生理盐水的AKI小鼠，“NPC移植”表示移植了hNPC(Bulk)的AKI小鼠。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图12示出针对顺铂给药而引起急性肾损伤(AKI)的免疫缺陷小鼠，将在CFY培养基中2次传代的hNPC(Bulk)的细胞团移植到肾被膜下，并测定了血液中的尿素氮(BUN)以及血清肌酐(S-Cre)的结果。图中，“正常”表示正常小鼠，“生理盐水”表示在肾被膜下输注了生理盐水的AKI小鼠，“NPC移植”表示移植了hNPC(Bulk)的AKI小鼠。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图13示出在基于分化诱导法B(参照实施例5)的从人诱导多能干细胞(hiPSC)向hNPC的诱导中，确认了在工序4(后肾谱系后期原始条纹的制备)中，使FGF2浓度发生了变化的情况以及添加了肝素的情况下的SIX2阳性细胞的分化诱导效率的结果。
图14示出在基于分化诱导法B的从hiPSC向hNPC的诱导中，确认了在工序3(中胚层谱系后期原始条纹的制备)中，使FGF2浓度发生了变化的情况下的SIX2阳性细胞的分化诱导效率的结果。
图15示出在基于分化诱导法B的从hiPSC向hNPC的诱导中，确认了在工序5(后期后方间介中胚层的制备)中，使FGF9浓度发生了变化的情况以及添加了肝素的情况下的SIX2阳性细胞的分化诱导效率的结果。
图16示出在基于分化诱导法B的从hiPSC向hNPC的诱导中，确认了将基础培养基的添加物从B27(无维生素A型添加剂(50×)英杰)变更为AS401(StemFit(注册商标)for Differentiation、Ajinomoto Healthy Supply Co.,Inc.)时的SIX2阳性细胞的分化诱导效率的结果。10％AS401:含有相对于基础培养基的总体积，10体积％的AS401的基础培养基；20％AS401:含有相对于基础培养基的总体积，20体积％的AS401的基础培养基；B27:添加了B27的基础培养基。以下，当记载为添加了10％AS401的培养基时，是指含有相对于培养基的总体积，10体积％的AS401的培养基。关于添加了20％AS401的培养基也一样。
图17示出在基于分化诱导法B的从临床用hiPSC向hNPC的诱导中，确认了将基础培养基的添加物从B27变更为AS401时的SIX2表达的结果。iPSC:临床用hiPSC；NPC(B27):使用添加了B27的基础培养基诱导出的NPC；NPC(AS10):使用添加了10％AS401的基础培养基诱导出的hNPC。
图18示出在实施例10～14中使用的从hiPSC向hNPC的分化诱导条件(分化诱导法C)。以下，将图18的小规模下的分化诱导法称为“分化诱导法C(Small)”，将大规模下的分化诱导法称为“分化诱导法C(Large)”。分化诱导法C中，除非另有说明，否则使用添加了10％AS401的DMEM/F12 Glutamax(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.))作为基础培养基。
图19示出通过分化诱导法C(Small)而利用免疫染色确认了由HLA同源hiPSC(Ff14s04)株诱导的hNPC的SIX2表达的荧光图像。
图20示出通过分化诱导法C(Small)或分化诱导法C(Large)而分化诱导的hNPC的阶段6在第二天(day2)中的形态和SIX2的表达，以及扩增培养后第7天(day7)的形态照片。
图21示出通过分化诱导法C(Large)而分化诱导的hNPC的细胞产量。
图22示出利用免疫染色确认了通过分化诱导法C(Large)而分化诱导的hNPC的SIX2表达的荧光图像。
图23示出在添加物(B27或AS401)不同的培养基中扩增培养中的hNPC的形态照片。比例尺为300μm。AS 10％:添加10％AS401以代替B27的改性CFY培养基(以下，也称为“CFY培养基(-B27,+10％AS401)”；AS 20％:添加20％AS401以代替B27的改性CFY培养基(以下，也称为“CFY培养基(-B27,+20％AS401)”；B27:CFY培养基。
图24示出在添加物(B27或AS401)不同的培养基中扩增培养的hNPC的增殖率。AS10％:CFY培养基(-B27,+10％AS401)；AS20％:CFY培养基(-B27,+20％AS401)；B27:CFY培养基。
图25示出将在添加物(B27或AS401)不同的培养基中扩增培养的hNPC的细胞团移植到AKI小鼠的肾被膜下，并测定了血液中的尿素氮(BUN)的结果。B27:移植在CFY培养基中扩增培养的hNPC的细胞团；AS10:移植在CFY培养基(-B27,+10％AS401)中扩增培养的hNPC的细胞团；AS20:移植在CFY培养基(-B27,+20％AS401)中扩增培养的hNPC的细胞团；Ctl:无移植。pre:顺铂给药前；post TX:顺铂给药后。
图26示出将在添加物(B27或AS401)不同的培养基中扩增培养的hNPC的细胞团移植到AKI小鼠的肾被膜下，并测定了血清肌酐(S-Cre)的结果。B27:移植在CFY培养基中扩增培养的hNPC的细胞团；AS10:移植在CFY培养基(-B27,+10％AS401)中扩增培养的hNPC的细胞团；AS20:移植在CFY培养基(-B27,+20％AS401)中扩增培养的hNPC的细胞团；Ctl:无移植。pre:顺铂给药前，post TX:顺铂给药后。
图27示出确认了在添加物(B27或AS401)不同的培养基中扩增培养的hNPC的基因表达的结果。B27:CFY培养基；AS10:CFY培养基(-B27,+10％AS401)。
图28示出使用将CFY培养基的FGF9变更为FGF2的培养基(以下，也称为“CFY培养基(-FGF9,+FGF2)”)或CFY培养基扩增培养的hNPC的NPC标记的表达。hNPC使用了通过分化诱导法A(国际公开第2018/216743号所记载的分化诱导方法)而从hiPSC分化诱导的产物。
图29示出使用光学显微镜观察了从hNPC分化诱导的肾脏类器官的结果。hNPC是使用CFY培养基(-FGF9,+FGF2)或CFY培养基扩增培养的。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图30示出对自传代起2天后培养基交换为CF培养基(从CFY培养基除去Y-27632的培养基)的传代方法反复3次传代时的、每次传代的细胞的FACS分析结果。P1:1次传代的细胞；P2:2次传代的细胞；P3:3次传代的细胞。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图31示出在CFY培养基中实施传代后的培养基更换，并反复3次传代时的、每次传代的细胞的FACS分析结果。P1:1次传代的细胞；P2:2次传代的细胞；P3:3次传代的细胞。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图32示出通过自传代起2天后培养基交换为CF培养基(CFY→CF)或CFY培养基(CFY→CFY)的传代方法进行了1次传代时的、NPC标记(OSR1(+)SIX2(+),OSR1(+)SIX2(-)、c-MET(+))阳性细胞数以及整体的细胞数。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图33示出通过自传代起2天后培养基交换为CF培养基(CFY→CF)或CFY培养基(CFY→CFY)的传代方法进行了2次传代时的、NPC标记(OSR1(+)SIX2(+),OSR1(+)SIX2(-)、c-MET(+))阳性细胞数以及整体的细胞数。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图34示出通过自传代起2天后培养基交换为CF培养基(CFY→CF)或CFY培养基(CFY→CFY)的传代方法进行了2次传代时的、NPC标记的表达。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
图35示出使用光学显微镜观察了从hNPC分化诱导的肾脏类器官的结果。hNPC使用了通过自传代起2天后培养基交换为CF培养基(CFY→CF)或CFY培养基(CFY→CFY)的传代方法进行了1次传代的产物。hNPC使用了通过分化诱导法A从hiPSC分化诱导的产物。
具体实施方式
<用于扩增培养肾元祖细胞的培养基>
本发明的第1方式为用于扩增培养肾元祖细胞的培养基。本方式的培养基含有GSK-3β抑制剂、ROCK抑制剂、以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少成纤维细胞生长因子。在一个实施方式中，本方式的培养基还含有JAK抑制剂。
(肾元祖细胞:NPC)
NPC是可在体外向肾脏的肾小球样结构和肾小管样结构等器官结构分化的细胞。可以通过例如Osafune K,et al.(2006),Development 133:151-61所记载的方法来评价肾元祖细胞向器官结构的分化能力。作为用于维持肾元祖细胞的状态的转录因子，已知SIX2(Cell Stem Cell 3:169-181(2008))，作为通过本方式的方法培养的肾元祖细胞的示例，可列举SIX2阳性的肾元祖细胞。例如，可以对具有在SIX2启动子控制下所导入的报告基因(例如、tdTomato)的多能干细胞(例如，后述实施例记载的OSR1-GFP/SIX2-tdTomato报告基因人诱导多能干细胞)进行培养，以该报告基因的表达为指标，通过该领域公知的方法(例如使用细胞仪的方法)，来分离SIX2阳性的肾元祖细胞。此外，还可以通过对定量的RT-PCR(NatCommun 4,1367,(2013))等基因表达进行分析的方法，来确认肾元祖细胞中的SIX2的表达。在本说明书中，在SIX2阳性的肾元祖细胞中包含:表达SIX2蛋白质的细胞、及表达在SIX2启动子控制下的基因所编码的蛋白质的细胞。虽然作为人类的SIX2基因(NCBI GeneID:10736)，可列举具有以NCBI登录号:NM_016932.5登记的核苷酸序列的基因，作为小鼠的SIX2基因(NCBI Gene ID:20472)，可列举具有以NCBI登录号:NM_011380.2登记的核苷酸序列的基因等，但不限定于此。对于在本方式的培养基中培养的肾元祖细胞，优选OSR1为阳性，且HOX11、WT1、SIX2以及SALL1为阳性。
肾元祖细胞来源的生物没有特别限定，只需为具有肾脏的动物即可。肾元祖细胞优选来自哺乳动物，更优选来自人类。即，优选人类的肾元祖细胞。
肾元祖细胞可以从生物体的后肾间叶分离，也可以从多能干细胞(ES细胞、iPS细胞等)分化诱导。在本方式的培养基中扩增培养的肾元祖细胞优选从多能干细胞诱导，更优选从iPS细胞诱导。
肾元祖细胞从多能干细胞的分化诱导可以通过公知的方法来实施。作为从多能干细胞诱导肾元祖细胞的方法，例如可列举国际公开第2014/200115号、国际公开第2017/043666号、国际公开第2018/216743号等所记载的方法。
肾元祖细胞从从后肾间叶采集的细胞团体或从多能干细胞分化诱导的细胞团体的分离例如可以将上述肾元祖细胞的标志物即OSR1、HOX11、WT1、SIX2、或SALL1的表达作为指标来实施。或者，可以将c-MET或AGTR 2的表达作为指标来实施(国际公开第2020/022261号)。
在本方式的培养基中扩增培养的肾元祖细胞可以被提供为包含其他细胞种类的细胞团体，也可以被提供为被纯化了的肾元祖细胞的细胞团体。在为包含肾元祖细胞和其他细胞种类的细胞团体的情况下，肾元祖细胞数的比例优选为，相对于总细胞数(100％)，为30％、大于等于40％、大于等于50％、大于等于60％、大于等于70％、大于等于80％或大于等于90％。
(扩增培养)
“扩增培养”是指在維持肾元祖细胞的性质的状态下使肾元祖细胞增殖的培养。即、扩增培养的肾元祖细胞可以在体外向肾脏的肾小球样结构和肾小管样结构等器官结构分化。本方式的培养基即使反复进行传代也能够在维持肾元祖细胞的性质的状态下扩增培养肾元祖细胞。
(培养基)
