WO2017010448A1 - ネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞の増幅培養方法 - Google Patents
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- WO2017010448A1 WO2017010448A1 PCT/JP2016/070396 JP2016070396W WO2017010448A1 WO 2017010448 A1 WO2017010448 A1 WO 2017010448A1 JP 2016070396 W JP2016070396 W JP 2016070396W WO 2017010448 A1 WO2017010448 A1 WO 2017010448A1
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Definitions
- the present invention relates to an amplification culture method for nephron progenitor cells. More specifically, the present invention relates to a culture method capable of amplifying nephron progenitor cells while maintaining an undifferentiated state without losing differentiation ability.
- the mammalian kidney contains about 1 million nephrons, which consist of glomeruli and tubules.
- the adult kidney is an organ that does not regenerate, but in the fetal kidney, there is a transcription factor Six2-positive nephron progenitor cell in a tissue called the metanephric mesenchyme (MM), and it repeats self-replication from glomeruli and tubules. It differentiates into nephron, which is a major functional unit.
- progenitor cells stop self-replicating and terminally differentiate within a few days after birth in mice (approximately 10 days after kidney development) and at 34 weeks of gestation in humans. Therefore, no new nephron formation occurs in the adult kidney. This is thought to be one reason why the adult kidney does not regenerate. And it causes the pathological kidney to be unrecoverable.
- the metanephric mesenchyme contains nephron progenitor cells that express the transcription factor Six2, which respond to the standard Wnt signal induced by ureteric bud-derived Wnt9 in the nephron epithelium (tissue). Produce. Six2 counters Wnt-mediated differentiation signals, thereby maintaining nephron progenitor cells in an undifferentiated state.
- Six2 counters Wnt-mediated differentiation signals, thereby maintaining nephron progenitor cells in an undifferentiated state.
- the balance between self-renewal and differentiation of nephron progenitor cells is important for renal organogenesis.
- Brown et al. Isolated Bmp7-positive cells from the kidney of embryonic day 17 of mice by FACS. The cells were nephrogenic zone cells (NZC), and Cited1 positive cells expressed in nephron progenitor cells were Fgf- It has been reported that it is maintained for 24 hours in the presence of 1, -2, -9 and -20 (200 ng / ml) (Non-patent Document 2). Furthermore, Brown et al.
- NZC is differentiated by treatment with Bmp7 (50 ng / ml) and BIO (0.5 ⁇ M), an activator of the Wnt pathway.
- BIO an activator of the Wnt pathway
- Non-Patent Document 4 Yuri et al. Also reported a method for culturing and amplifying nephron progenitor cells using a reaggregation system. It describes that Six2-GFP positive mouse nephron progenitor cells could be cultured until day 21 and that the number of Six2-GFP positive nephron progenitor cells was amplified more than 20 times on day 21. Has been. However, after 14 days, the cell count has reached a plateau.
- DAPT which is a ⁇ -secretase that inhibits Notch signaling pathway and prevents nephron progenitor cell differentiation, maintains Six2-GFP positive nephron progenitor cells in new aggregates reconstructed from the initial aggregates. It is effective for amplification and is described as being able to amplify up to 65 times.
- Cells separated into single cells are prepared using the initial aggregate, and a new aggregate is constructed again therefrom.
- cells after culture have been shown to be positive for the epithelial marker E-cadherin, but the ability to reconstruct the three-dimensional nephron structure of glomeruli and tubules has not been shown.
- the embryonic day 12 kidney was dissociated with a 0.25% trypsin EDTA solution, and cells in which ureteric buds, nephron progenitor cells and interstitial cells were mixed were cultured. Yes. That is, it is shown that the culture conditions of Yuri et al. Cannot be cultured only with nephron progenitor cells isolated from ureteric buds. Therefore, this culture system requires embryonic ureteric buds, and it is not clear whether the culture conditions directly affect nephron progenitor cell amplification.
- the present inventors have obtained a high rate of Six2-positive nephron progenitor cells having the ability to form a three-dimensional kidney tissue of glomeruli and tubules (for example, Nephron progenitor cells are maintained for a long period of time (for example, at least 7 days or more, preferably 10 days or more) while maintaining 60% or more of the whole, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more. (More preferably 15 days or more, and even more preferably 19 days or more) a culture method for amplification was established, and the present invention was completed.
- a culture method for amplification was established, and the present invention was completed.
- the present inventors added the concentration of Wnt activator in the medium and the concentration of Bmp7 in the medium in addition to the addition of Fgf9, Bmp7, CHIR99021 to the medium.
- the combination was found to be important for the differentiation and proliferation of nephron progenitor cells.
- the present inventors have found that Wnt activator and Bmp7 alone are not sufficient for maintaining highly efficient Six2-positive cells, and that Lif is essential.
- the present invention includes the following.
- the following compounds (I) a Wnt agonist, (Ii) Fgf, (Iii) leukocyte inhibitory factor (LIF), (Iv) Bmp family compounds, A method for amplifying and culturing nephron progenitor cells derived from an isolated mammal using a medium containing (v) a Rock inhibitor and (vi) a Notch inhibitor.
- the medium further contains (vii) Tgf- ⁇ .
- the medium contains a Bmp family compound at a concentration of 1.0 ng / ml to 20 ng / ml (preferably 2.5 ng / ml to 15 ng / ml, more preferably 5 ng / ml to 15 ng / ml).
- a Bmp family compound at a concentration of 1.0 ng / ml to 20 ng / ml (preferably 2.5 ng / ml to 15 ng / ml, more preferably 5 ng / ml to 15 ng / ml).
- the medium is a Wnt agonist at a concentration of 0.1 ⁇ M to 5 ⁇ M (preferably 0.5 ⁇ M to 2.5 ⁇ M, more preferably 0.75 ⁇ M to 1.5 ⁇ M), 1.0 ng / ml to 20 ng / ml (Preferably 2.5 ng / ml to 15 ng / ml, more preferably 5 ng / ml to 15 ng / ml) Bmp family compound at a concentration of 10 to 500 ng / ml (preferably 30 to 300 ng / ml, more preferably Fgf at a concentration of 50 to 200 ng / ml) and LIF at a concentration of 1 ng / ml to 30 ng / ml (preferably 1 ng / ml to 20 ng / ml, more preferably 1 ng / ml to 10 ng / ml)
- the method according to any one of [1] to [3] above, comprising:
- the Wnt agonist is a GSK-3 inhibitor (preferably CHIR99021, BIO, or SB415286, more preferably CHIR99021).
- the Fgf is selected from the group consisting of Fgf1, Fgf2, Fgf9, and Fgf20.
- the Wnt agonist is CHIR99021, the Fgf is Fgf9 or Fgf2, the Bmp is Bmp7, the Rock inhibitor is Y27632, and the Notch inhibitor is DAPT.
- the nephron progenitor cell is an ES cell or iPS cell-derived nephron progenitor cell (preferably a mouse ES cell or mouse iPS cell-derived mouse nephron progenitor cell, or a human ES cell or human iPS cell-derived human nephron progenitor cell.
- the method according to any one of [1] to [10] above.
- [12] The above [1] to [11], wherein the nephron progenitor cells are cultured for 5 days or more (preferably 7 days or more, more preferably 10 days or more, still more preferably 15 days or more). The method according to any one of the above.
- the nephron progenitor cells are 4 times or more (preferably 10 times or more, more preferably 30 times or more, still more preferably 50 times or more, most preferably 100 times or more) compared to the number of cells at the start of culture.
- the culture is performed on an iMatrix or fibronectin-coated plate.
- the culturing is performed in a U-bottom low cell adsorption plate.
- [16] A nephron progenitor cell having nephron-forming ability, cultured using the method according to any one of [1] to [15] above.
- [17] A method for producing a three-dimensional kidney structure having glomeruli and tubules using nephron progenitor cells cultured using the method according to any one of [1] to [15] above.
- Wnt agonist at a concentration of 0.1 ⁇ M to 5 ⁇ M (preferably 0.5 ⁇ M to 2.5 ⁇ M, more preferably 0.75 ⁇ M to 1.5 ⁇ M), 1.0 ng / ml to 20 ng / ml (preferably Bmp family compounds at a concentration of 2.5 ng / ml to 15 ng / ml, more preferably 5 ng / ml to 15 ng / ml), 10 to 500 ng / ml (preferably 30 to 300 ng / ml, more preferably 50 to 200 g / ml) and LIF at a concentration of 1 ng / ml to 30 ng / ml (preferably 1 ng / ml to 20 ng / ml, more preferably 1 ng / ml to 10 ng / ml), [18] The medium according to any one of [20] to [20].
- the medium comprises a Rock inhibitor at a concentration of 1.0 ⁇ M to 50 ⁇ M (preferably 2.0 ⁇ M to 30 ⁇ M, more preferably 5 ⁇ M to 20 ⁇ M), and 1.0 ⁇ M to 20 ⁇ M (preferably 2.
- the Wnt agonist is CHIR99021
- the Fgf is Fgf9 or Fgf2
- the Bmp is Bmp7
- the Rock inhibitor is Y27632
- the Notch inhibitor is DAPT.
- nephron progenitor cells can be cultured and expanded while being maintained in an undifferentiated state, and the nephron progenitor cells thus increased have the ability to differentiate into nephrons. That is, according to the present invention, amplification culture of nephron progenitor cells has become possible.
- FIG. 5 is the result of qPCR analysis of MM nephron progenitor cell markers cultured on plates coated with iMatrix or fibronectin (Fn) for 7 days. MM freshly isolated at E11.5 was used as a positive control (E11.5MM).
- FT Control; LY: LIF + Y27632; LYD: LY + DAPT. It is the result of having culture
- FIG. 6 is the result of reconstitution of 3D nephron structure from cells grown using cells prepared from E15.5 or P0 kidneys.
- FIG. 6 shows the results of confirming the influence of FGF2 and FGF9 on the proliferation of cells from kidneys of E11.5 Six2-GFP mice.
- GFP positive cells from E11.5 were cultured for 7 days in FGF2 (50 ng / ml) or FGF9 (50 ng / ml) and then analyzed by FACS.
- the results of FACS analysis at the start of culture are shown in the upper left panel, and the results of FACS analysis after 7 days of culture are shown in the upper right panel.
- the lower left panel shows the total number of cells and the number of Six2-GFP positive cells at the start of culture (E11.5) and on the seventh day of culture.
- the lower right panel shows the expression of nephron progenitor cell markers (Six2, Pax2, Sall1, and Wt1) in each condition.
- FIG. 6 is a result of reconstitution of three-dimensional nephron structure from cells grown using cells prepared from E11.5 kidneys.
- Left row hematoxylin and eosin (HE) staining; middle row: immunostaining for nephrin (red) and WT1 (green), markers for glomeruli; right row: markers for distal end and proximal tubule, respectively Immunostaining of Cadherin 1 (red) and Cadherin 6 (green).
- Scale bar 20 ⁇ m.
- White arrows indicate glomeruli, and black arrows indicate tubules. The examination of the optimal concentration of CHIR and Bmp7 in the proliferation of nephron progenitor cells is shown.
- FIG. 2 is a schematic diagram of continuous passage culture of Six2-GFP positive cells from E11.5.
- Sorted progenitor cells (green) were cultured for 2 days to aggregate, and further cultured on plates for 6 days (day 8). Cells were then diluted 1: 3 and cultured until day 19. The total number of cells on day 19 of culture and the number of GFP positive cells in optimized conditions (including all factors) or in the absence of the indicated factors are shown. The percentage of GFP positive cells in culture is shown.
- the result of the quantitative PCR analysis of a nephron progenitor cell marker (Six2, Pax2, Sall1, Wt1, and Osr1) is shown. It is the result of reconstruction of the three-dimensional nephron structure from cells cultured for 19 days.
- HE hematoxylin and eosin staining
- middle row immunostaining for nephrin (red) and WT1 (green), markers for glomeruli
- right row markers for distal end and proximal tubule, respectively Immunostaining of Cadherin 1 (red) and Cadherin 6 (green).
- Scale bar 20 ⁇ m.
- White arrows indicate glomeruli, and black arrows indicate tubules. It is the result of calculating the number of amplified cells of nephron progenitor cells in vitro compared with the state in vivo.
- Right panel calculated number of GFP positive cells cultured in vitro for 8 and 19 days from one E11.5 kidney progenitor cell. Shown are the results of quantitative PCR analysis (right panel) of the total number of cells and the number of OSR1-GFP positive cells (left panel) and nephron progenitor cell markers (Six2, Pax2, Sall1, Wt1, and Osr1) on day 7 of culture. Yes. It is the result of reconstitution of nephron structure from nephron progenitor cells cultured for 7 days from OSR1-GFP ES cells.
- the left figure shows the results of measuring the number of nephron progenitor cells on day 0 and 8 of culture, and the right figure shows the results of measuring the expression level of nephron progenitor cell markers. It is a result of reconstruction of a three-dimensional nephron structure from cells grown using nephron progenitor cells derived from human iPS cells.
- Left column HE staining; middle column: immunostaining of nephrin (red) and WT1 (green) markers for glomeruli; right column: Cadherin1 (marker for distal end and proximal tubule, respectively) Red) and Cadherin 6 (green) immunostaining.
- Scale bar 20 ⁇ m. Two white arrows on the right side indicate glomeruli, and two black arrows on the left side indicate tubules.
- One embodiment of the present invention provides for nephron progenitor cells comprising (i) a Wnt agonist, (ii) Fgf, (iii) a leukocyte inhibitory factor (LIF), (iv) a Bmp family compound, (v) a Rock inhibitor, and ( vi) It is a method of increasing by culturing in a medium containing a Notch inhibitor. Another aspect of the present invention is a method of increasing nephron progenitor cells by further culturing in a medium containing (vii) Tgfa. Another aspect of the present invention is a medium that can amplify and culture nephron progenitor cells in an undifferentiated state.
- nephron progenitor cell having nephron-forming ability cultured by the above method.
- nephron-forming ability means that a three-dimensional nephron structure having differentiated and developed glomeruli and tubules can be formed.
- Another embodiment of the present invention is a method for producing a three-dimensional kidney structure (nephron) having glomeruli and tubules using nephron progenitor cells amplified and cultured by the method of the present invention.
- the medium used in the culture method of the present invention can be a commonly used medium as a basal medium, and is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved.
- a medium used for animal cell culture is a basal medium.
- the basal medium for example, BME medium, BGjB medium, CMRL61066 medium, Glasgow MEM medium, improved MEM medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagles MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, ham medium, RPMI401640 medium, Fischer Examples thereof include 's medium, Dulbecco medium, improved Dulbecco medium, and mixed media thereof.
- a DMEM / F12 medium obtained by adding F12 to DMEM can be used, but is not limited thereto.
- the medium used in the culture method of the present invention may be a serum-containing medium or a serum-free medium, but a serum-free medium is preferable from the viewpoint of ensuring the safety of cell transplantation by eliminating different components.
- the serum-free medium means a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum, and is mixed with purified blood-derived components, animal tissue-derived components (for example, growth factors), or serum substitutes.
- the existing medium shall correspond to a serum-free medium.
- examples of such serum-free medium include serum-free medium supplemented with an appropriate amount (for example, 1-20%) of commercially available KSR, serum-free medium supplemented with insulin and transferrin, medium supplemented with cell-derived factors, and the like. However, it is not limited to these.
- the method for amplifying and culturing nephron progenitor cells of the present invention can be carried out according to the present invention using a medium obtained by adding each component or factor to the above medium, as described in detail later.
- the components and factors arbitrarily added to the medium are not limited to these, and examples thereof include B27, N2, insulin-transferrin-serenium, ⁇ -mercaptoethanol, ascorbic acid, and non-essential amino acid.
