CN115850501A - 非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白、其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白、其制备方法与应用。其非洲猪瘟病毒嵌合重组表达的蛋白为包含了在非洲猪瘟病毒感染和病毒壳形成中起主要作用的p30、p72和p54的部分片段，每个片段经过表位分析软件选取抗原表位比较集中的基因片段。本发明提供的重组蛋白为嵌合表达非洲猪瘟病毒三个结构蛋白p30、p72和p54的主要抗原表位部分序列，旨在弥补单一表达蛋白作为抗原制备亚单位疫苗时保护力不足，以及作为诊断试剂抗原对病毒感染整个过程的灵敏度和特异性均不理想等缺点。本发明所选择的p30、p54和p72蛋白贯穿非洲猪瘟病毒感染的整个过程，在非洲猪瘟病的诊断和预防领域具有广阔的市场应用价值。

Description

非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白、其制备方法 与应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒(ASFV)p30、p72和p54嵌合重组蛋白、其制备方法与应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的猪的高度接触性传染病。其临床症状主要以发热、呼吸和神经***功能紊乱、内脏器官病变、广泛性出血为主。病程短，发病率和死亡率均很高，家猪感染后十天内死亡率接近100％。目前还没有有效的商品化疫苗和药物能够预防和治疗该病，一经发现只能大规模扑杀，对生猪养殖业和猪肉贸易领域造成严重经济损失。因此筛选出具有良好免疫原性和抗原性的ASFV结构蛋白对于ASF的预防、治疗和研发高灵敏性和特异性检测试剂盒具有重大意义。

ASFV是一种正20面体，是在感染细胞的细胞质内复制的病毒。ASFV编码的蛋白超过200个，其中有50多种结构蛋白。有研究报道ASFV的50多种蛋白包装成病毒粒，并在病毒感染中发挥作用。ASFV的病毒粒是一种复杂的多层结构组成，直径大小170～190nm(Salaset al.,Virus Res 2013,173,29–41.)。ASFV编码的结构蛋白参与基因组复制和病毒感染(Dixon et al.，Virus Res 2013，173，3–14.)。p54和p30是参与ASFV入侵过程的结构蛋白。p54由E183L基因编码的，相对分子量大小为25KDa，是ASFV重要抗原结构蛋白。p54蛋白位于病毒粒外模脂质上在宿主细胞内质网膜聚集和转化为病毒囊膜前体过程中起到关键作用(Rodríguez et al.，J Virol 2004，78，4299–4313.)，并在病毒生长和在弱毒株免疫猪体内诱导产生特异性抗体过程中发挥重要作用(Rodriguez et al.，.Virus Res 1996，40，161–167.)。p54抗体能够抑制ASFV感染周期第一步，病毒附着。除此之外p54蛋白能够诱导受感染细胞产生细胞凋亡(Gómez-Puertas et al.，Virus Res1997，49，115–122.)。p30与p54一样也是早期病毒蛋白，由CP204L基因编码，相对分子量大小为30kDa，主要的抗原结构蛋白之一，参与ASFV入侵细胞过程。(Sánchez et al.，Virus Res 2013，173，58–75.)。ASFV入侵细胞后2～4小时就开始表达p30蛋白质并贯穿病毒感染整个周期。因此，p30蛋白质的表达标志着病毒入侵和早期病毒基因表达开始。(Lithgow et al.，Vet Microbiol 2014，168，413–419.)。p72由B646L(VP72)基因编码的重要抗原蛋白，分子量大小为73.2KDa，是ASFV主要结构蛋白之一。p72具有很高的抗原性和免疫原性，是ASFV 20面体主要组成部分。P72位于病毒衣壳表面，在病毒感染后期表达中形成核衣壳过程中起关键作用(Neilan etal.，Virology 2004，319，337–342.)。

鉴于以上所述特点本发明创新点在于将三个主要结构蛋白嵌合在一起一次性重组表达，获得含有三种蛋白的重组表达抗原，由于p72、p30和p54三种抗原贯穿于非洲猪瘟病毒入侵到后期表达整个感染过程，因此在非洲猪瘟病的诊断和预防方面有广泛的应用前景。但是现在市面上尚未发现以非洲猪瘟病毒p72、p30和p54三个蛋白嵌合表达重组蛋白作为抗原的诊断试剂盒和疫苗，因采用现有技术同时表达三种蛋白较困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白、其制备方法与应用，该重组表达蛋白串联嵌合表达非洲猪瘟病毒p30、p72和p54的结构蛋白。本发明对非洲猪瘟病毒主要结构蛋白保护性抗原蛋白进行了克隆表达，构建了表达较高的重组蛋白的表达菌株。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白，该嵌合重组表达蛋白为嵌合表达非洲猪瘟病毒p30、p72和p54的结构蛋白片段的蛋白质(命名为p307254)，其中，p30的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，p72的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，p54的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

如上所述的非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白，优选地，其蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或是与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列SEQ ID NO.1所示的氨基酸残基序列相同免疫原性和中和活性的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

编码如上所述的重组表达蛋白的基因，其含有SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示核苷酸序列。

编码如上所述的重组表达蛋白的基因，该基因的核苷酸序列为如下序列之一：

1)如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；

2)与SEQ ID NO.2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

其中，SEQ ID NO.2所示序列编码非洲猪瘟病毒p30、p72和p54蛋白嵌合基因序列(p307254基因)由1182个核苷酸组成，其中自5’到3’端第1位到366位碱基为非洲猪瘟病毒结构蛋白p30核苷酸序列，第367位到786位碱基为非洲猪瘟病毒结构蛋白p72核苷酸序列，第787位到第1182位碱基为非洲猪瘟病毒结构蛋白p54核苷酸序列。

