CN1166772C - 调控由哺乳动物细胞培养物产生的蛋白质唾液酸化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的利用哺乳动物细胞培养物来制备糖蛋白的方法，其中通过控制细胞培养条件来在一个较宽的范围内调节产生的糖蛋白中唾液酸的含量。本发明提供了这样一些方法，即通过改变影响细胞比生产率的细胞培养参数来改变糖蛋白中的唾液酸含量。本发明的优选实施方式包括在细胞培养的生产期调控其中的渗透摩尔浓度和转录增强子浓度的细胞培养方法。本发明还提供了新的可溶性1型肿瘤坏死因子免疫球蛋白G1制剂，及其在治疗炎性或免疫相关性疾病中的用途。

Description

调控由哺乳动物细胞培养物产生的蛋白质唾液酸化的方法
发明领域
本发明涉及调控在哺乳动物细胞培养物中生成的糖蛋白中唾液酸含量的方法。本发明提供了提高或降低哺乳动物产生的糖蛋白中唾液酸含量的方法。本发明还涉及产生肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(Ig)和新的TNFR1-IgG1制剂的方法及其在诊断和治疗各种炎性和免疫疾病中的用途。
相关技术
目前，重组产生的糖蛋白其糖基化方式的差异已经成为各科研团体广泛关注的课题，因为由此产生的重组蛋白可能用于临床预防和治疗手段。糖蛋白的寡糖侧链影响着蛋白质的功能(Wittwer A.和Howard.S.C.(1990)生物化学(Biochem.)29：4175-4180)和糖蛋白某些部分之间的分子内反应，这些反应形成糖蛋白的构象及其三维表面(Hart.(1992)，现代细胞生物学期刊摘要(Curr.Op.CellBiol.)4：1017-1023：Goochee等(1991)生物/技术(Bio/Technology)9：1347-1355；Parekh，R.B.，(1991)现代结构生物学期刊摘要(Curr.Op.Struct.Biol.)1：750-754)。寡糖还起着使一给定的多肽根据特异性细胞糖类受体而导向某些结构。(Bevilacqua，M.P.和Nelson，R.M.，(1993)临床研究杂志(J.Clin.Invest.)91：379-387；Nelson，R.M.，(1993)临床研究杂志(J.Clin.Invest.)91：1157-1166；Norgard，K.E.等美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：1068-1072；Imai，Y等，(1993)自然(Nature)361：555-557)。糖蛋白寡糖侧链的末端唾液酸组分影响着糖蛋白的吸附作用、血清半衰期、从血清中被清除，以及物理、化学和免疫原性特性(Parekh，R.B.，同上；Varki，A.(1993)糖基生物学(Glycobiology)3：97-100；Paulson，J.(1989)TIBS.14：272-276；Goochee等(1991)生物技术(Biotechnology)9：1347-1355；Kobata A(1992)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)209：483-501)。所以，维持糖蛋白中的唾液酸含量很重要，尤其在要用作治疗剂的那些蛋白质中。
人们已将大量的注意力投注于重组蛋白产生过程中影响糖基化作用的因素，例如培养模式(贴壁还是悬浮)、培养基配方中的胎牛血清、培养物密度、通氧气、pH、纯化方案等(Wemer，R.和Noe，W.(1993)药物研究(DrugRes.)43：1134-1249；Harter等，(1992)生物技术与生物工程(Biotech.andBioeng.)39：327-335；Borys等，(1994)生物技术与生物工程(Biotech.and Bioeng)43：505-514；生物技术与生物工程11：720-724；Hearing等，(1989)细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)108：339-353；Goochee等，生物方法的研究前沿II(Frontiers inBioprocessing II)Todd等编辑，(1992)美国化学协会(American ChemicalSociety)pp.199-240；美国专利No.5,096,816；Chotigeat，W.，(1994)细胞技术(Cytotech.)15：217-227)。有几个研究团体已经对影响重组蛋白产生的过程参数进行了研究，尤其是培养基组成在重组蛋白产生中的影响(Park等，(1992)生物技术与生物工程(Biotech.and Bioeng.)40：686-696；Cox和McClure，(1983)体外(InVitro)19：1-6；Mizutani等，(1992)生物化学和生物生理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)187：664-669；LeGros等，1985)淋巴研究(Lymph.Res.)4(3)；221-227)。
已知，加入丁酸之类的链烷酸影响到外源DNA在重组细胞培养物中的瞬时表达(Prasad和Sinha(1976)体外(In Vitro)12：125-132；日本专利申请No.62-48935；日本专利申请No.55-150440；Klehr等，(1992)生物化学(Biochem.)31：3222-3229；Gorman和Howard，(1983)核酸研究(Nucleic acid Res.)11：7631-7648)。但是，丁酸钠对于多种细胞系和培养基组成中的基因表达(D’Anna等，(1980)生物化学19：2656-2671；Hagopian，H.K.(1977)细胞(Cell)12：855-860)和蛋白质的产生(Milhaud(1980)细胞生理学杂志(J.Cell.Physol.)104：163-170；英国专利申请No.GB 2122207A)具有多种作用，这表明丁酸盐能够改变基因的表达(Yuan等，(1985)生物化学杂志.3778-3783)或抑制某些基因的表达(Yuan等，(1985)同上)。
欧洲专利No.0239292B1公开了一种在链烷酸或其盐例如丁酸存在下加强蛋白质生成的方法。但是，该文献在选择合适的添加剂浓度方面指导得很少，而且没有谈及添加剂对蛋白质糖基化的作用。其它文献谈到，为了提高细胞比生产率而加入细胞培养生产培养基中的低浓度(0-1.5mM)丁酸钠会伴随增加生成的重组蛋白中酸性糖基形式(对应于提高的唾液酸含量)(Chotigeat等(1994)细胞技术15：217-221)。
有些研究机构已经注意到渗透摩尔浓度对细胞生长和多肽生成的影响(Ozturk和Palsson，(1991)生物技术和生物工程37：989-993；Stubblefield等，(1960)癌症研究(Cancer Research)20：1646-1655；Garcia-Perez等，(1989)生物化学杂志264(28)：16815-16821；Miner等，(1981)侵染转移(InvasionMetastasis)1：158-174；GB2,251,249；EP481,791；美国专利No.5,151,359；美国专利No.4,724,206；美国专利No.5,122,469和WO89/04867)。已经提出了用于细胞生长或多肽产生的多种渗透摩尔浓度范围。通常，通过添加NaCl或氨基酸来提高细胞培养基的渗透摩尔浓度。某些情况中，环境应力例如高盐浓度会提高细胞产物的产出。通过溶质应力例如在培养基中添加盐、乳酸、氨可以在哺乳动物细胞培养物中获得哺乳动物蛋白质产物的高表达，这样的观点也已有所报道(专利国际申请No.WO89/04867)。这些应力通常是抑制细胞的生长而促进细胞的比生产率。
其它文献论述了重组细胞培养物中葡萄糖浓度对细胞生长和/或多肽产生的影响。例如参见Park等，(1992)生物技术和生物工程40：686-696；Huang等，(1991)生物技术杂志18：161-162；EP387840；Reuveny等，(1986)免疫学方法杂志(Journalof Immunological Method)86：53-59；Fine等，(1976)体外12(10)：693-701；Dircks等(1987)实验眼科研究(Exp.Eye Res.)44：951-958；Mizutani等，(1992)生物化学和生物生理学研究通讯187(2)：664-669；Sugiura，(1992)生物技术和生物工程39：953-959；WO88/01643；Graf等，(1989)DECHEMA生物技术参考(DECHEMABiotechnol.Conf.)3：615-618；日本专利申请No.JP 1-101882；美国专利No.3,926,723；WO87/00195；和Fleischaker，Jr.，Ph.D.Thesis，MassachusettsInstitute of Technology，pp.196-229(1982，6)。但是，已有的研究没有研究各种过程参数对成熟蛋白质中唾液酸含量的影响，糖蛋白生成中的这一因素对临床成功来说是十分重要的。