- Wnt agonist The Wnt agonist that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it has Wnt agonist activity.
- a Wnt agonist is defined as an agent that activates TCF / LEF-mediated transcription in a cell.
- Wnt agonists are selected from true Wnt agonists, inhibitors of intracellular ⁇ -catenin degradation and activators of TCF / LEF that bind to and activate Frizzled receptor family members, including any and all of the Wnt family proteins.
- a Wnt agonist is at least 10%, preferably at least 30%, more preferably at least 50%, even more preferably at least 70% compared to the level of Wnt activity in the absence of this molecule, Even more preferably at least 90%, most preferably 100% refers to those that stimulate Wnt activity in the cell.
- Wnt activity can be determined by measuring the transcriptional activity of Wnt, for example by pTOPFLASH and pFOPFLASH Tcf luciferase reporter constructs (Korinek et al., Science 275: 1784-1787, 1997).
- the Wnt agonists that can be used in the present invention include Wnt-1 / Int-1; Wnt-2 / Irp (Int-1 related protein); Wnt-2b / 13, Wnt-3 / Int-4; Wnt-3a; Wnt-4; Wnt-5a; Wnt-5b; Wnt-6; Wnt-7a; Wnt-7b, Wnt-8a / 8d; Wnt-8b; Wnt-9a / 14; Wnt-9b / 14b / 15; 10a; Wnt-10b / 12; including secreted glycoproteins including Wnt-11 and Wnt-16.
- Wnt agonists function as Wnt proteins in that they bind to the R-spondin family of secreted proteins and the Frizzled-4 receptor with high affinity and induce activation of the Wnt signaling pathway.
- Wnt agonists are small molecule agonists of the Wnt signaling pathway, aminopyrimidine derivatives.
- Wnt agonists included in the above definition also include Wnt signaling pathway inhibitors, GSK-3 inhibitors, Dkk1 antagonists and the like.
- a GSK-3 inhibitor includes a GSK- ⁇ or ⁇ inhibitor, and is defined as a substance that inhibits the kinase activity of GSK-3 ⁇ or ⁇ protein, for example, the ability to phosphorylate ⁇ -catenin. Many substances are known. ing.
- CHIR99021 (6-[[2-[[4- (2,4-dichlorophenyl) -5- (4-methyl-1H-imidazol-2-yl) -2-pyrimidinyl] amino] ethyl] Amino] nicotinonitrile), lithium and valproic acid, benzazepineone family Kenpaulone; 9-bromo-7,12-dihydroindolo [3,2-d] [1] benzacepine-6 (5H)- ON) and Alster Paulon (Alsterpaullone; 9-nitro-7,12-dihydroindolo [3,2-d] [1] benzacepin-6 (5H) -one), 5-chloro-indirubin, which is an indirubin derivative, Indirubin-3'-monooxime and BIO (aka GSK-3 ⁇ Inhibitor IX; 6-bromoindirubin-3′-oxime), a maleimide derivative SB216673 (3-
- the Wnt agonist that can be used in the present invention further contains a Wnt signal transduction pathway inhibitor, and a substance known or marketed as a Wnt signal transduction pathway inhibitor can be used.
- the Wnt agonist that can be used in the present invention includes any natural product or synthetic product as long as it is included in the above definition, and may be any protein, polymer, or small molecule.
- Examples of Wnt agonists that can be used in the present invention include, but are not limited to, for example, preferably GSK-3 inhibitors, more preferably CHIR99021, BIO, or SB415286, particularly preferably. CHIR99021.
- each Wnt agonist can be appropriately selected according to the purpose of use, and for example, a concentration that can exhibit the same effect as that obtained when CHIR99021 is used can be selected.
- These Wnt agonists are commercially available.
- the concentration in the medium can be, for example, 0.1 to 5.0 ⁇ M, preferably 0.5 to 2.5 ⁇ M, more preferably 0.75 to 1.5 ⁇ M. .
- the Fgf that can be used in the present invention can be selected from the group consisting of the Fgf family, preferably selected from Fgf2, Fgf9, and Fgf20, and more preferably Fgf9.
- the concentration of Fgf in the medium is, for example, 10 to 500 ng / ml, preferably 30 to 300 ng / ml, more preferably 50 to 200 ng / ml.
- these Fgf are also marketed and can be used for this invention without a restriction
- LIF Leukocyte inhibitor
- concentration of LIF used in the present invention in the medium is, for example, 1.0 ng / ml to 30 ng / ml, preferably 1.0 ng / ml to 20 ng / ml, more preferably 1.0 ng / ml to 10 ng / ml.
- concentration of ml can be increased.
- High concentrations of LIF eg, 50 ng / ml or higher
- PLC phospholipase C
- Jnks c-Jun N-terminal kinase
- Such activation is mild at low concentrations, and low concentrations of LIF can maintain nuclear localization of Six2 and Yap, which are important for progenitor cell amplification.
- combined treatment with a Rock inhibitor (Y27632) attenuates LIF-induced JNK activation, thereby allowing nephron progenitor cell amplification.
- Y27632 Rock inhibitor
- Bmp The Bmp family compound used in the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as “Bmp”) is selected from the group consisting of Bmp family such as Bmp1, Bmp2, Bmp4, Bmp6, Bmp7, Bmp8a, Bmp8b and Bmp10, GDF11. , Preferably selected from Bmp2, Bmp4 or Bmp7, more preferably Bmp7. These Bmps are commercially available. The concentration of Bmp in the medium can be appropriately selected depending on the type of Bmp.
- Bmp7 when used, for example, 1.0 ng / ml to 20 ng / ml, preferably 2.5 ng / ml to 15 ng / ml, more preferably 5 ng / ml to 15 ng / ml. These concentrations are very different from the concentrations (50 ng / ml) used in the cited prior art (Non-Patent Documents 1 to 4).
- the Bmp to be used can be any source of Bmp, but is preferably human Bmp. When other Bmp compounds are used, the concentration at which the same effect as that obtained when Bmp7 is used can be appropriately selected.
- Rock inhibitor Rock is a serine / threonine protein kinase that has been identified as a target protein for the low molecular weight GTP binding protein Rho.
- Rock inhibitors that are inhibitors thereof are commercially available, and those can be used without limitation in the present invention.
- Examples of the Rock inhibitor used in the present invention include, but are not limited to, Y27632 and HA1077, and Y27362 is preferable.
- the concentration of the Rock inhibitor used in the present invention can be, for example, 1 to 50 ⁇ M, preferably 2 to 30 ⁇ M, more preferably 5 to 20 ⁇ M.
- the Notch inhibitor used in the present invention is a compound that inhibits Notch signal, and ⁇ -selectase is also included in the Notch signal inhibitor of the present invention as long as it exhibits the same activity.
- a preferred Notch inhibitor includes DAPT, which is commercially available.
- the concentration of the Notch inhibitor in the medium can be appropriately selected according to the type of Notch inhibitor to be used. For example, when DAPT is used, for example, 1.0 to 20 ⁇ M, preferably 1.0 to 10 ⁇ M, More preferably, the concentration is 1.0 to 5 ⁇ M, more preferably 2.5 to 5 ⁇ M.
- Tgf ⁇ can be further added to the medium.
- Tgf ⁇ is a factor generally used in the culture of undifferentiated cells such as ES cells and iPS cells, and is a factor usually added to the medium in the culture of nephron progenitor cells.
- the concentration of Tgf ⁇ in the medium can be, for example, 1 to 500 ng / ml, preferably 5 to 300 ng / ml, more preferably 10 to 200 ng / ml.
- These Tgfas are also commercially available and can be used in the present invention without any particular limitation.
- cells can be cultured on a matrix-coated plate, and it is expected to obtain better culture results.
- Coating matrices include, but are not limited to, iMatrix, fibronectin, laminin, and collagen, and plates coated with these matrices are commercially available.
- the cells can be cultured in a spheroid-like U-bottom plate (for example, a low-cell-binding-plate having a plurality of wells), and a better amplification culture can be achieved.
- One aspect of the method of the present invention is to culture the cells while maintaining the spheroid form.
- Nephron progenitor cells used in the culturing method of the present invention may be any of nephron progenitor cells collected and collected from living bodies and nephron progenitor cells induced to differentiate from pluripotent stem cells (for example, ES cells and iPS cells). Can be used.
- the collection and collection of mammalian nephron progenitor cells other than humans from living bodies can be performed by removing the fetal kidney and isolating the metanephric mesenchyme.
- nephron progenitor cells of the mouse on the 12th day to the 1st day after birth can be isolated and collected by FACS.
- Nephron progenitor cells from ES cells or iPS cells can be prepared, for example, according to the report of the present inventors (Non-patent Document 6; Patent Document 1).
- the progenitor cells can continue to proliferate and are at least 5 days, preferably 7 days, more preferably 10 days or more, even more preferably 12 days or more, and even more preferably Culturing is possible for 15 days or more, most preferably 19 days or more.
- the number of cells is at least 10 times or more, usually 30 times or more, preferably 50, compared to the time of initiation of culture.
- Amplification of at least twice, more preferably at least 70 times, even more preferably at least 100 times, and even more preferably at least 1000 times is possible.
- the number of cells can be amplified by at least 4 times, preferably 10 times or more, compared to the time at the start of culture.
- Nephron progenitor cells cultured by the amplification culture method of the present invention maintain an undifferentiated state and have the ability to differentiate into nephrons.
- nephron progenitor cells are purified and then nephron efficiently using the amplification culture method of the present invention.
- Progenitor cells can be prepared.
- nephron progenitor cells are isolated from tissue derived from human iPS cells, and after purifying the cells, nephron progenitor cells having nephron-forming ability are amplified and cultured using the amplification culture method of the present invention. be able to.
- the cell mass (cell aggregate) is separated and divided into a plurality of small cell masses during the culture, for example, about 7 days, and then the culture is continued.
- progenitor cells can be efficiently amplified.
- nephron progenitor cells cultured by the amplification culture method of the present invention can be stored frozen.
- it can be cryopreserved using an existing cell cryopreservation solution, and the nephron progenitor cells thus stored can be used to reconstitute a three-dimensional nephron structure (eg, glomeruli and urine). (Formation of a thin tube) is possible.
- the isolated MM is trypsinized (0.25% trypsin / EDTA), washed with buffer, FACS buffer (1 ⁇ HBSS, 1% BSA, 0.035% NaHCO 3 , and 1 ⁇ g / ml iodinated) Suspended in propidium).
- Isolation of E15.5 Six2-GFP positive cells was performed by incubating kidneys with 0.25% trypsin / EDTA for 10 minutes at 37 ° C. and separating the cells by pipetting in cold DMEM containing 10% FCS. .
- Neonatal kidneys are treated with a mixture of collagenase XI (Sigma-Aldrich), dispase (Life Technologies), and DNase (Roche) for 10 minutes at 37 ° C. and then with 0.25% trypsin-EDTA. The cells were treated at 37 ° C. for 5 minutes and separated into single cells.
- Serum DMEM / F12 (Life Technologies) was used (abbreviated as “FT”).
- FT Serum DMEM / F12
- Optimum conditions (abbreviated as “CDBLY”) are further: 1 ⁇ M CHIR99021 (Wako), 2.5 ⁇ M DAPT (Merck Millipore), 5 ng / ml BMP7 (R & D Systems), 5 ng / ml LIF (Millpore) , And 10 ⁇ M Y27632 (Wako).
- OSR1-GFP mouse ES cells were used for induction of nephron progenitor cells.
- ES cells were passaged on gelatin coated plates for 2 days to remove feeders. Cells were then harvested, aggregated and differentiated with Accutase (Merck Millipore) according to the manufacturer's 5-step protocol. Induced spheroids were collected at day 8.5 and dissociated using 0.25% trypsin EDTA. Cells were blocked with normal mouse serum and stained with anti-integrin ⁇ 8 (R & D Systems) and anti-PDGFR ⁇ (Cell signaling) antibodies in FACS buffer.
- OSR1-GFP + / integrin ⁇ 8 + / Pdgfr ⁇ fractions were sorted with FACSAria SORP (BD) and cultured in a medium supplemented with CDBLY.
- nephron structure prepared from cultured mouse progenitor cells Cultured cells were seeded on low-cell-binding plates and allowed to form aggregates over 48 hours. Then, on the Nucleopore membrane (Millipore) suspended in DMEM medium containing 10% FCS, the cells were co-cultured with the spinal cord of the embryo for 7 days. The medium was changed every 3 days. The cultured graft was fixed with 10% formalin and embedded in paraffin. Sliced into 6 micron sections, deparaffinized, and then antigen retrieval with citric acid (10 mM, pH 6.0) at 121 ° C. for 5 minutes. Sections were blocked with 1% bovine serum albumin (BSA), incubated with primary antibody at 4 ° C.
- BSA bovine serum albumin
- the primary antibodies used are as follows: anti-cadherin 1 (BD), anti-cadherin 6 (provided by Dr. Gregory Dressler, Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109, USA), anti-nephrin (Progen), And anti-WT1 (Santa Cruz). Secondary antibodies used are as follows: anti-rabbit Alexa 488, anti-guinea pig Alexa 468, and anti-mouse Alexa 594 (Life Technologies).
- Primer sequences for qPCR for each marker gene ( ⁇ -Actin, E-Cadherin, Lef1, Osr1, Pax2, Sall1, Six2, and Wnt1) were purchased from Takara Bio. Incubation conditions were 45 cycles (95 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 45 seconds). All samples were normalized with actin expression.
- Example Example 1 Total MM was isolated from the kidneys of Six2-GFP mice at E11.5 in order to accurately determine the proportion of mouse nephron progenitor cells during partial amplification culture of nephron progenitor cells from the metanephric mesenchyme.
- LIF and Y27632 collectively abbreviated as “LY”
- the cells were cultured as a cell mass without being dispersed into individual cells in the presence of LIF and Y27632 (collectively abbreviated as “LY”). 1).
- LY LIF and Y27632
- CHIR99021 the Wnt agonist CHIR99021 (CHIR) was tested because Wnt signaling plays an important role in the maintenance and differentiation of nephron progenitor cells.
- CHIR increased GFP positive cells on day 7 of culture and the combination of LIF and CHIR was A large amount of amplification of GFP positive cells was shown. Therefore, a combination of LIF, Y27632, CHIR, and DAPT (abbreviated as “CDLY”) was tested on an iMatrix-coated plate. As a result, 26.3% became positive after 7 days of culture.
- BMP7 which is an important regulator of nephron progenitor cells.
- nephron progenitor cell markers including Six, Pax2, Sall1, Wt1, and Osr1
- CDBLY abbreviated as “CDBLY”. It was almost the same. Therefore, although the culture was started from the whole MM including the mixed cell population, this condition was found to be suitable for the amplification of nephron progenitor cells.
- Example 2 In Vitro Amplification of Nephron Progenitor Cells Purified from Mouse Embryos and Neonatal Kidneys
- the above culture conditions (CDBLY) were applied to purified Six2-GFP positive progenitor cells. Due to cell number limitations, the results were initially sorted using E15.5 and newborn (P0) kidney instead of E11.5, resulting in 21.1% and 8% of total GFP positive cells, respectively. It was 1%. The sorted cells were then cultured and aggregated for 2 days to form spheroids, seeded on iMatrix coated plates and cultured for 5 days or longer under the conditions described above. As shown in FIG.
- the glomeruli were round and positive for podocyte-specific markers, Wt1 and nephrin. Induced tubules were localized into cadherin 6 positive proximal and cadherin 1 positive distal domains.