一种表达载体，其含有如SEQ ID NO.2所示基因序列。

一种细胞系，其含有如SEQ ID NO.2所示基因序列。

一种非洲猪瘟病毒嵌合重组P30、p72和p54蛋白的制备方法，其包括如下步骤：

扩增如SEQ ID NO.2所示的目的片段；

将目的片段与表达载体相连转入大肠杆菌；

筛选阳性克隆；

诱导表达得到目的蛋白。

如上所述的制备方法，优选地，扩增目的片段的方法为：

首先用引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14以及SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16三对引物依次扩增SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.8；

第二步用引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.14以扩增获得的SEQ ID NO.9与SEQ IDNO.10基因片段为模板扩增获得p3072嵌合基因；

第三步用引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.16，以扩增获得的嵌合基因p3072和SEQID NO.8基因片段为模板进一步嵌合扩增获得本发明目的基因片段，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

如上所述的制备方法，优选地，将目的片段的PCR扩增产物纯化回收后用BamHI和SalI酶切，纯化回收酶切片段，与经相同酶切的pET28a(+)载体相连，转入表达型大肠杆菌BL21(DE3)中；挑取阳性，培养，经IPTG诱导表达得到目的蛋白并进行纯化。

利用本发明提供的上述方法，可以得到较高的表达产物收获率，每100ml培养液可收获重组蛋白15mg，该重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。

本发明还提供了能够有效中和非洲猪瘟病毒的疫苗抗原和检测非洲猪瘟病毒感染的抗原。

为了实现这个目的，本发明采用以下技术方案：

一种预防非洲猪瘟病毒感染的疫苗，其活性成分是具有如上所述的非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白，其包含ASFv p30、p72和p54的嵌合重组蛋白保护性抗原。

具体为具有如SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的蛋白，或者是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

在实际应用中，优选地是以SEQ ID NO.1所示的蛋白质为抗原活性成分的亚单位疫苗。

为了使本亚单位疫苗的效果更好，所述疫苗中还可以加入佐剂。加入的佐剂可以是10号矿物油佐剂或福氏佐剂或者霍乱弧菌菌影佐剂。本发明优选10号矿物油佐剂，抗原和佐剂按1:3(v/v)比例混合。

本发明疫苗的免疫剂量一般为0.5-1mg/kg体重。

用本发明非洲猪瘟病毒嵌合重组结构蛋白p307254为活性成分的疫苗免疫的家兔产生了非洲猪瘟病毒的特异性抗体，说明其具有较好的免疫原性，市场应用前景非常广阔。

本发明还提供了一种检测非洲猪瘟病毒感染血清抗体的抗原，其活性成分是如上所述的非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白，以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的p307254抗原。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的非洲猪瘟病毒重组表达蛋白p307254，嵌合表达非洲猪瘟病毒三个结构蛋白p30、p72和p54的抗原表位集中的氨基酸片段，旨在弥补单一表达重组蛋白用作疫苗抗原时保护力不足或不产生保护力以及用作诊断检测抗原时不够灵敏或者特异性不高等缺点。

本发明制备的嵌合重组表达蛋白将p30、p72和p54三个蛋白集于一个载体上进行表达获得，首先具备了三个蛋白的功能特点，具有非常好的免疫原性和抗原活性，在非洲猪瘟病毒的检测和预防领域具有广阔的市场应用价值。

本发明制备的嵌合表达重组蛋白用作非洲猪瘟病诊断试剂盒抗原相对于单一抗原制备试剂盒提高灵敏性和特异性大大提高；如果将其用作亚单位疫苗抗原，相对于单一蛋白制备疫苗，只免疫本发明制备嵌合重组抗原，免疫动物体内产生针对p72、p30和p54三种蛋白的特异抗体有效提高对非洲猪瘟病毒的保护作用；其次是本发明利用PCR方法将三个蛋白基因嵌合在一起后与原核表达载体构建重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达获得嵌合表达p307254蛋白，大大省去了单独表达三种表达所需的繁琐重复工作，节省了人力物力和时间成本，有利于大规模生产和应用。

附图说明

图1为实施例1中p30、p72和p54三个基因片段PCR扩增产物；

图2为实施例1中p30+p72嵌合基因PCR扩增产物即p3072；

图3为实施例1中p3072+p54嵌合基因PCR扩增产物即p307254；

图4为实施例1中重组p307254-pet28a/BL21(DE3)诱导表达鉴定图；

图5为实施例1中重组p307254-pet28a/BL21(DE3)表达蛋白纯化图；

图6为实施例3中重组p307254的抗原性鉴定结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。本发明对比试验所用的单独表达重组蛋白p30、p72和p54重组蛋白基因和氨基酸序列均与p307254蛋白所用片段完全相同。另外单独表达p30、p72和p54蛋白所用载体、宿主菌和纯化方法均同于p307254蛋白，本发明中不再赘述。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本发明所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1非洲猪瘟病毒嵌合重组表达蛋白p307254的制备

本发明利用PCR方法将非洲猪瘟病毒结构蛋白p30、p72和p54的抗原表位高度集中基因片段以p30-p72-p54顺序进行嵌合获得p307254连接基因。

具体扩增方法如下：

1.1 ASFv P30、p72模板合成和p54模板基因组提取

根据GenBank提供的Anhui XCGQ毒株序列(登录号：MK128995.1)，选取p30、p72和p54蛋白基因序列，对p30和p72蛋白基因序列进行大肠杆菌偏爱密码子优化后，由华大基因进行合成，分别与pLB载体克隆；p54蛋白质为跨膜蛋白，本发明选取膜内蛋白片段，基因序列未经优化，p54基因扩增以河南某个体户病猪肝脏病料基因组DNA为模板，病料组织基因组DN A提取方法按照天根生化科技(北京)有限公司组织提取DNA试剂盒(DP304)的说明书进行。