本发明提供了调控哺乳动物细胞培养物产生的糖蛋白中唾液酸含量的方法。
发明综述
本发明发现，某些哺乳动物细胞培养过程参数影响着细胞的比生产率和生成的蛋白质的糖基化程度和类型。更具体地说，本发明已经发现某些提高细胞比生产率的因素对生成的蛋白质中的唾液酸含量具有负作用。所以，本发明设计了多种细胞培养方法，以丰富哺乳动物细胞培养物中生成的糖蛋白的特定的糖基化形式。
所以，本发明提供了调控哺乳动物细胞培养物产生的糖蛋白中唾液酸含量的方法。根据本发明的这项内容，改变细胞培养生产期的生成速度会引起成熟糖蛋白中唾液酸含量的改变。更具体地说，糖蛋白生产期中细胞比生产率的提高引起成熟蛋白质中唾液酸含量的降低。相反，细胞比生产率的降低引起成熟蛋白质中唾液酸含量的升高。
在具体的实施方式之一中，本发明通过调控会影响细胞比生产率的因素来在哺乳动物细胞培养的蛋白质生产期改变哺乳动物宿主细胞的比生产率。根据本发明内容之一，促进DNA转录的因子的浓度受到调控。在另一实施方式中，通过将细胞培养物的渗透摩尔浓度维持在一定的范围内来控制细胞的比生产率。根据本发明，对以上各参数单独或联合加以调控来影响成熟糖蛋白中的唾液酸含量。在本发明具体实施方式之一中，加强DNA转录的因子是某种链烷酸或其盐，例如浓度约为0.1mM至约20mM的丁酸钠。根据本发明内容之二，细胞培养物的渗透摩尔浓度被维持在约250至600mOsm之间。在另一方面的内容中，细胞培养物的温度被控制在约30℃至37℃之间。
在优选实施方式之一中，本发明提供了提高哺乳动物细胞培养物产生的成熟糖蛋白中唾液酸含量的方法，其中包括通过调控以上过程参数中任一或全部，并可以结合以本领域已知的其它参数来维持低细胞比生产率。根据本发明的这一项内容，在链烷酸或其盐浓度约为0.1mM至约6mM时培养宿主细胞，并可以结合以维持细胞培养物的渗透摩尔浓度在约300至450mOsm之间，生产出了高唾液酸含量的蛋白质。
在另一优选实施方式中，本发明提供了降低哺乳动物细胞培养物产生的成熟糖蛋白中唾液酸含量的方法，其中包括提高细胞培养物的细胞比生产率。在一优选实施方式中，通过任选在约6mM至约12mM的链烷酸或其盐浓度下培养细胞，以及将细胞培养物的渗透摩尔浓度维持在约450至600mOsm之间来提高细胞比生产率。
在具体实施方式之一中，本发明还提供了包含三个细胞培养阶段的细胞培养方法。所以，本发明提供了调控哺乳动物细胞培养物产生的糖蛋白中唾液酸含量的方法，其过程包括在最大程度促进细胞生长的条件下将表达蛋白质的宿主细胞在生长期培养一段时间。根据本发明的该项内容，生长期之后是过渡期，在该阶段选择并使用适合成熟糖蛋白中唾液酸含量要求的细胞培养参数。过渡期之后是细胞培养的生产期，在该阶段维持过渡期选用的参数，产生和收获糖蛋白产物。在过渡期向细胞培养物中添加浓度约为0.1mM至20mM的某种链烷酸或其盐，以及使用约250至600mOsm之间的细胞培养物渗透摩尔浓度，或者两者结合使用，由此改变细胞培养生产期的细胞比生产率，产生了具有不同唾液酸含量的蛋白质。
在本发明的另一实施方式中，调控可溶性1型肿瘤坏死因子受体(TNFR1)-免疫球蛋白G1(IgG1)嵌合蛋白中唾液酸含量的方法。本发明还发现，在某些条件下可以获得新的TNFR1-IgG制剂，它们具有延迟从血液中被清除的同时保持显著的功能活性这样的理想特性。长功能性半衰期允许使用简单的弹丸剂型，且有助于糖蛋白产生的体内效力，由此允许使用糖蛋白的低剂量剂型。
根据本发明这一方面的内容，产生了一种唾液酸残基含量提高的TNFR1-IgG1糖蛋白分子。以获得要求的唾液酸含量为目的来选用TNFR1-IgG1生产期的细胞培养参数。在优选实施方式之一中，生产期的丁酸钠浓度约为0.1至约6mM，渗透摩尔浓度维持在约300-450mOsm。更好的是，丁酸钠浓度约为1mM，渗透摩尔浓度维持在约300-400mOsm。
在另一实施方式中，本发明提供了一种利用本发明方法产生的TNFR1-IgG1糖蛋白制剂。本发明的该项内容提供了一种包含TNFR1-IgG1的制剂，其中该制剂的pI范围在约5.5至7.5之间。此外还提供了一种唾液酸与蛋白质的摩尔比约为4至7、约5至6更好的TNFR1-IgG1制剂。在其它方面的内容中，TNFR1-IgG1制剂中每摩尔蛋白质具有约1至2摩尔的暴露的N-乙酰基葡糖胺。在其它方面的内容中，该制剂中唾液酸与N-乙酰基葡糖胺的摩尔比约为0.35至0.5，约0.4至约0.45更好。
本发明还提供了包含以上制剂、可用于治疗TNF-介导的病理状况的治疗性组合物。
附图说明
图1A和图1B。图1A和图1B表示用于在生产期计算典型细胞培养的比生产率的方法。比生产率可以表示为图1A所示活细胞计数(细胞存活天数)的函数；或图B所示收集细胞体积(PCV)的函数。给出的是90％置信区间范围内的比生产率。
图2A和图2B。图2A和图2B表示生产期中基于细胞存活天数(图2A)或收集细胞体积(图2B)的比生产率与收获的产物中唾液酸(NANA)含量之间的关系。图中显示了9种不同方法(A至I)的值。数据点代表表I中各自独立的生产方法。
详细说明
I. 定义
将参照描述寡糖的常用术语来描述本发明中糖类部分。有关使用这类术语的糖类化学综述可见于Hubbard和Ivatt(1981)生物化学评论记要(Ann.Rev.Biochem.)50：555-583。这类术语包括例如Man，代表甘露糖；GlucNAc，代表2-N-乙酰基葡糖胺；Gal，代表半乳糖；Glc，代表葡萄糖。唾液酸的描述参照以下缩写，NeuNAc，代表5-N-乙酰基神经氨酸，NeuNGc，代表5-糖基神经氨酸(生物化学杂志，1982，257：3347；生物化学杂志，1982，257：3352)。
“渗透(重量)摩尔浓度”是水溶液中溶解的溶质粒子的渗透压。溶剂粒子包括离子和非离子化分子。渗透摩尔浓度表示为溶解在1kg溶液中的渗透压活性粒子的浓度(即渗透压摩尔)(38℃时1mOsm/kg H2O相当于19mmHg的渗透压)。与之相对的是“渗透(体积)摩尔浓度”，表示溶解在1L溶液中的溶质粒子数。本文中，缩写“mOsm”表示“毫摩尔/kg溶液”。
本文中，“糖蛋白”指具有超过约10个氨基酸和至少一个寡糖侧链的多肽或蛋白质。糖蛋白可以是与宿主细胞同源的，或者最好是与使用的宿主细胞异源的，即外源的，例如由中国仓鼠卵巢细胞产生的人蛋白。较好的是使用哺乳动物糖蛋白(源自哺乳动物的糖蛋白)，直接分泌到培养基中的更好。哺乳动物糖蛋白的实例包括这样一些分子，例如细胞因子及其受体以及包含细胞因子或其受体的嵌合蛋白，这些细胞因子或其受体包括例如α-和β-肿瘤坏死因子，它们的受体(TNFR-1；EP417,563，于1991年3月20日公开；和TNFR-2；EP417,014，于1991年3月20日公开)及其衍生物；肾素(renin)；生长激素，如人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺素；脂蛋白；α1-抗胰蛋白；胰岛素A-链；胰岛素B-链，胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白质C；心钠素；肺表面活性剂；血纤维蛋白溶酶原激活物，如尿激酶或者人尿或组织型血纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；脑啡肽酶；RANTES(调节正常表达和分泌的T细胞的活化)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Mullerian抑制物；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原(prorelaxin)；鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3，-4，-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或神经生长因子如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；上皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；***-I和-II(IGF-I和IGF-II)；脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，***结合蛋白；CD蛋白如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；***；骨诱导因子(osteoinductive factors)；免疫毒素；骨形态形成蛋白(BMP)；干扰素如α-，β-和γ-干扰素；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如AIDS包膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；抗体；嵌合蛋白，例如免疫粘附素；以及以上所述多肽的片段。