- this culture condition allowed the growth of purified nephron progenitor cells while maintaining the ability to form the three-dimensional nephron structure shown by well-developed glomeruli and tubules.
- progenitor cells from newborns were maintained for 7 days. This is because mouse nephron progenitor cells stop proliferating within 2-3 days after birth and undergo terminal differentiation. Therefore, this result shows that the culture conditions of the present invention maintain the proliferation of progenitor cells in vivo exceeding their physiological time limit.
- Example 3 Effect of LIF, FGF2 / 9, BMP7, and Wnt agonist on the proliferation of mouse nephron progenitor cells
- the above culture conditions allow the proliferation of purified nephron progenitor cells from E15.5 or P0, but cell number The increase was not dramatic (approximately double, see FIG. 4).
- the culture conditions were optimized using all MM from E11.5, and it was confirmed that similar results were obtained with E15.5 and P0.
- Six2-GFP positive progenitor cells were purified with E11.5.
- the sorted cells were aggregated and cultured on an iMatrix-coated plate for 7 days.
- the medium used contained Fgf2 in all experiments. This is based on the results of rat MM culture recently reported by the inventors. Since Fgf9 has been reported to be required for the maintenance of mouse nephron progenitor cells in vivo, the effects of Fgf2 and Fgf9 in culture were compared. Both Fgf2 and Fgdf9 maintained Six2-GFP positive cells at a very high rate (> 95%), but a larger increase in cell number was observed with Fgf9 based conditions (30-fold vs. 60-fold). (FIG. 6).
- nephron progenitor cell markers (Six2, Pax2, Sall1, and Wt1) was equivalent to that of Six2-GFP positive cells newly isolated in E11.5 (FIG. 6). . As shown in FIG. 7, glomeruli and tubules were formed under any conditions when combined with the spinal cord. Therefore, Fgf9 was used in the following experiment.
- Example 4 Reconstruction of three-dimensional nephron structure using mouse embryonic nephron progenitor cells passaged for 19 days
- the cells were separated into small clumps (aggregates) and divided into 3 plates the cells continued to grow and could be passaged every 3-4 days until day 19 (see FIG. 10). .
- the cell number increased and 97% remained positive for Six2-GFP (FIG. 11). Under the optimum conditions (addition of all factors), the percentage of GFP-positive cells on day 19 was 97%.
- mouse fetal nephron progenitor cells were amplified about 1500 times in 19 days of culture while maintaining an undifferentiated state, and the amplified progenitor cells were also threaded after culture. It was found that a three-dimensional structure of a sphere and a tubule can be formed.
- Example 5 Amplification of nephron progenitor cells prepared from mouse ES cells and nephron forming ability
- the inventors have recently reported the preparation of nephron progenitor cells from mouse ES cells (Non-patent Document 6; Patent Document 1). . Therefore, it was examined whether the above-described amplification culture method can be applied to ES cell-derived nephron progenitor cells. Since Six2-GFP ES cells capable of differentiating into the kidney lineage were not available, nephron progenitor cells and subsequently Osr1-GFP ES cells that were shown to differentiate into three-dimensional nephrons were used.
- Osr1 is expressed not only in nephron progenitor cells but also in the stroma at this stage, but its expression is restricted to nephron progenitor cells at later stages of development. Therefore, the Osr1-GFP + / integrin ⁇ 8 + / Pdgfr ⁇ population was selected as the nephron progenitor cell fraction and cultured for 7 days. Cells grew 15-fold and 90.3 percent of them remained positive for Osr1-GFP, but the proportion of integrin ⁇ 8 + / Pdgfr ⁇ - fraction was reduced to 65.2 percent.
- nephron progenitor cell markers (Six2, Pax2, Sall1, Wt1 and Osr1) in Osr1-GFP positive cells on day 7 was comparable to that of Six2 positive cells in vivo at E11.5. These cultured cells formed a three-dimensional nephron structure when stimulated by the spinal cord (FIG. 17). Therefore, nephron progenitor cells prepared from mouse ES cells can be amplified while maintaining nephron-forming ability, which indicates that the culture conditions of the present invention are robust.
- nephron progenitor cells derived from mouse ES cells were amplified 15 times in 7 days of culture by the method of the present invention, and the amplified cells could form a three-dimensional structure of glomeruli and tubules. .
- Example 6 Amplification of nephron progenitor cells prepared from human iPS cells and nephron formation Nephron progenitor cells are induced from human iPS cells according to the method of Taiguchi et al. At that time, human iPS cells whose nephron progenitor cell marker glows with GFP are prepared, and nephron progenitor cells are isolated by FACS. Thereafter, nephron cells are cultured at the concentration of each compound described in the present invention in the same manner as in the above Examples.
- Non-patent Document 6 Using the cultured nephron progenitor cells, a three-dimensional nephron structure is formed in the same manner as in the above example, according to the known report of the inventor (Non-patent Document 6; Patent Document 1). Specifically, it was performed as follows. The outline is shown in FIG. Human nephron progenitor cells were prepared from iPS cells (201B7) according to the method of Taiguchi et al. The precursor spheroids on day 14 of culture were treated with a dissociation solution (CTK solution, Reprocell) to dissociate into small lumps.
- CTK solution dissociation solution
- FIG. 19 shows the results of measuring the number of nephron precursor cells and the gene expression level of the nephron precursor cell marker on day 8 of culture. Cells were amplified 4 times in 8 days.
- a differentiation assay into nephron was performed.
- the iPS cell-derived nephron precursor cells on day 8 of culture were dissociated into small clumps using a dissociation solution (CTK solution) and seeded in 96-well U-bottom low-cell-binding plates (200,000 cells per well) ) Incubated for 24-48 hours to form aggregates and then co-cultured with embryonic spinal cord to form nephrons. The result is shown in FIG. Glomeruli and tubules were confirmed.
- Example 7 Nephron formation from human iPS cell-derived nephron progenitor cells
- amplification of human iPS cell-derived nephron progenitor cells and nephron formation of the amplified cells were performed.
- the precursor spheroids on the 14th day of culture were divided into 4 with a tungsten needle using 96-well U-bottom low-cell-binding plates instead of iMartin-coated plates, and cultured in a spheroid form. .
- nephrons were formed, and many glomeruli and tubules were confirmed (data not shown).
- Example 8 Amplification of nephron progenitor cells derived from purified human iPS cells
- a tissue containing spheroid-like nephron progenitor cells derived from cultured human iPS cells 201B7 according to the method of Taiguchi et al. was immersed in 1x Accumax cell detachment solution (Millipore). , Treated at 37 ° C. for 8 minutes and dissociated (20 spheroids / 500 ⁇ L of Accumax cell detachment solution). Meanwhile, the solution was stirred every 2 minutes. Immediately after the reaction, centrifugation was performed (1000 rpm, 2 minutes).
- the method of the present invention is useful as an amplification culture method for nephron progenitor cells. Further, nephron progenitor cells amplified and cultured by the method of the present invention are useful as research materials for neurogenesis and regeneration, and as raw materials for regenerative medicine.
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Abstract
本発明は、ネフロン前駆細胞を、未分化状態を維持しながら増幅培養する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、培養したネフロン前駆細胞がネフロン形成能力を有する増幅培養方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、優れた増幅率を達成できる、ネフロン前駆細胞の増幅培養方法を提供することを目的とする。本発明により、以下の化合物：（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤、（ｉｉｉ）Ｂｍｐ、（ｉｖ）白血球阻害因子、（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および（ｖｉ）Ｆｇｆを含む培地を用いて、単離された哺乳動物由来のネフロン前駆細胞またはｉＰＳ細胞から作成されたネフロン前駆細胞を培養して増やす方法が提供される。
Description
本発明は、ネフロン前駆細胞の増幅培養方法に関する。より具体的には、ネフロン前駆細胞を、分化能を失うことなく未分化状態に維持したまま増幅させることができる培養方法に関する。
哺乳類の腎臓には、約１００万のネフロンが含まれており、それは、糸球体と尿細管からなる。成体の腎臓は再生しない臓器であるが、胎児期の腎臓では、後腎間葉（ＭＭ）と呼ばれる組織に転写因子Ｓｉｘ２陽性のネフロン前駆細胞が存在し自己複製を繰り返しながら糸球体や尿細管からなる主要機能単位であるネフロンに分化する。しかし、前駆細胞は、マウスでは出生後数日以内（腎臓発生から約１０日後）に、ヒトでは妊娠３４週で、自己複製を停止し、最終分化する。したがって、成体の腎臓では新たなネフロン形成は起こらない。これが、成体の腎臓が再生しない一因であると考えられている。そして、病的な腎臓が回復不能であることの原因となっている。
後腎間葉（ＭＭ）は、転写因子Ｓｉｘ２を発現するネフロン前駆細胞を含んでおり、これらの細胞は尿管芽由来Ｗｎｔ９によって誘発される標準的なＷｎｔシグナルに応答してネフロン上皮（組織）を生じる。Ｓｉｘ２は、Ｗｎｔが媒介する分化信号に対抗しており、それによってネフロン前駆細胞を未分化の状態に維持している。したがって、ネフロン前駆細胞の、自己複製および分化の間のバランスは、腎器官形成にとって重要である。
よって、このネフロンへと分化可能なＳｉｘ２陽性のネフロン前駆細胞集団がどのように自己複製し、分化するのかを細胞レベルで理解することが、腎臓再生医療の基盤構築として重要である。また、そのような前駆細胞を大量に調製することが腎臓再生医療に欠かせない課題である。そこで、ネフロン前駆細胞を未分化の状態で培養や増幅をする方法が今まで試みられてきた。
