CN104211783B - 一种蓝耳病亚单位疫苗的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蓝耳病亚单位疫苗的制备。所述疫苗含有猪繁殖与呼吸***综合征病毒PRRSV GP5蛋白二联体以及纯化标签。本疫苗生产制备工艺稳定，适合大规模生产。靶动物实验表明，本发明所述的重组亚单位疫苗能够诱导有效的体液免疫。

Description

一种蓝耳病亚单位疫苗的制备

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种猪蓝耳病亚单位疫苗制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将主要结构蛋白GP5串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到重组蓝耳病亚单位疫苗以及该疫苗在预防重大动物疾病猪蓝耳病中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcinere productive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinere productive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的猪病毒性疾病，以妊娠母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病及免疫抑制和持续性感染为特征，是近年来引起世界养猪业严重经济损失的重要疾病之一(Terpstraet al.1991)。现在PRRSV几乎在所有的养猪国家都流行(Bilodeau et al，1991；Wensvoortet al，1991；Albina et al，1997)。目前针对该病的防控，疫苗免疫仍然是一个主要的途径之一(梁皓仪，2008)。

PRRSV基因组大小为15kb左右，含有8个开放阅读框架(ORFs)，其5’末端有帽子结构，3’末端有一个Poly(A)尾巴。GP5(E蛋白)具有中和表位，为病毒的主要免疫保护型抗原；PRRSV与EAV同为马动脉炎病毒科成员，GP5的生物学功能非常重要，主要在病毒感染、细胞结合及病毒吸附中起作用，也是淋巴细胞增生性应答的靶点。

GP5蛋白是PRRSV病毒的主要囊膜糖蛋白，是病毒的重要的中和抗原(Pirzadeh etal.，1998；Gonin et al.，1999)，可以刺激机体产生中和抗体和细胞免疫，另外，针对GP5蛋白的单克隆抗体也被证实具有病毒中和活性。GP5有6个抗原决定簇，3个B细胞表位，能诱导机体产生中和抗体(Plagemann，2004)，是PRRSV所有结构蛋白中产生中和抗体最强的结构蛋白，GP5诱导产生的中和抗体效价与对病毒的保护是呈显著的相关性；GP5的另一重要作用是可诱导细胞凋亡(Fernidez et al.，2002)。用表达GP5的基因工程疫苗免疫猪，可以产生针对PRRSV的中和抗体(Pirzadeh and Dea，1997；Zhanget al.，1998)，而且免疫猪攻毒后可以得到有效的保护，比如缓解病毒血症和减轻肺部损伤(Pirzadeh et al，1998；Xueet al.，2004；Qiu et al.，2005)。有研究人员对6株“高热综合病”RRSV变异株的GP5的同源性进行对比，表明同源性较高，均位于同一个独立的分支中。现行疫苗株RespPRRS/ReproMLV，PrimePac，IngeIvacATP和CH-1 a分别位于不同的分支中。在高致病性蓝耳病的GP5中，中和表位的抗体结合位点的39位氨基酸发生了比较一致的突变。且在9，16，35，39，58，94及185为氨基酸发生了比较一致的突变，与先前的疫苗株和国内流行株有明显的差异。所有高致病性PRRS分离株的13位和151位的氨基酸都为R，表现为强毒类型(Ansari IH，2006)。GP5蛋白含有多个中和表位，用重组GP5蛋白制备的单克隆抗体具有中和活性，病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性。针对GP5的单克隆抗体的中和活性比针对其它蛋白如GP4蛋白的单克隆抗体更强。研究表明，GP5蛋白至少包含两种类型的中和抗原决定簇，一些为线性决定簇，可以与大肠杆菌表达的重组GP5蛋白反应，还有一些为构象依赖性决定簇(KreutzLC，1997；PirzadehB，1998；Weiland E，1999；Zhang Y，1998)。

应用缺失突变的方法证明GP5至少含有两个重要的抗原相关区域，分别位于胞外域的aa27～41和C-端的aa180～197。然而，对病毒蛋白和大肠杆菌表达的重组GP5蛋白反应阳性的猪血清却不与C-末端缺失50个氨基酸残基的GP5蛋白反应，说明C-末端是是一个重要的抗原决定簇和/或在维持蛋白构象中发挥重要作用。推测GP5蛋白含有一个胞外结构域，包括蛋白的大约前40个氨基酸(Rowland RR，1999)。在胞外结构域的中间已经鉴定出一个主要的中和表位(B epitope，aa37-45)和一个非中和表位(A epitope，aa27-35)。GP5蛋白在N-末端有一个高度疏水的区域，作为该蛋白的前导区。GP5蛋白中还包含有许多跨膜疏水区，这些区域可以使翻译的GP5蛋白停留在内质网(ER)内，从而抑制GP5蛋白的表达。现在已经得到证实在14-31和64-134处有两个主要的跨膜区域(Osrowski M，2002；Wissink EH，2003；)。