“细胞培养基”和“培养基”指用于生长哺乳动物细胞的营养溶液，通常提供下列物质中至少一种或多种：
1)能量源，通常是糖类形式的，例如葡萄糖；
2)所有必需氨基酸，通常是20种基本氨基酸加上半胱氨酸；
3)必需的低浓度维生素和/或其它有机化合物；
4)游离脂肪酸；和
5)微量元素，微量元素是指通常只需很低浓度，通常为微摩尔浓度级别的无机化合物或天然元素。
营养溶液还可以可选性的补充以下物质中的一种或多种：
1)激素和其它生长因子，例如胰岛素、运铁蛋白和表皮生长因子；
2)盐和缓冲液，例如钙、镁和磷酸盐；
3)核苷和碱基，例如腺苷、胸苷和次黄嘌呤；和
4)蛋白质和组织水解产物。
“哺乳动物宿主细胞”，“宿主细胞”，“哺乳动物细胞”等指来源于哺乳动物，并且能够在包含合适的营养物和生长因子的培养基中，在单层培养或悬浮培养中生长和存活的细胞系。正如 哺乳动物细胞培养(Mammalian Cell Culture)(Mather，J.P.编辑，Plenum Press，N.Y.[1984])和Barnes及Sato(1980)在细胞(Cell)22：649中所述，无需大量实验，凭经验即可方便地确定特定细胞系所必需的生长因子。通常，细胞能够表达和向培养基中分泌大量人们感兴趣的特定的糖蛋白。本发明中合适的哺乳动物宿主细胞实例包括中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin， 美国科学院院报，77：4216[1980])；dp12.CHO细胞(EP307,247，于1989年3月15日公开)；猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(293或亚克隆的悬浮培养生长的293细胞，Graham等人， J. Gen Virol.36：59[1977])；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠Sertoli细胞(TM4，Mather， Biol.Reprod.23：243-251[1980])；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠***肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68[1982])；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(HepG2)。
优选的是中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，美国科学院院报，77：4216[1980])；dp12.CHO细胞(EP307,247，于1989年3月15日公开)。
本文中的“蛋白胨”指一种培养基补充成份，主要是水解动物蛋白。这种蛋白质的来源可以是屠宰场的动物副产物，纯化明胶或植物材料。这些蛋白质通常利用酸、加热或各种酶制剂来水解。较好的蛋白胨混合物是例如“Primatone RL”和“Primatone HS”，以上两种都是市售商品(Sheffield，England)。
“细胞比生产率”，“细胞比速度”等指产物的比表达速度，即与细胞个数，或细胞质量或体积量度之比。例如，细胞比生产率按照每日每个细胞产生的蛋白质克数来测定。可以根据以下积分方法方便地测得细胞比生产率：
                      dP/dt＝qpX，或者
                      P＝qp∫Xdt
其中的qp是细胞比生产率常数，X是细胞个数或细胞体积或细胞质量当量，dP/dt是蛋白质产出速度。所以，从产物浓度对活细胞的时间积分(∫Xdt“活细胞天数”)所做的图中可以获得qp。根据该公式，当用产出的糖蛋白产物量对活细胞天数作图时，斜率等于细胞比速度。有多种方法可以测定活细胞，例如生物质量、耗氧率、乳酸脱氢酶(LDH)、收集细胞体积或浊度。
细胞培养的“生长期”指细胞迅速***的指数生长期(对数期)，在此期间，通常将细胞培养一定的时间，一般为1至4天，并且在最大程度细胞生长的条件下进行培养。无需过多的实验就可根据考虑使用的特定的宿主细胞确定其生长周期。“在最大程度细胞生长的条件下培养一定的时间”指根据具体的细胞系确定的最适于细胞生长和***的培养条件。在生长期，通常将细胞培养在包含必需添加剂的营养培养基中，温度约30至40℃，大气环境湿润且可调节，以便获得特定细胞系的最佳生长。将细胞在生长期维持1至4天，通常为2至3天。
细胞培养“过渡期”指使用生产期的培养条件的时期。在过渡期，环境因素例如培养温度、培养基的渗透摩尔浓度等由生长期向生产条件转变。
细胞培养的“生产期”指细胞生长至平台期。在生产期，细胞的对数生长结束，而以蛋白质生产为主。在此期间，通常对培养基进行补充以支持持续的蛋白质生产且获得所需的糖蛋白产物。
本文中的“表达”指宿主细胞内发生的转录和翻译。宿主细胞内产物基因的表达水平可以根据存在于细胞内的相应的mRNA含量或者根据由细胞产生的由产物基因编码的蛋白质的含量来测定。例如，可以较好地利用Northern杂交来定量由产物基因转录得到的mRNA。Sambrook等《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)pp.7.3-7.57(冷泉港，1989)。定量由产物基因编码的蛋白质可以利用蛋白质生物活性检测，或与这些活性无关的例如Western印迹检测或使用能够与蛋白质反应的抗体的放射性免疫检测。Sambrook等《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)pp.18，1-18，88(冷泉港，1989)。
链烷酸或其盐是指直链或支链/饱和或不饱和的链烷酸或其盐。链烷酸通常包含1至10个碳原子，以3至6个碳原子为佳。链烷酸的实例之一j丁酸，而其相应的盐是丁酸钠。
II.细胞培养过程
本发明已经说明在哺乳动物细胞培养物产生糖蛋白期间提高细胞比生产率的因素对产出的糖蛋白中的唾液酸含量具有负作用。由于每个复合寡糖结构表达一个或多个唾液酸残基的蛋白质在体内具有较慢的被清除速度，可以通过制备过程中的总唾液酸化程度来在较宽的范围内调节产出的糖蛋白的清除速度。本发明提供了用于调节哺乳动物细胞培养物产生的糖蛋白的唾液酸化程度的方法。按照本发明所述的方法，技术人员能够根据所要求的通过哺乳动物细胞培养产生的糖蛋白中的唾液酸含量来确定准确的过程参数。
根据本发明的方法，培养哺乳动物细胞来产生可回收的糖蛋白产物。通过调控会影响细胞比生产率的细胞培养参数来调控糖蛋白中的总唾液酸含量。影响细胞比生产率的因素在本领域中是众所周知的，其中包括但不限于影响DNA/RNA拷贝数的因素，影响RNA的因素例如使RNA稳定的因素，培养基中的营养物及其它补充成份，转录增强子的浓度，培养环境的渗透摩尔浓度，细胞培养的温度和pH等。根据本发明，单独或联合调控以上因素来提高细胞比生产率将生成低唾液酸含量的蛋白质。单独或联合调控以上因素来降低细胞比生产率将生成高唾液酸含量的糖蛋白。
以下将参照细胞培养技术和原理来说明本发明，其中包括众所周知的那些。
根据本发明，培养哺乳动物细胞来生成所需的糖蛋白产物。本发明在选择用于生成特定的糖蛋白的宿主细胞时，很重要的是认识到不同的宿主细胞对于表达的蛋白质具有特征性的和特异性的翻译和翻译后加工和修饰(例如糖基化或剪切)机制。必须选择合适的细胞系来确保发生合乎要求的翻译修饰。或者，可以对细胞加以改变，使其表达一种特异性翻译后修饰所必需的基因产物。
具体地说，表达所需蛋白质的哺乳动物细胞应该表达或经改进后表达特定的酶，从而在本文所述的合适条件下在体内发生正确的翻译后修饰作用。这些酶包括Hubbard和Ivan 同上所述为N-连接的寡糖添加和补全N-和O-连接的糖所必需的酶。这些酶可选性地包括寡糖转移酶、α-葡萄糖苷酶I、α-葡萄糖苷酶II、ERα(1，2)甘露糖苷酶、高尔基体α-甘露糖苷酶I、N-乙酰基葡糖胺基转移酶I、高尔基体α-甘露糖苷酶II、N-乙酰基葡糖胺基转移酶II、α(1，6)岩藻糖基转移酶和β(1，4)半乳糖苷转移酶。或者，宿主细胞表达基因组内的合适的唾液酸转移酶，可以期望该酶在特定的位置以特定的连接方式接上末端唾液酸。也可以例如用编码唾液酸转移酶的DNA转染宿主细胞来使得宿主表达合适的唾液酸转移酶。
以上所述的唾液酸转移酶被预期在合适的寡糖核心结构例如Galβ1-4ClcNac加上末端唾液酸残基。本文中合适的唾液酸转移酶包括但不限于催化N-和O-连接寡糖的复合唾液酸化和支链化的那些转移酶。
至于培养表达所需蛋白并能够在特定的位置以特定的连接方式加糖类的哺乳动物细胞，可以使用多种培养条件但同时需要注意具体培养的宿主细胞。适合哺乳动物细胞的培养条件在本领域是众所周知的或者是技术人员容易确定的(例如可参见 动物细胞培养：实际操作方法(Animal Cell Culture：A Practical Approach)第2版，Rickwood，D.和Hames，B.D.编辑，牛津大学出版社，纽约(1992))，而且随具体选用的宿主细胞而不同。