これまでにネフロン前駆細胞を未分化の状態で培養や増幅をする方法の研究は多数報告されている。例えば、マウスのネフロン前駆細胞の増幅培養を試みた報告としては以下がある。Ｂａｒａｋらは、胎生１４－１７日目のＳｉｘ２－ＧＦＰマウスの腎臓からＦＡＣＳによって単離したＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性の細胞を、Ｂｍｐ７（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｇｆ９（８．６ｎＭ，２００ｎｇ／ｍｌに相当）及びｈｅｐａｒｉｎ（１μｇ／ｍｌ）を含む培養条件で培養した（非特許文献１）。その結果、５日間のＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性の細胞の維持に成功したとしている。しかし、培養２日目以降に増殖能の低下および尿細管形成能が喪失している。一方、Ｂｒｏｗｎらは、Ｂｍｐ７陽性の細胞をマウス胎生１７日目の腎臓からＦＡＣＳによって単離し、その細胞をｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ ｚｏｎｅ ｃｅｌｌ（ＮＺＣ）とし、ネフロン前駆細胞に発現するＣｉｔｅｄ１が陽性の細胞が、Ｆｇｆ－１，－２，－９および－２０（２００ｎｇ／ｍｌ）の各々の存在下で２４時間維持されることを報告している（非特許文献２）。さらに、Ｂｒｏｗｎらは、Ｂｍｐ７（５０ｎｇ／ｍｌ）とＷｎｔ経路の活性化剤であるＢＩＯ（０．５μＭ）でＮＺＣを処理すると分化することを報告している（非特許文献３）。これらの報告は、ネフロン前駆細胞の維持にはＦｇｆ（２００ｎｇ／ｍｌ）／Ｂｍｐ７（５０ｎｇ／ｍｌ）が重要である一方、Ｗｎｔ活性化剤によって分化することを示している。
なお、これらの報告では、ネフロン前駆細胞の増幅量については述べられていない。
なお、これらの報告では、ネフロン前駆細胞の増幅量については述べられていない。
また、Ｙｕｒｉらは、再凝集系（"re-aggregate" system）を用いたネフロン前駆細胞の培養・増幅方法を報告している（非特許文献４）。そこでは、Ｓｉｘ２－ＧＦＰ陽性のマウスネフロン前駆細胞が、２１日目まで培養できたこと、および２１日目にはＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性のネフロン前駆細胞の数が２０倍を超えて増幅したことが記載されている。しかし、１４日後は、細胞数はプラトーに達している。また、Ｎｏｔｃｈシグナル経路を阻害するγ－セクレターゼであり、ネフロン前駆細胞の分化を妨げるＤＡＰＴは、最初の凝集体から再構築された新たな凝集体中でのＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性のネフロン前駆細胞の維持および増幅に有効であり、６５倍にまで増幅出来たことが記載されている。Ｙｕｒｉらの再凝集系においては、最初の凝集体を用いて、単一細胞に分離された細胞を調製し、そこから再び新たな凝集体を構築している。しかし、培養後の細胞が、凝集体が上皮マーカーのＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性であることは示されているが、糸球体、尿細管の三次元のネフロン構造を再構築する能力は示されていない。また、この培養系は胎生１２日目の腎臓を０．２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液で解離し、尿管芽、ネフロン前駆細胞および間質の細胞が混在した細胞を再凝集化したものを培養している。つまり、Ｙｕｒｉらの培養条件は、尿管芽から単離したネフロン前駆細胞だけでは培養できないことを示している。よって、この培養系は、胎生期の尿管芽が必要であり、培養条件がネフロン前駆細胞の増幅に直接作用しているかどうかは明確ではない。
上記のように、ネフロン前駆細胞を、ネフロン形成能力を保持しかつ未分化状態を維持したまま培養や増幅することは困難であり、適切な培養法はこれまでに確立されていなかった。
Barak et al., Developmental Cell, 22, 1191-1207 (2012)
Brown et al., Development, 138, 5099-5112 (2011)
Brown et al., PNAS 110, 4640-4645 (2013)
Yuri et al., PLoS ONE 10(6): e0129242 (2015)
ＩＳＮ－International Society of Nephrology, Forefronts Symposium, September (2013), Florence Italy. Poster No.45
Taguchiら, Cell Stem Cell 14, 53-67 (2014)
本発明は、ネフロン前駆細胞を、未分化状態を維持しながら増幅培養する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、培養した後もネフロン前駆細胞がネフロン形成能力を有する増幅培養方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、優れた増幅率を達成できる、ネフロン前駆細胞の増幅培養方法を提供することを目的とする。
本発明者らはまず、ラットの後腎間葉（ＭＭ）を用いて、Ｆｇｆ２およびＴｇｆαに加えて、１ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ（白血球阻害因子）と低分子化合物Ｙ２７６３２（１０μＭ）の共添加と細胞外マトリックス（ＬａｍｉｎｉｎまたはＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）でラットの後腎間葉が増幅することを発見し、報告した（非特許文献５）。
その後、研究を重ねた結果、上記条件で増殖した細胞はネフロン前駆細胞の主要なマーカー遺伝子を発現し、尿細管や糸球体を形成する分化能力を維持していたことを確認した。しかし、ラットのＭＭと同じ条件下で培養したマウスの全領域のＭＭは、容易に、ネフロン構造を形成する能力を失う。
その後、研究を重ねた結果、上記条件で増殖した細胞はネフロン前駆細胞の主要なマーカー遺伝子を発現し、尿細管や糸球体を形成する分化能力を維持していたことを確認した。しかし、ラットのＭＭと同じ条件下で培養したマウスの全領域のＭＭは、容易に、ネフロン構造を形成する能力を失う。
そこで本発明者らは上記課題を解決するために引き続き鋭意研究を重ねた結果、糸球体と尿細管の３次元の腎臓組織を形成する能力を持つＳｉｘ２陽性のネフロン前駆細胞を高率（例えば、全体の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）で維持したまま、ネフロン前駆細胞を長期間（例えば、少なくとも７日以上、好ましくは１０日以上、より好ましくは１５日以上、さらに好ましくは１９日間以上）増幅する培養法を確立し、本発明を完成した。
より具体的には、本発明者らは、ネフロン前駆細胞の培養条件として、培地へのＦｇｆ９、Ｂｍｐ７、ＣＨＩＲ９９０２１の添加に加え、培地中のＷｎｔ活性化剤の濃度と培地中のＢｍｐ７の濃度の組み合わせがネフロン前駆細胞の分化、増殖に重要であることをつきとめた。さらに本発明者らは、Ｗｎｔ活性化剤とＢｍｐ７だけでは高効率のＳｉｘ２陽性の細胞の維持には不十分で、Ｌｉｆが必須であることもつきとめた。
より具体的には、本発明者らは、ネフロン前駆細胞の培養条件として、培地へのＦｇｆ９、Ｂｍｐ７、ＣＨＩＲ９９０２１の添加に加え、培地中のＷｎｔ活性化剤の濃度と培地中のＢｍｐ７の濃度の組み合わせがネフロン前駆細胞の分化、増殖に重要であることをつきとめた。さらに本発明者らは、Ｗｎｔ活性化剤とＢｍｐ７だけでは高効率のＳｉｘ２陽性の細胞の維持には不十分で、Ｌｉｆが必須であることもつきとめた。
本発明は以下を含む。
［１］以下の化合物：
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む培地を用いて、単離された哺乳動物由来のネフロン前駆細胞の増幅培養方法。
［２］さらに、培地が（ｖｉｉ）Ｔｇｆ－αを含む上記［１］に記載の方法。
［３］前記培地が、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物を含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記培地が、０．１μＭ～５μＭ（好ましくは、０．５μＭ～２．５μＭ、より好ましくは０．７５μＭ～１．５μＭ）の濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０～５００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、３０～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０～２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＬＩＦを含む、上記［１］～［３］のいずれか一つに記載の方法。
［５］前記培地が、１．０μＭ～５０μＭ（好ましくは、２．０μＭ～３０μＭ、より好ましくは、５μＭ～２０μＭ）の濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ～２０μＭ（好ましくは、１．０μＭ～１０μＭ、より好ましくは、１．０μＭ～５μＭ、さらに好ましくは２．５μＭ～５μＭ）の濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、上記［４］に記載の方法。
［６］前記培地が、１ｎｇ／ｍｌ～５００（好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＴｇｆαを含む、上記［５］に記載の方法。
［７］前記Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、上記［１］～［６］のいずれか一つに記載の方法。
［８］前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ－３阻害剤（好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはＳＢ４１５２８６、より好ましくはＣＨＩＲ９９０２１）である、上記［１］～［７］のいずれか一つに記載の方法。
［９］前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、前記［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、前記［１］～［６］のいずれか一つに記載の方法。
［１１］前記ネフロン前駆細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来のネフロン前駆細胞（好ましくは、マウスＥＳ細胞またはマウスｉＰＳ細胞由来のマウスネフロン前駆細胞、またはヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞由来のヒトネフロン前駆細胞）である、上記［１］～［１０］のいずれか一つに記載の方法。
［１２］前記ネフロン前駆細胞が５日以上（好ましくは７日以上、より好ましくは１０日以上、更に好ましくは１５日以上）培養されることを特徴とする、上記［１］～［１１］のいずれか一つに記載の方法。
［１３］前記ネフロン前駆細胞が、培養開始時の細胞数と比較して４倍以上（好ましくは、１０倍以上、より好ましくは３０倍以上、更に好ましくは５０倍以上、最も好ましくは１００倍以上）の細胞数まで培養されることを特徴とする、上記［１］～［１２］のいずれか一つに記載の方法。
［１４］前記培養が、ｉＭａｔｒｉｘまたはフィブロネクチン被覆プレート上で行われる、上記［１］～［１３］のいずれか一つに記載の方法。
［１５］前記培養が、Ｕ底低細胞吸着プレートで行われる、上記［１］～［１３］のいずれか一つに記載の方法。
［１６］上記［１］～［１５］のいずれか一つに記載の方法を用いて培養されたネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞。
［１７］上記［１］～［１５］のいずれか一つに記載の方法を用いて培養されたネフロン前駆細胞を用いて、糸球体および尿細管を有する三次元腎臓構造を作成する方法。
［１］以下の化合物：
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む培地を用いて、単離された哺乳動物由来のネフロン前駆細胞の増幅培養方法。
［２］さらに、培地が（ｖｉｉ）Ｔｇｆ－αを含む上記［１］に記載の方法。
［３］前記培地が、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物を含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記培地が、０．１μＭ～５μＭ（好ましくは、０．５μＭ～２．５μＭ、より好ましくは０．７５μＭ～１．５μＭ）の濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０～５００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、３０～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０～２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＬＩＦを含む、上記［１］～［３］のいずれか一つに記載の方法。
［５］前記培地が、１．０μＭ～５０μＭ（好ましくは、２．０μＭ～３０μＭ、より好ましくは、５μＭ～２０μＭ）の濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ～２０μＭ（好ましくは、１．０μＭ～１０μＭ、より好ましくは、１．０μＭ～５μＭ、さらに好ましくは２．５μＭ～５μＭ）の濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、上記［４］に記載の方法。
［６］前記培地が、１ｎｇ／ｍｌ～５００（好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＴｇｆαを含む、上記［５］に記載の方法。
［７］前記Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、上記［１］～［６］のいずれか一つに記載の方法。
［８］前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ－３阻害剤（好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはＳＢ４１５２８６、より好ましくはＣＨＩＲ９９０２１）である、上記［１］～［７］のいずれか一つに記載の方法。
［９］前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、前記［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、前記［１］～［６］のいずれか一つに記載の方法。
［１１］前記ネフロン前駆細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来のネフロン前駆細胞（好ましくは、マウスＥＳ細胞またはマウスｉＰＳ細胞由来のマウスネフロン前駆細胞、またはヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞由来のヒトネフロン前駆細胞）である、上記［１］～［１０］のいずれか一つに記載の方法。
［１２］前記ネフロン前駆細胞が５日以上（好ましくは７日以上、より好ましくは１０日以上、更に好ましくは１５日以上）培養されることを特徴とする、上記［１］～［１１］のいずれか一つに記載の方法。
［１３］前記ネフロン前駆細胞が、培養開始時の細胞数と比較して４倍以上（好ましくは、１０倍以上、より好ましくは３０倍以上、更に好ましくは５０倍以上、最も好ましくは１００倍以上）の細胞数まで培養されることを特徴とする、上記［１］～［１２］のいずれか一つに記載の方法。
［１４］前記培養が、ｉＭａｔｒｉｘまたはフィブロネクチン被覆プレート上で行われる、上記［１］～［１３］のいずれか一つに記載の方法。
［１５］前記培養が、Ｕ底低細胞吸着プレートで行われる、上記［１］～［１３］のいずれか一つに記載の方法。
［１６］上記［１］～［１５］のいずれか一つに記載の方法を用いて培養されたネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞。
［１７］上記［１］～［１５］のいずれか一つに記載の方法を用いて培養されたネフロン前駆細胞を用いて、糸球体および尿細管を有する三次元腎臓構造を作成する方法。
［１８］以下の化合物：
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む、ネフロン前駆細胞を増幅させるための培地。
［１９］さらに、（ｖｉｉ）Ｔｇｆαを含む上記［１８］に記載の培地。
［２０］１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物を含む、上記［１８］または［１９］に記載の培地。
［２１］０．１μＭ～５μＭ（好ましくは、０．５μＭ～２．５μＭ、より好ましくは０．７５μＭ～１．５μＭ）の濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０～５００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、３０～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０～２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＬＩＦを含む、上記［１８］～［２０］のいずれか一つに記載の培地。
［２２］前記培地が、１．０μＭ～５０μＭ（好ましくは、２．０μＭ～３０μＭ、より好ましくは、５μＭ～２０μＭ）の濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ～２０μＭ（好ましくは、２．０μＭ～１０μＭ、より好ましくは、２．５μＭ～５μＭ）の濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、上記［２１］に記載の培地。
［２３］１ｎｇ／ｍｌ～５００（好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０～２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＴｇｆαを含む、上記［２２］に記載の培地。
［２４］Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、上記［１８］～［２３］のいずれか一つに記載の培地。
［２５］前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ－３阻害剤（好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはＳＢ４１５２８６、より好ましくはＣＨＩＲ９９０２１）である、上記［１８］～［２４］のいずれか一つに記載の培地。
［２６］前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、前記［１８］～［２５］のいずれかに記載の培地。
［２７］前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、前記［１８］～［２３］のいずれか一つに記載の培地。
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む、ネフロン前駆細胞を増幅させるための培地。
［１９］さらに、（ｖｉｉ）Ｔｇｆαを含む上記［１８］に記載の培地。
［２０］１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物を含む、上記［１８］または［１９］に記載の培地。
［２１］０．１μＭ～５μＭ（好ましくは、０．５μＭ～２．５μＭ、より好ましくは０．７５μＭ～１．５μＭ）の濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０～５００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、３０～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０～２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＬＩＦを含む、上記［１８］～［２０］のいずれか一つに記載の培地。
［２２］前記培地が、１．０μＭ～５０μＭ（好ましくは、２．０μＭ～３０μＭ、より好ましくは、５μＭ～２０μＭ）の濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ～２０μＭ（好ましくは、２．０μＭ～１０μＭ、より好ましくは、２．５μＭ～５μＭ）の濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、上記［２１］に記載の培地。
［２３］１ｎｇ／ｍｌ～５００（好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０～２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＴｇｆαを含む、上記［２２］に記載の培地。