本方式的培养基可以是在用于动物培养的基础培养基中添加了GSK-3β抑制剂、ROCK抑制剂、以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少成纤维细胞生长因子的培养基。此外，也可以是在用于动物培养的基础培养基中除了添加了GSK-3β抑制剂、ROCK抑制剂、以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少成纤维细胞生长因子之外，还添加了JAK抑制剂的培养基。
<基础培养基>
基础培养基不受特别限定，可以不受特别限制地使用通常用于动物培养的基础培养基。作为基础培养基，例如可列举IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle最低基础培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium，EMEM)培养基、αMEM培养基、杜皮克氏改良爱哥尔氏培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle’sMedium，DMEM)培养基、Ham’sF12(F12)培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、以及它们的混合培养基等，但不限于此。培养基可以含有血清(例如、胎牛血清(FBS))，或者也可以是无血清。根据需要，也可以含有例如白蛋白、转铁蛋白、KnockOutTM血清替代物(KnockOutTM Serum Replacement，KSR)(ES细胞培养时的血清替代物)(英杰(Invitrogen))、N2(英杰)、B27补充剂(英杰)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫醇甘油等一个或多个血清替代物。此外，也可以含有脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、谷氨酰胺(英杰)、非必需氨基酸(NEAA)、维生素、增殖因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐以及它们的等价物等一个或多个物质。
基础培养基例如可以是在DMEM/F12培养基的混合培养基(例如，将DMEM:F12以1:1混合的混合培养基)中添加了氨基酸、非必需氨基酸、血清替代物等的基础培养基。
可以在基础培养基中适当添加补充剂。作为补充剂，例如可列举AS401(StemFitfor Differentiation、Ajinomoto Healthy Supply Co.,Inc.)、B27(无维生素A型添加剂(英杰))等。基础培养基优选含有相对于基础培养基的总体积，10体积％的AS401。在本说明书中，有时会将含有相对于培养基的总体积，10体积％的AS401的培养基记载为添加了10％AS401的培养基。
作为基础培养基，例如可以是在DMEM/F12培养基的混合培养基中添加了10％AS401的培养基。作为基础培养基，例如可以是在DMEM/F12培养基的混合培养基中添加了10％AS401以及谷丙氨酸二肽(英杰)的培养基。作为在DMEM/F12培养基的混合培养基中添加了谷氨酰胺(GlutaMAX)的培养基，也可以使用DMEM/F12 Glutamax(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.))。基础培养基也可以为在DMEM/F12 Glutamax中添加了10％AS401的培养基。通过使用添加了10％AS401的基础培养基，从而提高了肾元祖细胞的增殖率，细胞团的形状，以及NPC标记(SIX2、OSR1)和肾保护因子(VEGFA)的表达等。
本方式的培养基含有GSK-3β抑制剂、ROCK抑制剂、以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子。
<GSK-3β抑制剂>
本方式的培养基含有GSK-3β抑制剂。GSK-3β抑制剂是一种阻碍GSK(GlycogenSynthase Kinase)3β的功能，例如激酶活性(例如对β连环蛋白的磷酸化能力)的物质。作为GSK3β抑制剂，例如可列举作为靛玉红衍生物的BIO(别名、GSK-3β抑制剂IX，6-溴靛玉红-3’-肟)、作为马来酰亚胺衍生物的SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羟苯基)氨基]-4-(2-硝苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、作为苯基α溴甲基酮类化合物的GSK-3β抑制剂VII(4-溴苯乙酮)、作为细胞膜透过型的磷酸化肽的L803-mts(别名，GSK3β肽抑制剂，Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2)，和CHIR99021(6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈)以及它们的衍生物等。这些化合物可以从例如Stemgent公司、Calbiochem公司、Biomol公司等获得，也可以自行制备。GSK-3β抑制剂也可以是针对GSK-3β的反义核酸、RNA干扰诱导核酸(例如siRNA)、显性阴性突变体以及它们的表达载体等。
GSK-3β抑制剂可以单独使用一种，也可以同时使用两种以上。作为优选的GSK3β抑制剂，可列举CHIR99021。可以根据GSK-3β抑制剂的种类适当选择培养基中的GSK-3β抑制剂的浓度。优选为，例如以IC50附近的浓度使用GSK-3β抑制剂。作为培养基中的GSK3β的浓度，当GSK-3β为CHIR99021时，例如可列举0.01～100μm，优选为0.1～10μm，进一步优选为0.5～3μm，特别优选为0.5～1.5μm。
<ROCK抑制剂>
本方式的培养基含有ROCK抑制剂。ROCK抑制剂是一种阻碍Rho-激酶(ROCK)的功能的物质。作为ROCK抑制剂，例如可列举Y-27632(例如，参照Ishizaki et al.,Mol.Pharmacol.57,976-983(2000)，Narumiya et al.,Methods Enzymol.325,273-284(2000))、Fasudil/HA1077(例如，参照Uenata et al.,Nature389:990-994(1997))、H-1152(例如，参照Sasaki et al.,Pharmacol.Ther.93:225-232(2002))、Wf-536(例如，参照Nakajima et al.,Cancer Chemother Pharmacol.52(4):319-324(2003))和它们的衍生物，以及针对ROCK的反义核酸、RNA干扰诱导核酸(例如，siRNA)、显性阴性突变体、以及它们的表达载体。此外，作为ROCK抑制剂，也可以使用其他的公知的低分子化合物(例如、参照美国专利申请公开第2005/0209261号，美国专利申请公开第2005/0192304号，美国专利申请公开第2004/0014755号，美国专利申请公开第2004/0002508号，美国专利申请公开第2004/0002507号，美国专利申请公开第2003/0125344号，美国专利申请公开第2003/0087919号，以及国际公开第2003/062227号、国际公开第2003/059913号、国际公开第2003/062225号、国际公开第2002/076976号、国际公开第2004/039796号)。
ROCK抑制剂可以单独使用一种，也可以同时使用两种以上。作为优选的ROCK抑制剂，可列举Y-27632。可以根据ROCK抑制剂的种类适当选择培养基中的ROCK抑制剂的浓度。优选为，例如以IC50附近的浓度使用ROCK抑制剂。作为培养基中的ROCK抑制剂的浓度，当ROCK抑制剂为Y-27632时，例如可列举0.1～100μm，优选为1～75μm，更优选为5～50μm。
本方式的培养基含有从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子。
<FGF9>
本方式的培养基可以含有成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor:FGF)9。FGF9来源的生物没有特别限定。作为FGF9，例如可以使用人FGF9。作为人FGF9(NCBIGene ID:2254)，例如可列举具有NCBI登录号:NP_002001.1的氨基酸序列的蛋白质。FGF9只要具有促进肾元祖细胞的增殖的活性，就可以是其片段或功能性变体。FGF9可以使用市售的，也可以使用从细胞精制的蛋白质或通过转基因生产的蛋白质。FGF20属于与FGF9相同的亚家族，根据在小鼠的发生期肾脏中显示出与FGF9的作用重复的作用的这一见解(Barak,H.et al.FGF9 and FGF20 Maintain the Stemness of Nephron Progenitors in Miceand Man.Dev.Cell 22,1191-1207(2012).)，认为可以代替FGF9。
作为培养基中的FGF9的浓度，例如可列举1～800ng/ml，优选为5～500ng/ml，更优选为10～400ng/ml，进一步优选为100～300ng/ml。
<FGF20>
本方式的培养基可以含有FGF20，以代替FGF9，或者含有FGF9和FGF20。如上所述，已知FGF20和FGF9在肾发生期同样起作用，并且可以相互代替。FGF20来源的生物没有特别限定。作为FGF20，例如可以使用人FGF20。作为人FGF20(NCBI Gene ID:26281)，例如可以列举具有NCBI登录号:NP_062825.1的氨基酸序列的蛋白质。FGF20只要具有促进肾元祖细胞的增殖的活性，就可以是其片段或功能性变体。FGF20可以使用市售的，也可以使用从细胞精制的蛋白质或通过转基因生产的蛋白质。
作为培养基中的FGF20的浓度，例如可列举1～800ng/ml，优选为5～500ng/ml，更优选为10～400ng/ml，进一步优选为100～300ng/ml。
本方式的培养基可以含有FGF9以及FGF20中的任意一种，也可以含有双方。在本方式的培养基含有FGF9以及FGF20双方的情况下，作为FGF9以及FGF20的合计浓度，例如可列举1～800ng/ml，优选为5～500ng/ml，更优选为10～400ng/ml，进一步优选为100～300ng/ml。
<其他成分>
本方式的培养基除了上述成分，还可以含有其他成分。作为其他成分，例如可列举JAK抑制剂。
·JAK抑制剂
本方式的培养基可以含有JAK抑制剂。JAK抑制剂是一种阻碍两面神激酶(Januskinase)家族(例如、JAK1、JAK2、JAK3、TYK2)的一种或多种酶的活性的物质。JAK抑制剂通过阻碍两面神激酶家族的酶活性，从而阻碍JAK-STAT的信号传导。由于培养基除了含有GSK-3β抑制剂、ROCK抑制剂、以及从FGF9抑制剂和FGF20组成的群中选择的至少成纤维细胞生长因子之外，还含有JAK抑制剂，因此进一步促进了肾元祖细胞的增殖。JAK抑制剂只要能够阻碍两面神激酶家族的酶的活性，就不被特别限定。JAK抑制剂优选为阻碍从JAK1、JAK2和JAK3组成的群中选择的至少一种的酶活性的抑制剂，更优选为阻碍JAK2的酶活性的抑制剂(JAK2抑制剂)。
JAK3抑制剂只要能够阻碍JAK3的活性就不会被特别限定。作为JAK3抑制剂，例如可列举TCS21311(CAS号1260181-14-3)、WHI-P154(CAS 211555-04-3)、PF-06651600(CAS号1792180-81-4)、FM-381(CAS号2226521-65-7)、CP690550(CAS号540737-29-9)、7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-5-甲酸，4-[3-[(2-甲基-1-氧-2-丙烯-1-酰)氨基]苯]-，乙酯(4-[3-[(2-methyl-1-oxo-2-propene-1-yl)amino]phenyl]-，乙基酯)、JAK3INHIBITOR IV(CAS号58753-54-1)、ZM449829(CAS号4452-06-6)、AZD1480(CAS号935666-88-9)、选择性JAK3抑制剂1(CAS号1443235-95-7)，以及它们的衍生物等，但不限于此。其中，JAK3抑制剂优选为TCS21311。