1.2 ASFv p30、p72和p54所选片段的扩增：

用在线抗原表位预测软件(Bepipred 1.0Server)对上述三个蛋白进行分析后，选取抗原表位高度集中的片段，设计合成引物，其中编码ASFv p30蛋白优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码ASFv p72蛋白优后核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，分别作为p30和p72目的片段的PCR扩增模板。编码ASFv p54膜内蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

SEQ ID NO.6：ATGGACTTCATCCTGAACATCAGCATGAAGATGGAAGTGATCTTCAAGACCGACCTGAGGAGCTCCAGCCAGGTGGTGTTCCACGCAGGATCCCTGTACAACTGGTTCAGCGTGGAGATCATCAACTCCGGCAGGATCGTGACCACCGCCATCAAGACCCTGCTGAGCACCGTGAAGTACGACATCGTGAAGTCCGCCAGGATCTACGCAGGACAGGGATACACCGAGCACCAGGCCCAGGAGGAGTGGAACATGATCCTGCACGTGCTGTTCGAGGAGGAGACCGAGTCCAGCGCCTCCAGCGAGAACATCCACGAGAAGAACGACAACGAGACCAACGAGTGCACCTCCAGCTTCGAGACCCTGTTCGAGCAGGAGCCCTCCAGCGAGGTGCCTAAGGACTCCAAGCTGTACATGCTGGCCCAGAAGACCGTGCAGCACATCGAGCAGTACGGCAAGGCCCCAGACTTCAACAAAGTGATCAGAGCCCACAACTTCATCCAGACCATCTACGGCACCCCCCTGAAGGAGGAGGAGAAGGAGGTGGTGCGCCTGATGGTCATCAAGCTGCTGAAGAAGAAG

SEQ ID NO.7：ATGGCAAGCGGAGGAGCATTCTGCCTGATCGCAAACGACGGCAAGGCCGACAAGATCATCCTGGCCCAGGACCTGCTGAACAGCAGGATCTCCAACATCAAGAACGTGAACAAGAGCTACGGCAAGCCAGACCCCGAGCCTACCCTGTCCCAGATCGAGGAGACCCACCTGGTGCACTTCAACGCCCACTTCAAGCCATACGTGCCCGTGGGCTTCGAGTACAACAAGGTGCGGCCACACACCGGAACCCCTACCCTGGGCAACAAGCTGACCTTCGGCATCCCACAGTACGGCGACTTCTTCCACGACATGGTGGGCCACCACATCCTGGGAGCATGTCACAGCTCCTGGCAGGACGCACCAATCCAGGGCACCAGCCAGATGGGAGCACACGGACAGCTGCAGACCTTCCCAAGAAACGGCTACGACTGGGACAACCAGACCCCACTGGAGGGAGCCGTGTACACCCTGGTGGACCCTTTCGGCAGACCTATCGTGCCAGGCACCAAGAACGCCTACCGCAACCTGGTGTACTACTGCGAGTACCCTGGCGAGAGACTGTACGAGAACGTGCGCTTCGACGTGAACGGCAACTCCCTGGACGAGTACAGCTCCGACGTGACCACCCTGGTGAGAAAGTTCTGTATCCCCGGCGACAAGATGACCGGCTACAAGCACCTGGTGGGACAGGAGGTGAGCGTGGAGGGCACCTCCGGACCTCTGCTGTGCAACATCCACGACCTGCACAAGCCACACCAGAGCAAGCCCATCCTGACCGACGAGAACGACACCCAGCGCACCTGTTCCCACACCAACCCAAAGTTCCTGAGCCAGCACTTCCCCGAGAACTCCCACAACATCCAGACCGCCGGCAAGCAGGACATCACCCCCATCACCGACGCCACCTACCTGGACATCAGGCGGAACGTGCACTACAGCTGCAACGGCCCCCAGACCCCTAAGTACTACCAGCCCCCTCTGGCCCTGTGGATCAAGCTGAGGTTCTGGTTCAACGAGAACGTGAACCTGGCCATCCCTAGCGTGTCCATCCCATTCGGCGAGCGGTTCATCACCATCAAGCTGGCCTCCCAGAAGGACCTGGTGAACGAGTTCCCAGGCCTGTTCGTGAGGCAGAGCCGGTTCATCGCAGGCAGGCCCTCCAGAAGGAACATCCGGTTCAAGCCTTGGTTCATCCCAGGCGTGATCAACGAGATCAGCCTGACCAACAACGAGCTGTACATCAACAACCTGTTCGTGACCCCTGAGATCCACAACCTGTTCGTGAAGAGGGTGCGGTTCTCCCTGATCAGGGTGCACAAGACCCAGGTGACCCACACCAACAACAACCACCACGACGAGAAGCTGATGAGCGCCCTGAAGTGGCCAATCGAGTACATGTTCATCGGCCTGAAGCCTACCTGGAACATCTCCGACCAGAACCCACACCAGCACAGAGACTGGCACAAGTTCGGCCACGTGGTGAACGCCATCATGCAGCCTACCCACCACGCCGAGATCTCCTTCCAGGACAGGGACACCGCCCTGCCAGACGCCTGCAGCTCCATCAGCGACATCTCCCCCGTGACCTACCCTATCACCCTGCCAATCATCAAGAACATCAGCGTGACCGCCCACGGCATCAACCTGATCGACAAGTTCCCCTCCAAGTTCTGTAGCTCCTACATCCCTTTCCACTACGGCGGCAACGCCATCAAGACCCCAGACGACCCAGGAGCCATGATGATCACCTTCGCCCTGAAGCCCAGGGAGGAGTACCAGCCTAGCGGCCACATCAACGTGTCCAGAGCCCGCGAGTTCTACATCAGCTGGGACACCGACTACGTGGGCTCCATCACCACCGCAGACCTGGTGGTGAGCGCCTCCGCCATCAACTTCCTGCTGCTGCAGAACGGAAGCGCCGTGCTGCGGTACTCCACC