［２４］Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、上記［１８］～［２３］のいずれか一つに記載の培地。
［２５］前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ－３阻害剤（好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはＳＢ４１５２８６、より好ましくはＣＨＩＲ９９０２１）である、上記［１８］～［２４］のいずれか一つに記載の培地。
［２６］前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、前記［１８］～［２５］のいずれかに記載の培地。
［２７］前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、前記［１８］～［２３］のいずれか一つに記載の培地。
本発明により、ネフロン前駆細胞を、未分化状態に維持したまま培養して増やすことができ、そのようにして増やしたネフロン前駆細胞は、ネフロンへの分化能を有する。すなわち、本発明により、ネフロン前駆細胞の増幅培養が可能となった。
以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明する。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
本発明の一つの態様は、ネフロン前駆細胞を、（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、（ｉｉ）Ｆｇｆ、（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤を含む培地で培養して増やす方法である。
本発明の別の態様は、ネフロン前駆細胞を、さらに（ｖｉｉ）Ｔｇｆαを含む培地で培養して増やす方法である。
本発明の他の態様は、ネフロン前駆細胞を未分化状態で増幅培養することができる培地である。
本発明の他の態様は、上記の方法で培養されたネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞である。ここでネフロン形成能とは、分化して、発達した糸球体や尿細管を有する３次元のネフロン構造を形成できることを意味する。
本発明の他の態様は、本発明の方法で増幅培養されたネフロン前駆細胞を用いて糸球体および尿細管を有する三次元腎臓構造（ネフロン）を作成する方法である。
本発明の別の態様は、ネフロン前駆細胞を、さらに（ｖｉｉ）Ｔｇｆαを含む培地で培養して増やす方法である。
本発明の他の態様は、ネフロン前駆細胞を未分化状態で増幅培養することができる培地である。
本発明の他の態様は、上記の方法で培養されたネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞である。ここでネフロン形成能とは、分化して、発達した糸球体や尿細管を有する３次元のネフロン構造を形成できることを意味する。
本発明の他の態様は、本発明の方法で増幅培養されたネフロン前駆細胞を用いて糸球体および尿細管を有する三次元腎臓構造（ネフロン）を作成する方法である。
本発明の培養方法で用いる培地は、一般に用いられている培地を基礎培地として用いることができ、本発明の目的を達成できる限り特に制限がなく、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧｊＢ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、改良ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅｓ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ダルベッコ培地、改良ダルベッコ培地、およびこれらの混合培地等をあげることができる。例えば、好ましくは、ＤＭＥＭにＦ１２を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いることができるが、これに制限されない。
本発明の培養方法で用いられる培地は、血清含有培地、無血清培地であり得るが、異種成分の排除による細胞移植の安全性の確保という観点からは、無血清培地が好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）または、血清代替物が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。かかる無血清培地としては、例えば、市販のＫＳＲを適量（例えば、１－２０％）添加した無血清培地、インスリンおよびトランスフェリンを添加した無血清培地、細胞由来の因子を添加した培地等をあげることができるが、これらに限定されない。
本発明のネフロン前駆細胞の増幅培養方法は、後に詳細に記載するように、本発明に従って、上記の培地に各成分や因子を添加した培地を用いて行うことができる。培地に任意に添加する成分や因子としては、これに限定されないが、例えば、Ｂ２７、Ｎ２、Insulin-transferrin-serenium、β-メルカプトエタノール、アスコルビン酸、Non-essential amino acidなどをあげることができる。
以下、本発明において用いられる各成分または因子である化合物を説明する。
（ａ）Ｗｎｔアゴニスト
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔアゴニスト活性を有する限り特に制限されない。Ｗｎｔアゴニストは、細胞中でＴＣＦ／ＬＥＦ介在性の転写を活性化する薬剤として定義される。従ってＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリータンパク質のありとあらゆるものを含むＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーに結合し、活性化する真のＷｎｔアゴニスト、細胞内β－カテニン分解の阻害剤およびＴＣＦ／ＬＥＦの活性化物質から選択される。本発明でいう、Ｗｎｔアゴニストは、この分子の非存在下でのＷｎｔ活性のレベルと比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％、細胞においてＷｎｔ活性を刺激するものを言う。当業者にとって公知のように、Ｗｎｔ活性は、例えばｐＴＯＰＦＬＡＳＨおよびｐＦＯＰＦＬＡＳＨ Ｔｃｆルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって、Ｗｎｔの転写活性を測定することにより調べることができる（Korinekら, Science 275:1784-1787, 1997）。
（ａ）Ｗｎｔアゴニスト
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔアゴニスト活性を有する限り特に制限されない。Ｗｎｔアゴニストは、細胞中でＴＣＦ／ＬＥＦ介在性の転写を活性化する薬剤として定義される。従ってＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリータンパク質のありとあらゆるものを含むＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーに結合し、活性化する真のＷｎｔアゴニスト、細胞内β－カテニン分解の阻害剤およびＴＣＦ／ＬＥＦの活性化物質から選択される。本発明でいう、Ｗｎｔアゴニストは、この分子の非存在下でのＷｎｔ活性のレベルと比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％、細胞においてＷｎｔ活性を刺激するものを言う。当業者にとって公知のように、Ｗｎｔ活性は、例えばｐＴＯＰＦＬＡＳＨおよびｐＦＯＰＦＬＡＳＨ Ｔｃｆルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって、Ｗｎｔの転写活性を測定することにより調べることができる（Korinekら, Science 275:1784-1787, 1997）。
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔ－１／Ｉｎｔ－１；Ｗｎｔ－２／Ｉｒｐ（Ｉｎｔ－１関連タンパク質）；Ｗｎｔ－２ｂ／１３、Ｗｎｔ－３／Ｉｎｔ－４；Ｗｎｔ－３ａ；Ｗｎｔ－４；Ｗｎｔ－５ａ；Ｗｎｔ－５ｂ；Ｗｎｔ－６；Ｗｎｔ－７ａ；Ｗｎｔ－７ｂ、Ｗｎｔ－８ａ／８ｄ；Ｗｎｔ－８ｂ；Ｗｎｔ－９ａ／１４；Ｗｎｔ－９ｂ／１４ｂ／１５；Ｗｎｔ－１０ａ；Ｗｎｔ－１０ｂ／１２；Ｗｎｔ－１１およびＷｎｔ－１６を含む分泌糖タンパク質を含む。さらに、Ｗｎｔアゴニストは、分泌タンパク質のＲ－スポンジンファミリーおよび、高親和性でＦｒｉｚｚｌｅｄ－４受容体に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化を誘導するという点でＷｎｔタンパク質のように機能する分泌性制御タンパク質であるノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）を含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路の小分子アゴニスト、アミノピリミジン誘導体もまたＷｎｔアゴニストとして明確に含まれる。
上記定義に含まれるＷｎｔアゴニストはまた、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＧＳＫ－３阻害剤、Ｄｋｋ１アンタゴニスト等も含む。ＧＳＫ－３阻害剤とは、ＧＳＫ－αまたはβ阻害剤を含み、ＧＳＫ－３αまたはβ蛋白質のキナーゼ活性、例えばβカテニンに対するリン酸化能、を阻害する物質として定義され、多くの物質が知られている。その具体例としては、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、リチウムやバルプロ酸、ベンズアゼピノン（ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｏｎｅ）ファミリーのケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ；９－ブロモ－７，１２－ジヒドロインドロ［３，２－ｄ］［１］ベンズアセピン－６（５Ｈ）－オン）やアルスターパウロン（Ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ；９－ニトロ－７，１２－ジヒドロインドロ［３，２－ｄ］［１］ベンズアセピン－６（５Ｈ）－オン）、インジルビン誘導体である５－クロロ－インジルビン、インジルビン－３’－モノオキシムやＢＩＯ（別名、ＧＳＫ－３βインヒビターＩＸ；６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）やＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、チアジアゾリジノン（ＴＤＺＤ：ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）類似体であるＴＤＺＤ－８（別名、ＧＳＫ－３βインヒビターＩ；４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン）やＯＴＤＺＴ（別名、ＧＳＫ－３βインヒビターＩＩＩ；２，４－ジベンジル－５－オキソチアジアゾリジン－３－チオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ－３βインヒビターＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３－ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ－３βペプチドインヒビター；Ｍｙｒ－Ｎ－ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ2）などが挙げられる。
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストはさらに、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含み、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として公知のまたは販売されている物質を用いることができる。
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストは、上記の定義に含まれる限り、天然物または合成物のいずれも含まれ、また、タンパク質、高分子、低分子のいずれであってもよい。本発明において用いることができるＷｎｔアゴニストの例としては、これに限定されないが、例えば、好ましくは、ＧＳＫ－３阻害剤、より好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはＳＢ４１５２８６をあげることができ、特に好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１をあげることができる。各Ｗｎｔアゴニストの使用濃度は使用目的に合わせて適宜選択できるが、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合に得られる効果と同様の効果を発揮できる濃度を選択することができる。これらのＷｎｔアゴニストは市販されている。
例えばＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合、培地中の濃度は、例えば、０．１～５．０μＭ、好ましくは、０．５～２．５μＭ、より好ましくは、０．７５～１．５μＭをあげることができる。
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストは、上記の定義に含まれる限り、天然物または合成物のいずれも含まれ、また、タンパク質、高分子、低分子のいずれであってもよい。本発明において用いることができるＷｎｔアゴニストの例としては、これに限定されないが、例えば、好ましくは、ＧＳＫ－３阻害剤、より好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはＳＢ４１５２８６をあげることができ、特に好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１をあげることができる。各Ｗｎｔアゴニストの使用濃度は使用目的に合わせて適宜選択できるが、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合に得られる効果と同様の効果を発揮できる濃度を選択することができる。これらのＷｎｔアゴニストは市販されている。
例えばＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合、培地中の濃度は、例えば、０．１～５．０μＭ、好ましくは、０．５～２．５μＭ、より好ましくは、０．７５～１．５μＭをあげることができる。
（ｂ）Ｆｇｆ
本発明で用いることができるＦｇｆは、Ｆｇｆファミリーからなる群から選ぶことができ、好ましくはＦｇｆ２、Ｆｇｆ９およびＦｇｆ２０から選ばれ、より好ましくはＦｇｆ９である。培地中のＦｇｆの濃度は、例えば、１０～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、３０～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０～２００ｎｇ／ｍｌである。
またこれらのＦｇｆも市販されており、特に制限なく、本発明に用いることができる。
本発明で用いることができるＦｇｆは、Ｆｇｆファミリーからなる群から選ぶことができ、好ましくはＦｇｆ２、Ｆｇｆ９およびＦｇｆ２０から選ばれ、より好ましくはＦｇｆ９である。培地中のＦｇｆの濃度は、例えば、１０～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、３０～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０～２００ｎｇ／ｍｌである。
またこれらのＦｇｆも市販されており、特に制限なく、本発明に用いることができる。
（ｃ）白血球阻害剤（ＬＩＦ）
本発明で用いるＬＩＦの培地中の濃度は、例えば、１．０ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、１．０ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌの濃度をあげることができる。
ＬＩＦの濃度が高いと（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ以上）、ネフロン前駆細胞において、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）およびｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（Ｊｎｋｓ）の活性化と分化を引き起こす。このような活性化は低濃度では軽度であり、低濃度のＬＩＦは、前駆細胞の増幅に重要なＳｉｘ２とＹａｐの核局在化を維持することができる。また、Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）との併用処置は、ＬＩＦによって誘導されるＪＮＫ活性化を減衰させ、それによってネフロン前駆細胞の増幅を可能にする。
また、ＬＩＦは市販されているものを制限なく用いることができる。
本発明で用いるＬＩＦの培地中の濃度は、例えば、１．０ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、１．０ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌの濃度をあげることができる。
ＬＩＦの濃度が高いと（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ以上）、ネフロン前駆細胞において、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）およびｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（Ｊｎｋｓ）の活性化と分化を引き起こす。このような活性化は低濃度では軽度であり、低濃度のＬＩＦは、前駆細胞の増幅に重要なＳｉｘ２とＹａｐの核局在化を維持することができる。また、Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）との併用処置は、ＬＩＦによって誘導されるＪＮＫ活性化を減衰させ、それによってネフロン前駆細胞の増幅を可能にする。
また、ＬＩＦは市販されているものを制限なく用いることができる。
（ｄ）Ｂｍｐ
本発明で用いられるＢｍｐファミリー化合物（以下、単に「Ｂｍｐ」と言う場合がある）は、Ｂｍｐ１、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ６、Ｂｍｐ７、Ｂｍｐ８a、Ｂｍｐ８ｂおよびＢｍｐ１０、ＧＤＦ１１等のＢｍｐファミリーからなる群より選ばれ、好ましくは、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４またはＢｍｐ７から選ばれ、さらに好ましくはＢｍｐ７である。これらのＢｍｐは市販されている
培地中のＢｍｐの濃度は、Ｂｍｐの種類に応じて適宜選択できるが、例えば、Ｂｍｐ７を用いた場合は、例えば、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌの濃度をあげることができる。これらの濃度は、引用している従来技術（非特許文献１～４）で用いられている濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）とは大きく異なるものである。
また、用いるＢｍｐは、いずれの起源のＢｍｐを用いることができるが、好ましくはヒトＢｍｐである。他のＢｍｐ化合物を用いる場合は、Ｂｍｐ７を用いた場合に得られる効果を同様の効果を発揮できる濃度を適宜選択することができる。
本発明で用いられるＢｍｐファミリー化合物（以下、単に「Ｂｍｐ」と言う場合がある）は、Ｂｍｐ１、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ６、Ｂｍｐ７、Ｂｍｐ８a、Ｂｍｐ８ｂおよびＢｍｐ１０、ＧＤＦ１１等のＢｍｐファミリーからなる群より選ばれ、好ましくは、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４またはＢｍｐ７から選ばれ、さらに好ましくはＢｍｐ７である。これらのＢｍｐは市販されている