JAK2抑制剂只要能够阻碍JAK2的活性就不会被特别限定。作为JAK2抑制剂，例如可列举NVP-BSK805 2HCl(CAS号1942919-79-0)、TG101209(CAS号936091-14-4)、TG101348(CAS号936091-26-8)、1,2,3,4,5,6-六溴环己烷(CAS号1837-91-8)、CEP-33779(CAS号1257704-57-6)、NSC 33994(CAS号82058-16-0)，以及它们的衍生物等，但不限于此。其中，JAK2抑制剂优选为TG101348。
JAK抑制剂可以是JAK2/3抑制剂。JAK2/3抑制剂是阻碍JAK2以及JAK3的抑制剂。作为JAK2/3抑制剂，例如可列举AG490(CAS号133550-30-8)、AT9283(CAS号896466-04-9)、LY3009104(CAS号1187594-09-7)，以及它们的衍生物等，但不限于此。
JAK抑制剂可以是JAK1/2抑制剂。JAK1/2抑制剂是阻碍JAK1以及JAK2的抑制剂。作为JAK1/2抑制剂，例如可列举CYT387(CAS号1056634-68-4)、S-鲁索替尼(S-Ruxolitinib)(INCB018424)(CAS号941685-37-6)、LY2784544(CAS号1229236-86-5)，以及它们的衍生物等，但不限于此。
JAK抑制剂并不限于上述那种低分子化合物，也可以是针对两面神激酶家族(JAK1、JAK2、JAK3、TYK2)的反义核酸，RNA干扰诱导核酸(例如，siRNA)，显性阴性突变体，以及它们的表达载体等。
JAK抑制剂可以单独使用一种，也可以同时使用两种以上。JAK抑制剂优选为JAK2抑制剂，更优选为TG101348。
可以根据JAK抑制剂的种类适当选择本方式的培养基中的JAK抑制剂的浓度。优选为，例如以IC50附近的浓度使用JAK抑制剂。能够以例如大于等于0.01nM、大于等于0.05nM、大于等于0.1nM、大于等于0.5nM、或大于等于1nM的浓度使用JAK抑制剂。JAK抑制剂的浓度的上限值，例如可列举小于等于100nM、小于等于50nM、小于等于30nM、小于等于20nM、小于等于10nM、或小于等于5nM等。当JAK抑制剂为TG101348时，TG101348在培养基中的浓度例如可列举0.5～50nM、1～30nM、1～20nM、1～10nM、或1～5nM等。
本方式的培养基在不损害本发明的效果的范围内可以含有上述以外的成分。本方式的培养基优选不含有上述以外的信号传导抑制剂，酶抑制剂，细胞因子，增殖因子等。
在一个实施方式中，本方式的培养基含有GSK-3β抑制剂，ROCK抑制剂，以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少成纤维细胞生长因子。在一个实施方式中，本培养基含有GSK-3β抑制剂，ROCK抑制剂，FGF9，以及JAK抑制剂。在一个实施方式中，本培养基含有GSK-3β抑制剂，ROCK抑制剂，FGF9，以及JAK2抑制剂。在一个实施方式中，本方式的培养基含有CHIR99021，Y-27632，以及FGF9。在一个实施方式中，本方式的培养基含有CHIR99021，Y-27632，FGF9，以及TG101348。所述FGF9也可以由FGF20代替。
本方式的培养基通过将GSK-3β抑制剂，ROCK抑制剂，以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少成纤维细胞生长因子组合在一起，从而能够在维持肾元祖细胞的分化能力的状态下，使肾元祖细胞良好地增殖。本方式的培养基除了含有所述成分之外，还含有JAK抑制剂，因此肾元祖细胞的增殖更加良好。
通过使用本方式的培养基，从而即使反复实施肾元祖细胞的传代，也能够在维持肾元祖细胞的分化能力的状态下，使肾元祖细胞良好地增殖。因此，本方式的培养基也可以说是肾元祖细胞的传代培养用培养基。此外，本方式的培养基也可以说是肾元祖细胞的维持培养基。
<扩增培养肾元祖细胞的方法>
本发明的第2方式为包括在所述第1方式的培养基中培养肾元祖细胞的工序的扩增培养肾元祖细胞的方法。
作为以本方式的方法进行培养的肾元祖细胞，可以列举与上述<用于扩增培养肾元祖细胞的培养基>的(肾元祖细胞:NPC)的项中所列举的肾元祖细胞相同的肾元祖细胞。肾元祖细胞优选为人的肾元祖细胞。肾元祖细胞优选为从多能干细胞诱导的肾元祖细胞，更优选为从iPS细胞诱导的肾元祖细胞。在一个实施方式中，肾元祖细胞为从人诱导多能干细胞诱导的肾元祖细胞。
本方式的方法只要使用所述第1方式的培养基，则培养方法不会被特别限定。肾元祖细胞能够以通常用于动物细胞的培养的培养条件进行培养。只要肾元祖细胞能够增殖，则培养温度不会被特别限定，但是通常设为25～40℃，优选为30～40℃。作为培养温度的具体例，可列举约37℃。肾元祖细胞可以在通常含有CO2的空气的气氛下培养。CO2浓度通常可以设为约0.3～5％，优选为约2～5％。作为CO2浓度的具体例，可列举约5％。
培养可以是贴壁培养，也可以是悬浮培养，但是优选为悬浮培养。
培养期间没有特别限定，可以设为任意的期间。在本方式的方法中，通过使用第1方式的培养基，从而能够在维持肾元祖细胞的性质的状态下，进行长期培养。在进行长期培养的情况下，优选适当地进行传代。由于使用所述第1方式的培养基反复进行传代，因此能够在维持肾元祖细胞的性质的状态下，继续肾元祖细胞的培养。能够通过从培养液中采集肾元祖细胞的细胞团，并播种到新的培养基，从而实施传代。在传代时，也可以使用含有蛋白酶、胶原酶和DNase等酶的细胞分散液，将细胞团分散后，播种到新的培养基中。传代的间隔没有被特别限定，但是例如可以设为2～10天左右，或3～7天左右。在一个实施方式中，本方式的方法包括传代培养肾元祖细胞。
扩增培养本方式的肾元祖细胞的方法可以包括下述(A)以及(B)工序。
(A)在所述第1方式的培养基中培养肾元祖细胞30～60小时的工序。
(B)在含有GSK-3β抑制剂以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子，且不含有ROCK抑制剂的培养基中，培养在所述工序(A)中得到的细胞的工序。
在工序(A)中，在第1方式的培养基中，培养肾元祖细胞30～60小时。第1方式的培养基中的培养时间可以是2天左右。作为第1方式的培养基中的培养时间，例如可列举35～55小时以及40～50小时等。所述培养时间是从肾元祖细胞被播种到第1方式的培养基的时间点起的时间。
在工序(B)中，在含有GSK-3β抑制剂以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子，且不含有ROCK抑制剂的培养基(以下，称为“不含有ROCK抑制剂的培养基”)中，培养在工序(A)中得到的细胞。作为在工序(B)中使用的培养基，可列举从第1方式的培养基中除去ROCK抑制剂的培养基。工序(B)中的培养可以通过将工序(A)的培养中的培养基更换为不含有ROCK抑制剂的培养基而开始。在工序(B)中，也可以以2天1次左右的间隔实施培养基更换。用于培养基更换的培养基可以采用不含有ROCK抑制剂的培养基。工序(B)中的培养基更换可以设为1～5次左右，2～4次左右，2次，或3次。工序(B)中使用的培养基不含有ROCK抑制剂，因此与使用含有ROCK抑制剂的培养基的情况相比较，能够廉价地实施。
本方式的方法在所述工序(B)之后还可以包括下述工序(C)。
(C)将在工序(B)中得到的细胞传代至第1方式的培养基的工序。
本方式的方法在所述工序(C)之后还可以包括下述工序(D)以及(E)。
(D)在第1方式的培养基中，培养在所述工序(C)中传代的细胞30～60小时的工序。
(E)在含有GSK-3β抑制剂以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子，且不含有ROCK抑制剂的培养基中，培养在所述工序(D)中得到的细胞的工序。
在工序(D)中，能够在工序(C)中传代的培养基中，直接培养30～60小时。工序(D)中的培养时间可以是2天左右。作为工序(D)中的培养时间，例如可列举35～55小时以及40～50小时等。所述培养时间是从对肾元祖细胞进行了传代的时间点起的时间。
在工序(E)中，在不含有ROCK抑制剂的培养基中培养在工序(D)中得到的细胞。在工序(E)中，能够使用与工序(B)相同的不含有ROCK抑制剂的培养基。工序(E)中的培养能够以与工序(B)相同的方式实施。
本方式的方法中使用的肾元祖细胞可以是从多能干细胞(例如、iPS细胞)分化诱导而来的。肾元祖细胞例如可以是通过国际公开第2018/216743号所记载的分化诱导法得到的。
此外，本方式的方法中使用的肾元祖细胞例如可以是通过包括下述工序(i)～(vi)的方法得到的。
(i)在含有FGF2、BMP4、GSK-3β抑制剂以及视黄酸或其衍生物的培养基中，培养多能干细胞的工序。
(ii)在含有FGF2、GSK-3β抑制剂以及BMP7的培养基中，培养在所述工序(i)中得到的细胞的工序。
(iii)在含有GSK-3β抑制剂、BMP7以及TGFβ抑制剂，且不含有FGF2的培养基中，培养在所述工序(ii)中得到的细胞的工序。
(iv)在含有FGF2、GSK-3β抑制剂、激活素以及ROCK抑制剂的培养基中，培养在所述工序(iii)中得到的细胞的工序。
(v)在含有视黄酸或其衍生物，且不含有FGF9的培养基中，培养在所述工序(iv)中得到的细胞的工序。
(vi)在含有GSK-3β抑制剂以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子的培养基中，培养在所述工序(v)中得到的细胞，从间介中胚层细胞诱导肾元祖细胞的工序。
(工序(i))
在该工序中，从多能干细胞诱导出后期后方外胚层。后期后方外胚层表征为CDX1、OCT4、NANOG、E-钙粘蛋白(CDH1)的至少一个或多个标志物为阳性的细胞，优选表征为所有这些标志物为阳性的细胞。后期后方外胚层进一步优选脱中胚蛋白和鼠短尾突变体表型为阴性。
在工序(i)中，通过本领域公知的任意的方法来分离多能干细胞，优选通过贴壁培养来进行培养。作为多能干细胞的分离的方法，例如可列举力学分离，或使用了具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液(例如可列举Accutase(TM)以及Accumax(TM)(InnovativeCell Technologies,Inc))或仅具有胶原酶活性的分离溶液的分离。优选的方法是使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液进行解离，并且在力学上细致地向单个细胞分散。作为在工序(i)中使用的人多能干细胞，优选使用相对于使用的皿培养至70％～80％融合的菌落。
在工序(i)中使用的培养基可以通过在用于动物细胞的培养的基础培养基中添加FGF2、BMP4、GSK-3β抑制剂以及视黄酸或其衍生物来制备。在工序(i)中使用的培养基可以含有ROCK抑制剂。此时，在基础培养基中，除了所述成分之外还可以添加ROCK抑制剂以制备在工序(i)中使用的培养基。作为基础培养基，能够使用上述那种基础培养基，可以含有血清，或者也可以是无血清。根据需要，也可以含有血清替代物，脂质，氨基酸，维生素，增殖因子，低分子化合物，抗生素，抗氧化剂，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。
ROCK抑制剂可以使用与上述相同的物质。作为优选的ROCK抑制剂，可列举Y-27632。本领域技术人员可根据使用的ROCK抑制剂适当选择工序(i)中使用的ROCK抑制剂的浓度。作为ROCK抑制剂的浓度，在ROCK抑制剂为Y-27632时，例如可列举0.1～100μm，优选为1～75μm、更优选为5～50μm。