本发明的哺乳动物培养物被制备在适于特定的被培养细胞的培养基中。营养溶液的实例有市售的例如Ham F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM(Sigma))。此外，还可以使用以下所述的任意一种作为培养基，Ham和Wallace(1979)酶法(Meth Enz)，58：44；Barnes和Sato(1980)生物活性记要(Anal.Biochem.)102：255；美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；5,122,469或4,560,655；国际申请WO90/03430和WO87/00195；以上文献的内容均在此参考引用。以上培养基都可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素TM)、微量元素(通常以微摩尔浓度级的最终浓度存在的无机化合物)、脂类(例如亚油酸或其它脂肪酸)和它们的合适载体，和葡萄糖或与之相当的能源。培养基中还包括本领域技术人员已知的适当浓度的其它补充成份。
在具体实施方式之一中，哺乳动物细胞是CHO，以dp12.CHO细胞为佳，相适的培养基中包含基本培养基组分例如DMEM/HAM F-12基本配方(用于DMEM和HAM F-12的组合物，参见第6版的美国典型培养物的细胞系和杂交瘤保藏目录中的培养基配方，1988，第346至349页)(美国专利5,122,469中所述的培养基配配方尤为适用)，但改变了某些成份的浓度，例如氨基酸、盐、糖和维生素和可选性地包含在内的甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶、重组人胰岛素、水解蛋白胨例如Primatone HS或Primatone RL(Sheffield，England)或相当物、细胞保护剂例如Pluronic F68或其它Pluronic多元醇、庆大霉素和微量元素。
可在多种细胞培养条件下培养表达所需蛋白的细胞来生成本发明的糖蛋白。例如，在本发明中，用于大规模或少量生成蛋白质的细胞培养过程都可使用。这些过程包括但不限于流化床生物反应器，中空纤维反应器、摇瓶培养，或搅拌罐反应器***均可使用，在后两种***中，可以有也可以没有微载体，可以按分批、补料分批或连续模式运行。
在优选实施方式之一中，本发明的细胞培养是在搅拌罐反应器***中用补料分批过程进行的。在优选的补料分批培养中，先在一开始加入哺乳动物宿主细胞和培养基于培养罐中，然后在培养过程中连续或在间断地补加培养基，在培养结束前可以间断或不间断地收获细胞和/或产物也可以不进行收获。补料分批培养可以包括例如半连续补料分批培养，其中相隔一定的间期放出所有的培养物(包括细胞和培养基)替换以新鲜培养基。补料分批培养与单批培养的区别在于后者所有的细胞培养成份(包括细胞和培养营养物)均在培养过程开始时加入培养罐中。补料分批也区别于灌流培养，前者在培养过程中不从培养容器中放出上清液(在灌流培养中，细胞通过过滤、包埋或与微载体固定等被保留在培养物中但培养基被连续地引入和放出培养罐)。
而且，可以根据特定的宿主细胞和特定的生成计划选用合适的方法或常规操作来增殖培养物中的细胞。所以，本发明考虑使用一步或多步培养过程。在一步培养中，宿主细胞被接种到一定的培养环境中，只在细胞培养的生产期运用本发明的方法。或者，考虑使用多步培养。在多步培养中，可以分多个步骤或阶段培养细胞。例如，可以在第一步或生长期培养细胞，在此阶段可能取自储备物的细胞被接种到适合于促进细胞生长和高活性的培养基中。可以通过在宿主细胞培养物中添加新鲜培养基将细胞在生长期维持一段合适的时间。
根据本发明的优选内容之一，补料分批培养或连续细胞培养的条件被设计成加强哺乳动物细胞在细胞培养生长期的生长。在生长期，细胞在一定的条件下培养一定的时间以使其最大程度地生长。根据特定的细胞使用特定的培养条件例如温度、pH、溶解氧(dO2)等，这些对本领域技术人员来说是显而易见的。通常，用酸(例如CO2)或碱(例如Na2CO3或NaOH)将pH调节在约6.5至7.5之间。适合培养哺乳动物细胞例如CHO细胞的温度范围在约30至38℃之间，合适的dO2在5-90％空气饱和度。
在特定的阶段，这些细胞可以用于接种细胞培养的生产期或生产步骤。或者，如前所述，生产期或步骤可以与接种或生长期或步骤相连续。
根据本发明，细胞培养生产期的细胞培养环境是受到调控的。根据本发明的方法，通过调控影响哺乳动物宿主细胞的细胞比生产率的因素来获得产出的糖蛋白中要求的唾液酸含量。具体地说，在细胞培养过程的生产期控制提高细胞比生产率的因素从而使得生成的糖蛋白产物中含有要求的唾液酸含量。
在优选内容之一中，细胞培养过程的生产期之前有一个细胞培养过渡期，在此期间使用细胞培养生产期的参数。
根据本发明内容之一，某种转录增强子例如链烷酸的浓度受到调控以影响细胞比生产率，由此形成哺乳动物糖蛋白产物中的唾液酸含量。链烷酸可以是任意能够增强哺乳动物蛋白质转录的单链或支链链烷酸。在优选实施方式之一中，链烷酸是丁酸，尤其是其盐，即丁酸钠。
本发明通过控制丁酸钠的浓度来控制细胞比生产率。本发明使用的丁酸钠浓度在0.1至20mM之间，根据特定的宿主细胞和产出的糖蛋白中要求的唾液酸含量加以改变。为了生成具有要求的唾液酸含量的蛋白质，应选用提高具有最佳唾液酸含量的最高细胞比生产率的丁酸钠浓度。所以，根据本发明，转录增强子例如丁酸钠的浓度选择以获得要求的唾液酸含量为目的。
为了提高成熟糖蛋白中的唾液酸含量，使用低浓度的转录增强子。低浓度增强转录，但在维持宿主细胞培养物活性的同时保持低细胞比生产率。通常使用约0.1至8mM之间的转录增强子浓度。使用约1.0至60mM的浓度更好。在具体实施方式之一中，使用的是约6mM的丁酸钠。在另一实施方式中使用的是约1mM的丁酸钠。
在另一实施方式中产生的是低唾液酸水平的糖蛋白。根据本发明这一方面的内容，哺乳动物细胞被培养在提高细胞比生产率的条件下。根据本发明这一方面的内容，选择链烷酸或其它合适的转录增强子的浓度使得高细胞比生产率产生具有要求的唾液酸含量的蛋白质。在优先实施方式之一中，链烷酸或其盐的浓度在约5至20mM之间，约6mM至12mM之间更好。在具体实施方式之一中，丁酸钠的浓度是约12mM。
在确定合适的转录增强子例如链烷酸或其盐的浓度时，可以参照图2和实施例1的表I。根据本发明，低丁酸盐浓度通常降低细胞比生产率。选择丁酸钠浓度时需要同时考虑其它过程参数例如生产期的渗透摩尔浓度。如下文所述，渗透摩尔浓度会影响细胞比生产率。必需同时考虑在生产期中维持特定的渗透摩尔浓度来选用丁酸盐浓度。
或者，对于其它宿主细胞和其它糖蛋白，可以制备小试培养，测定糖蛋白产物的生成速度即细胞比生产率，可利用形成的唾液酸含量来绘制适合于培养的特定宿主细胞的类似表格和图形，记住细胞比生产率的降低提高生成的糖蛋白中的唾液酸含量。大约在细胞培养生产期开始时加入丁酸钠之类链烷酸或其盐或其它转录增强子。最好，在细胞培养过程中在生产期之前使用过渡期，在此期间使用在此所述的用于获得要求的细胞比生产率并由此获得要求的糖基形式的细胞培养条件。
可利用本领域已知的任何一种方式加入链烷酸或其盐。在优选实施方式之一中，如本文所述或如哺乳动物培养领域技术人员已知的那样，丁酸钠单独或与其它营养物一起加入补料分批培养***。
根据本发明，除以上所述的因素之外还通过调控细胞培养环境的渗透摩尔浓度来调节成熟糖蛋白的唾液酸化程度。在实施方式之一中，独立于影响细胞比生产率的其它因素之外调节渗透摩尔浓度来控制成熟蛋白质中的唾液酸含量。在另一实施方式中，在调节影响细胞比生产率的其它因素之外调节渗透摩尔浓度。在优选实施方式之一中，渗透摩尔浓度和链烷酸浓度同时受到调控。
对细胞培养环境的渗透摩尔浓度进行调控从而在细胞比生产率和生成的糖蛋白中唾液酸含量之间按要求形成平衡。通常，渗透摩尔浓度提高时，细胞比生产率提高。在选择产生具有要求的唾液酸含量的蛋白质的渗透摩尔浓度时，必需记住渗透摩尔浓度的提高通常会提高特定蛋白质的生产速度。为了降低生产速度而提高成熟糖蛋白中的唾液酸含量，通常将渗透摩尔浓度维持在适合于特定培养细胞类型的较低水平。
对哺乳动物细胞培养来说，培养基的渗透摩尔浓度通常在约290-330mOsm。但是，提高渗透摩尔浓度通常会提高蛋白质的生产速度。渗透摩尔浓度的选择需使得生产速度与要求的产物特性相对应。为了提高唾液酸含量，生产速度被降低，通常根据培养的特定细胞将渗透摩尔浓度维持在较低的范围。对于高唾液酸浓度来说，合适的渗透摩尔浓度在约250mOsm至约450mOsm范围之间。根据本发明这一方面的内容，较好的是将渗透摩尔浓度维持在约300至450mOsm之间，更好的是维持在350至400mOsm之间，最好约为400mOsm。