SEQ ID NO.8：TCAAGAAAGAAAAAAGCTGCTGCTATTGAGGAGGAAGATATACAGTTTATAAATCCTTATCAAGATCAGCAGTGGGTAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCAGCTGGAGCGACTACAGCAAGTGTAGGCAAGCCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTTACGGACAACCCAGTTACGGACAGACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCGGCGGCCGCACCTGCGGCCGCGAGTGCTCCTGCTCATCCGGCTGAGCCTTACACGACAGTCACTACTCAGAACACTGCTTCACAAACAATGTCGGCTATTGAAAATTTACGACAAAGAAACACCTATACGCATAAAGACCTAGAAAACTCCTTGTAA

分别以SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和1.1中提取的病毒基因组为模板，用特异引物扩增P30、p72和p54目标片段(对应基因序列为序列SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.8)。

将扩增获得的目标基因序列用PCR方法按p30-p72-p54顺序扩增嵌合连接，用DANMAN分析酶切位点，在第一条和第六条引物分别添加BamHI和SalI限制性内切酶酶切位点，所用引物序列如下：

SEQ ID NO.11:5’-ATAATTGGATCCGACATCGTGAAGTCCGC-3’；

SEQ ID NO.12:5’-TTCTCGTACAGTCTCTCcacctccttctcctcct-3’；

SEQ ID NO.13:5’-aggaggagaaggaggtgGAGAGACTGTACGAGAA-3’；

SEQ ID NO.14:5‘-GCTTTTTTCTTTCTTGActggtagtacttagggg-3’；

SEQ ID NO.15:5‘-cccctaagtactaccagTCAAGAAAGAAAAAAGC-3’；

SEQ ID NO.16:5’-TTAGTCGACTTACAAGGAGTTTTCCA-3’；

第一步：以优化合成的p30/plB质粒为模板，用SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12两条引物扩增p30所选基因片段，基因总长366bp，切胶回收目的片段备用，基因序列如序SEQ IDNO.9所示；其对应编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，

SEQ ID NO.9：GACATCGTGAAGTCCGCCAGGATCTACGCAGGACAGGGATACACCGAGCACCAGGCCCAGGAGGAGTGGAACATGATCCTGCACGTGCTGTTCGAGGAGGAGACCGAGTCCAGCGCCTCCAGCGAGAACATCCACGAGAAGAACGACAACGAGACCAACGAGTGCACCTCCAGCTTCGAGACCCTGTTCGAGCAGGAGCCCTCCAGCGAGGTGCCTAAGGACTCCAAGCTGTACATGCTGGCCCAGAAGACCGTGCAGCACATCGAGCAGTACGGCAAGGCCCCAGACTTCAACAAAGTGATCAGAGCCCACAACTTCATCCAGACCATCTACGGCACCCCCCTGAAGGAGGAGGAGAAGGAGGTG

SEQ ID NO.3：DIVKSARIYAGQGYTEHQAQEEWNMILHVLFEEETESSASSENIHEKNDNETNECTSSFETLFEQEPSSEVPKDSKLYMLAQKTVQHIEQYGKAPDFNKVIRAHNFIQTIYGTPLKEEEKEV

第二步：以优化合成的p72/pLB为模板，用SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14两条引物扩增p72所选基因片段，基因总长420bp，切胶回收目的片段备用，基因序列如序列SEQ IDNO.10所示；其对应编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，

SEQ ID NO.10：GAGAGACTGTACGAGAACGTGCGCTTCGACGTGAACGGCAACTCCCTGGACGAGTACAGCTCCGACGTGACCACCCTGGTGAGAAAGTTCTGTATCCCCGGCGACAAGATGACCGGCTACAAGCACCTGGTGGGACAGGAGGTGAGCGTGGAGGGCACCTCCGGACCTCTGCTGTGCAACATCCACGACCTGCACAAGCCACACCAGAGCAAGCCCATCCTGACCGACGAGAACGACACCCAGCGCACCTGTTCCCACACCAACCCAAAGTTCCTGAGCCAGCACTTCCCCGAGAACTCCCACAACATCCAGACCGCCGGCAAGCAGGACATCACCCCCATCACCGACGCCACCTACCTGGACATCAGGCGGAACGTGCACTACAGCTGCAACGGCCCCCAGACCCCTAAGTACTACCAG；SEQ ID NO.4：ERLYENVRFDVNGNSLDEYSSDVTTLVRKFCIPGDKMTGYKHLVGQEVSVEGTSGPLLCNIHDLHKPHQSKPILTDENDTQRTCSHTNPKFLSQHFPENSHNIQTAGKQDITPITDATYLDIRRNVHYSCNGPQTPKYYQ

第三步：以1.1中提取的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16两条引物扩增p54所选膜内蛋白片段，基因总长396bp，切胶回收目的片段备用，基因序列如SEQID NO.8所示；对应编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，

SEQ ID NO.5：SRKKKAAAIEEEDIQFINPYQDQQWVEVTPQPGTSKPAGATTASVGKPVTGRPATNRPATNKPVTDNPVTDRLVMATGGPAAAPAAASAPAHPAEPYTTVTTQNTASQTMSAIENLRQRNTYTHKDLENSL

第四步：以扩增切胶回收的p30和p72(序列如SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10所示)各1微升为模板，用SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.14两条引物扩增获得p3072嵌合基因，基因总长786bp，切胶回收备用；