GSK-3β抑制剂可以使用与上述相同的物质。作为优选的GSK-3β抑制剂，可列举CHIR99021。本领域技术人员可根据使用的GSK-3β抑制剂适当选择工序(i)中使用的GSK-3β抑制剂的浓度。作为GSK-3β抑制剂的浓度，在GSK-3β抑制剂为CHIR99021时，例如可列举0.01～100μm，优选为0.1～10μm、进一步优选为0.5～3μm，特别优选为0.5～1.5μm。
FGF2(碱性FGF:bFGF)优选人FGF2。作为人FGF2，例如可列举具有NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)的登录号:ABO43041.1的氨基酸序列的蛋白质。只要FGF2具有分化诱导活性，包含其片段和功能性变体的FGF2可以使用市售的，也可以使用从细胞精制的蛋白质或通过转基因生产的蛋白质。作为该工序中所使用的FGF2的浓度，例如可列举1～1000ng/ml，优选为10～500ng/ml、更优选为50～250ng/ml。
BMP4优选人BMP4。作为人BMP4，例如可列举具有NCBI(National Center forBiotechnology Information)的登录号:AAH20546.1的氨基酸序列的蛋白质。只要BMP4具有分化诱导活性，包含其片段和功能性变体的BMP4可以使用市售的，也可以使用从细胞精制的蛋白质或通过转基因生产的蛋白质。作为该工序中所使用的BMP4的浓度，例如可列举0.1～100ng/ml，优选为0.5～50ng/ml、更优选为0.5～5ng/ml。
视黄酸可以是视黄酸本身，也可以是保持天然的视黄酸所具有的分化诱导功能的视黄酸衍生物。作为视黄酸衍生物，可列举3-脱氢视黄酸、4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)甲酰氨基]苯甲酸(AM580)(Tamura K,et al.,Cell Differ.Dev.32:17-26(1990))、4-[(1E)-2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯-1-基]苯甲酸(TTNPB)(Strickland S,et al.,Cancer Res.43:5268-5272(1983))，以及Tanenaga,K.etal.,Cancer Res.40:914-919(1980)所记载的化合物，棕榈酸视黄醇，视黄醇，视黄醛，3-脱氢视黄醇，3-脱氢视黄醛等。
作为工序(i)中使用的视黄酸或其衍生物的浓度，例如可列举1～100nM，优选为5～50nM，更优选为5～25nM。
在工序(i)中，培养温度没有被特别限定，但是约为30～40℃，优选约37℃。培养在含有CO2的空气的气氛下实施。CO2浓度约为2～5％，优选约5％。工序(i)的培养时间只需是足够分化诱导后期后方外胚层的期间即可，例如1～2天的培养，优选为1天。
(工序(ii))
在该工序中，从后期后方外胚层诱导出中胚层谱系原始条纹。中胚层谱系原始条纹表征为CDX1以及鼠短尾突变体表型为阳性的细胞。中胚层谱系原始条纹进一步优选OCT4，NANOG以及CDH1为阴性。
在工序(ii)中，可以将在前文所述的工序(i)中得到的细胞团体分离出来，用另外准备的涂层处理过的培养容器进行贴壁培养，也可以直接通过培养基的交换继续培养在工序(i)中通过贴壁培养而得到的细胞。
在工序(ii)中使用的培养基可以通过在用于动物细胞的培养的基础培养基中添加FGF2、GSK-3β抑制剂以及BMP7来制备。作为基础培养基，能够使用上述那种基础培养基，可以含有血清，或者也可以是无血清。根据需要，也可以含有血清替代物，脂质，氨基酸，维生素，增殖因子，低分子化合物，抗生素，抗氧化剂，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。
FGF2可以使用与上述相同的物质。作为工序(ii)中所使用的FGF2的浓度，可列举与在工序(i)中列举的浓度相同的浓度。
GSK-3β抑制剂可以使用与上述相同的物质。作为优选的GSK-3β抑制剂，可列举CHIR99021。作为工序(ii)中所使用的GSK-3β抑制剂的浓度，本领域技术人员可根据使用的GSK-3β抑制剂适当选择，例如可列举0.01～100μm，优选为0.1～10μm、进一步优选为1～7.5μm、特别优选为2～5μm。工序(ii)中所使用的GSK-3β抑制剂的浓度优选高于工序(i)中的浓度。
BMP7优选为人BMP7。作为人BMP7，例如可列举具有NCBI(National Center forBiotechnology Information)的登录号:NM_001719.2的氨基酸序列的蛋白质。只要BMP7具有分化诱导活性，则包含其片段和功能性变体。BMP7可以使用市售的，也可以使用从细胞精制的蛋白质或通过转基因生产的蛋白质。
作为工序(ii)中所使用的BMP7的浓度，例如可列举0.1～100ng/ml，优选为0.5～50ng/ml、更优选为0.5～5ng/ml。
在工序(ii)中，培养温度没有被特别限定，但是约为30～40℃，优选约37℃。培养在含有CO2的空气的气氛下实施。CO2浓度约为2～5％，优选约5％。工序(ii)的培养时间只需是足够分化诱导中胚层谱系原始条纹的期间即可，例如10小时～2天或1～2天的培养，优选为0.5～1天。
(工序(iii))
在该工序中，中胚层谱系原始条纹诱导出中胚层谱系后期原始条纹。中胚层谱系后期原始条纹表征为CDX2以及鼠短尾突变体表型为阳性的细胞。
在工序(iii)中，可以将在前文所述的工序(ii)中得到的细胞团体分离出来，用另外准备的涂层处理过的培养容器进行贴壁培养，也可以直接通过培养基的交换继续培养在工序(ii)中通过贴壁培养而得到的细胞。
在工序(iii)中使用的培养基可以通过在用于动物细胞的培养的基础培养基中添加GSK-3β抑制剂、BMP7以及TGFβ抑制剂来制备。作为基础培养基，能够使用上述那种基础培养基，可以含有血清，或者也可以是无血清。根据需要，也可以含有血清替代物，脂质，氨基酸，维生素，增殖因子，低分子化合物，抗生素，抗氧化剂，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。
GSK-3β抑制剂可以使用与上述相同的物质。工序(iii)中所使用的GSK-3β抑制剂的浓度可以与工序(ii)相同。作为GSK-3β抑制剂的浓度，例如可列举0.01～100μm，优选为0.1～10μm、进一步优选为1～7.5μm，特别优选为2～5μm。
BMP7可以使用与上述相同的物质。工序(iii)中所使用的BMP7的浓度可以与工序(ii)相同。
TGFβ抑制剂是一种阻碍TGFβ的从与受体的结合到SMAD的信号传导的物质。作为TGFβ抑制剂，可列举阻碍与作为TGFβ受体的ALK家族的结合的物质，或者阻碍ALK家族对SMAD的磷酸化的物质，例如例示了Lefty-1(作为NCBI登录号，例示了小鼠：NM_010094，人：NM_020997)、SB431542、SB202190(以上，R.K.Lindemann et al.,Mol.Cancer,2003,2:20)、SB505124(葛兰素史克公司)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(礼来研究实验室)、A83-01(WO2009146408)以及它们的衍生物等。TGFβ抑制剂可优选为A83-01。
工序(iii)中所使用的TGFβ抑制剂的浓度只要是阻碍ALK的浓度，则不会被特别限定。作为TGFβ抑制剂的浓度，在TGFβ抑制剂为A83-01时，例如可列举0.5～100μm，优选为1～50μm，进一步优选为5～25μm。
工序(iii)中所使用的培养基不含有FGF2。由于即使不含有FGF2也会诱导出中胚层谱系后期原始条纹，因此与使用含有FGF2的培养基的方法相比能够更廉价地实施。
在工序(iii)中，培养温度没有被特别限定，但是约为30～40℃，优选约37℃。培养在含有CO2的空气的气氛下实施。CO2浓度约为2～5％，优选约5％。工序(iii)的培养时间只需是足够分化诱导中胚层谱系后期原始条纹的期间即可，例如1～3天的培养，优选为1～2天。
(工序(iv))
在该工序中，从中胚层谱系后期原始条纹诱导出后肾谱系后期原始条纹。后肾谱系后期原始条纹表征为HOX11以及鼠短尾突变体表型为阳性的细胞。
在工序(iv)中，可以将在前文所述的工序(iii)中得到的细胞团体分离出来，用另外准备的涂层处理过的培养容器进行贴壁培养，也可以直接通过培养基的交换继续培养在工序(iii)中通过贴壁培养而得到的细胞。
在工序(iv)中使用的培养基可以通过在用于动物细胞的培养的基础培养基中添加FGF2，GSK-3β抑制剂，激活素以及ROCK抑制剂来制备。作为基础培养基，能够使用上述那种基础培养基，可以含有血清，或者也可以是无血清。根据需要，也可以含有血清替代物，脂质，氨基酸，维生素，增殖因子，低分子化合物，抗生素，抗氧化剂，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。
FGF2以及GSK-3β抑制剂可以使用与上述相同的物质。工序(iv)中所使用的FGF2以及GSK-3β抑制剂的浓度范围可以与工序(ii)相同。作为工序(iv)中所使用的GSK-3β抑制剂的浓度，例如可列举0.01～100μm，优选为0.1～10μm，进一步优选为1～7.5μm，特别优选为2～5μm。作为工序(iv)中所使用的FGF2的浓度，例如可列举1ng/ml～1000ng/ml，优选大于等于30ng/ml，更优选为30～100ng/ml。
激活素可以是来自人的激活素，也可以是来自其他动物的激活素，还可以是这些激活素的功能性变体。激活素可以是激活素A，也可以是激活素B，还可以是激活素AB。激活素例如能够使用美国安迪生物等市售的。作为优选的激活素，可列举激活素A。作为工序(iv)中所使用的激活素的浓度，例如可列举1～100ng/ml，优选为5～50ng/ml，更优选为5～25ng/ml。
ROCK抑制剂可以使用与上述相同的物质。作为优选的ROCK抑制剂，可列举Y-27632。本领域技术人员可根据使用的ROCK抑制剂适当选择工序(iv)中所使用的ROCK抑制剂的浓度。作为ROCK抑制剂的浓度，在ROCK抑制剂为Y-27632时，例如为0.1～100μm，优选为1～75μm，进一步优选为5～50μm。
工序(iv)中所使用的培养基也可以不含有BMP7。通过使用不含有BMP7的培养基，从而能够更廉价地实施工序(iv)。
在工序(iv)中，培养温度没有被特别限定，但是约为30～40℃，优选约37℃。培养在含有CO2的空气的气氛下实施。CO2浓度约为2～5％，优选约5％。工序(iv)的培养时间只需是足够分化诱导后肾谱系后期原始条纹的期间即可，例如1～5天的培养，优选为3天。
(工序(v))
在该工序中，从后肾谱系后期原始条纹诱导出后期后方间介中胚层。间介中胚层表征为OSR1，HOX11以及WT1为阳性的细胞。
在工序(v)中，可以将在前文所述的工序(iv)中得到的细胞团体分离出来，用另外准备的涂层处理过的培养容器进行贴壁培养，也可以直接通过培养基的交换继续培养在工序(iv)中通过贴壁培养而得到的细胞。
在工序(v)中使用的培养基可以通过在用于动物细胞的培养的基础培养基中添加视黄酸或其衍生物来制备。工序(v)中所使用的培养基可以含有BMP抑制剂。此时，在基础培养基中，除了所述成分之外还可以添加BMP抑制剂以制备工序(v)中所使用的培养基。作为基础培养基，能够使用上述那种基础培养基，可以含有血清，或者也可以是无血清。根据需要，也可以含有血清替代物，脂质，氨基酸，维生素，增殖因子，低分子化合物，抗生素，抗氧化剂，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。
BMP抑制剂是阻碍BMP的功能的物质。作为BMP抑制剂，例示了脊索发生素，NOGGIN，卵泡抑制素等蛋白质抑制剂，多索***(即，6-[4-(2-哌啶-1-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1,5-A]嘧啶)，其衍生物(P.B.Yu et al.