为了低唾液酸含量可选用会提高生产速度的渗透摩尔浓度。根据本发明的这一方面内容，渗透摩尔浓度被维持在约350-600mOsm之间，约450至550mOsm更好。
熟练的操作者懂得，培养基的渗透摩尔浓度取决于培养液中的渗透压活性粒子浓度，而且，许多变量构成了哺乳动物细胞培养基复杂的冲击渗透摩尔浓度。培养基最初的渗透摩尔浓度取决于培养基的组成。渗透摩尔浓度可以利用渗透压计来测定，例如Fisher Scientific，Pittsburgh，Pennsylvania出售的商品名为OSMETTE的渗透压计(或是Precision Systems，Inc.Natick MA的Osmette 2007型)。例如，为了获得要求范围内的渗透摩尔浓度，可以调节培养基中不同组分的浓度。
可以加入培养基中提高其渗透摩尔浓度的溶质包括蛋白质、肽、氨基酸、水解动物蛋白例如蛋白胨、非代谢聚合物、维生素、离子、盐、糖、代谢物、有机酸、脂类等。在实施方式之一中，通过在补料分批培养过程中结合其它培养基组分一起加入蛋白胨来调控渗透摩尔浓度。
根据本发明，通过添加例如除蛋白胨之外还包含氨基酸、各种盐(例如NaCl)的基本培养基来维持或调节渗透摩尔浓度在一定的范围内。在优选实施方式之一中，培养基被补充以例如包含过多氨基酸(参见前文美国专利5,122,469中的“超”培养基)、葡萄糖和蛋白胨的基本培养基。
但是，应该理解，为了获得上述渗透摩尔浓度范围，可以改变培养基中其它组分的浓度。例如，在培养过程中间断或连续调控培养基中的葡萄糖(主要能量来源)浓度可以将培养基的渗透摩尔浓度大致维持在规定的要求范围内。调控葡萄糖浓度的作用在于为细胞提高足够的碳源，同时控制宿主细胞的乳酸生产。其优点在于限制了培养基中pH的下降，pH下降需要加入中和剂(例如Na2CO3或NaOH之类的碱)由此造成渗透摩尔浓度的升高。
可以按照任何用于维持细胞培养的方法补充培养基以维持渗透摩尔浓度在合适的范围内。在优选实施方式之一中，培养***是补料分批培养***，在细胞培养的生产期通过补料分批补加培养基。此外，可以按照下文所述在生产期补加培养基。
或者，可以进行离线的培养基取样。由此可以通过按要求调节补料溶液来改变培养基的渗透摩尔浓度。
熟练技术人员明白，本发明对细胞培养过程的选择是为了获得要求的蛋白质产物的唾液酸化水平。影响唾液酸化水平的过程参数除了以上所述之外还包括氧水平和葡萄糖水平。培养物密度、时间和保存条件例如温度也影响着唾液酸化作用。本发明倾向于将其它最适合于加强唾液酸化的过程参数都包含在内。
III.糖蛋白的回收
在多肽生产期之后，利用本领域的成熟技术来从培养基中回收感兴趣的多肽。
感兴趣的多肽最好以分泌多肽的形式从培养基中回收得到，但是也可能从宿主细胞裂解物中进行回收。
第一步，离心培养基或裂解物以去除颗粒细胞碎片。利用以下合适纯化过程范例从污染性可溶蛋白和多肽中纯化多肽：免疫亲和柱或离子交换柱上的分离；乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅或阳离子交换树脂例如DEAE上的色谱；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephdex G-75的凝胶过滤；和用于去除例如IgG污染蛋白的蛋白A琼脂糖柱。在纯化过程中还可能需要使用例如苯甲酰磺酰氯(PMSF)之类的蛋白酶抑制剂来抑制蛋白质降解。本领域的技术人员将理解，考虑到重组细胞培养中表达的多肽的特性变化，可能需要修改适合感兴趣的多肽的纯化方法。
本发明特别优选的是适合本发明的糖类而选用的纯化技术和方法。可以例如通过选择偏酸性流份的离子交换软凝胶色谱或使用阳离子或阴离子交换树脂的HPLC来富集含唾液酸分子的本发明要求的糖基形式。
IV.糖蛋白分析
根据需要，利用糖类分析的常规技术可方便地分析本发明方法产生的糖蛋白中的复合糖类部分。这样，例如本领域众所周知的凝集素印迹等技术揭示末端的甘露糖或其它糖例如葡萄糖的比例。利用本领域众所周知的无水肼法或酶法和利用离子交换或大小排阻色谱或其它方法进行的寡糖分级分离，通过糖从蛋白质中的释放来证实唾液酸是单、双、三或四-触角寡糖的未端。还可以在用神经氨酸酶处理去除唾液酸之前或之后测定糖蛋白的pI。神经氨酸酶处理之后pI的升高表示在糖蛋白上存在唾液酸。
本发明的糖类结构被表达为N-连接或O-连接的糖类位于蛋白质上。N-连接和O-连接的糖类主要区别在它们的核心结构。N-连接的糖基化指糖部分通过GlcNAc与肽链中的天冬酰胺残基连接。N-连接的糖类都含有一个Man1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R的共有核心结构。所以，在上述核心结构中，R代表生成的蛋白质的天冬酰胺残基。生成的蛋白质的肽序列将包含天冬酰胺-X-丝氨酸，天冬酰胺-X-苏氨酸，和天冬酰胺-X-半脱氨酸，其中的X是脯氨酸之外的任意氨基酸。相对地，O-连接的糖类其特征在于GlaNAc与苏氨酸或丝氨酸的羟基连接的共有核心结构。对N-连接和O-连接的糖类来说最重要的是复合的N-和O-连接的糖类。这样的复合糖类包含数个触角结构。单、二、三和四-外部结构对添加末端唾液酸来说十分重要。这样的外部链结构为构成本发明糖类的特定的糖和连接提供了额外的位点。
形成的糖类可以利用任意本领域的已知方法，包括本文所述的方法来分析。有数种糖基化分析方法是本领域已知的并被用于本发明。这些方法提供了有关与肽连接的寡糖的同一性和组成的信息。用于本发明的糖类分析方法包括但不限于凝集素色谱；使用高pH阴离子交换色谱根据电荷来分离寡糖的HPAEC-PAD；NMR；质谱；HPLC；GPC；单糖组成分析；顺序酶消化。
此外，寡糖释放技术是已知的。这些技术包括1)酶法，通常用肽-N-糖苷酶F/内-β-半乳糖苷酶；2)利用苛性碱环境来释放主要为O-连接的结构的β消去法；和3)使用释放N-连接和O-连接的寡糖的无水肼的化学方法。
可以使用以下步骤来进行分析：
1.用去离子水透析样品，以去除所有的缓冲盐，然后冷冻干燥。
2.用无水肼法释放完整的寡糖链。
3.用无水甲醇HCl处理完整的寡糖链，释放出O-甲基衍生物形式的单个单糖。
4.N-乙酰化任意必需氨基。
5.衍生成过氧-三甲基甲硅烷基甲基糖苷。
6.在CP-SIL8柱上利用毛细GLC(气-液色谱)分离上述衍生物。
7.利用GLC的滞留时间和质谱，与已知标准物比较鉴定各糖苷衍生物。
8.通过利用内标(13-O-甲基-D-葡萄糖)的FID定量各衍生物。
可以利用高性能阴离子交换色谱结合脉冲安培计(HPAE-PAD糖***，Dionex Corp.)测定中性的和氨基糖。例如，可以于100℃在20％(v/v)三氟乙酸中水解6小时来释放糖。然后通过冷冻干燥或用Speed-Vac(Savant Instruments)干燥水解产物。然后将残留物溶解在1％的三水合乙酸钠溶液中，并在HPLC-AS6柱上如Anumula等所述(《生物化学记要》195：269-280(1991))进行分析。
可以用Yao等的方法(《生物化学记要》179：332-335(1989))分别在三份样品中直接测定唾液酸。在优选实施方式之一中，使用的是Warren，L.J.《生物化学杂志》238：(8)(1959)所述的巴比妥酸(TBA)。
或者，可以进行免疫印迹糖类分析法。根据该方法，利用上述的聚糖检测***(Boehringer)来检测与蛋白质结合的糖类，该***以Haselbech和Hosel所述的氧化性免疫印迹法(Haselbeck等，《糖结合物杂志》(Glycoconjugate J.)7：63(1959))为基础。按照制造商的建议进行染色，所不同的是将蛋白质转移到聚二氟乙烯薄膜上而不是硝酸纤维素薄膜，而且封闭缓冲液中含有溶于10mM pH7.4、含0.9％氯化钠的Tris缓冲液中的5％胎牛血清白蛋白。用与碱性磷酸盐结合物连接的抗洋地黄毒苷抗体进行检测，抗体按1∶1000稀释在tris缓冲液中，该缓冲液使用了溶于100mM pH9.5、含100mM氯化钠和50mM氯化镁的tris缓冲液中的磷酸酶底物4-硝基蓝四唑氯0.03％(w/v)和5-溴-3-吲哚基磷酸酯0.03％(w/v)。通常，约10至15分钟后可以看到含糖类的蛋白质条带。
还可以利用肽-N-糖苷酶F来分析糖类。根据该方法，残留物被悬浮在含0.18％SDS，18mM β-巯基乙醇，90mM磷酸盐，3.6mM EDTA，pH8.6的14μl缓冲液中，并在100℃加热3分钟。冷却至室温后，将样品分成两等份。一份不经处理作为对照。另一份调节至含1％NP-40去垢剂，然后用0.2单位肽-N-糖苷酶F(Boehringer)处理。将两份样品均在37℃保温2小时，然后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
V.肿瘤坏死因子受体免疫球蛋白嵌合物
在优选实施方式之一中，本发明方法被用于产生肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(Ig)嵌合物。在这类嵌合蛋白中特别好的是可溶性1型TNFR-IgG1。生成的TNFR-IgG1常被用于治疗和诊断多种由TNF介导或与TNF相关的疾病和紊乱。“治疗”在本文中同时包括防治(预防)、抑制(例如某种症状)和治疗表现出的病症。与TNF相关的病理状况包括但不限于革兰氏阴性和***、内毒素性休克、移植排斥现象、类风湿性关节炎、***性狼疮、Crohn氏症和其它与TNF相关的自身免疫和炎性疾病。