PRRS灭活疫苗具有安全、不存在散布病毒和造成PRRS新疫源的危险，便于贮存和运输、对母源抗体的干扰作用不敏感等优点，因此人们首选灭活疫苗来预防和控制PRRS。国内分离的PRRSV CH-1a株制成油佐剂灭活疫苗，该毒株是经Marc-145细胞系传代、多次克隆纯化，筛选出嗜Marc-145细胞生长的PRRSV毒株，该毒株的细胞培养液经化学试剂灭活后，配以医用油佐剂，制成了繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(郭宝清等，2000)，已成为国内首批商品化的PRRS疫苗，并对3月龄仔猪间隔20d进行了2次免疫，结果在首次免疫后5d就可检测到病毒特异性抗体，28d达到高峰，在首免后56d还可检测到抗体。

PRRS弱毒疫苗具有免疫力强、免疫期长等优点。在美国，Boehringer Ingleheitm公司NOBL实验室于1995年首次推出商品化减毒疫苗Resp PRRSVTM，已获准用于3～18周龄仔猪的预防接种。但禁用于PRRS阴性猪群、妊娠母猪和育龄公猪。弱毒苗使用后可产生一定的保护作用(Sipos et al.，2003)。何信群等(2003)制备了PRRSV减毒活疫苗并进行了猪体试验，结果发现，免疫后20^35d左右出现抗体高峰，并可持续3个月以上，有较长的免疫保护期，免疫后第14d即可检测出PRRSV中和抗体。Mavromatis等(1999)证实活疫苗可保护育肥猪抵抗PRRSv引起的呼吸道症状。但是弱毒苗的不安全性，尤其毒力返强的可能性成为人们关心的一个主要问题。弱毒疫苗在提供免疫保护的同时，还会持续散播疫苗病毒，使得病毒在猪场中循环存在，有时甚至引发PRRS的暴发。实验证明，PRRSV感染诱导B细胞的增生的同时，也导致这些猪免疫损伤(Ansari IH etal，2006；Wissink EH etal，2004)。

发明概述

本发明根据不同结构蛋白在病毒感染中的作用，选择主要结构蛋白GP5作为疫苗框架结构，两个GP5串联后经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的重组蓝耳病亚单位疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防猪蓝耳病的感染。

本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于预防蓝耳病的亚单位疫苗多肽及其疫苗组合物。

本发明的目的之二在于提供了所述亚单位疫苗的构建及获得方法。

本发明的目的之三在于提供了能够表达所述蓝耳病亚单位疫苗的基因工程菌株。

本发明的目的之四在于提供了所述蓝耳病亚单位疫苗的制备方法。

本发明的目的之五在于提供了所述亚单位疫苗在预防蓝耳病中的用途。

在第一方面，本发明提供了一种用于预防蓝耳病的亚单位疫苗多肽及其组合物。其含有主要的结构蛋白GP5二联体。所述的亚单位疫苗蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及表达抗原表位蛋白所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，串联可以通过遗传工程方法进行。所述疫苗也包括非免疫活性物质，即为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和***反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。

在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的蓝耳病亚单位疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式合成多抗原表位串联序列和分子佐剂序列，然后经过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得蓝耳病亚单位疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切，连接等，核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点。优选本发明中的核苷酸序列如下：

TTGGGGAAATGCTTGACCGCGGGCTGTTGCTCGCAATTGTTTTTTTTGTGGTGTATCGTGCCGTCTTGTTTTGTTGCGCTCGTCAGCGCCAACAGCAACAGCAGCTCAAATTTACAGCTGATTTACAACTTGACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTAGCTAATAAATTTGACTGGGCAGTGGAGTGTTTTGTCATTTTTCCTGTGTTGACTCACATTGTCTCTTATGGTGCCCTCACTACTAGCCATTTCCTTGACACAGTCGGTCTGGTCACTGTGTCTACCGCCGGATTTGTTCACGGGCGGTATGTTCTGAGTAGCATCTACGCGGTCTGTGCCCTGGCTGCGTTGATTTGCTTCGTCATTAGGCTTGCGAAGAATTGCATGTCCTGGCGCTACTCATGTACCAGATATACCAACTTTCTTCTGGACAGTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCTGTCATCATAGAGAAAAGGGGCAAAGTTGAGGTCGAAGGTCAACTGATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTGTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCCTTTGGGGAAATGCTTGACCGCGGGCTGTTGCTCGCAATTGTTTTTTTTGTGGTGTATCGTGCCGTCTTGTTTTGTTGCGCTCGTCAGCGCCAACAGCAACAGCAGCTCAAATTTACAGCTGATTTACAACTTGACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTAGCTAATAAATTTGACTGGGCAGTGGAGTGTTTTGTCATTTTTCCTGTGTTGACTCACATTGTCTCTTATGGTGCCCTCACTACTAGCCATTTCCTTGACACAGTCGGTCTGGTCACTGTGTCTACCGCCGGATTTGTTCACGGGCGGTATGTTCTGAGTAGCATCTACGCGGTCTGTGCCCTGGCTGCGTTGATTTGCTTCGTCATTAGGCTTGCGAAGAATTGCATGTCCTGGCGCTACTCATGTACCAGATATACCAACTTTCTTCTGGACAGTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCTGTCATCATAGAGAAAAGGGGCAAAGTTGAGGTCGAAGGTCAACTGATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTGTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCCT

在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码蓝耳病亚单位疫苗核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。在一优选实施方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。

在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的蓝耳病亚单位疫苗多肽。

在第五方面，本发明提供了一种蓝耳病亚单位疫苗的制备方法，其包括以下步骤：工程菌发酵表达亚单位疫苗多肽，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续乳化工艺，获得所需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、阴离子交换色谱、反相色谱、复性、乳化等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。

在第六方面，本发明提供了一种用于预防猪蓝耳病的重组亚单位疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。所述亚单位疫苗能够预防猪蓝耳病的爆发。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为进口白油佐剂。

在第七方面，本发明提供了第六方面所述的重组蓝耳病亚单位疫苗的应用。疫苗可以一定有效剂量肌肉注射，皮内或皮下注射或鼻内接种注射动物，能够表达足够量的IFN提供抗病毒活性，保护动物免于蓝耳病流行毒株的攻击。此外，在本发明的实施方案中，通过对疫苗进行靶动物攻毒对比试验、实验室安全性试验等，表明本发明所述的重组蓝耳病亚单位疫苗是安全的(见实施例四)，能够保护动物免受蓝耳病病毒感染(见实施例五)。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1重组蓝耳病亚单位表达载体pRSETB-PRRSVGP52构建图；

图2 pRSETB-PRRSVGP52载体质粒酶切图，其中泳道1为DNAmarker，从上至下分子量依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，泳道2为阴性对照，泳道3为质粒没切图；

图3 SDS-PAGE检测图，其中泳道1、4为未诱导阴性对照，泳道2为纯化目的蛋白(箭头所指)，泳道3为蛋白marker，从上至下依次为97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD，泳道5、6为菌体诱导；

图4 Westernblot检测图，其中泳道1为预染marker，从上至下依次为97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD，泳道2为阴性对照，泳道3为目的蛋白(箭头所指)。

具体实施方式

实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制，依据本发明的许多变化为本领域的技术人员所熟知。

实施例一 大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建

将设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了BamH I(5’端)和HindIII(3’端)限制性酶切位点，把这片段合成后分别克隆到pMD18T载体上，序列测定证实***基因片段与设计序列一致(见序列表)。将重组质粒分别命名为pMD18T-PRRSVGP52。用相应的限制性内切酶将两种质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用Invitrogen公司的pRSETB质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μl反应体系，体系内加入2μl质粒，限制性内切酶为5个活性单位(New England biolabs)，加入10×缓冲液1μl，去离子水补齐，37℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μl 200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2.9kb pRSETB质粒和1194bpPRRSVGP52片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段1：2-3的比例将多表位核苷酸片段单独和表达载体混合，反应体系15μl，由T4 DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒分别命名为pRSETB-PRRSVGP52，(见图1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

转化：将pRSETB-PRRSVGP52置冰上融化，加入2μl链接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃ 30秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入1ml LB培养液，37℃，静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μlLB培养基重悬菌体；将菌液均匀涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12-16小时，直至克隆形成。

鉴定：挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37℃，180rpm震荡培养12小时，提取质粒，分别使用内切酶BamH I和HindIII进行双酶切，可以切出相应蓝耳病疫苗基因大小片段的克隆，1200bp，可初步确定为阳性克隆(见图2)；阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。

诱导表达。即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1∶100转接，培养3小时后，加入0.5mM IPTG，继续培养3小时，制备样品；常规SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况——在49KD(见图3)，见到特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Western-blot进一步证实其表达准确性(见图4)；经过上述构建及鉴定程序后，可将挑选的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立，菌种命名pRSETB-PRRSVGP52/BL21(DE3，Plys)。