(2007),Circulation,116:II_60；P.B.Yu et al.(2008),Nat.Chem.Biol.,4:33-41；J.Hao et al.(2008),PLoS ONE,3(8):e2904)，以及LDN193189(即，4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)。
作为优选的BMP抑制剂，可列举NOGGIN。作为工序(v)中所使用的BMP抑制剂的浓度，在BMP抑制剂为NOGGIN时，例如可列举1～100ng/ml，优选为10～50ng/ml。
工序(v)中所使用的培养基不含有FGF9。由于即使不含有FGF9也会诱导出后期后方间介中胚层，因此与使用含有FGF9的培养基的方法相比能够更廉价地实施。工序(v)中所使用的培养基也可以不含有FGF20。
在工序(v)中，培养温度没有被特别限定，但是约为30～40℃，优选约37℃。培养在含有CO2的空气的气氛下实施。CO2浓度约为2～5％，优选约5％。工序(v)的培养时间只需是足够分化诱导后期后方间介中胚层的期间即可，例如1～3天的培养，优选为2天。
(工序(vi))
在该工序中，从后期后方间介中胚层诱导出肾元祖细胞。肾元祖细胞的OSR1为阳性，且HOX11，WT1，SIX2以及SALL1为阳性。
在工序(vi)中，可以将在前文所述的工序(v)中得到的细胞团体分离出来，用另外准备的涂层处理过的培养容器进行贴壁培养，也可以直接通过培养基的交换继续培养在工序(v)中通过贴壁培养而得到的细胞。
在工序(vi)中使用的培养基可以通过在用于动物细胞的培养的基础培养基中添加GSK-3β抑制剂，以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子来制备。工序(vi)中所使用的培养基可以含有肝素。此时，在基础培养基中，除了所述成分之外还可以添加肝素以制备工序(vi)中所使用的培养基。作为基础培养基，能够使用上述那种基础培养基，可以含有血清，或者也可以是无血清。根据需要，也可以含有血清替代物，脂质，氨基酸，维生素，增殖因子，低分子化合物，抗生素，抗氧化剂，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。
肝素优选为盐的形态。作为肝素的盐，例如可列举与锂、钠、钾等碱金属的盐，与钙、钡、镁等碱土金属的盐，与铝、锌、铜、铁等金属的盐，铵盐，与有机碱的盐，以及与氨基酸的盐等。其中，肝素优选碱金属盐，更优选钠盐。
作为工序(vi)中所使用的肝素的浓度，例如可列举0.01～100μg/ml，优选为0.05～50μg/ml，更优选为0.1～10μg/ml。
GSK-3β抑制剂，FGF9以及FGF20可以使用与上述相同的物质。作为GSK-3β抑制剂的浓度，例如可列举0.01～100μm，优选为0.1～10μm，进一步优选为0.5～3μm，特别优选为0.5～1.5μm。作为FGF9或FGF20的浓度(或者FGF9以及FGF20的合计浓度)，例如可列举1～500ng/ml，为10～300ng/ml，50～200ng/ml。
在工序(vi)中，培养温度没有被特别限定，但是约为30～40℃，优选约37℃。培养在含有CO2的空气的气氛下实施。CO2浓度约为2～5％，优选约5％。工序(vi)的培养时间只需是足够分化诱导肾元祖细胞的期间即可，例如1～5天的培养，优选为2天。
上述工序(i)～(vi)中所使用的基础培养基可以使用与上述<用于扩增培养肾元祖细胞的培养基>中记载的基础培养基相同的基础培养基。作为基础培养基，例如可以使用在DMEM/F12培养基的混合培养基中添加了B27，AS401，及谷丙氨酸二肽(英杰)等的培养基。作为基础培养基的具体例，例如可列举在DMEM/F12 Glutamax中添加了B27，10％AS401，或20％AS401的培养基，优选在DMEM/F12 Glutamax中添加了10％AS401的培养基。
上述工序(i)～(vi)中所使用的培养容器没有特别限定。作为培养容器，例如可列举24孔板，12孔板，培养皿、培养瓶、生物反应器及细胞培养袋等。作为培养容器，优选使用能够进行贴壁培养的培养容器。作为培养容器的细胞贴壁面(例如培养容器的底面)的面积，例如可列举1～1000cm2。培养容器可以使用细胞贴壁面大于等于400cm2的培养容器。作为培养容器的细胞贴壁面的面积，例如可列举400～800cm2，400～700cm2，及400～600cm2等。在包括工序(i)～(vi)的分化诱导方法中，即使使用如上所述的大容量的培养容器，也能够分化诱导肾元祖细胞。通过使用大容量的培养容器，可以增加肾元祖细胞的细胞产量。在工序(i)～(vi)中，可以在培养基更换的时刻或细胞的播种的时刻，变更培养容器。例如，在工序(i)～(iii)中，可以使用中容量的培养容器(例如，细胞贴壁面50～200cm2)，在工序(iv)～(vi)中，可以使用大容量的培养容器(细胞贴壁面大于等于400cm2)。
贴壁培养是指细胞在粘附于培养基材的状态下被培养，例如是指在经涂层处理的培养容器中进行培养。作为涂层剂，例如可列举胶原蛋白，蛋白聚糖，纤连蛋白，透明质酸，腱生蛋白，巢蛋白,弹性蛋白,纤维蛋白以及层粘连蛋白这样的物质或它们的片段。这些细胞外基质可以组合使用，例如可以是来自BD Matrigel(商标)等的细胞的制备物。细胞外基质优选为层粘连蛋白或其片段。在本发明中，层粘连蛋白是指具有持有α链、β链、γ链各一条的异三聚体结构的蛋白质，是存在亚基链的组成有所不同的同源异构体的细胞外基质蛋白。层粘连蛋白是5种α链，4种β链以及3种γ链的组合，具有15种同源异构体。虽然没有特别限定，但是例如，α链可例示α1、α2、α3、α4或α5，β链可例示β1、β2、β3或β4，以及γ链可例示γ1、γ2或γ3。层粘连蛋白更优选为由α5、β1及γ1构成的层粘连蛋白511(Nat Biotechnol28,611-615(2010))。层粘连蛋白可以是片段，只要是具有整联蛋白结合活性的片段，则不会特别限定，但例如也可以是作为用弹性蛋白酶消化而得到的片段的E8片段(层粘连蛋白511E8)(EMBO J.,3:1463-1468,1984、J.Cell Biol.,105:589-598,1987、WO2011/043405)。层粘连蛋白511E8有市售，例如可以从日皮株式会社等购入。
能够通过在第1方式的培养基中培养由所述工序(i)～(vi)得到的肾元祖细胞，从而进行扩增培养。或者，能够通过将由所述工序(i)～(vi)得到的肾元祖细胞提供给包含所述工序(A)以及(B)，任意的工序(C)～(E)的方法，从而进行扩增培养。即使在工序(A)～(E)中，也可以使用与上述工序(i)～(vi)中说明的培养容器相同的培养容器。
本方式的方法由于使用所述第1方式的培养基培养肾元祖细胞，因此能够在维持分化能力的状态下使肾元祖细胞良好地增殖。此外，由于即使进行传代培养，也能够维持肾元祖细胞的分化能力，因此能够长期维持肾元祖细胞。可以将在本方式的方法中扩增培养的肾元祖细胞施用于患有肾病的对象，并用于治疗肾病。此外，能够作为用于治疗或预防肾病的医药组合物来使用。另外，通过本方式的方法培养的肾元祖细胞维持了肾脏类器官形成能力，因此可以用于后述的肾脏类器官的制造。
<肾脏类器官的制造方法>
本发明的第3方式是肾脏类器官的制造方法。本方式的肾脏类器官的制造方法包括：通过所述第2方式的方法对肾元祖细胞进行扩增培养的工序(扩增培养工序)；使所述扩增培养的肾元祖细胞分化为肾脏类器官的工序(分化工序)。
(扩增培养工序)
扩增培养工序通过所述第2方式的方法来实施。通过本工序，能够在维持分化能力的状态下使肾元祖细胞良好地增殖至所期望的数量。
(分化工序)
从肾元祖细胞向肾脏类器官的分化能够通过公知的方法来实施。例如，可以使用Nature,526,564-568(2015)中报告的方法等。例如，也可以将在所述扩增培养工序中得到的肾元祖细胞的细胞团与3T3-Wnt4细胞等饲养细胞，小鼠胎儿脊髓细胞，或小鼠胎儿肾细胞进行共培养。或者，也可以通过使用了含有GSK-3β抑制剂的基础培养基的半气相培养(优选为气液相培养，参照Nature,526,564-568(2015))来培养肾元祖细胞的细胞团。所述半气相培养中使用的培养基除了含有GSK-3β抑制剂以外，还可以含有FGF9及FGF2等。作为基础培养基、GSK-3β抑制剂、FGF2，可列举与上述相同的物质。作为优选的基础培养基，可列举KSR。作为优选的GSK-3β抑制剂，可列举CHIR99021。作为优选的FGF2，可列举人FGF2。作为优选的FGF9，可列举人FGF9。作为人FGF9，例如可列举具有NCBI登录号:NP_002001.1的氨基酸序列的蛋白质。FGF9只要具有向肾脏类器官的分化诱导活性，就包括其片段和功能性变体。FGF9可以使用市售的，也可以使用从细胞精制的蛋白质或通过转基因生产的蛋白质。在上文中，FGF9可以代替FGF20。或者，也可以同时使用FGF9和FGF20。
分化工序中的培养条件可以使用通常用于动物细胞的培养的培养条件。培养温度只要能够分化诱导为肾脏类器官则不会被特别限定，但是通常设为25～40℃，优选为30～40℃。作为培养温度的具体例，可列举约37℃。CO2浓度通常可以设为约0.3～5％，优选为约2～5％。作为CO2浓度的具体例，可列举约5％。
可以将通过本方式的制造方法得到的肾脏类器官施用于患有肾病的对象，并用于治疗肾病。此外，能够作为用于治疗或预防肾病的医药组合物来使用。
(其他工序)
本方式的制造方法除了包括上述工序以外，还可以包括其他工序。作为其他工序，例如可列举在所述扩增培养工序之前从多能干细胞诱导肾元祖细胞的工序。肾元祖细胞从多能干细胞的诱导可以通过公知的方法来实施。
<其他方式>
本发明还提供了医药组合物，其包含通过所述第2方式的方法获得的肾元祖细胞或通过所述第3方式的制造方法获得的肾脏类器官。本发明还提供了肾病治疗药剂，其包含所述肾元祖细胞或所述肾脏类器官。本发明还提供了治疗或预防肾病的方法，其包括向患有肾病的对象或有肾病风险的对象施用所述肾元祖细胞或所述肾脏类器官的治疗有效量的工序。本发明还提供一种肾病治疗用细胞的制造方法，其包括在所述第1方式的培养基中培养肾元祖细胞的工序。
作为向需要治疗或预防肾病的对象给予所述肾元祖细胞的方法，例如可列举：将所述肾元祖细胞薄片化并贴附于对象的肾脏的方法，将使所述肾元祖细胞悬浮于生理盐水等而得到的细胞悬液移植至对象的肾脏的方法，对所述肾元祖细胞进行三维培养(例如，Dev Cell.Sep 11,2012，23(3):637-651)，将得到的细胞团直接移植至对象的肾脏的方法，在由基底膜等构成的支架上对所述肾元祖细胞进行三维培养，将得到的细胞团移植至对象的肾脏的方法等。移植部位只要是肾脏内就没有特别限定，但是优选为肾被膜下。作为向需要治疗或预防肾病的对象给予所述肾脏类器官的方法，可列举移植到对象的体内(例如腹腔内)的方法等。
成为治疗或预防对象的肾病没有特别限定，但是例如可列举急性肾损伤、慢性肾衰竭、未达到慢性肾衰竭的慢性肾脏病等。要移植的所述肾元祖细胞的细胞数或所述肾脏类器官的大小只要能够在移植后植活就没有特别限定，可以根据疾病部位的大小、给药对象的躯体、年龄、性别等适当调整。
(实施例)
以下，通过实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
(材料和方法)
<动物实验>
所有动物实验均在京都大学动物实验委员会的批准下进行。
NOD.CB17-Prkdcscid/J小鼠购自查理氏日本子公司。在京都大学iPS细胞研究所的实验动物设施中，无特定病原体(SPF)条件下进行饲养。对小鼠自由饲喂饲料和水。
<肾元祖细胞(hNPC)从人诱导多能干细胞的诱导>
使用国际公开第2018/216743号所记载的方法，将作为来自健康人的人诱导多能干细胞株的4A6株(来自201B7)在24孔板上分化诱导为来自人诱导多能干细胞NPC后，添加100μLAccumax，在37℃，5％CO2的培养箱中静置30分钟。30分钟后，悬浮在900μL10％FBS中。用TC20对悬浮的细胞测定细胞数，将流式细胞仪所需的细胞移至1.5ml管中，以200g离心5分钟。离心后，除去上清液，以相对于1.0x106个细胞成为2％FBS 100μL的比率的方式悬浮。
<c-MET阳性细胞的纯化>