本发明的TNFR1-IgG1常可用于被发现用TNF的单克隆抗体有效的指征中。例如，在动物模型中，TNF-α的单克隆抗体被发现在预防性使用时具有保护作用(Tracey，K.J.等(1987)《自然》(Nature)330：662)。在I期临床研究中，据Exley，A.R.等在(1990)《柳叶刀》(Lancet)335：1275中报道，针对人重组TNF-α的小鼠单克隆抗体在给严重败血性休克病人使用时是安全的。TNFR1-IgG1适合用于治疗类风湿性关节炎和败血性休克。
在治疗与TNF相关的疾病或紊乱的方法中，给需要这种治疗的病人使用治疗有效量的TNFR1-IgG1制剂。
本发明中，用于治疗疾病或紊乱的TNFR-IgG1糖基化制剂的有效量在0.01-100mg/病人的范围内；1mg-75mg/病人更好，最好是约10至约50mg/病人。
为了使用，需将TNFR1-IgG1制剂配制成合适的药物或治疗性组合物。这类组合物通常包含治疗有效量的TNFR1-IgG1制剂和药学上认可的赋形剂或载体例如生理盐水、缓冲盐、葡萄糖或水。组合物还可以包含特定的稳定剂例如糖，其中包括甘露糖和甘露糖醇，和针剂组合物中的局部麻醉剂，其中包括例如利多卡因。
本发明提供进一步包含治疗有效量的其它活性成份的组合物，这些成份例如与TNF生成有关的单克隆抗体(例如抗TNF抗体，Mac1或LFA1的抗体)或其它受体，例如IL-1或IL-2受体等。
一种如上所述用于单一或联合疗法的较好的组合物包含本发明新的TNFR1-IgG1制剂，它表现为从血液中清除被延迟，同时保持着很高的功能活性。这样被延长的功能性半衰期允许使用简单的弹丸剂型，而且有利于其在体内的效力。治疗组合物中较好的TNFR1-IgG1嵌合物包括TNFR1-IgG1和本文所述的制剂，例如：
(1)包含一个或多个唾液酸未端的复合寡糖的TNFR1-IgG1制剂；
(2)经色谱聚焦测得的制剂等电点pI范围在5.5至7.5之间的TNFR1-IgG1制剂，在所述的测试中，pI对神经氨酸酶处理敏感；
(3)每摩尔蛋白质具有约1至2摩尔暴露的N-乙酰基葡糖胺残基的TNFR1-IgG1制剂；
(4)唾液酸与蛋白质的摩尔比约为4至7，更好的是5至6的TNFR1-IgG1制剂；
(5)唾液酸与N-乙酰基葡糖胺残基的摩尔比约为0.35至约0.5，更好的是约0.4至0.45的TNFR1-IgG1制剂。
本发明单一或合用治疗组合物的使用途径包括标准途径，例如静脉输注或弹丸注射。
本发明还提供了本发明的TNFR1-IgG1制剂在生产治疗人或动物的药物中的用途。
以上已经对本发明进行了全面的说明，参照以下说明性实施例将对本发明有更为清晰的理解，除非另作说明，这些实施例都不对本发明构成限制。
实施例
TNF-α和TNF-β的生物作用是通过特异性受体介导的(Dembic等，(1990)《细胞因子》(Cytokines)2：231)。分子克隆已经证明存在着两种不同类型的TNF，表观分子量分别为55千道尔顿(KD)(1型)(Schall等，(1990)《细胞》(Cell)61：361)和75KD(2型)(Smith等，1990《科学》(Science)248：1019)，每一种天然地与TNF-α和TNF-β都结合(Loetscher等，(1990)《细胞》(Cell)61：351；Shall等，(1990)《细胞》(Cell)61：361；Kohno等，(1990)《美国科学院院报》87：8331)。两种受体的胞外部分被发现在天然条件下是可溶性的TNF结合蛋白(Kohno等，同上)。已经开发出了在多种免疫和炎性病症中抑制TNF的损伤作用的TNF的拮抗剂(Peppel等，(1991)《实验医学杂志》(J.Exp.Med)174：1483-1489；Ulich，(1993)《美国病理学杂志》(Am.J.Path.)142：1335-1338；Howard，O.M.Z.，(1993)《美国科学院院报》90：2335-2339；Wooley，P.H.，(1993)《免疫学杂志》(J.Immunol.)151：6602-6607)。这类拮抗剂之一合并了人的55KD 1型TNF的胞外区与人免疫球蛋白G1重链的铰链区和Fc区(Werner等，(1991)《细胞生物学杂志摘要，第20届年会》(J.Cell.Biochem.Abstract，20th annual meeting)p.115)。
                               方法
A.细胞系
用作宿主细胞系的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)来源于CHO-K1(ATCC No.CCL61 CHO-K1)。使用CHO-K1的突变型二氢叶酸还原酶缺陷细胞系CHO-K1DUX-B11(DHFR)(由哥仑比亚大学的L.Chasin博士提供；Simonsen，C.C.和Levinson，A.D.(1983)《美国科学院院报》80：2495-2499；Urlaub G.和Chasin，L.(1980)《美国科学院院报》77：4216-4220)，经包含编码前胰岛素原的cDNA转染后制得对胰岛素需求降低的细胞系(Sures等，(1980)《科学》208：57-59)。选出的dp12.CHO克隆其生长需要甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶，由此证实其DHFR基因型。
B.可溶性1型TNFR1-IgG1嵌合物的构建
通过将人1型TNFR的胞外区与IgG1重链的铰链区和CH2及CH3区基因融合(后文称为TNFR1-IgG1)来构建可溶性1型嵌合物。
从质粒pRK-TNF-R(Schall等，《细胞》61：361(1990))上获取编码人1型TNFR的DNA序列(参见Loetscher等，同上)。为了构建该起始质粒，将一段2.1kb的胎盘cDNA克隆((Schall等，同上)***到哺乳动物表达载体pRK5中，于1989年3月15日公开的EP Pub.No.307，247中记述了该构建物。这段cDNA起始于Loetscher等报道的序列中第64位核苷酸，在起始甲硫氨酸上游118bp。
IgG1编码序列的来源是CD4-IgG表达质粒pRKCD42FC1(Capon，D.J.等，《自然》(Nature)337：525(1989)；Byrn等，《自然》344，667(1990))，其中含有一段编码一种杂交多肽的cDNA序列，该多肽由成熟人CD4蛋白的1-180残基(两个N-末端CD4可变区)和从第216位天冬氨酸开始(以第114位氨基酸作为重链恒定区(Kabat等，《具有免疫学意义的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)第4版(19867))的第一个残基，该残基在半胱氨酸残基参与重链-轻链结合后成为IgG1铰链区的第一个残基)到第441位残基结束之间包含IgG1的CH2及CH3区的人IgG1序列融合而成。
如下构建TNFR-IgG1，从质粒pRK-TNF-R和pRKCD42FC1产生限制性酶切片段，将它们连接，利用缺失诱变使得成熟TNFR第171位的苏氨酸残基与IgG1重链(Kabat等，同上)第216位的天冬氨酸残基并列。形成的质粒pRKTNFR-IgG包含了全长的TNFR-IgG1编码序列。
C.细胞培养
通过转染将编码可溶性1型TNFR1-IgG1的基因引入dp12CHO细胞。利用用于将DNA引入哺乳动物细胞的磷酸钙技术来完成该过程。转染后2天，用胰蛋白酶消化细胞，平铺在选择性培养基(不含甘氨酸-次黄嘌呤和胸腺嘧啶的HamF12 DMEM培养基，1∶1v/v，含2％透析过的血清)中。然后筛选分泌TNFR1-IgG1的分离体。在氨甲喋呤高产率表达克隆中扩增表达TNFR1-IgG1的克隆，然后使之适应无血清的培养基。让这些细胞处于连续选择压力之下，直至转移至用于接种物的生长和扩增的非选择性培养基中。
为了提供用于产生TNFR1-IgG1培养物的细胞，以上所述的细胞在体积不断增加的容器中，通过连续的亚培养，在含氨甲喋呤的培养基中扩增，然后生长在不含氨甲喋呤的培养基中。用于本方法以上步骤的非选择性生长培养基是DMEM/HAM F-12基本配方(参见例如美国专利5,122,469)，但改变其中某些组分的浓度，例如葡萄糖、氨基酸、盐、糖、维生素、甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶；重组人胰岛素、水解蛋白胨(Primatone HS或Primatone RL)、细胞保护剂例如Pluronic F68(Pluronic多元醇)或其它保护剂；庆大霉素；脂类和微量元素。