培地中のＢｍｐの濃度は、Ｂｍｐの種類に応じて適宜選択できるが、例えば、Ｂｍｐ７を用いた場合は、例えば、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌの濃度をあげることができる。これらの濃度は、引用している従来技術（非特許文献１～４）で用いられている濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）とは大きく異なるものである。
また、用いるＢｍｐは、いずれの起源のＢｍｐを用いることができるが、好ましくはヒトＢｍｐである。他のＢｍｐ化合物を用いる場合は、Ｂｍｐ７を用いた場合に得られる効果を同様の効果を発揮できる濃度を適宜選択することができる。
（ｅ）Ｒｏｃｋ阻害剤
Ｒｏｃｋ（Ｒｈｏキナーゼ）は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒｈｏの標的タンパク質として同定されたセリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素である。その阻害剤であるＲｏｃｋ阻害剤は、市販されており、それらのものが本発明において制限なく用いることができる。本発明で用いるＲｏｃｋ阻害剤としては、これに制限されないが、例えば、Ｙ２７６３２、ＨＡ１０７７をあげることができ、好ましくは、Ｙ２７３６２である。本発明で用いるＲｏｃｋ阻害剤の濃度は、例えば、１～５０μＭ、好ましくは２～３０μＭ、より好ましくは５～２０μＭをあげることができる。
Ｒｏｃｋ（Ｒｈｏキナーゼ）は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒｈｏの標的タンパク質として同定されたセリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素である。その阻害剤であるＲｏｃｋ阻害剤は、市販されており、それらのものが本発明において制限なく用いることができる。本発明で用いるＲｏｃｋ阻害剤としては、これに制限されないが、例えば、Ｙ２７６３２、ＨＡ１０７７をあげることができ、好ましくは、Ｙ２７３６２である。本発明で用いるＲｏｃｋ阻害剤の濃度は、例えば、１～５０μＭ、好ましくは２～３０μＭ、より好ましくは５～２０μＭをあげることができる。
（ｆ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
本発明で用いられるＮｏｔｃｈ阻害剤は、Ｎｏｔｃｈシグナルを阻害する化合物であり、同様の活性を示す限りγ―セレクターゼも本発明のＮｏｔｃｈシグナル阻害剤に含まれる。好ましいＮｏｔｃｈ阻害剤としては、ＤＡＰＴをあげることができ、これらは市販されている。
培地中のＮｏｔｃｈ阻害剤の濃度は、用いるＮｏｔｃｈ阻害剤の種類に応じて適宜選択できるが、例えば、ＤＡＰＴを用いた場合は、例えば、１．０～２０μＭ、好ましくは、１．０～１０μＭ、よりに好ましくは、１．０～５μＭ、さらに好ましくは２．５～５μＭの濃度をあげることができる。
本発明で用いられるＮｏｔｃｈ阻害剤は、Ｎｏｔｃｈシグナルを阻害する化合物であり、同様の活性を示す限りγ―セレクターゼも本発明のＮｏｔｃｈシグナル阻害剤に含まれる。好ましいＮｏｔｃｈ阻害剤としては、ＤＡＰＴをあげることができ、これらは市販されている。
培地中のＮｏｔｃｈ阻害剤の濃度は、用いるＮｏｔｃｈ阻害剤の種類に応じて適宜選択できるが、例えば、ＤＡＰＴを用いた場合は、例えば、１．０～２０μＭ、好ましくは、１．０～１０μＭ、よりに好ましくは、１．０～５μＭ、さらに好ましくは２．５～５μＭの濃度をあげることができる。
本発明の培養方法においては、さらに、培地にＴｇｆαをさらに添加することもできる。Ｔｇｆαは、未分化細胞、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の培養において一般に用いられている因子であり、ネフロン前駆細胞の培養においても通常培地中に添加されている因子である。
培地中のＴｇｆαの濃度は、例えば、１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０～２００ｎｇ／ｍｌをあげることができる。
またこれらのＴｇｆαも市販されており、特に制限なく、本発明に用いることができる。
培地中のＴｇｆαの濃度は、例えば、１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５～３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０～２００ｎｇ／ｍｌをあげることができる。
またこれらのＴｇｆαも市販されており、特に制限なく、本発明に用いることができる。
本発明の方法においては、細胞を、マトリックス被覆したプレート上で培養することもでき、より良好な培養結果を得ることが期待される。被覆マトリックスとしては、これに限定されないが、ｉＭａｔｒｉｘ、フィブロネクチン、ラミニン、およびコラーゲンをあげることができる、これらのマトリックスにより被覆されたプレートは市販されている。 また、本発明の方法においては、細胞をスフェロイド状でＵ底のプレート（例えば、複数のウェルをもつ、ｌｏｗ-ｃｅｌｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ－ｐｌａｔｅ）で培養することもでき、より良好な増幅培養が達成できる。細胞をスフェロイド状を保持して培養することも本発明の方法の一つの態様としてあげることができる。
ネフロン前駆細胞
本発明の培養方法で用いるネフロン前駆細胞は、生体から採取・回収したネフロン前駆細胞、多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）から分化誘導したネフロン前駆細胞のいずれも制限なく用いることができる。
ヒトを除く哺乳動物のネフロン前駆細胞の生体からの採取・回収は、胎児の腎臓を摘出し、後腎間葉を単離することにより行うことができる。例えばマウスを例にした場合は、これに限定されないが、ネフロン前駆細胞が発生する胎生１０－１１日に、マウスの胎児の腎臓を摘出し、後腎間葉を単離することにより、採取・回収することができる。マウス前駆細胞マーカーがＧＦＰで標識されたマウスを用いることにより、胎生１２日～出生後１日目のマウスのネフロン前駆細胞をＦＡＣＳにより単離・回収することができる。
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞からのネフロン前駆細胞は、例えば、本発明者の公知の報告（非特許文献６；特許文献１）に従って作成できる。
本発明の培養方法で用いるネフロン前駆細胞は、生体から採取・回収したネフロン前駆細胞、多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）から分化誘導したネフロン前駆細胞のいずれも制限なく用いることができる。
ヒトを除く哺乳動物のネフロン前駆細胞の生体からの採取・回収は、胎児の腎臓を摘出し、後腎間葉を単離することにより行うことができる。例えばマウスを例にした場合は、これに限定されないが、ネフロン前駆細胞が発生する胎生１０－１１日に、マウスの胎児の腎臓を摘出し、後腎間葉を単離することにより、採取・回収することができる。マウス前駆細胞マーカーがＧＦＰで標識されたマウスを用いることにより、胎生１２日～出生後１日目のマウスのネフロン前駆細胞をＦＡＣＳにより単離・回収することができる。
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞からのネフロン前駆細胞は、例えば、本発明者の公知の報告（非特許文献６；特許文献１）に従って作成できる。
本発明の増幅培養方法によりネフロン前駆細胞を培養すると、前駆細胞は継続して増殖でき、少なくとも５日間、好ましくは７日間、より好ましくは１０日以上、さらに好ましくは１２日以上、よりさらに好ましくは１５日以上、最も好ましくは１９日以上培養が可能である。
本発明の増幅培養方法によりネフロン前駆細胞を培養すると、マウスネフロン前駆細胞を用いた場合は、細胞数は、培養開始時と比較して、少なくとも１０倍以上、通常は３０倍以上、好ましくは５０倍以上、より好ましくは７０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上、よりさらに好ましくは１０００倍以上の増幅が可能である。ヒトのネフロン前駆細胞を用いた場合は、細胞数は、培養開始時と比較して、少なくとも４倍以上、好ましくは１０倍以上の増幅が可能である。
本発明の増幅培養方法により培養したネフロン前駆細胞は、未分化状態を維持しており、また、ネフロンへの分化能を持っている。
本発明の増幅培養方法によりネフロン前駆細胞を培養すると、マウスネフロン前駆細胞を用いた場合は、細胞数は、培養開始時と比較して、少なくとも１０倍以上、通常は３０倍以上、好ましくは５０倍以上、より好ましくは７０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上、よりさらに好ましくは１０００倍以上の増幅が可能である。ヒトのネフロン前駆細胞を用いた場合は、細胞数は、培養開始時と比較して、少なくとも４倍以上、好ましくは１０倍以上の増幅が可能である。
本発明の増幅培養方法により培養したネフロン前駆細胞は、未分化状態を維持しており、また、ネフロンへの分化能を持っている。
本発明の増幅培養方法においては、培養開始時および／またはその培養期間において、細胞塊（細胞凝集体）を単一の細胞単位に分離することを必要としない。
ただし、純化した細胞（単一の細胞単位）から増幅した多くのネフロン前駆細胞を調製することが好ましい場合は、ネフロン前駆細胞を純化した後、本発明の増幅培養方法を用いて、効率良くネフロン前駆細胞を調製することができる。これに限定されないが、例えば、ヒトｉＰＳ細胞から誘導した組織からネフロン前駆細胞を単離し、細胞を純化した後、本発明の増幅培養方法を用いてネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞を増幅培養することができる。
ただし、純化した細胞（単一の細胞単位）から増幅した多くのネフロン前駆細胞を調製することが好ましい場合は、ネフロン前駆細胞を純化した後、本発明の増幅培養方法を用いて、効率良くネフロン前駆細胞を調製することができる。これに限定されないが、例えば、ヒトｉＰＳ細胞から誘導した組織からネフロン前駆細胞を単離し、細胞を純化した後、本発明の増幅培養方法を用いてネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞を増幅培養することができる。
本発明の増幅培養方法においては、好ましくは、培養の途中、例えば、約７日目において、細胞塊（細胞凝集体）を複数の小さな細胞塊に分離し分割した後、引き続き培養を継続することにより、効率良く前駆細胞を増幅させることができる。
また、本発明の増幅培養方法により培養したネフロン前駆細胞は、凍結保存することも可能である。例えば、既成の細胞凍結保存溶液を使用して凍結保存することが可能であり、そのようにして保存したネフロン前駆細胞を用いて三次元のネフロン構造を再構成すること（例えば、糸球体と尿細管の形成）が可能である。
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（Ａ）材料と方法
（１－１）動物
バクテリア人工染色体技術によって作成されたトランスジェニックマウス、Ｓｉｘ２ＧＦＰＣｒｅは、アンドリュー・マクマホン（南カリフォルニア大学）により提供された。すべての動物操作は、熊本大学の実験動物委員会のガイドライン（＃のA27-018）にしたがって行った。
（１－２）ｉＰＳ細胞
ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）は、理研バイオリソースセンターから入手した。
（１－１）動物
バクテリア人工染色体技術によって作成されたトランスジェニックマウス、Ｓｉｘ２ＧＦＰＣｒｅは、アンドリュー・マクマホン（南カリフォルニア大学）により提供された。すべての動物操作は、熊本大学の実験動物委員会のガイドライン（＃のA27-018）にしたがって行った。
（１－２）ｉＰＳ細胞
ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）は、理研バイオリソースセンターから入手した。
（２）マウス胚腎臓からのネフロン前駆細胞の単離および増幅
Ｓｉｘ２プロモーター下でＧＦＰを発現する系統であるＳｉｘ２－ＧＦＰマウスを用いた。胎生１１．５日目（Ｅ１１．５）のＳｉｘ２－ＧＦＰマウスの胎児の腎臓を摘出し、後腎間葉（ＭＭ）を、コラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて尿管芽から単離し、次いで、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＣａＣｌ2、およびＮａＨＣＯ3を含むＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）で洗浄した。単離したＭＭは、トリプシン処理（０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ）し、緩衝液で洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＨＢＳＳ、１％ＢＳＡ、０．０３５％ ＮaＨＣＯ3、および１μｇ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム）中に懸濁した。Ｅ１５．５ Ｓｉｘ２－ＧＦＰ陽性細胞の単離は、腎臓を３７℃で１０分間、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡでンキュベートし、そして細胞を、１０％ＦＣＳを含む冷却ＤＭＥＭ中でピペッティングにより分離した。新生児腎臓を、コラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ディスパーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）の混合物を用いて、３７℃で１０分間、処理し、次いで、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡで、３７℃にて５分間処理して、単一の細胞に分離した。
Ｓｉｘ２プロモーター下でＧＦＰを発現する系統であるＳｉｘ２－ＧＦＰマウスを用いた。胎生１１．５日目（Ｅ１１．５）のＳｉｘ２－ＧＦＰマウスの胎児の腎臓を摘出し、後腎間葉（ＭＭ）を、コラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて尿管芽から単離し、次いで、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＣａＣｌ2、およびＮａＨＣＯ3を含むＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）で洗浄した。単離したＭＭは、トリプシン処理（０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ）し、緩衝液で洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＨＢＳＳ、１％ＢＳＡ、０．０３５％ ＮaＨＣＯ3、および１μｇ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム）中に懸濁した。Ｅ１５．５ Ｓｉｘ２－ＧＦＰ陽性細胞の単離は、腎臓を３７℃で１０分間、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡでンキュベートし、そして細胞を、１０％ＦＣＳを含む冷却ＤＭＥＭ中でピペッティングにより分離した。新生児腎臓を、コラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ディスパーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）の混合物を用いて、３７℃で１０分間、処理し、次いで、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡで、３７℃にて５分間処理して、単一の細胞に分離した。
Ｓｉｘ２－ＧＦＰ陽性細胞は、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＳＯＲＰ（ＢＤ）によりソートし、Ｕ－底 ｌｏｗ－ｃｅｌｌｂｉｎｄｉｎｇ ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ）に、ウェルあたり３０００－１０，０００細胞を播種した。４８時間後、細胞凝集体をｉＭａｔｒｉｘ被覆プレート（０．５μｇ／ｃｍ2）に移し、さらに５日間培養した（ｄａｙ ７）。基礎培地は、トリヨードサイロニン、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、１０ ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および５０ ｎｇ／ｍｌのＦｇｆ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）／Ｆｇｆ９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した無血清 ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた（「ＦＴ」と略す）。最適条件（「ＣＤＢＬＹ」と略す）は、さらに、１μＭのＣＨＩＲ９９０２１（和光）、２．５μＭのＤＡＰＴ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｏｐｏｒｅ）、５ ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５ ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ）、および１０μＭのＹ２７６３２（和光）を添加した。
Ｄａｙ ８にて、培養した細胞を、解離溶液（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）を使用して小さな塊に分離し、３プレートに分けた。培地は、次の継代まで、３～４日間、２４時間毎に交換した。培養細胞の総数は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動セルカウンター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で計数した。ネフロン前駆細胞の数は、ＦＡＣＳ分析によって同定したＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性細胞の割合を用いて算出した。
（３）マウスＥＳ細胞から作成したネフロン前駆細胞の単離
ＯＳＲ１－ＧＦＰマウスＥＳ細胞を、ネフロン前駆細胞の誘導に使用した。ＥＳ細胞は、フィーダーを除去するために２日間ゼラチンコートプレート上で継代した。次いで、細胞を、メーカー記載の５段階のプロトコルに従い、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により回収し、凝集させ、分化させた。誘導したスフェロイドは、ｄａｙ ８．５で回収し、０．２５％トリプシンＥＤＴＡを用いて解離させた。細胞は、正常マウス血清によってブロックし、そしてＦＡＣＳ緩衝液中で、抗ｉｎｔｅｇｒｉｎα８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＰＤＧＦＲα（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体で染色した。ＯＳＲ１－ＧＦＰ＋／ｉｎｔｅｇｒｉｎα８＋／Ｐｄｇｆｒα－ フラクションをＦＡＣＳＡｒｉａ ＳＯＲＰ（ＢＤ）でソートし、ＣＤＢＬＹ添加培地で培養した。
ＯＳＲ１－ＧＦＰマウスＥＳ細胞を、ネフロン前駆細胞の誘導に使用した。ＥＳ細胞は、フィーダーを除去するために２日間ゼラチンコートプレート上で継代した。次いで、細胞を、メーカー記載の５段階のプロトコルに従い、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により回収し、凝集させ、分化させた。誘導したスフェロイドは、ｄａｙ ８．５で回収し、０．２５％トリプシンＥＤＴＡを用いて解離させた。細胞は、正常マウス血清によってブロックし、そしてＦＡＣＳ緩衝液中で、抗ｉｎｔｅｇｒｉｎα８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＰＤＧＦＲα（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体で染色した。ＯＳＲ１－ＧＦＰ＋／ｉｎｔｅｇｒｉｎα８＋／Ｐｄｇｆｒα－ フラクションをＦＡＣＳＡｒｉａ ＳＯＲＰ（ＢＤ）でソートし、ＣＤＢＬＹ添加培地で培養した。
（４）培養マウス前駆細胞から作成したネフロン構造体の免疫染色