实施例三 工程菌的发酵、纯化与乳化

发酵取生产菌种，接种于2ml LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃，180rpm振荡培养12小时活化菌种。再以1∶100的接种量接入摇瓶，37℃振荡培养至OD600＝3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和pH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37.0℃时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0±0.1℃，溶氧控制在20％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600＝1.0～1.2时流加补料500ml，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检定表达情况。

纯化将收集到的菌体，用包含体洗液I(1％Triton X-100，20mMTris-cl PH8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包含体，并用包含体洗液II(1％DOC，4M尿素，20mMTris-cl PH8.0)混悬二次超声洗涤包含体，二次低温离心收集包含体。包含体沉淀用8M尿素，0.3％β-ME，20mM Tris-cl(pH＝8.00)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30min，弃去沉淀。变性蛋白1∶100稀释，复性液用Tris(PH8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱；即得重组蓝耳病亚单位疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及Western blot印记检定纯化产物是否为目标蛋白(图4)。

乳化将纯化的半成品用灭菌的PBS稀释至200μg/ml。取进口白矿物油佐剂DUOPRIME(医药级)经121℃，灭菌15分钟，备用。按油相∶水相＝50∶50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2min，然后以5500r/min高速循环乳化9min，制成油包水单相疫苗。

实施例四 重组蓝耳病亚单位疫苗安全性试验

疫苗对小白鼠的安全性

皮下注射18～22g Balb/C小白鼠，每只注射0.5ml，每批疫苗注射5只，共三个批次，注射15只小白鼠，同时设定2只阴性对照，连续观察10天，观测小白鼠的健康状况。

疫苗对仔猪的安全性

选择30日龄健康三元杂交仔猪，每头耳后肌肉注射重组蓝耳病亚单位疫苗，每批次5头，共三个批次，注射15头仔猪，同时设立阴性对照2头，每头注射生理盐水白油乳化液2ml，临床观察10天。

结果

疫苗对小白鼠的安全性试验

结果如表1，20110903免疫组2只受试动物第二天体温略有升高，第三天恢复正常，食欲和健康状况无异常，与对照组一致，无死亡发生，可见重组蓝耳病亚单位疫苗对小白鼠是安全的，见表1。

表1 疫苗对小白鼠的安全性试验结果

组别	动物数量	体温	食欲	健康状况	死亡数量
						20110903	5	2头体温升高，其他正常。	正常	健康状况良好	0
20110904	5	正常	正常	健康状况良好	0
						20110905	5	正常	正常	健康状况良好	0
对照	2	正常	正常	健康状况良好	0

疫苗对仔猪的安全性试验

结果如表2，整个试验观察期10天内，所有免疫的仔猪，体温和食欲均正常，没有出现任何临床异常现象，试验结束后，15头仔猪均健活。对照佐剂组的2头仔猪也无任何不良反应。这说明，重组蓝耳病亚单位疫苗对仔猪是安全的。

表2 疫苗对仔猪的安全性试验结果

组别	动物数量	体温	食欲	异常状况	死亡数量
						20110903	5	正常	正常	无	0
20110904	5	正常	正常	无	0
						20110905	5	正常	正常	无	0
对照	2	正常	正常	无	0

实施例五 重组蓝耳病亚单位疫苗与传统疫苗的免疫效力对比试验

本实验选择传统灭活苗和弱毒苗作为对照苗，与重组亚单位疫苗共同免疫蓝耳病病毒阴性仔猪，每个苗免疫5头，同时设对照组2头。免疫组耳后肌肉注射，1ml/头，免疫前0d，免疫后14、28、56d采集血样并测抗体。空白对照组免疫生理盐水乳化液，1ml/头。

结果：本发明制备的重组蓝耳病亚单位疫苗与弱毒苗，免疫效果相当，均明显好于灭活苗组，抗体水平上升较快。在免疫后28天，所有疫苗的抗体阳性率均达到100％，至免疫后56天，灭活苗的抗体水平阳性率下降，其他两组抗体阳性率均保持100％。

表1 不同疫苗免疫后抗体水平检测

组别	0d	14d	28d	42d	56d
						重组亚单位苗组	0	4(80％)	5(100％)	5(100％)	5(100％)
灭活苗组	0	3(60％)	5(100％)	5(100％)	3(60％)
						弱毒苗组	0	4(80％)	5(100％)	5(100％)	5(100％)
空白对照组	0	0	0	0	0

Claims (5)

1.一种核酸分子，具体组合序列为SEQ ID No.1，其编码一种疫苗蛋白氨基酸序列。

2.权利要求1所述的氨基酸序列，具体组合序列为SEQ ID No.2。

3.一种载体，其含有权利要求1所述的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其含有权利要求3所述的载体。

5.一种用于预防猪蓝耳病的疫苗，其包括权利要求1所述的疫苗蛋白以及药学上可接受的载体。