用CO2气体(酸)和/或Na2CO3(碱)将培养物控制在pH7.2±0.4。生长期的温度控制在近37℃。直接通空气和/或氧气来将溶解氧维持在空气饱和度的5％以上。
维持接种物扩增期的渗透摩尔浓度在约250mOsm至350mOsm之间。
每一次培养的生长期之后都继之以第二期或过渡期，在此期间，培养参数由最适于生长向生产条件转变。在过渡期，培养***的温度通常下降至约30至35℃之间。加入丁酸盐并使用一定的渗透摩尔浓度范围。分析在该生产期积累的产物中唾液酸的含量。
在一种典型的生产程序中，约1.2×106个来自选择阶段接种物扩增的细胞在生长期进行生长，起始渗透摩尔浓度为300mOsm。在生长培养基中补充微量元素、重组人胰岛素和水解蛋白胨。细胞在此条件下生长2天。在第3天开始时降低细胞培养物的温度。在改变温度的同时或其后在细胞培养物中加入丁酸钠，并通过加入各种培养基组分来调节到要求的生产渗透摩尔浓度。在此条件下并结合补料培养细胞9至10天。在必要时为细胞补加各种培养基成份。
表I说明了各生产过程的生产条件。
过程   丁酸盐      生产期          第5至第10天的    第10天TNFR1-IgG1中的
       浓度        渗透摩尔浓度    细胞比生产率     唾液酸含量
       (mmol/l)    (mOsm/kg)       (pg/d)           (mol/mol)
A      1           360-420         0.6-1.5          6.4-7.2       N＝4
B      1           480-510         1.7-2.2          6.0-6.3       N＝3
C      6           460             4.8              4.7           N＝1
D      6           370-420         2.4-2.8          5.5-5.6       N＝3
E      6           350-370         1.4-2.3          5.4-6.3       N＝3
F      12          390             4.0              5.3           N＝1
G      12          490-510         2.9-5.2          4.0-5.2       N＝4
H      12          400-430         2.0-2.8          5.8-6.0       N＝3
I      12          370-380         2.0-2.2          5.5-5.9       N＝3
D.TNFR1-IgG1的回收
按照Capon等，同上所述，利用固定化金黄色葡萄球菌蛋白A的亲和色谱将TNFR1-IgG1嵌合物纯化至同源性95％以上。
E.糖类的分析
利用Warren，L(1959)《生物化学杂志》234：1971-1975中的方法分析唾液酸含量。
结果
表I中每一批生产培养物的细胞比生产率都对收获的产物中的唾液酸含量作图。结果列于图1。当过程参数被维持在生产渗透摩尔浓度约360至420mOsm之间而丁酸盐浓度约为1mM时，观察到了最高唾液酸含量。通过调节过程参数可在一较宽的范围内控制唾液酸含量。
                           实施例II
测定不同制剂的血浆药物动力学半衰期和/或清除速度。一般，唾液酸高含量剂表现出比唾液酸低含量制剂高的血浆半衰期和/或较低的总清除速度。
方法
将17个重272-315g的雄性Sprague-Dawley衍生的大鼠随机分成3个TNFR1-IgG1融合蛋白处理组(每组的N＝5或6)。利用股静脉插管给动物静脉输注5mg/kg正常剂量的测试物。选择的测试物包括两种来自过程I的TNFR1-IgG1制剂，即生产期的丁酸盐浓度为6mM而渗透摩尔浓度维持在约400mOsm，和来自过程II的第3种TNFR1-IgG1制剂，即生产期的丁酸盐浓度约为12mM而渗透摩尔浓度约为500mOsm。在输注前和输注后5分钟及2、6、10、24、34、48、56、72、96和120小时采集2ml的血样加到EDTA(8.5％)上。离心血样，收集血浆，测定血浆中TNFR1-IgG1融合蛋白的浓度。
使用酶联免疫和生物结合测定法(ELIBA)来定量大鼠血浆中TNFR1-IgG1。该测定方法以与辣根过氧化物酶偶联的TNF-α(TNF-α-HRP)结合TNFR1-IgG1融合蛋白的受体部分的能力为基础。在该测定中，用包被在微量滴定板孔中的山羊抗人IgGFc的Fab片段通过与分子的Fc部分相互作用来捕获TNFR1-IgG1。在孔中加入TNF-α-HRP使之与捕获到的TNFR1-IgG1的受体部分结合。通过测定过氧化物酶和过氧化物及正苯二胺(OPD)底物间反应产生的颜色来定量。测定的量级为0.003至0.02mg/ml。存在于血浆样品中的EDTA经证明对测定的性能没有影响。
标定剂量以计算用药溶液浓度差异。全部计算都以相对于120小时时间点内时间数据的浓度为基础。利用梯形法则计算曲线下的截面积(AUC0-120)，计算重量标定的截清除速度(CL0-120/W)，即剂量/AUC0-120。
结果
清除速度根据过程的不同(过程I与过程II比较)和产物中唾液酸含量的不同而不同。下文表II列出了由以上研究测得的动物个体的清除速度和得到的平均值与标准偏差。过程I表现出较低、较理想的清除速度。
                             表II
                      清除0-120(ml/hr/kg)
                 过程I      过程I     过程II
                 2.12        2.08       2.144
                 2.03        2.31       2.99
                 1.63        2.20       2.61
                 1.89        2.22       3.27
                 1.85        1.99       2.82
                             1.66       3.42
平均值           1.91        2.08       2.88
标准偏差         0.02        0.23       0.45
                         实施例III
                      TNFR1-IgG1的单糖组成
对实施例I中制备的TNFR1-IgG1的寡糖的糖组成和结构测定显示，不同过程的唾液酸含量是不同的。快速的血浆清除与GlcNAc的高度暴露、寡糖链上的低唾液酸含量和蛋白质对甘露糖或半乳糖受体的(根据推断的)可接近性相关。较慢的血浆清度与多末端唾液酸残基相关。
A.测试物的来源
按照实施例I中所述的方法生产TNFR1-IgG1。从在生产期使用6mM丁酸盐和约400mOsm渗透摩尔浓度的细胞培养物制取过程I物质。从在生产期使用12mM丁酸盐和约500mOsm渗透摩尔浓度的细胞培养物制取过程II物质。
B.方法
利用高pH阴离子交换色谱结合以脉冲安培计检测来测定完整的中性和氨基-糖的释放。使用以下步骤进行检测：
1.用TNFR1-IgG1(约50μg/ml)和合适的参照样品进行缓冲交换，使得最终样品被包含在1％乙酸中。
2.在干冰和乙醇浴中冷冻约90μg的TNFR1-IgG1和参照物样品，然后通宵冷冻干燥冻结后的样品。
3.将冷冻干燥的样品再生在500μl三氟乙酸中，在120℃温育1小时。
4.酸水解之后，冷却TNFR1-IgG1和参照样品，并蒸发至干燥。
5.样品用水再生，至最终浓度约0.6mg/ml。
6.使用一根Dionex CarboPac PA1(4×250mm)柱(Dionex Corp.，Sunnyvale，CA)，在环境温度下利用高pH阴离子交换色谱结合以脉冲安培计检测来分离单糖。
7.通过与参照单糖的比较来定量各种单糖。
C.结果
表III列出了两种制剂中每种单糖的相对摩尔浓度。
                            表III
        两种TNFR1-IgG1制剂中单糖的相对摩尔浓度
单糖                      过程I              过程II
果糖                       4.3±0.2            4.4
半乳糖                     6.5±0.0            4.7
甘露糖                     12.2±0.6           12.5
N-乙酰基葡糖胺             14.1±0.6           14.3