向悬浮有以上述方式诱导的hNPC的2％FBS 100μL添加缀合有作为荧光物质的APC的人-HGFR/c-MET抗体(美国安迪生物,FAB 3582A)10μL，在冰上静置30分钟。30分钟后，以200g离心5分钟，除去上清液后，用1mL的PBS清洗，再次以200g离心5分钟，除去上清液。实施2次该操作。将除去上清液的细胞悬浮于将DAPI稀释1000倍的2％FBS中，通过40μm的过滤器后，使用流式细胞仪提取c-MET阳性的细胞。
在本说明书中，将未进行c-MET阳性细胞的纯化的hNPC称为“hNPC(Bulk)”。有时将进行了c-MET阳性细胞的纯化的hNPC称为“hNPC(c-MET(+))”。
<扩增培养用培养基>
作为扩增培养用的试验培养基，使用了hNPSR培养基、CFY培养基、以及在CFY培养基中添加了DMSO或溶解于DMSO的JAK抑制剂(JAK2抑制剂:TG101348(最终浓度3nM))的培养基。
表1示出hNPSR培养基的组成。hNPSR培养基通过在表1所示的基础培养基中添加表1所示的试剂来制备。表2示出CFY培养基的组成。CFY培养基通过在表2所示的基础培养基中添加表2所示的试剂来制备。
表1
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表2
<细胞增殖>
将hNPC以每孔为2.0x104个细胞的方式悬浮在50μL的试验培养基中，并播种于低附着96孔板(Nunc)，以300g离心3分钟，在37℃、5％CO2的培养箱中静置培养。在静置培养开始6小时后形成细胞团。
在静置培养开始48小时后，将与播种细胞时相同的培养基追加给药各100μL。在追加给药培养基48小时后，从各孔中除去100μL的上清液，并添加新的培养基100μL。以后，每48小时进行同样的操作。在悬浮培养开始后第7天，将各孔的细胞团移至1.5ml管中，完全除去上清液，添加30μL Accumax(Innovative Cell Technologies,Inc.)，在37℃、5％CO2的培养箱中静置10分钟。10分钟后，用470μL的10％FBS悬浮，用TC20(Bio-Rad)测定细胞数。
<传代培养>
将在试验培养基中培养的来自人诱导多能干细胞的NPC(hNPC)的细胞块移至1.5ml管中，完全除去上清液，添加30μL Accumax(Innovative Cell Technologies,Inc.)，在37℃、5％CO2的培养箱中静置10分钟。10分钟后，用470μL的10％FBS悬浮，用TC20(Bio-Rad)测定细胞数。在低附着96孔板(Nunc)中，将每孔2.0x104个细胞的来自人诱导多能干细胞的NPC悬浮并接种于试验培养基。将播种了细胞的低附着96孔板以300g离心3分钟，在37℃、5％CO2的培养箱中静置培养。在静置培养开始48小时后，向各孔中分别追加给药100μL的试验培养基。在培养基的追加给药后48小时，进行与上述同样的操作，进行细胞数的测定和传代。
<肾脏类器官的制备>
在试验培养基中，将传代培养的hNPC的细胞团载置于转移盘(康宁)，除去周围的培养基。接着，在预先用添加了200ng/ml的FGF2及5μm的CHIR99021的5％KSR(Knock-outSerum replacement)(赛默飞世尔科技公司)充满的培养皿中，设置载有细胞团的转移盘。48小时后，培养基更换为未添加生长因子和低分子化合物的5％KSR。之后，每48小时用未添加生长因子和低分子化合物的5％KSR进行培养基更换，在分化培养开始第10天，在，转移盘的状态下使用4％PFA在4℃下固定3小时。固定后，置换为PBS，在4℃下静置一夜，进行免疫染色。
<OSR1以及SIX2的表达确认>
建立具有在OSR1基因座中导入了GFP编码区域的OSR1-GFP报告基因、且导入有在SIX2基因上连结有tdTomato编码区域的SIX2-tdTomato报告基因的人诱导多能干细胞。通过使用所述人诱导多能干细胞进行培养试验，并用荧光显微镜检测GFP以及tdTomato的各荧光，从而确认了OSR1和SIX2的表达。
<肾脏类器官的成像>
用KEYENCE BZ-X700或共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)拍摄肾脏类器官的明场图像。使用Image J V1.51版本j8(美国国家卫生研究院)来进行画像解析(C.A.Schneider,etal.,Nat Methods.9(2012)671-675.)。
<hNPC的给药试验>
对于8～12周龄的雄性NOD.CB17-Prkdcscid/J小鼠(以下称为“NOD-SCID小鼠”)，以21mg/kg的给药量皮下注射用生理盐水调整为1mg/mL的顺铂，制作顺铂诱发性急性肾损伤(AKI)模型。顺铂给药24小时后，通过将用异氟烷全身麻醉下的NOD-SCID小鼠的左下背侧部的皮肤切开约1cm，接着，将后腹膜切开约1cm，从而使左肾露出体外。在露出的肾脏中穿刺24G的一次性使用静脉留置针，将外筒留置在肾被膜下。通过经由外筒用注射器送入空气或注入生理盐水，从而将肾被膜和肾实质剥离。接着，拔出24G的一次性使用静脉留置针的外筒，将在CFY培养基中进行了1次传代或2次传代扩增培养的hNPC(Bulk)的细胞团(相当于约3.0x106个细胞)从相同的穿刺部位***抽吸的22G的一次性使用静脉留置针的外筒，并缓慢地注入细胞(细胞移植)。生理盐水组中，hNPC(Bulk)，在肾被膜下注入15μL的生理盐水。注入细胞后，拔出22G的一次性使用静脉留置针的外筒，确认没有细胞从穿刺部位流出和出血后，将露出的肾脏放回后腹膜内，用4-0真丝编织缝合线缝合后腹膜和皮肤。
在顺铂给药96小时后(细胞移植72小时后)，从眼下静脉丛进行100～200μL的采血，进行离心分离而得到血清。接着，使用进行离心分离而得到的血清，用富士DRI-CHEMNX500测定血清肌酐(S-Cre)和血尿素氮(BUN)。
(实施例1)
使用CFY培养基和hNPSR培养基进行hNPC(Bulk)的传代培养，对于培养细胞，确认了细胞增殖、NPC标记的表达以及肾类器官形成能力。
<利用CFY培养基进行的hNPC(Bulk)的维持培养>
使用hNPSR培养基或CFY培养基进行hNPC(Bulk)的传代培养，确认在各传代培养中作为NPC标记的SIX2以及OSR1的表达是否得以维持。
将结果示于图1。关于在hNPSR培养基中传代培养的hNPC(Bulk)，OSR1的表达一直到第3次传代都被检测出，但是SIX2的表达自第2次传代起就几乎未被检测出。另一方面，关于在CFY培养基中传代培养的hNPC(Bulk)，在1～3次传代的任一次传代中，OSR1和SIX2双方的表达都被检测到。根据该结果，确认了在利用CFY培养基进行的传代培养中，NPC标记的表达易于被维持。即，通过使用CFY培养基，从而能够在维持NPC的性质的状态下对hNPC(Bulk)进行传代培养。
<肾脏类器官从在CFY培养基中传代培养的hNPC(Bulk)的制备>
尝试从使用hNPSR培养基或CFY培养基传代培养的hNPC(Bulk)制备肾脏类器官。
将结果示于图2。当在hNPSR培养基中传代培养时，从第一代hNPC(Bulk)形成肾脏类器官。然而，从第二代和第三代hNPC(Bulk)没有形成肾脏类器官。另一方面，当在CFY培养基中传代培养时，从1～3次传代的任一hNPC(Bulk)均形成肾脏类器官。根据该结果，确认了通过使用CFY培养基，从而能够在维持肾脏类器官的形成能力的状态下对hNPC(Bulk)进行传代培养。
<使用CFY培养基的hNPC(Bulk)的传代培养中的细胞增殖>
使用在hNPSR培养基或CFY培养基中添加了DMSO的培养基实施hNPC(Bulk)的传代培养，并测定了细胞数。
将结果示于图3和图4。图3示出由各传代培养中的细胞计算出的累积细胞数。传代数1中的累积细胞数可以如下计算出：在将传代数0下增殖的细胞数设为a、将传代数0的培养液的容量设为b、将传代中使用的P0的培养液的容量设为c、将P1下增殖而得到的细胞数设为d的情况下，传代数1的累积细胞数＝a×[d/(a×c/b)]×b/c。之后的传代培养中的累积细胞数也以同样的方式计算出。
如图3及图4所示，在使用hNPSR培养基或CFY培养基中的任一培养基的情况下，都促进了hNPC(Bulk)的增殖。关于hNPC(Bulk)的增殖促进效果，与CFY培养基相比，hNPSR培养基更高。
(实施例2)
使用在CFY培养基中添加了JAK抑制剂的培养基进行hNPC(Bulk)的传代培养，对于培养细胞，确认了细胞增殖、NPC标记的表达以及肾类器官形成能力。
<基于JAK抑制剂的细胞增殖促进效果>
使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348(JAK2抑制剂)的培养基实施hNPC(Bulk)的培养，并测定了细胞数。
将结果示于图5。在CFY培养基中添加了TG101348的培养基(CFY+TG(3))中进行培养的情况下，与在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(CFY+DMSO)中的培养相比较，促进了细胞增殖。根据该结果，确认了通过添加JAK抑制剂，从而CFY培养基中的hNPC(Bulk)的增殖促进效果得到提高。
<利用添加了JAK抑制剂的CFY培养基进行的hNPC(Bulk)的维持培养>
使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基，或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348(JAK2抑制剂)的培养基，进行hNPC(Bulk)的传代培养，确认在各传代培养中作为NPC标记的OSR1以及SIX2的表达是否得以维持。
将结果示于图6。在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(+DMSO)和在CFY培养基中添加了3nM的TG101348的培养基(+TG(3))中的任一者中，直至第三代为止，均维持了OSR1和SIX2两者的表达。根据该结果，确认了使用在CFY培养基中添加了JAK抑制剂的培养基，能够在维持NPC的性质的状态下对hNPC(Bulk)进行传代培养。
<肾脏类器官从在添加了JAK抑制剂的CFY培养基中传代培养的hNPC(Bulk)的制备>
使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基，或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348(JAK2抑制剂)的培养基进行hNPC(Bulk)的传代培养，尝试由第二代细胞制备肾脏类器官。
将结果示于图7。在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(+DMSO)和在CFY培养基中添加了3nM的TG101348的培养基(+TG(3))中的任一者中，都由第二代细胞形成肾脏类器官。根据该结果，确认了使用在CFY培养基中添加了JAK抑制剂的培养基，能够在维持肾脏类器官的形成能力的状态下对hNPC(Bulk)进行传代培养。
(实施例3)
使用在CFY培养基中添加了JAK抑制剂的培养基实施hNPC(c-MET(+))的传代培养，对于培养细胞，确认了细胞增殖、NPC标记的表达以及肾类器官形成能力。
<hNPC(c-MET(+))的传代培养中的JAK抑制剂的增殖促进效果>
使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348(JAK2抑制剂)的培养基实施hNPC(c-MET(+))的传代培养，并测定细胞数计算出累积细胞数。
将结果示于图8。在CFY培养基中添加了TG101348的培养基(CFY+TG(3))中进行培养的情况下，与在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(CFY+DMSO)中的培养相比较，在任一传代中均促进了细胞增殖。根据该结果，确认了通过添加JAK抑制剂，从而提高了CFY培养基中的hNPC(c-MET(+))的增殖促进效果。
<利用添加了JAK抑制剂的CFY培养基进行的hNPC(c-MET(+))的维持培养>