第五步：以第四步扩增获得的p3072和第三步扩增获得的p54(序列如SEQ IDNO.8)各1微升为模板，用SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.16两条引物，嵌合p3072和p54获得总长1182bp的p307254基因片段，基因序列如序列SEQ ID NO.2所示；对应编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.2：GACATCGTGAAGTCCGCCAGGATCTACGCAGGACAGGGATACACCGAGCACCAGGCCCAGGAGGAGTGGAACATGATCCTGCACGTGCTGTTCGAGGAGGAGACCGAGTCCAGCGCCTCCAGCGAGAACATCCACGAGAAGAACGACAACGAGACCAACGAGTGCACCTCCAGCTTCGAGACCCTGTTCGAGCAGGAGCCCTCCAGCGAGGTGCCTAAGGACTCCAAGCTGTACATGCTGGCCCAGAAGACCGTGCAGCACATCGAGCAGTACGGCAAGGCCCCAGACTTCAACAAAGTGATCAGAGCCCACAACTTCATCCAGACCATCTACGGCACCCCCCTGAAGGAGGAGGAGAAGGAGGTGGAGAGACTGTACGAGAACGTGCGCTTCGACGTGAACGGCAACTCCCTGGACGAGTACAGCTCCGACGTGACCACCCTGGTGAGAAAGTTCTGTATCCCCGGCGACAAGATGACCGGCTACAAGCACCTGGTGGGACAGGAGGTGAGCGTGGAGGGCACCTCCGGACCTCTGCTGTGCAACATCCACGACCTGCACAAGCCACACCAGAGCAAGCCCATCCTGACCGACGAGAACGACACCCAGCGCACCTGTTCCCACACCAACCCAAAGTTCCTGAGCCAGCACTTCCCCGAGAACTCCCACAACATCCAGACCGCCGGCAAGCAGGACATCACCCCCATCACCGACGCCACCTACCTGGACATCAGGCGGAACGTGCACTACAGCTGCAACGGCCCCCAGACCCCTAAGTACTACCAGTCAAGAAAGAAAAAAGCTGCTGCTATTGAGGAGGAAGATATACAGTTTATAAATCCTTATCAAGATCAGCAGTGGGTAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCAGCTGGAGCGACTACAGCAAGTGTAGGCAAGCCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTTACGGACAACCCAGTTACGGACAGACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCGGCGGCCGCACCTGCGGCCGCGAGTGCTCCTGCTCATCCGGCTGAGCCTTACACGACAGTCACTACTCAGAACACTGCTTCACAAACAATGTCGGCTATTGAAAATTTACGACAAAGAAACACCTATACGCATAAAGACCTAGAAAACTCCTTGTAA

SEQ ID NO.1：DIVKSARIYAGQGYTEHQAQEEWNMILHVLFEEETESSASSENIHEKNDNETNECTSSFETLFEQEPSSEVPKDSKLYMLAQKTVQHIEQYGKAPDFNKVIRAHNFIQTIYGTPLKEEEKEVERLYENVRFDVNGNSLDEYSSDVTTLVRKFCIPGDKMTGYKHLVGQEVSVEGTSGPLLCNIHDLHKPHQSKPILTDENDTQRTCSHTNPKFLSQHFPENSHNIQTAGKQDITPITDATYLDIRRNVHYSCNGPQTPKYYQSRKKKAAAIEEEDIQFINPYQDQQWVEVTPQPGTSKPAGATTASVGKPVTGRPATNRPATNKPVTDNPVTDRLVMATGGPAAAPAAASAPAHPAEPYTTVTTQNTASQTMSAIENLRQRNTYTHKDLENSL

上述每步骤PCR反应体系为50μL，用生工生化(上海)股份有限公司pfu高保真酶进行扩增，PCR扩增采用通用方法在此不再赘述。每步获得PCR产物经过1％DNA胶鉴定，结果如图1-3所示，图1为p30、p72和p54三个基因片段PCR扩增产物，其中条带1为p72基因片段，大小420bp；条带2为p30基因片段，大小366bp；条带3为p54基因片段，大小396bp；M：DNA分子量标准(100～2000bp)。图2为p30+p72嵌合基因PCR扩增产物即p3072；其中条带1:p3072基因，大小786bp；M:DNA分子量标准(100～2000bp)。图3为p3072+p54嵌合基因PCR扩增产物(SEQID NO.2)即p307254；图中条带1：p307254基因，大小1182bp；M:DNA分子量标准(100～2000bp)。

之后用天根生化科技(北京)有限公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)进行切胶回收。

1.3 p307254-pet28a重组表达质粒的构建：

将1.2中第五步获得的p307254基因片段回收产物32μL，加BamHI和SalI酶(Takara限制性内切酶)各2μL，4μL 10×H buffer，总体积40μL，置于37℃酶切反应5小时，纯化回收酶切产物，按4.3:1(V/V)将酶切的p307254基因片段与经相同限制性内切酶BamHI和SalI酶切的pET28a(+)载体混合，使用天根生化科技(北京有限公司T4酶快速连接方法25℃反应连接30min，吸取10μL连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，置于37℃，130rpm摇床培养1小时后，在无菌条件下吸取100μL菌液，在含有25μg/mL卡那霉素的固体LB培养基涂板，置于37℃培养14～18小时，挑取几个单菌落，用引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.16先进行PCR鉴定，将PCR阳性菌落提取质粒进行测序鉴定，PCR和测序结果均为阳性菌，即为含p307254/pet28重组表达质粒的阳性菌。