唾液酸                     4.9±0.3            3.7±0.3
N-乙酰基半乳糖胺           0.5±0.1            0.3
唾液酸/GlcNAc之比          0.35                0.26
以上结果表明，选择用于糖蛋白生产期的过程参数影响着成熟糖蛋白的糖组成。具有较高唾液酸含量的制剂通常表现出被延迟的血清半衰期。
下文表IV和V表明在过程I和过程II型条件下产生的TNFR1-IgG1嵌合物制剂中寡糖侧链的糖组成。表V给出减去FC的糖基化位点后嵌合物分子受体部分的糖数据。
                             表IV
                       PI        PI        PI      PI     PII    PII
唾液酸                 5.8        5.8        5.7      5.8     3.7     3.5
果糖                   4.0        4.0        3.6      4.1     4.4     4.3
Gal NAc                0.3        0.2        0.2      0.4     0.3     0.4
Glc NAc                12.9       15.0       14.8     14.3    14.3    14.4
Gal                    7.4        7.6        7.1      7.0     4.7     4.1
Man                    12.0       12.0       10.0     12.0    12.5    11.9
SA/GlcNAc之比          0.45       0.39       0.39     0.41    0.26    0.24
                                 表V
                       PII       PII       PI      PI
暴露的GlcNAc           3.18       3.2        1.11     1.32
(摩尔/摩尔)
暴露的Gal              0.97       -0.08      1.45     -0.26
(摩尔/摩尔)
Gal触角                4.47       4.72       6.45     6.24
唾液酸(摩尔-1)        3.5        4.8        5.00     6.5
表IV和表V中的结果表明，TNFR1-IgG1的组成是典型的唾液酸为未端的单、双和三触角复合寡糖。可以推断，由过程I制备的TNFR1-IgG1含有很高比例的唾液酸和很低比例的暴露的GlcNAc。每摩尔蛋白质中的唾液酸表明该物质具有比过程II产生的物质低的等电点。与表II的结果比较，以上结果还证明过程I物质较慢的血浆清除总是与较低的暴露的GlcNAc含量和较高的唾液酸含量相关。
表IV和表V表明，TNFR1-IgG1制剂包含以一个或多个唾液酸残基为未端的复合寡糖。较佳的TNFR1-IgG1制剂包含每摩尔蛋白质上具有约1至2摩尔暴露的N-乙酰基葡糖胺残基的TNFR1-IgG1分子。唾液酸与蛋白质的摩尔比约为4至7。TNFR1-IgG1制剂的唾液酸与N-乙酰基葡糖胺的摩尔比约为0.4至0.45。
                       实施例IV
重度唾液酸化的制剂的pI比轻度唾液酸化的制剂的低。
方法
对实施例II中的各种制剂进行等电聚焦。等电聚焦凝胶电泳利用pH不同的两性电解质产生的pH梯度，根据糖蛋白的等电点pI将它们分离。在该研究中，使用10至4的pH梯度进行制剂的分析。
结果
经色谱聚焦测定，TNFR1-IgG1制剂的等电点范围约为5.5至7.5，在该测定中pI对神经氨酸酶处理敏感。
不论是否具体与本文结合，以上引用的参考文献都作为参考结合在本发明中。
虽然结合具体的实施方式对本发明进行了说明，但显然它还可以进一步修改。本申请的目的在于覆盖在总体上遵循本发明原理的任何形式的改变、用途或适应性修改，包括虽然与在此公开的内容不同但可以由本发明所述领域的已知技术或常规技术得出的结果，以及后文权利要求范围内的实质性特征。

Claims (21)

1.调控由哺乳动物细胞培养物产生的糖蛋白中寡糖侧链上唾液酸含量的方法，它包括：
i)在细胞培养物中加入浓度0.1mM至20mM的链烷酸或其盐；
ii)将细胞培养物的渗透摩尔浓度维持在250至600mOsm；和
iii)将细胞培养物的温度保持在30-37℃。
2.根据权利要求1所述的方法，在其中提高糖蛋白中寡糖侧链上的唾液酸含量，而其中：
通过将宿主细胞培养在0.1至6mM的链烷酸或其盐浓度中，并维持渗透摩尔浓度为300至450mOsm来降低细胞培养物的比生产率。
3.根据权利要求2所述的方法，其中的宿主细胞是CHO细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中的链烷酸或其盐是丁酸钠。
5.根据权利要求4所述的方法，其中产生的糖蛋白是哺乳动物糖蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其中的糖蛋白是肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白嵌合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中的宿主细胞是用含编码可溶性1型肿瘤坏死因子免疫球蛋白G1嵌合物的cDNA的载体转染的dp12.CHO细胞系。
8.根据权利要求1所述的方法，在其中降低糖蛋白中寡糖侧链上的唾液酸含量，而其中：
通过将宿主细胞培养在6至12mM的链烷酸或其盐浓度中，并维持渗透摩尔浓度为450至600mOsm来提高细胞培养物的比生产率。
9.根据权利要求8所述的方法，其中的宿主细胞是CHO细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中的链烷酸或其盐是丁酸钠。
11.根据权利要求10所述的方法，其中产生的糖蛋白是哺乳动物糖蛋白。
12.根据权利要求11所述的方法，其中的糖蛋白是肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白嵌合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中的宿主细胞是用含编码可溶性1型肿瘤坏死因子免疫球蛋白G1嵌合物即TNFR1-IgG1嵌合物的cDNA的载体转染的dp12.CHO细胞系。
14.根据权利要求1所述的方法，所述的糖蛋白是人可溶性1型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白即TNFR1-IgG1嵌合蛋白，它包括：
(a)在生长期培养表达TNFR1-IgG1嵌合物的CHO宿主细胞，在一定的条件下培养一定的时间以便获取最大程度的细胞生长；
(b)在生产期，如下培养所述宿主细胞：
(i)在有6mM至12mM丁酸钠存在下培养宿主细胞；
(ii)将渗透摩尔浓度维持在450至600mOsm。
15.根据权利要求1所述的方法，所述糖蛋白是人可溶性1型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白即TNFR1-IgG1嵌合蛋白，它包括：
(a)在生长期培养表达TNFR1-IgG1嵌合物的哺乳动物宿主细胞，在一定的条件下培养一定的时间以便获取最大程度的细胞生长；
(b)在生产期，如下培养所述宿主细胞：
(i)在有1mM至6mM丁酸钠存在下培养宿主细胞；
(ii)将渗透摩尔浓度维持在300至450mOsm。
16.根据权利要求15所述的方法，其中的宿主细胞是CHO细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中的宿主细胞是dp12.CHO细胞。
18.由权利要求14或15制得的TNFR1-IgG1分子，其中TNFR1-IgG1分子的唾液酸与蛋白质的摩尔比为4至7。
19.根据权利要求18所述的TNFR1-IgG1分子，其中每摩尔TNFR1-IgG1分子具有1至2摩尔的暴露的N-乙酰基葡糖胺残基。
20.根据权利要求18所述的TNFR1-IgG1分子，其中TNFR1-IgG1分子的唾液酸与N-乙酰基葡糖胺的摩尔比为0.35至0.5。
21.根据权利要求18所述的TNFR1-IgG1分子，其中唾液酸与N-乙酰基葡糖胺的摩尔比为0.4至0.45。
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