使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基，或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348(JAK2抑制剂)的培养基，实施hNPC(c-MET(+))的传代培养，确认在各传代培养中作为NPC标记的OSR1以及SIX2的表达是否得以维持。
将结果示于图9。在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(+DMSO)和在CFY培养基中添加了3nM的TG101348的培养基(+TG(3))中的任一者中，直至第三代为止，均维持了OSR1和SIX2两者的表达。根据该结果，确认了使用在CFY培养基中添加了JAK抑制剂的培养基，能够在维持NPC的性质的状态下对hNPC(c-MET(+))进行传代培养。
<肾脏类器官从在添加了JAK抑制剂的CFY培养基中传代培养的hNPC(c-MET(+))的制备>
使用在CFY培养基中添加了DMSO的培养基，或在CFY培养基中添加了3nM的TG101348(JAK2抑制剂)的培养基进行hNPC(c-MET(+))的传代培养，尝试由第一代细胞制备肾脏类器官。
将结果示于图10。在CFY培养基中添加了DMSO的培养基(+DMSO)和在CFY培养基中添加了3nM的TG101348的培养基(+TG(3))中的任一者中，都由第一代细胞形成肾脏类器官。根据该结果，确认了使用在CFY培养基中添加了JAK抑制剂的培养基，能够在维持肾脏类器官的形成能力的状态下对hNPC(c-MET(+))进行传代培养。
(实施例4)
将在CFY培养基中扩增培养的hNPC(Bulk)的细胞团移植至AKI小鼠的肾被膜下，并确认了基于hNPC(Bulk)的治疗效果。
将1次传代及2次传代的hNPC细胞团的移植结果分别示于图11及图12。图11和图12中，“正常”表示正常小鼠，“生理盐水”表示在肾被膜下输注了生理盐水的AKI小鼠，“NPC移植”表示将hNPC(Bulk)的细胞团移植至肾被膜下的AKI小鼠。输注了生理盐水的AKI小鼠与正常小鼠相比，BUN和S-Cre的数值显著升高，确认了肾功能障碍。另一方面，在移植了hNPC(Bulk)的细胞团的小鼠中，在1次传代hNPC和2次传代hNPC中的任一者中，与输注了生理盐水的小鼠相比，BUN和S-Cre的数值均显著降低，观察到肾功能的改善。根据这些结果，确认了通过移植在CFY培养基中扩增培养的hNPC，从而能够改善肾功能障碍。
在上述实施例1～4中，使用了基于国际公开第2018/216743号所记载的方法的、通过以下的分化诱导法A而分化诱导的NPC。
<分化诱导法A>
1.通过accutase处理将未分化hiPSC细胞单细胞化后，悬浮于添加了10μm的Y-27632及1.25μL iMatrix(日皮)的500μL的AK02N培养基(味之素)中，以1.0×104个细胞/孔～5.0×104个细胞/孔的密度播种于24孔板，在37℃下培养24小时。
2.24小时后(第1天)，将添加了B27(无维生素A型添加剂，英杰)的DMEM/F12 Glutamax(赛默飞世尔科技公司)作为基础培养基，并在添加了1μm CHIR99021、10nM视黄酸、1ng/ml BMP4、100ng/ml FGF2的培养基中进行培养基更换(后期后方外胚层的制备…1)。
3.在第2天，培养基更换为在相同基础培养基中添加了3μm CHIR99021、1ng/mlBMP7、100ng/ml FGF2的培养基(中胚层谱系原始条纹的制备…2)。
4.在第3天，培养基更换为在相同基础培养基中添加了3μm CHIR99021、1ng/mlBMP7、100ng/ml FGF2、10μm A83-01的培养基(中胚层谱系后期原始条纹的制备…3)。
5.在第4天、第5天、第6天，培养基更换为在相同基础培养基中添加了3μmCHIR99021、1ng/ml BMP7、100ng/ml FGF2、10ng/ml激活素、30μm Y-27632的培养基(后肾谱系后期原始条纹的制备…4)。
6.在第7天、第8天，培养基更换为在相同基础培养基中添加了200ng/ml FGF9、100nM视黄酸、25ng/ml NOGGIN的培养基(后期后方间介中胚层的制备…5)。
7.在第9天、第10天、第11天，培养基更换为在相同基础培养基中添加了200ng/mlFGF9、1μm CHIR99021的培养基(肾脏祖细胞(肾元祖细胞)的制备…6)。
(实施例5)
研究了hNPC是否通过以下方案由人诱导多能干细胞(hiPSC)分化诱导。hiPSC使用来自201B7的OSR1-GFP/SIX2-tdTomato报告基因人诱导多能干细胞。
<由hiPSC分化诱导hNPC的方法(分化诱导法B)>
1.通过TrypLETM Select酶(Gibco)处理将未分化hiPSC单细胞化后，将添加了B27的DMEM/F12 Glutamax(英杰)作为基础培养基，并在添加了1μmCHIR99021、10nM视黄酸、1ng/ml BMP4、100ng/ml FGF2、10μm Y-27632、iMatrix-511(日皮)的培养基中，以1.0×104个细胞/孔～5.0×104个细胞/孔的密度进行播种，在37℃下培养24小时(后期后方外胚层的制备:工序1)。
2.在第1天，培养基更换为在相同基础培养基中添加了5μm CHIR99021、1ng/mlBMP7、100ng/ml FGF2的培养基(中胚层谱系原始条纹的制备…工序2)。
3.在第2天，培养基更换为在相同基础培养基中添加了5μm CHIR99021、1ng/mlBMP7、100ng/ml FGF2、10μm A83-01的培养基(中胚层谱系后期原始条纹的制备:工序3)。
4.在第3天，培养基更换为在相同基础培养基中添加了5μm CHIR99021、100ng/mlFGF2、1ng/ml BMP7、10ng/ml激活素A、30μm Y-27632的培养基(后肾谱系后期原始条纹的制备:工序4)。
5.在第6天，培养基更换为在相同基础培养基中添加了100nM视黄酸、200ng/mlFGF9、25ng/ml Noggin的培养基(后期后方间介中胚层的制备:工序5)。
6.在第8天，培养基更换为在相同基础培养基中添加了1μm CHIR99021、200ng/mlFGF9的培养基(hNPC的制备…工序6)。
此外，在所述分化诱导法B的4(后肾谱系后期原始条纹的制备:工序4)中，将100ng/ml FGF2替换为30ng/ml FGF2、30ng/ml FGF2以及0.18U/ml(1μg/ml)肝素、10ng/mlFGF2、10ng/ml FGF2以及0.18U/ml(1μg/ml)肝素、或者0ng/ml FGF2，除此以外，通过与分化诱导法B同样的方法，由hiPSC分化诱导hNPC。
对于分化诱导的hNPC，将确认了SIX2阳性细胞的分化诱导效率的结果示于图13。示出了未被DAPI染色的活细胞中的SIX2阳性细胞的比例。在所述4(后肾谱系后期原始条纹的制备:工序4)中，将FGF2的浓度设为小于等于10ng/ml时，向hNPC的诱导效率降低。肝素的存在对hNPC的诱导效率没有影响。
(实施例6)
按照所述分化诱导法B的方案，由hiPSC分化诱导hNPC。
此外，在所述分化诱导法B的3(中胚层谱系后期原始条纹的制备:工序3)中，将100ng/ml FGF2替换为30ng/ml FGF2或10ng/ml FGF2，并且在所述分化诱导法B的4(后肾谱系后期原始条纹的制备:工序4)中，将100ng/ml FGF2替换为30ng/ml FGF2，除此以外，通过与分化诱导法B同样的方法，由hiPSC分化诱导hNPC。
对于分化诱导的hNPC，将确认了SIX2阳性细胞的分化诱导效率的结果示于图14。示出了未被DAPI染色的活细胞中的SIX2阳性细胞的比例。在所述3(中胚层谱系后期原始条纹的制备:工序3)中，FGF2的浓度对向hNPC的诱导效率没有影响。
(实施例7)
按照所述分化诱导法B的方案，由hiPSC分化诱导hNPC。
此外，在所述分化诱导法B的5(后期后方间介中胚层的制备:工序5)中，将200ng/ml FGF9替换为100ng/ml FGF9、100ng/ml FGF9以及0.18U/ml(1μg/ml)肝素、25ng/mlFGF9、25ng/ml FGF9以及0.18U/ml(1μg/ml)肝素、10ng/ml FGF9、10ng/ml FGF9以及0.18U/ml(1μg/ml)肝素，或0ng/ml FGF9，并且在所述分化诱导法B的4(后肾谱系后期原始条纹的制备:工序4)中，将100ng/ml FGF2替换为30ng/ml FGF2，除此以外，通过与分化诱导法B同样的方法，由hiPSC分化诱导hNPC。
对于分化诱导的hNPC，将确认了SIX2阳性细胞的分化诱导效率的结果示于图15。示出了未被DAPI染色的活细胞中的SIX2阳性细胞的比例。在所述5(后期后方间介中胚层的制备:工序5)中，FGF9的浓度对向hNPC的诱导效率没有影响。肝素的存在对hNPC的诱导效率没有影响。
(实施例8)
按照所述分化诱导法B的方案，由hiPSC分化诱导hNPC。
此外，在所述分化诱导法B的2～6中，作为基础培养基，使用添加了10％或20％AS401(StemFit(注册商标)for Differentiation，Ajinomoto Healthy SupplyCo.,Inc.)的DMEM/F12 Glutamax，并且在所述分化诱导法B的3(中胚层谱系后期原始条纹的制备:工序3)中，将100ng/ml FGF2替换为0ng/ml FGF2，在所述分化诱导法B的4(后肾谱系后期原始条纹的制备:工序4)中，将100ng/ml FGF2替换为30ng/ml FGF2，在所述分化诱导法B的5(后期后方间介中胚层的制备:工序5)中，将200ng/ml FGF9替换为0ng/ml FGF9，在所述分化诱导法B的6(hNPC的制备:工序6)中，将200ng/ml FGF9替换为100ng/ml FGF9以及0.18U/ml(1μg/ml)肝素，除此以外，通过与分化诱导法B同样的方法，由hiPSC分化诱导hNPC。
对于分化诱导的hNPC，将确认了SIX2阳性细胞的分化诱导效率的结果示于图16。在图16中示出了未被DAPI染色的活细胞中的SIX2阳性细胞的比例。由于使用了添加了10％AS401的基础培养基，因此确认了hNPC的诱导效率有所提高的倾向。
(实施例9)
除了使用临床用hiPSC储备株以作为hiPSC之外，以与实施例8相同的方式，分化诱导hNPC(分化诱导法B)。在本实施例中，作为基础培养基，使用了添加了B27或10％AS401的DMEM/F12 Glutamax。
对于分化诱导的hNPC，将确认了SIX2的表达的结果示于图17。由于使用了添加了10％AS401的基础培养基，因此确认了hNPC的诱导效率有所提高的倾向。
(实施例10)
在图18所示的条件下，由hiPSC分化诱导hNPC(以下，称为“分化诱导法C”)。基础培养基使用了添加有10％AS401的DMEM/F12 Glutamax。在小规模中，在阶段1中将iPS细胞播种于24孔板(德国葛莱娜第一生化股份有限公司,662160)，在阶段4的第1天结束后将细胞再播种于24孔板。在阶段6的第2天结束后，回收hNPC，使用低附着96孔板(PrimeSurface96U板(住友电木株式会社，MS-9096U))在CFY培养基中扩增培养。在大规模中，在阶段1中将iPS细胞播种于T150培养瓶或T75培养瓶(易威奇)，在阶段4的第1天结束后将细胞再播种于512cm2板(住友电木，粘附细胞培养剥离培养容器512，MS-28500)。在阶段6的第2天结束后，回收hNPC，使用低附着96孔板在CFY培养基中扩增培养。
图19示出通过小规模的分化诱导法(分化诱导法C(Small))而利用免疫染色确认了由HLA同源hiPSC(Ff14s04)株诱导的hNPC的SIX2表达的结果。
图20示出实施了图18中的小规模(分化诱导法C(Small))或大规模(分化诱导法C(Large))的分化诱导法的细胞的形态照片和SIX2表达量。根据阶段6的形态照片及SIX2的表达量，确认了在小规模及大规模的任一种培养中，hNPC均被分化诱导。根据扩增培养后第7天的形态照片，确认了由小规模以及大规模的任一种培养分化诱导的hNPC均能够利用CFY培养基进行扩增培养。
(实施例11)
通过分化诱导法C(Large)，由hiPSC分化诱导hNPC。基础培养基使用了添加有10％AS401的DMEM/F12 Glutamax。