1.4重组质粒p307254/pet28a的诱导表达、纯化和定量分装：

第一步：鉴定1.3中获得含重组表达质粒p307254/pet28的阳性大肠杆菌BL21(DE3)菌是否能够表达目的蛋白。其方法为：p307254/pet28a/BL21(DE3)、BL21(DE3)空菌和转化空载体pet28a的BL21(DE3)/pet28a菌分别1毫升进行IPTG(终浓度0.5mM)诱导，其中BL21(DE3)空菌和转化空载体pet28a的BL21(DE3)/pet28a作为对照。结果如图4所示，图中1：BL21(DE3)空菌诱导表达；2：pet28a/BL21(DE3)空载体诱导表达；3：p307254-pet28a/BL21(DE3)诱导表达，理论大小47.5KDa；M：蛋白质分子量标准(14.4，18.4，25，35，45，66.2，116KDa)。从结果看307254/pet28a/BL21(DE3)诱导菌在45～66.2KDa中间有较粗的表达带与目标重组蛋白p307254/pet28a大小相符，空载体pet28a/BL21(DE3)和空菌BL21(DE3)均无与目标蛋白大小相符的表达带，说明目标基因重组表达质粒p307254/pet28a在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，即成功获得了p307254/pet28a/BL21(DE3)阳性表达菌。

第二步：将阳性p307254/pet28a/BL21(DE3)菌液按1∶100的比例，加入到含25g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm摇床培养2小时，至菌液OD600＝0.5-0.7，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续培养4小时，离心，倒掉上清，收集菌体沉淀。

第三步：将菌体沉淀用诱导表达总菌液(即第一步中LB液体培养基，是指诱导表达的菌液体积，比如诱导了200毫升，将200毫升菌液离心得到的菌体沉淀，用20毫升PBS重悬，只计算体积重悬沉淀不用LB)1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2～7.4PBS)重悬菌体沉淀，超声破碎菌体细胞，工作5秒间歇10秒，超声次数40次，功率300～400w，破碎完的菌体溶液6000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀。

第四步：重复第二步2次，收集沉淀即为包涵体。(两次超声离心后上清，需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。

第五步：获得的包涵体用10mL含8M尿素的缓冲液(NaH₂PO₄ 0.1M，Tris-HCl pH8.0，0.01M)充分溶解，在工作5秒间歇10秒，功率150～200w条件下，超声20次，10000rpm离心15min，收集上清，即变性的p307254蛋白质。

第五步：将获得的变性裂解的p307254蛋白质溶液10000rpm离心15分钟，上清即为含重组蛋白p307254的缓冲液，将收集到的上清溶液轻轻吸取装入透析袋内(截留分子量3KDa)置含4M尿素的复性液(100mM Tris-HCl，0.004M氧化型谷胱甘肽，0.002M还原型谷胱甘肽)中透析6小时然后依次转置含2M尿素的复性液中透析16小时和含1M尿素的复性液中透析10小时，最后转置0.1M PBS缓冲液中透析12～16小时，期间更换缓冲液2次。透析完成后将透析袋内溶液装到干净的离心管内用于下一步纯化过程。

第六步：用NI-NTA琼脂糖柱子与复性好的p307254蛋白进行混合，冰上缓慢摇床混合，2小时，进行纯化，纯化p307254蛋白质经SDS-PAGE分析纯度大于90％的蛋白质。结果如图5所示，图中条带1：重组p307254-pet28a/BL21(DE3)纯化产物，理论大小47.5KDa；条带2：蛋白质分子量标准(14.4，18.4，25，35，45，66.2，116KDa)。

第七步：纯化好的p307254蛋白质，定量，100μg/管分装，冷冻抽干，保存于-20℃备用。

实施例2以本发明重组p307254蛋白为活性成分的疫苗对家兔的免疫评价

(一)将实施例1所得的非洲猪瘟病毒重组p307254蛋白稀释至0.5mg/ml后包被ELIAS板子用ELISA方法检测血清效价。

取血清OD450值小于0.1的阴性的大耳白家兔6只，随机分成实验组(编号1～3)和对照组(编号4～6)。大耳白家兔，30日龄，雄性，体重相近约1.8～2kg/只，由中国农业大学实验动物中心提供。实验组用本发明非洲猪瘟病毒重组p307254蛋白免疫，将冷冻抽干的粉末状重组p307254蛋白用PBS(0.01M，pH7.2～7.4)溶解与等体积福氏佐剂充分搅拌混匀，制成乳胶溶液，颈部皮下多点注射家兔3只，每只按200μg/kg体重，间隔14天同样剂量和部位追加1针，28天时再追加1针，对照组大耳白家兔3只，仅注射PBS与福氏佐剂乳胶溶液(注射体积与实验组注射体积相同)，共免疫3次。在整个免疫过程中在28天和35天时采集兔子血清，检测血清抗体效价，比较实验组及对照组大耳白家兔血清的效价。

(二)准备材料：

包被抗原：实施例1制备的重组p307254蛋白质。

待检血清：实验组3份兔血清和对照组3份兔血清。

封闭液：含5％脱脂奶粉的PBST。

二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗兔多抗血清。

(三)P307254抗原检测非洲猪瘟病毒抗体效价ELISA方法：

1、制备包被抗原：用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至5μg/mL，备用；

2、包被ELISA板：将稀释好的浓度为5μg/mL的重组p307254蛋白溶液加到ELISA板内，100μL/孔，4～8℃12～16小时；

3、洗涤ELISA板：从4～8℃的冰箱取出包被抗原的板子，倒掉孔内包被抗原溶液，用PBST(PBST为含0.5‰的Tween-20的0.01M，pH7.2～7.4PBS溶液)注满洗涤3次，3min/次，拍干ELISA板；