培養細胞は、ｌｏｗ－ｃｅｌｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅｓに播種し、４８時間かけて凝集体を形成させた。そして、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に浮遊させたＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で、胚の脊髄と７日間共培養した。培地は３日ごとに交換した。培養した移植片を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。６ミクロンの切片にスライスし、脱パラフィンし、次いで、１２１℃で５分間、クエン酸（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）により抗原回復を行った。切片は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした後、室温で１時間二次抗体とインキュベートした。共焦点画像は、ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によって撮像した。用いた一次抗体は以下の通りである：抗Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（ＢＤ）、抗Ｃａｄｈｅｒｉｎ６（グレゴリー・ドレスラー博士、Department of Pathology, University of Michigan, AnnArbor, MI 48109, USA、から供与）、抗ネフリン（Ｐｒｏｇｅｎ）、および抗ＷＴ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。用いた二次次抗体は以下の通りである：抗ウサギＡｌｅｘａ４８８、抗モルモットＡｌｅｘａ４６８、および抗マウスＡｌｅｘａ５９４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
培養細胞は、ｌｏｗ－ｃｅｌｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅｓに播種し、４８時間かけて凝集体を形成させた。そして、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に浮遊させたＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で、胚の脊髄と７日間共培養した。培地は３日ごとに交換した。培養した移植片を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。６ミクロンの切片にスライスし、脱パラフィンし、次いで、１２１℃で５分間、クエン酸（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）により抗原回復を行った。切片は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした後、室温で１時間二次抗体とインキュベートした。共焦点画像は、ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によって撮像した。用いた一次抗体は以下の通りである：抗Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（ＢＤ）、抗Ｃａｄｈｅｒｉｎ６（グレゴリー・ドレスラー博士、Department of Pathology, University of Michigan, AnnArbor, MI 48109, USA、から供与）、抗ネフリン（Ｐｒｏｇｅｎ）、および抗ＷＴ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。用いた二次次抗体は以下の通りである：抗ウサギＡｌｅｘａ４８８、抗モルモットＡｌｅｘａ４６８、および抗マウスＡｌｅｘａ５９４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
（５）定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、そしてｃＤＮＡを、製造業者の指示にしたがって、ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。ＰＣＲ反応は、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ（東洋紡）およびＤｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（タカラバイオ）を用いて行った。各マーカー遺伝子（β－Ａｃｔｉｎ，Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｌｅｆ１，Ｏｓｒ１，Ｐａｘ２，Ｓａｌｌ１，Ｓｉｘ２，およびＷｎｔ１）に対するｑＰＣＲ用のプライマー配列はタカラバイオから購入した。インキュベーション条件は、４５サイクルとした（９５℃で１５秒、６０℃で４５秒）。全てのサンプルはアクチン発現で正規化した。
全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、そしてｃＤＮＡを、製造業者の指示にしたがって、ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。ＰＣＲ反応は、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ（東洋紡）およびＤｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（タカラバイオ）を用いて行った。各マーカー遺伝子（β－Ａｃｔｉｎ，Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｌｅｆ１，Ｏｓｒ１，Ｐａｘ２，Ｓａｌｌ１，Ｓｉｘ２，およびＷｎｔ１）に対するｑＰＣＲ用のプライマー配列はタカラバイオから購入した。インキュベーション条件は、４５サイクルとした（９５℃で１５秒、６０℃で４５秒）。全てのサンプルはアクチン発現で正規化した。
（６）統計分析
データは、スチューデントのt検定を用いて解析し、統計的有意性を評価した。全ての実験は、独立して、少なくとも３回実施し、そして代表的なデータを示した。結果は、平均±標準偏差として示した。
データは、スチューデントのt検定を用いて解析し、統計的有意性を評価した。全ての実験は、独立して、少なくとも３回実施し、そして代表的なデータを示した。結果は、平均±標準偏差として示した。
Ｂ．実施例
実施例１：後腎間葉からネフロン前駆細胞の部分的増幅
培養時のマウスのネフロン前駆細胞の割合を正確に測定するために、Ｅ１１．５でＳｉｘ２－ＧＦＰマウスの腎臓から全ＭＭを単離し、ラットＭＭの培養に用いたようにしてＬＩＦとＹ２７６３２（合わせて「ＬＹ」と略す）の存在下で、フィブロネクチンコートしたプレート上で、個々の細胞に分散させることなく細胞塊として培養した（図１）。ＦＡＣＳ分析の結果、ＧＦＰ陽性細胞は、単離されたばかりのＭＭの２２．６％を占めていたが、７日の培養後には、割合は５．０％に低下した。ＬＩＦおよびＹ２７６３２の非存在下では、細胞のわずか０．１％がＧＦＰ陽性であった。このことは、ＬＹが、マウス前駆細胞にある種の効果を発揮しているが、ネフロン前駆細胞を維持するのに十分ではなかったことを明らかに示唆している。
７日目のＳｉｘ２とＰａｘ２の発現レベルは、新たに単離したＭＭのものと比べると低かった。発明者らは以前にＮｏｔｃｈ２の活性化が未成熟な前駆細胞の分化を引き起こしたことを報告している。そこで、発明者らは、ＬＹに加えて、Ｎｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴをテストした。また、コーティングのマトリックスとして、ラミニンのＥ８フラグメント（ｉＭａｔｒｉｘ）をフィブロネクチンと比較した結果、ｉＭａｔｒｉｘとＤＡＰＴの組み合わせが、Ｓｉｘ２の、そしてより顕著にはＰａｘ２のレベルを維持するのに有効であることが判った。結果を図２に示す。
実施例１：後腎間葉からネフロン前駆細胞の部分的増幅
培養時のマウスのネフロン前駆細胞の割合を正確に測定するために、Ｅ１１．５でＳｉｘ２－ＧＦＰマウスの腎臓から全ＭＭを単離し、ラットＭＭの培養に用いたようにしてＬＩＦとＹ２７６３２（合わせて「ＬＹ」と略す）の存在下で、フィブロネクチンコートしたプレート上で、個々の細胞に分散させることなく細胞塊として培養した（図１）。ＦＡＣＳ分析の結果、ＧＦＰ陽性細胞は、単離されたばかりのＭＭの２２．６％を占めていたが、７日の培養後には、割合は５．０％に低下した。ＬＩＦおよびＹ２７６３２の非存在下では、細胞のわずか０．１％がＧＦＰ陽性であった。このことは、ＬＹが、マウス前駆細胞にある種の効果を発揮しているが、ネフロン前駆細胞を維持するのに十分ではなかったことを明らかに示唆している。
７日目のＳｉｘ２とＰａｘ２の発現レベルは、新たに単離したＭＭのものと比べると低かった。発明者らは以前にＮｏｔｃｈ２の活性化が未成熟な前駆細胞の分化を引き起こしたことを報告している。そこで、発明者らは、ＬＹに加えて、Ｎｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴをテストした。また、コーティングのマトリックスとして、ラミニンのＥ８フラグメント（ｉＭａｔｒｉｘ）をフィブロネクチンと比較した結果、ｉＭａｔｒｉｘとＤＡＰＴの組み合わせが、Ｓｉｘ２の、そしてより顕著にはＰａｘ２のレベルを維持するのに有効であることが判った。結果を図２に示す。
平行して、Ｗｎｔシグナル伝達は、ネフロン前駆細胞の維持および分化において重要な役割を果たしているので、ＷｎｔアゴニストＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）を試験した。ＬＩＦ単独（１－１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で限られた数のＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性細胞が維持されたが、ＣＨＩＲは培養７日目でＧＦＰ陽性細胞を増加させ、ＬＩＦおよびＣＨＩＲの組み合わせは、ＧＦＰ陽性細胞の大量の増幅を示した。そこで、ｉＭａｔｒｉｘ被覆プレート上で、ＬＩＦ、Ｙ２７６３２、ＣＨＩＲ、およびＤＡＰＴ（「ＣＤＬＹ」と略す）の組み合わせを試験した結果、培養７日後で２６．３％が陽性となった。そこでさらに、ネフロン前駆細胞の重要な調節因子であるＢＭＰ７を追加した。その結果、顕著な細胞増殖が観察され、ＧＦＰ陽性細胞は４０．６％に増加した。結果を図３に示す。Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｗｔ１およびＯｓｒ１を含むネフロン前駆細胞マーカーの発現レベルを確認したところ、この条件（ＣＤＬＹ＋ＢＭＰ７：「ＣＤＢＬＹ」と略す）では、他の条件よりも高く、新たに単離したＭＭのものとほぼ同等であった。それゆえ、混合細胞集団を含む全ＭＭから培養を開始しているが、この条件がネフロン前駆細胞の増幅に適していると判った。
実施例２：マウスの胚および新生児の腎臓から精製したネフロン前駆細胞のインビトロでの増幅
上記の培養条件（ＣＤＢＬＹ）を、精製したＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性前駆細胞に適用した。細胞数の制限のために、最初は、Ｅ１１．５の代わりにＥ１５．５および新生児（Ｐ０）腎臓を用いて、ソートした結果、ＧＦＰ陽性細胞は、それぞれ、全細胞の２１．１％と８．１％であった。ソートした細胞はその後、スフェロイドを形成するために二日間培養し凝集させ、ｉＭａｔｒｉｘ被覆プレート上に播種し、上記した条件で５日間以上培養した。図４に示されるように、総細胞数は増加し（Ｅ１５．５で２．４倍、Ｐ０で１．７倍）、ＧＦＰ陽性の割合が非常に高いままであった（Ｅ１５．５で９４．３パーセント、Ｐ０で９０．９パーセント）。７日目でのネフロン前駆細胞マーカーの発現レベルを確認したところ、新たに単離したネフロン前駆細胞のものとほぼ同等であった。これらの培養細胞を、Ｗｎｔを発現する間葉上皮転換の強力な誘導因子である脊髄と組み合わせると、管形成が３日以内に観察され、誘導してから５日後に回収したときは多数の糸球体や尿細管が確認された。結果を図５に示す。糸球体は、丸形で、足細胞特異的マーカーである、Ｗｔ１とネフリンが陽性であった。誘導された尿細管は、カドヘリン６陽性近位およびカドヘリン１陽性遠位ドメインに領域化した。したがって、この培養条件は、よく発達した糸球体や尿細管で示される三次元ネフロン構造を形成する能力を維持しながら、精製したネフロン前駆細胞の増殖を可能にした。新生児からの前駆細胞が７日間維持されたことは注目すべきことである。なぜなら、マウスのネフロン前駆細胞は、出生後２～３日以内には増殖するのをやめ、最終分化をする。したがって、この結果は、本発明の培養条件は、生体内でそれらの生理学的制限時間を超えて前駆細胞の増殖を維持していることを示している。
上記の培養条件（ＣＤＢＬＹ）を、精製したＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性前駆細胞に適用した。細胞数の制限のために、最初は、Ｅ１１．５の代わりにＥ１５．５および新生児（Ｐ０）腎臓を用いて、ソートした結果、ＧＦＰ陽性細胞は、それぞれ、全細胞の２１．１％と８．１％であった。ソートした細胞はその後、スフェロイドを形成するために二日間培養し凝集させ、ｉＭａｔｒｉｘ被覆プレート上に播種し、上記した条件で５日間以上培養した。図４に示されるように、総細胞数は増加し（Ｅ１５．５で２．４倍、Ｐ０で１．７倍）、ＧＦＰ陽性の割合が非常に高いままであった（Ｅ１５．５で９４．３パーセント、Ｐ０で９０．９パーセント）。７日目でのネフロン前駆細胞マーカーの発現レベルを確認したところ、新たに単離したネフロン前駆細胞のものとほぼ同等であった。これらの培養細胞を、Ｗｎｔを発現する間葉上皮転換の強力な誘導因子である脊髄と組み合わせると、管形成が３日以内に観察され、誘導してから５日後に回収したときは多数の糸球体や尿細管が確認された。結果を図５に示す。糸球体は、丸形で、足細胞特異的マーカーである、Ｗｔ１とネフリンが陽性であった。誘導された尿細管は、カドヘリン６陽性近位およびカドヘリン１陽性遠位ドメインに領域化した。したがって、この培養条件は、よく発達した糸球体や尿細管で示される三次元ネフロン構造を形成する能力を維持しながら、精製したネフロン前駆細胞の増殖を可能にした。新生児からの前駆細胞が７日間維持されたことは注目すべきことである。なぜなら、マウスのネフロン前駆細胞は、出生後２～３日以内には増殖するのをやめ、最終分化をする。したがって、この結果は、本発明の培養条件は、生体内でそれらの生理学的制限時間を超えて前駆細胞の増殖を維持していることを示している。
実施例３：マウスネフロン前駆細胞の増殖に対するＬＩＦ、ＦＧＦ２／９、ＢＭＰ７、およびＷｎｔアゴニストの影響
上記の培養条件は、Ｅ１５．５またはＰ０から精製ネフロン前駆細胞の増殖を可能にするが、細胞数の増加は劇的ではなかった（約２倍、図４参照）。上記のように、最初は、Ｅ１１．５からの全ＭＭを用いて培養条件を最適化し、Ｅ１５．５やＰ０でも同様の結果が得られることを確認した。
次に、細胞数が制限されていたが、Ｅ１１．５でＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性前駆細胞を精製した。選別された細胞を、７日間、ｉＭａｔｒｉｘ被覆プレート上に凝集させ培養した結果、顕著な細胞数の増加（３０倍）および９５％以上のＧＦＰ陽性の残存が観察された（図６）。これらのデータは、後の発生段階のものと比較して、Ｅ１１．５でのＳｉｘ２陽性細胞は、より高い増殖能力を有していることを示唆している。
上記の培養条件は、Ｅ１５．５またはＰ０から精製ネフロン前駆細胞の増殖を可能にするが、細胞数の増加は劇的ではなかった（約２倍、図４参照）。上記のように、最初は、Ｅ１１．５からの全ＭＭを用いて培養条件を最適化し、Ｅ１５．５やＰ０でも同様の結果が得られることを確認した。
次に、細胞数が制限されていたが、Ｅ１１．５でＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性前駆細胞を精製した。選別された細胞を、７日間、ｉＭａｔｒｉｘ被覆プレート上に凝集させ培養した結果、顕著な細胞数の増加（３０倍）および９５％以上のＧＦＰ陽性の残存が観察された（図６）。これらのデータは、後の発生段階のものと比較して、Ｅ１１．５でのＳｉｘ２陽性細胞は、より高い増殖能力を有していることを示唆している。
上記の実施例では、全ての実験で使用培地（ＣＤＢＬＹ）はＦｇｆ２を含んでいた。これは、発明者らが最近報告したラットＭＭ培養の結果に基づいている。インビボにおいてＦｇｆ９がマウスネフロン前駆細胞の維持に必要であることが報告されているので、培養におけるＦｇｆ２およびＦｇｆ９の効果を比較した。Ｆｇｆ２およびＦｇｄｆ９の両方とも、非常に高い割合（９５％以上）でＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性細胞を維持したが、より大きな細胞数の増加は、Ｆｇｆ９に基づく条件で観察された（３０倍対６０倍）（図６）。いずれの条件においても、ネフロン前駆細胞マーカー（Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、およびＷｔ１）の発現レベルは、Ｅ１１．５で新たに単離したＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性細胞のものと同等であった（図６）。図７に示すように、脊髄と組み合わせた場合に、いずれの条件でも糸球体および尿細管が形成された。したがって、以下の実験では、Ｆｇｆ９を使用した。
かなり最適化された条件（ＣＤＢＬＹ＋Ｆｇｆ９）にて、Ｅ１１．５からのＳｉｘ２陽性ネフロン前駆細胞を用いて、その維持および増殖のための各要素の必要性を再検討した。細胞はＦｇｆの非存在下で増殖することができなかったので、Ｆｇｆシグナリングが重要であると判った（図６参照）。カノニカルＷｎｔシグナルはネフロン前駆細胞の分化に関連しているので、次に、Ｗｎｔシグナル伝達の必要性を検討した。種々の濃度のＣＨＩＲとＢｍｐ７を試験した。結果を図８に示す。その結果、Ｓｉｘ２陽性細胞は、ＣＨＩＲに関し、１μＭまでは濃度依存的に増加したことがわかった。２．５μＭのＣＨＩＲ処理は、ＧＦＰ陰性細胞は増幅したが、前駆細胞の維持は出来なかった。これらのデータは、Ｗｎｔシグナルの最適な強度が自己複製のために必要であり、過剰な信号は増殖を伴う分化を誘導することを示唆している。また、Ｂｍｐ７については、高濃度（２５ｎｇ／ｍＬ超）はＧＦＰ＋前駆細胞を減少させたが、低濃度（５ｎｇ／ｍＬ）は至適であった。次に、培養条件におけるＬＩＦおよびＢｍｐ７の役割を検討した。結果を図９に示す。ＬＩＦを培地から除くと、全細胞数がわずかに増加したが、ＧＦＰ陽性細胞の割合が８４％に減少した。このことは、ＬＩＦが分化した細胞の増殖を阻害し得ることを示唆している。Ｂｍｐ７の非存在下では、全細胞数は減少したが、ＧＦＰ陽性の割合は高いままであった。ＬＩＦおよびＢＭＰ７を除くと、細胞数はＢＭＰ７のみが非存在下のものよりも多かったが、ＧＦＰ陽性細胞の割合は大幅に減少した。このことより、ＬＩＦは、分化を阻害するだけでなく前駆細胞および分化した細胞の両方の増殖を阻害することができ、一方、Ｂｍｐ７は、前駆細胞に対するＬＩＦの負の効果に対抗して前駆細胞の増殖を高め、それによってネフロン前駆細胞の自己複製を可能にすると推測できる。さらなるメカニズムの研究が必要であるが、これらのデータは、ＬＩＦおよびＢｍｐ７の両方が最適化された培養条件のために必要であることを示している。
実施例４：マウスの１９日間継代胚性ネフロン前駆細胞を用いた三次元ネフロン構造の再構成
次に、一週間を超える前駆細胞の増幅を試みた。８日目での単一細胞への分散は、細胞のさらなる増殖を妨げた（データ示さず）。しかし、細胞を小さな塊（凝集体）に分離し３つのプレートに分割した場合は、細胞は成長を続け、１９日目まで３～４日ごとに継代することができた（図１０参照）。１９日目で、細胞数が増加し、９７％がＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性のままであった（図１１）。最適条件（全ての因子を添加）では、１９日目でＧＦＰ陽性細胞の割合は９７％であった。ＬＩＦの非存在下では、ＧＦＰ陽性細胞の割合が８日目に急激に低下し、１９日で７３％であったが、逆に、ＬＩＦ存在の条件と比較した場合、全細胞数は増加した。結果を図１２に示す。このことは、図９の状況と同様である。興味深いことに、Ｂｍｐ７の非存在下では、ＧＦＰ陽性細胞の割合は、１１日目まで高いレベルに維持され、１９日目で５３％にまで急激に減少した。したがって、Ｂｍｐ７は、ＧＦＰ陽性細胞の長期維持に必須であった。培地からのＬＩＦおよびＢｍｐ７の排除はまた、全細胞数の増加にもかかわらず、Ｓｉｘ２陽性細胞を維持することができなかった（６８％）。したがって、ＬＩＦおよびＢｍｐ７の両方がネフロン前駆細胞の自己複製に必要であると判った。この最適化された状態（ＣＤＢＬＹ＋Ｆｇｆ９）では、Ｐａｘ２を除くネフロン前駆細胞マーカーのほとんどが、８日目より低いレベルであったが、１９日目で維持されていた（図１３）。さらに、図１４に示すように、培養細胞は、脊髄と組み合わせることにより、３次元ネフロン構造（糸球体と尿細管）を形成した。したがって、培養細胞は、１９日間、分化能を保持していた。