将分化诱导法C(Large)中的阶段6后的细胞产量示于图21。确认了通过本实施例的方法能够制造108数量规模的hNPC。
图22示出通过免疫染色确认了阶段6后的hNPC的SIX2表达的荧光图像。
(实施例12)
在扩增培养中，为了比较添加剂的影响，制备了添加了10％AS401以代替B27的CFY培养基(CFY培养基(-B27,+10％AS401)，或添加了20％AS401以代替B27的CFY培养基(CFY培养基(-B27,+20％AS401)，以及CFY培养基。
通过分化诱导法C(Small)，由hiPSC分化诱导hNPC。基础培养基使用了添加了10％AS401的DMEM/F12 Glutamax。回收阶段6后的hNPC，使用低附着96孔板，在CFY培养基、CFY培养基(-B27,+10％AS401)、或CFY培养基(-B27,+20％AS401)中扩增培养。
图23示出扩增培养中的hNPC的形态照片。使用CFY培养基或CFY培养基(-B27,+20％AS401)时，hNPC团的形态变化为椭圆形。另一方面，使用CFY培养基(-B27,+10％AS401)时，hNPC团的形态维持为圆形。
图24示出增殖率。hNPC在CFY培养基(-B27,+10％AS401)中显示出最良好的增殖率。
根据这些结果，可认为CFY培养基(-B27,+10％AS401)最适于hNPC的扩增培养。
(实施例13)
通过分化诱导法C(Small)，由hiPSC分化诱导hNPC。基础培养基使用了添加了10％AS401的DMEM/F12 Glutamax。回收阶段6后的hNPC，使用低附着96孔板，在CFY培养基、CFY培养基(-B27,+10％AS401)、或CFY培养基(-B27,+20％AS401)中扩增培养。
将扩增培养第7天的hNPC的相当于3×106个细胞的细胞团移植到AKI小鼠的肾被膜下，确认了基于hNPC的治疗效果。
将测定了血液中的尿素氮(BUN)以及血清肌酐(S-Cre)的结果分别示于图25以及图26。虽然未检测出包括Ctl组在内的4组间的显著性差异，但在移植组中BUN和S-Cre均被认为有改善倾向。
(实施例14)
通过分化诱导法C(Small)，由hiPSC分化诱导hNPC。基础培养基使用了添加了10％AS401的DMEM/F12 Glutamax。回收阶段6后的hNPC，使用低附着96孔板，在CFY培养基、或CFY培养基(-B27,+10％AS401)中扩增培养。
图27示出确认了扩增培养第7天的hNPC的细胞团的基因表达的结果。在CFY培养基(-B27,+10％AS401)中扩大培养时，处于NPC标记和血管新生相关基因的表达较高的倾向。
(实施例15)
为了确认CFY培养基中的FGF9的效果，制备了添加300ng/ml的FGF2以代替CFY培养基的FGF9的培养基(CFY培养基(-FGF9,+FGF2))。
通过分化诱导法A，由hiPSC分化诱导hNPC。基础培养基使用了添加了B27(无维生素A型添加剂，英杰)的DMEM/F12Glutamax。回收阶段6后的hNPC，使用低附着96孔板，在CFY培养基或CFY培养基(-FGF9,+FGF2)中扩增培养。
在扩增培养后第7天，用光学显微镜及荧光显微镜观察细胞团，将用光学显微镜观察到的形态与用荧光显微镜观察到的NPC标记(OSR1，SIX2)的表达进行比较。将结果示于图28。在含有FGF9的培养基中扩增培养时，NPC标记的表达较高。
(实施例16)
进行由使用CFY培养基或CFY培养基(-FGF9,+FGF2)扩增培养的hNPC向肾脏类器官的分化诱导。
将结果示于图29。在含有FGF9的培养基中扩大培养时，肾脏类器官(颜色浅的部分)的面积增加，肾脏类器官的形成良好。
(实施例17)
为了确认CFY培养基中的ROCK抑制剂(Y-27632)的效果，制备了从CFY培养基中除去了ROCK抑制剂的培养基(CF培养基)。
将在CFY培养基中维持的hNPC传代至CFY培养基。传代2天后，培养基更换为CFY培养基或CF培养基(第1次培养基更换)。接着，从第1次培养基更换起2天后，进一步培养基更换为CFY培养基或CF培养基(第2次培养基更换)。从第2次培养基更换起2天后，传代至CFY培养基。在该循环中传代培养至3次传代。
在传代的时刻采集细胞，利用流式细胞仪对NPC标记阳性细胞(OSR1，SIX2)进行分析。
将结果示于图30及图31。自传代起2天后之后的培养基即使为CF培养基(CFY→CF)和CFY培养基(CFY→CFY)中的任一者，也不会影响NPC标记的表达。
(实施例18)
将在CFY培养基中维持的hNPC传代至CFY培养基。传代2天后，培养基更换为CFY培养基或CF培养基(第1次培养基更换)。接着，在2天后，进一步培养基更换为CFY培养基或CF培养基(第2次培养基更换)。从第2次培养基更换起2天后，传代至CFY培养基。在该循环中传代培养至3次传代。
在传代的时刻采集细胞，利用流式细胞仪对未被DAPI染色的活细胞中的、NPC标记(OSR1，SIX2)阳性细胞以及c-MET(在NPC中特异性表达的细胞表面抗原蛋白质)阳性细胞的比例进行分析。
将结果示于图32(传代数1)及图33(传代数2)。以未被DAPI染色的活细胞的总细胞数中的、与利用流式细胞仪测定的各细胞组(OSR1(+)SIX2(+),OSR1(+)SIX2(-),c-MET(+))的比例相匹配的细胞数表示。自传代起2天后之后的培养基即使为CF培养基(CFY→CF)和CFY培养基(CFY→CFY)中的任一者，也不会影响NPC标记的表达。
(实施例19)
将在CFY培养基中维持的hNPC传代至CFY培养基。传代2天后，培养基更换为CFY培养基或CF培养基(第1次培养基更换)。接着，在2天后，进一步培养基更换为CFY培养基或CF培养基(第2次培养基更换)。从第2次培养基更换起2天后，传代至CFY培养基。在该循环中传代培养至2次传代。
用光学显微镜及荧光显微镜观察2次传代后的细胞团，将用光学显微镜观察到的形态与用荧光显微镜观察到的NPC标记(OSR1，SIX2)的表达进行比较。将结果示于图34。自传代起2天后之后的培养基即使为CF培养基(CFY→CF)和CFY培养基(CFY→CFY)中的任一者，也不会影响NPC标记的表达。
(实施例20)
将在CFY培养基中维持的hNPC传代至CFY培养基。传代2天后，培养基更换为CFY培养基或CF培养基(第1次培养基更换)。接着，在2天后，进一步培养基更换为CFY培养基或CF培养基(第2次培养基更换)。从第2次培养基更换起2天后，传代至CFY培养基。在该循环中传代培养至1次传代。
将1次传代后的hNPC分化诱导为肾脏类器官。通过光学显微镜来观察肾脏类器官的形态。将结果示于图35。自传代起2天后之后的培养基即使为CF培养基(CFY→CF)和CFY培养基(CFY→CFY)中的任一者，也会形成肾脏类器官。即使将自传代起2天后之后的培养基作为CF培养基(CFY→CF)，肾脏类器官的形成也与2天后之后使用CFY培养基(CFY→CFY)的情况相同。
(产业上的可利用性)
根据本发明，提供了能够在维持分化能力的状态下扩增培养肾元祖细胞的用于扩增培养肾元祖细胞的培养基，使用了所述培养基的NPC的扩增培养方法，以及由通过所述扩增培养方法得到的肾元祖细胞制造肾脏类器官的方法。通过本发明的方法得到的肾元祖细胞以及肾脏类器官能够应用于肾病的治疗或预防。

Claims (22)

1.一种用于扩增培养肾元祖细胞的培养基，其含有：
GSK-3β抑制剂、ROCK抑制剂、以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的用于扩增培养肾元祖细胞的培养基，其还含有JAK抑制剂。
3.根据权利要求2所述的培养基，其中，所述JAK抑制剂为JAK2抑制剂。
4.根据权利要求3所述的培养基，其中，所述JAK2抑制剂为TG101348。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的培养基，其中，所述GSK-3β抑制剂为CHIR99021。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的培养基，其中，所述ROCK抑制剂为Y-27632。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的培养基，其还含有相对于所述培养基的总体积，10体积％的AS401。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的培养基，其中，所述肾元祖细胞为人类的肾元祖细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的培养基，其中，所述肾元祖细胞为从多能干细胞诱导出的肾元祖细胞。
10.根据权利要求9所述的培养基，其中，所述多能干细胞为iPS细胞。
11.一种扩增培养肾元祖细胞的方法，其包括在权利要求1至10中任一项所述的培养基中培养肾元祖细胞的工序。
12.根据权利要求11所述的扩增培养肾元祖细胞的方法，其中，培养所述肾元祖细胞的工序包括传代培养所述肾元祖细胞。
13.一种扩增培养肾元祖细胞的方法，其包括：
(A)在权利要求1至10中任一项所述的培养基中培养肾元祖细胞30～60小时的工序；
(B)在含有GSK-3β抑制剂以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子，且不含有ROCK抑制剂的培养基中，培养在所述工序(A)中得到的细胞的工序。
14.根据权利要求13所述的扩增培养肾元祖细胞的方法，其还包括(C)将在所述工序(B)中得到的细胞传代至权利要求1至10中任一项所述的培养基的工序。
15.根据权利要求14所述的扩增培养肾元祖细胞的方法，其还包括：
(D)在权利要求1至10中任一项所述的培养基中，培养在所述工序(C)中传代的细胞30～60小时的工序；
(E)在含有GSK3β抑制剂以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子，且不含有ROCK抑制剂的培养基中，培养在所述工序(D)中得到的细胞的工序。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的扩增培养肾元祖细胞的方法，其中，所述肾元祖细胞为人类的肾元祖细胞。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的扩增培养肾元祖细胞的方法，其中，所述肾元祖细胞为从多能干细胞诱导出的肾元祖细胞。
18.根据权利要求17所述的扩增培养肾元祖细胞的方法，其中，所述多能干细胞为iPS细胞。
19.根据权利要求17或18所述的扩增培养肾元祖细胞的方法，其中，所述肾元祖细胞为通过包括下述工序(i)～(vi)的方法得到的肾元祖细胞：
(i)在含有FGF2、BMP4、GSK-3β抑制剂以及视黄酸或其衍生物的培养基中，培养多能干细胞的工序；
(ii)在含有FGF2、GSK-3β抑制剂以及BMP7的培养基中，培养在所述工序(i)中得到的细胞的工序；
(iii)在含有GSK-3β抑制剂、BMP7以及TGFβ抑制剂，且不含有FGF2的培养基中，培养在所述工序(ii)中得到的细胞的工序；
(iv)在含有FGF2、GSK-3β抑制剂、激活素以及ROCK抑制剂的培养基中，培养在所述工序(iii)中得到的细胞的工序；
(v)在含有视黄酸或其衍生物，且不含有FGF9的培养基中，培养在所述工序(iv)中得到的细胞的工序；
(vi)在含有GSK-3β抑制剂以及从FGF9和FGF20组成的群中选择的至少1种成纤维细胞生长因子的培养基中，培养在所述工序(v)中得到的细胞的工序。
20.根据权利要求19所述的扩增培养肾元祖细胞的方法，其中，在所述工序(iv)中使用的培养基为不含有BMP7的培养基。
21.根据权利要求19或20所述的扩增培养肾元祖细胞的方法，其中，使用细胞贴壁面大于等于400cm2的培养容器来实施所述工序(i)～(vi)中的至少1个工序。
22.一种肾脏类器官的制造方法，其包括：
通过权利要求11至21中任一项所述的扩增培养肾元祖细胞的方法，来扩增培养肾元祖细胞的工序；
使所述扩增培养的肾元祖细胞分化为肾脏类器官的工序。
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