4、封闭ELISA板：ELISA板每孔内加入封闭溶液(含0.5％脱脂奶粉的PBST溶液)，200μL/孔，置于37℃恒温反应2小时；

5、洗涤ELISA板：重复第3步；

6、加一抗：ELISA板每孔内加入1:100比例稀释好的待检血清(用PBST稀释)，100μL/孔，置于37℃恒温反应30min；

7、洗涤ELISA板：倒掉孔内一抗，用PBST洗涤5次，3min/次，拍干ELISA板；

8、加二抗：ELISA板内加入1:4000比例稀释好(用0.01M，pH7.2～7.4PBS稀释)的HRP标记羊抗兔血清100μL/孔，置于37℃恒温反应30min；

9、洗涤ELISA板：重复第7步；

10、加底物：ELISA板每孔内加入TMB溶液，100μL/孔，置于37℃恒温，避光显色13～15min；

11、加终止液：ELISA板每孔内加入2M盐酸溶液，100μL/孔，轻轻摇动混匀孔内液体；

12、读取OD450值：将ELISA板放入酶标仪上，在450波长读取数值，即OD450值。

(四)结果见表1，检测结果对照组兔子二免和三免后14天血清，2次的OD450值均小于0.1，实验组兔子二免和三免后14天血清，2次的OD450值均大于1.5。说明本发明的重组p307254蛋白可以在家兔体内诱导产生中和抗体即能够激活体液免疫反应。

表1OD450值

实施例3斑点ELISA法检测比较非洲猪瘟病毒重组p307254与单独表达的p30、p72和p54重组蛋白的抗原性

蛋白质样品：经纯化定量的非洲猪瘟病毒重组p307254、p30、p72和p54重组蛋白。

抗原制备：将实施例1中纯化好的p307254重组蛋白以及纯化好的p30、p72和p54单独表达重组蛋白用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)稀释至10μg/mL，充分溶解备用1％BSA：用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)配制备用。

一抗血清：非洲猪瘟标准阳性血清(购自中国兽医药品监察所)；阴性对照血清用未经免疫和未感染过非洲猪瘟病毒的正常猪血清。

斑点ELISA实验步骤：

1、硝酸纤维膜(NC)抗原包被：取出0.45μm孔径NC膜，剪下适当大小的NC膜，用铅笔在所裁剪下来的NC膜上画10个方块，在8个方块内各点2μL，稀释好的p307254、p30、p72、p54抗原(10μg/mL)，即每个点位抗原含量为20ng，另外2个方块内各点2μL 1％BSA。将NC膜置于铺有潮湿纱布的盒内盖好盖子4～8℃孵育12～16小时。

2、洗涤NC膜:取出包被好的NC膜，放入10mL～20mL PBST(含0.5‰吐温-20的0.01MPBS缓冲液pH值7.2～7.4)置于摇床上洗涤5min，换掉洗液。重复3次。

3、封闭NC膜:洗涤好的NC膜放入预先配制好的封闭液中(含5％脱脂奶粉的PBST溶液)，37℃封闭2小时。

3、洗涤NC膜：同第2步。

4、加入一抗：将NC膜10个抗原点位裁剪成2条(每条含5个抗原点位)后两条NC膜分别放入1:100比例稀释好的非洲猪瘟标准阳性血清和阴性对照(正常猪血清)血清溶液中(均用含5％脱脂奶粉的PBST稀释)，室温(22～25℃)平稳摇动，室温2小时。

5、洗涤NC膜：弃一抗，用PBST分别洗膜，5min×4次。

6、加入二抗：将2条NC膜加入到辣根过氧化物酶偶联的兔抗猪二抗(用0.01M PBSpH7.2～7.4，按1∶4000稀释)溶液中，平稳摇动，室温1小时。

7、洗涤NC膜：弃二抗，用PBST洗膜，5min×4次。

8、DAB显色：将膜放入预先配制好的DAB显色液中，避光显色至出现出现浅棕色斑点后继续在显色2min后取出NC膜移入双蒸水中终止反应。

结果如图6所示，图中A列为未经免疫和未感染过非洲猪瘟病毒的正常猪血清结果，B列为非洲猪瘟标准阳性血清的结果，1：p307254-pet28a/BL21(DE3)重组蛋白；2：p30-pet28a/BL21(DE3)重组蛋白；3：p72-pet28a/BL21(DE3)重组蛋白:4:BSA；5：p54-pet28a/BL21(DE3)重组蛋白。

结果表明p307254抗原与非洲猪瘟标准阳性血清反应出现很深棕色斑点，与阴性对照(正常猪血清)没有出现显色；p30和p72单独表达抗原与非洲猪瘟病毒阳性血清和阴性血清液均未出现肉眼可见显色；p54单独表达抗原与非洲猪瘟阳性血清反应后出现肉眼可见浅棕色斑点，与阴性血清未出现显色；1％BSA与非洲猪瘟阳性血清和阴性猪血清均无显色反应。

结论：根据斑点ELISA实验结果可以看出，单独表达的p30和p72蛋白与非洲猪瘟病毒阳性血清没有抗原活性，单独表达的p54虽然与非洲猪瘟病毒阳性血清反应，但从显色结果来看抗原性很弱。本发明嵌合重组表达p30、p72和p54获得的重组蛋白p307254与非洲猪瘟阳性血清反应后出现很强的显色反应，说明p307254嵌合表达重组蛋白抗原性明显好于p30、p72和p54的单独表达重组蛋白，同时p307254嵌合表达重组蛋与非洲猪瘟阴性血清未出现显色，说明p307254嵌合表达重组蛋特异性也很好。