次に、一週間を超える前駆細胞の増幅を試みた。８日目での単一細胞への分散は、細胞のさらなる増殖を妨げた（データ示さず）。しかし、細胞を小さな塊（凝集体）に分離し３つのプレートに分割した場合は、細胞は成長を続け、１９日目まで３～４日ごとに継代することができた（図１０参照）。１９日目で、細胞数が増加し、９７％がＳｉｘ２－ＧＦＰ陽性のままであった（図１１）。最適条件（全ての因子を添加）では、１９日目でＧＦＰ陽性細胞の割合は９７％であった。ＬＩＦの非存在下では、ＧＦＰ陽性細胞の割合が８日目に急激に低下し、１９日で７３％であったが、逆に、ＬＩＦ存在の条件と比較した場合、全細胞数は増加した。結果を図１２に示す。このことは、図９の状況と同様である。興味深いことに、Ｂｍｐ７の非存在下では、ＧＦＰ陽性細胞の割合は、１１日目まで高いレベルに維持され、１９日目で５３％にまで急激に減少した。したがって、Ｂｍｐ７は、ＧＦＰ陽性細胞の長期維持に必須であった。培地からのＬＩＦおよびＢｍｐ７の排除はまた、全細胞数の増加にもかかわらず、Ｓｉｘ２陽性細胞を維持することができなかった（６８％）。したがって、ＬＩＦおよびＢｍｐ７の両方がネフロン前駆細胞の自己複製に必要であると判った。この最適化された状態（ＣＤＢＬＹ＋Ｆｇｆ９）では、Ｐａｘ２を除くネフロン前駆細胞マーカーのほとんどが、８日目より低いレベルであったが、１９日目で維持されていた（図１３）。さらに、図１４に示すように、培養細胞は、脊髄と組み合わせることにより、３次元ネフロン構造（糸球体と尿細管）を形成した。したがって、培養細胞は、１９日間、分化能を保持していた。
インビボおよびインビトロでの増幅理論細胞数を計算した。結果を図１５に示す。インビボでは、Ｓｉｘ２－ＧＦＰ陽性ネフロン前駆細胞の割合は減少したが、１腎臓内の全細胞数は増加した。したがって、１腎臓における前駆細胞の絶対数は、Ｅ１１．５での２１２５７±７３４４から出生時に３８６５００±８４４０３へと増加したと推定された（１８倍の増加）。Ｅ１１．５での前駆細胞の同じ数の前駆体をインビトロに置くと、ＧＦＰ陽性細胞数が、８日目で１７０万（６０倍の増加）、１９日目で４５００万（１５００倍の増加）と推定された。よって、分化能を維持したまま、細胞数および期間の両者で、成体内での生理的限界を遥かに超えて、インビトロでのネフロン前駆細胞の増幅に成功した。
以上の結果より、本発明の方法を用いて、マウス胎児のネフロン前駆細胞を、未分化の状態を維持したまま１９日間の培養で約１５００倍に増幅し、培養後も増幅した前駆細胞から糸球体と尿細管の３次元構造を形成できることが判った。
実施例５：マウスＥＳ細胞から作成されたネフロン前駆細胞の増幅とネフロン形成能
発明者らは、マウスＥＳ細胞からネフロン前駆細胞の作成を最近報告している（非特許文献６；特許文献１）。そこで、上記の増幅培養方法が、ＥＳ細胞由来ネフロン前駆細胞に適用することができるかどうかを検討した。腎臓系統への分化能を持つＳｉｘ２－ＧＦＰ ＥＳ細胞は入手できなかったので、ネフロン前駆細胞およびそれに続いて三次元ネフロンに分化することが示されているＯｓｒ１－ＧＦＰ ＥＳ細胞を用いた。マウスＥＳ細胞から誘導された凝集体は、おそらくＥ１０．５－１１．５でのネフロン前駆細胞に相当する。Ｏｓｒ１は、ネフロン前駆細胞で発現されているばかりでなくこの段階での間質でも発現されているが、発達の後期段階ではその発現はネフロン前駆細胞に制限されている。したがって、ネフロン前駆細胞画分としてＯｓｒ１－ＧＦＰ＋／インテグリンα８＋／Ｐｄｇｆｒα－集団を選別し、それを７日間培養した。細胞は１５倍に増殖し、それらの９０．３パーセントはＯｓｒ１－ＧＦＰについて陽性のままであったが、インテグリンα８＋／Ｐｄｇｆｒα－画分の割合は６５．２パーセントに減少した。結果を図１６に示す。７日目のＯｓｒ１－ＧＦＰ陽性細胞におけるネフロン前駆細胞マーカー（Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｗｔ１およびＯｓｒ１）の発現レベルは、Ｅ１１．５でのインビボでのＳｉｘ２陽性細胞のものと同等であった。これらの培養細胞は、脊髄により刺激されると、三次元ネフロン構造を形成した（図１７）。したがって、マウスＥＳ細胞から作成されたネフロン前駆細胞は、ネフロン形成能を維持したまま増幅でき、このことは、本発明の培養条件がしっかりしたものであることを示している。
発明者らは、マウスＥＳ細胞からネフロン前駆細胞の作成を最近報告している（非特許文献６；特許文献１）。そこで、上記の増幅培養方法が、ＥＳ細胞由来ネフロン前駆細胞に適用することができるかどうかを検討した。腎臓系統への分化能を持つＳｉｘ２－ＧＦＰ ＥＳ細胞は入手できなかったので、ネフロン前駆細胞およびそれに続いて三次元ネフロンに分化することが示されているＯｓｒ１－ＧＦＰ ＥＳ細胞を用いた。マウスＥＳ細胞から誘導された凝集体は、おそらくＥ１０．５－１１．５でのネフロン前駆細胞に相当する。Ｏｓｒ１は、ネフロン前駆細胞で発現されているばかりでなくこの段階での間質でも発現されているが、発達の後期段階ではその発現はネフロン前駆細胞に制限されている。したがって、ネフロン前駆細胞画分としてＯｓｒ１－ＧＦＰ＋／インテグリンα８＋／Ｐｄｇｆｒα－集団を選別し、それを７日間培養した。細胞は１５倍に増殖し、それらの９０．３パーセントはＯｓｒ１－ＧＦＰについて陽性のままであったが、インテグリンα８＋／Ｐｄｇｆｒα－画分の割合は６５．２パーセントに減少した。結果を図１６に示す。７日目のＯｓｒ１－ＧＦＰ陽性細胞におけるネフロン前駆細胞マーカー（Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｗｔ１およびＯｓｒ１）の発現レベルは、Ｅ１１．５でのインビボでのＳｉｘ２陽性細胞のものと同等であった。これらの培養細胞は、脊髄により刺激されると、三次元ネフロン構造を形成した（図１７）。したがって、マウスＥＳ細胞から作成されたネフロン前駆細胞は、ネフロン形成能を維持したまま増幅でき、このことは、本発明の培養条件がしっかりしたものであることを示している。
以上の結果より、本発明の方法により、マウスＥＳ細胞から誘導したネフロン前駆細胞は培養７日間で１５倍に増幅し、増幅した細胞が糸球体と尿細管の３次元構造を形成できることが判った。
実施例６：ヒトｉＰＳ細胞から作成されたネフロン前駆細胞の増幅とネフロン形成
太口らの方法（非特許文献６）に沿ってヒトｉＰＳ細胞からネフロン前駆細胞を誘導する。その際に、ネフロン前駆細胞マーカーがＧＦＰで光るヒトｉＰＳ細胞を作成し、ＦＡＣＳによってネフロン前駆細胞を単離する。その後、上記の実施例と同様にし、本発明の記載の各化合物の濃度にて、ネフロン細胞の培養を行う。培養したネフロン前駆細胞を用い、上記実施例と同様にして、本発明者の公知の報告（非特許文献６；特許文献１）に従い、三次元ネフロン構造を形成する。
具体的には以下のようにして行った。概略を図１８に示す。
ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）から太口らの方法に従いヒトネフロン前駆細胞を作成した。培養１４日目の前駆体スフェロイドを、解離溶液（ＣＴＫ溶液、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）で処理して、小さな塊に解離した。前駆体スフェロイドを約１／４に分割した塊を、ｉＭａｔｒｉｘ被覆プレートに播き、ＣＤＢＬＹを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＣＨＩＲ９９０２１：１μＭ、ＤＡＰＴ：２．５μＭ、ＢＭＰ７：５ｎｇ／ｍｌ、ＬＩＦ：５ｎｇ／ｍｌ、Ｙ２７６３２：１０μＭ）中で培養した。培地を毎日交換し、８日間培養を続けた。培養８日目のネフロン前駆体細胞数及びネフロン前駆細胞マーカーの遺伝子発現レベルを測定した結果を図１９に示す。８日間で細胞が４倍に増幅された。
培養８日目の細胞を用いて、ネフロンへの分化アッセイを行った。培養８日目のｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆体細胞を解離溶液（ＣＴＫ溶液）を用いて小さな塊に解離し、９６ウェルのＵ底ｌｏｗ－ｃｅｌｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅｓに播種して（ウェル当たり２００，０００細胞）２４－４８時間培養して凝集体を形成させ、次いで、胚の脊髄とともに共培養することにより、ネフロンを形成させた。その結果を図２０に示す。糸球体や尿細管が確認された。
太口らの方法（非特許文献６）に沿ってヒトｉＰＳ細胞からネフロン前駆細胞を誘導する。その際に、ネフロン前駆細胞マーカーがＧＦＰで光るヒトｉＰＳ細胞を作成し、ＦＡＣＳによってネフロン前駆細胞を単離する。その後、上記の実施例と同様にし、本発明の記載の各化合物の濃度にて、ネフロン細胞の培養を行う。培養したネフロン前駆細胞を用い、上記実施例と同様にして、本発明者の公知の報告（非特許文献６；特許文献１）に従い、三次元ネフロン構造を形成する。
具体的には以下のようにして行った。概略を図１８に示す。
ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）から太口らの方法に従いヒトネフロン前駆細胞を作成した。培養１４日目の前駆体スフェロイドを、解離溶液（ＣＴＫ溶液、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）で処理して、小さな塊に解離した。前駆体スフェロイドを約１／４に分割した塊を、ｉＭａｔｒｉｘ被覆プレートに播き、ＣＤＢＬＹを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＣＨＩＲ９９０２１：１μＭ、ＤＡＰＴ：２．５μＭ、ＢＭＰ７：５ｎｇ／ｍｌ、ＬＩＦ：５ｎｇ／ｍｌ、Ｙ２７６３２：１０μＭ）中で培養した。培地を毎日交換し、８日間培養を続けた。培養８日目のネフロン前駆体細胞数及びネフロン前駆細胞マーカーの遺伝子発現レベルを測定した結果を図１９に示す。８日間で細胞が４倍に増幅された。
培養８日目の細胞を用いて、ネフロンへの分化アッセイを行った。培養８日目のｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆体細胞を解離溶液（ＣＴＫ溶液）を用いて小さな塊に解離し、９６ウェルのＵ底ｌｏｗ－ｃｅｌｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅｓに播種して（ウェル当たり２００，０００細胞）２４－４８時間培養して凝集体を形成させ、次いで、胚の脊髄とともに共培養することにより、ネフロンを形成させた。その結果を図２０に示す。糸球体や尿細管が確認された。
実施例７：ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞からのネフロン形成
実施例６と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞の増幅と増幅した細胞のネフロン形成を行った。但し、ネフロン前駆細胞の増幅は、ｉＭａｒｔｉｘ被覆プレートの代わりに９６ウェルのＵ底ｌｏｗ－ｃｅｌｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅｓを用いて培養１４日目の前駆体スフェロイドをタングステン針で４分割し、スフェロイド状で培養した。結果は、実施例６と同様に、ネフロンが形成され、多数の糸球体や尿細管が確認された（データは示さず）。
実施例６と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞の増幅と増幅した細胞のネフロン形成を行った。但し、ネフロン前駆細胞の増幅は、ｉＭａｒｔｉｘ被覆プレートの代わりに９６ウェルのＵ底ｌｏｗ－ｃｅｌｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅｓを用いて培養１４日目の前駆体スフェロイドをタングステン針で４分割し、スフェロイド状で培養した。結果は、実施例６と同様に、ネフロンが形成され、多数の糸球体や尿細管が確認された（データは示さず）。
実施例８：純化したヒトｉＰＳ細胞由来のネフロン前駆細胞の増幅培養
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７から太口らの方法に従い誘導したｓｐｈｅｒｏｉｄ様のネフロン前駆細胞を含む組織を１ｘＡｃｃｕｍａｘ細胞剥離液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に浸し、３７度、８分間処理し、解離した（２０個ｓｐｈｅｒｏｉｄ／５００μLのＡｃｃｕｍａｘ細胞剥離液）。その間、２分ごとに溶液を攪拌した。
反応後、すぐに遠心を行った（１０００ｒｐｍ，２分）。次いで、上清を取り除き、５００μＬのＦＡＣＳ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＢＳＳ，ＦＣＳ，ＤＮａｓｅ，ＣａＣｌ２, ＮａＨＣＯ3）で再懸濁した。
Ｉｎｔｅｇｒｉｎ α抗体およびＰＤＧＦＲ α抗体で細胞を処理し、ＦＡＣＳによりＩｎｔｅｇｒｉｎ α陽性／ＰＤＧＦＲ α陰性の細胞を単離した。
これをネフロン前駆細胞として、実施例６に記載の培地条件および培養条件にて培養した。具体的には、純化した１０，０００個のＩｎｔｅｇｒｉｎ α陽性のネフロン前駆細胞をｌｏｗ－ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅにて培養し凝集体を形成させた。その結果、８日間の培養で４０－６０倍に増幅した。さらに、増幅した細胞から尿細管、糸球体様の組織をマウス胎児の脊髄との共培養によって再構築することできた。
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７から太口らの方法に従い誘導したｓｐｈｅｒｏｉｄ様のネフロン前駆細胞を含む組織を１ｘＡｃｃｕｍａｘ細胞剥離液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に浸し、３７度、８分間処理し、解離した（２０個ｓｐｈｅｒｏｉｄ／５００μLのＡｃｃｕｍａｘ細胞剥離液）。その間、２分ごとに溶液を攪拌した。
反応後、すぐに遠心を行った（１０００ｒｐｍ，２分）。次いで、上清を取り除き、５００μＬのＦＡＣＳ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＢＳＳ，ＦＣＳ，ＤＮａｓｅ，ＣａＣｌ２, ＮａＨＣＯ3）で再懸濁した。
Ｉｎｔｅｇｒｉｎ α抗体およびＰＤＧＦＲ α抗体で細胞を処理し、ＦＡＣＳによりＩｎｔｅｇｒｉｎ α陽性／ＰＤＧＦＲ α陰性の細胞を単離した。
これをネフロン前駆細胞として、実施例６に記載の培地条件および培養条件にて培養した。具体的には、純化した１０，０００個のＩｎｔｅｇｒｉｎ α陽性のネフロン前駆細胞をｌｏｗ－ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅにて培養し凝集体を形成させた。その結果、８日間の培養で４０－６０倍に増幅した。さらに、増幅した細胞から尿細管、糸球体様の組織をマウス胎児の脊髄との共培養によって再構築することできた。
上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
本発明の方法は、ネフロン前駆細胞の増幅培養法として有用である。また、本発明の方法により増幅培養されたネフロン前駆細胞は、腎臓発生学や再生の研究材料として、および再生医療の原料として有用である。
Claims (27)
- 以下の化合物：
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む培地を用いて、単離された哺乳動物由来のネフロン前駆細胞を培養して増やす方法。 - さらに、培地が（ｖｉｉ）Ｔｇｆ－αを含む請求項１に記載の方法。
- 前記培地が、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｍｐファミリー化合物を含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記培地が０．１μＭ～５μＭの濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０～５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＩＦを含む、請求項１～３のいずれか一つに記載の方法。
- 前記培地が、１．０μＭ～５０μＭの濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ～２０μＭの濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、請求項４に記載の方法。
- 前記培地が、１ｎｇ／ｍｌ～５００の濃度のＴｇｆαを含む、請求項５に記載の方法。
- 前記Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、請求項１～６のいずれか一つに記載の方法。
- 前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ－３阻害剤から選ばれる、請求項１～７のいずれか一つに記載の方法。
- 前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
- 前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項１～６のいずれか一つに記載の方法。
- 前記ネフロン前駆細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来のネフロン前駆細胞である、請求項１～１０のいずれか一つに記載の方法。
- 前記ネフロン前駆細胞が５日以上培養されることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一つに記載の方法。
- 前記ネフロン前駆細胞が、培養開始時の細胞数と比較して４倍以上の細胞数まで培養されることを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一つに記載の方法。
- 前記培養が、ｉＭａｔｒｉｘまたはフィブロネクチン被覆プレート上で行われる、上記請求項１～１３のいずれか一つに記載の方法。
- 前記培養が、Ｕ底低細胞吸着プレートで行われる、請求項１～１３のいずれか一つに記載の方法。
- 請求項１～１５のいずれか一つに記載の方法を用いて培養されたネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞。
- 請求項１～１５のいずれか一つに記載の方法を用いて培養されたネフロン前駆細胞を用いて、糸球体および尿細管を有する三次元腎臓構造を作成する方法。
- 以下の化合物：
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む、ネフロン前駆細胞を増幅させるための培地。 - さらに、（ｖｉｉ）Ｔｇｆαを含む請求項１８に記載の培地。
- １．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｍｐファミリー化合物を含む、請求項１８または１９に記載の培地。
- ０．１μＭ～５μＭの濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０～５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＩＦを含む、請求項１８～２０のいずれか一つに記載の培地。
- 前記培地が、１．０μＭ～５０μＭの濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ～２０μＭの濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、請求項２１に記載の培地。
- １ｎｇ／ｍｌ～５００の濃度のＴｇｆαを含む、請求項２２に記載の培地。
- Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、請求項１８～２３のいずれか一つに記載の培地。
- 前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ－３阻害剤である、請求項１８～２４のいずれか一つに記載の培地。
- 前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、請求項１８～２３のいずれかに記載の培地。
- 前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項１８～２６のいずれか一つに記載の培地。
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