实施例4利用本发明制备的非洲猪瘟病毒嵌合重组蛋白p307254和单独表达p30、p72和p54重组蛋白抗原间接ELISA法检测非洲猪瘟血清抗体

1、包被抗原制备：(本发明所用的单独表达p30、p72和p54蛋白抗原基因和氨基酸序列以及表达载体与p307254完全相同，由本实验室自制，方法和步骤不赘述)。将纯化的非洲猪瘟病毒p307254重组蛋白、单独表达p30、p72和p54重组蛋白用包被碳酸盐缓冲液(0.05M，pH 9.6)稀释至5μg/mL。

2、包被ELISA反应板：将稀释好的p307254、p30、p72和p54抗原溶液加入到ELISA反应板内，100μL/孔，置于4～8℃14～16小时，各抗原包被一整板。

3、洗涤ELISA反应板：取出反应板，用PBST(含0.5‰吐温-20的0.01M，pH7.2～7.4的PBS)洗涤5次，每次3分钟。

4、封闭ELISA反应板：反应板每孔内加入含有5％脱脂奶粉的PBST(200μL/孔)，置于37℃，封闭2小时。

5、洗涤ELISA反应板：同步骤36、一抗反应：用PBST按1:200比例稀释的非洲猪瘟标准阳性血清(中检所购买)和阴性对照血清(正常猪血清)，加入p307254、p30、p72和p54不同抗原包被ELISA反应板对应孔内(均做复孔)，同时用PBST作为空白对照同样做复孔，100μL/孔，37℃孵育30分钟。

7、洗涤ELISA反应板：同步骤3。

8、二抗反应：ELISA反应板每孔内加入预先1:5000稀释好的(用0.01M，pH7.2～7.4PBS)HRP标记兔子抗猪二抗，100μL/孔，37℃孵育30分钟。

9、洗涤ELISA反应板：同步骤3。

10、显色反应：ELISA反应板每孔内加入TMB底物溶液，100μL/孔，37℃孵育10～15分钟。

11、终止：ELISA反应板内加入2N盐酸溶液，100μL/孔，轻轻摇动反应板，充分混合。

11、读OD₄₅₀值：将ELISA反应板放入酶标仪板槽内，读取每孔OD₄₅₀值。

12、结果：见表2。

表2

从表格2结果可以看出，使用单独表达的p30、p72和p54蛋白分别作为ELISA抗原检测阳性和阴性血清时P/N值均低于三个蛋白嵌合在一起表达的重组蛋白p307254作为抗原的P/N(38.7)值，说明本发明制备的嵌合重组蛋白p307254的抗原性比单一表达重组蛋白高。本发明所选的p30和p54为非洲猪瘟病毒侵入细胞体内起至关重要作用，在病毒感染早期能够产生对应的中和抗体，并贯穿整个感染过程。P72为病毒感染后期对病毒壳的形成。本发明制备提供的嵌合重组表达蛋白p307254集三个蛋白特征于一身，有效弥补了单一蛋白作为疫苗抗原时因所产生的抗体单一甚至不能激活产生抗体而免疫失败。另一方面p307254作为非洲猪瘟病毒诊断抗原使用时，相对于单一抗原p30、p72和p54单独使用，对非洲猪瘟病毒抗体的灵敏性和特异性大大提高，对于非洲猪瘟病诊断，尤其病毒感染早期检测具有重要价值。

本发选取非洲猪瘟病毒三个结构蛋白p30、p72和p54抗原表位集中片段，用PCR方法将三个基因连接在一起，构建原核表达载体，诱导表达制备了p307254嵌合重组蛋白。所制备p307254蛋白在实施例3和实施例4所述，与单独表达p30、p72和p54重组蛋白进行比对发现，p307254蛋白对非洲猪瘟病毒阳性血清的抗原性明显高于单独表达p30、p72和p54三种蛋白，从而填补市场上现有检测试剂抗原灵敏度和特异性不理想等缺点。另外p307254嵌合重组蛋白从基因水平上连在一起获得的表达产物，因此具备了三个蛋白各自的功能特性，甚至在某种程度上相互强化了免疫原性和抗原性，对开发非洲猪瘟病毒亚单位疫苗和检测试剂具有预料不到的应用前景。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白，其特征在于，该蛋白为嵌合表达非洲猪瘟病毒p30、p72和p54的结构蛋白片段的蛋白质；其中，p30的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，p72的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，p54的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.如权利要求1所述的重组表达蛋白，其特征在于，其蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，

或是与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列SEQ ID NO.1所示的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

3.编码如权利要求1所述的重组表达蛋白的基因，其特征在于，其能嵌合重组p30、p72和p54蛋白的基因，其含有SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列。

4.编码如权利要求1所述的重组表达蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为如下序列之一：

1)如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；

2)与SEQ ID NO.2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

5.一种表达载体，其含有如SEQ ID NO.2所示序列。

6.一种细胞系，其含有如SEQ ID NO.2所示序列。

7.一种嵌合重组表达非洲猪瘟病毒p30、p72和p54蛋白的制备方法，其包括如下步骤：

扩增如SEQ ID NO.2所示的目的片段；

将目的片段与表达载体相连转入大肠杆菌；

筛选阳性克隆；

诱导表达得到目的蛋白。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，扩增目的片段的方法为：首先用引物SEQID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14以及SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16三对引物依次扩增SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.8；

第二步用引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.14以扩增获得的SEQ ID NO.9与SEQ IDNO.10基因片段为模板扩增获得p3072嵌合基因；

第三步用引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.16，以扩增获得的嵌合基因p3072和SEQ IDNO.8基因片段为模板进一步嵌合扩增，获得其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的目的片段。

9.一种预防非洲猪瘟病毒感染的疫苗，其特征在于，其活性成分是权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白，其嵌合重组表达p30、p72和p54蛋白组成的保护性抗原。

10.一种检测非洲猪瘟病毒感染血清抗体的抗原，其特征在于，其抗原成分是权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白。

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