CN104628865B - 一种伪狂犬表位多肽基因工程疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种伪狂犬(Pseudorabies virus，PrV)表位多肽基因工程疫苗的制备与应用。所述疫苗以PRV主要糖蛋白gB、gC、gD的B细胞中和表位和T细胞免疫表位作为疫苗框架结构，通过柔性linker连接后再与分子佐剂牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesvirus 1，BHV‑1)被膜蛋白VP22串联，克隆入pRSETB载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的伪狂犬表位多肽基因工程疫苗。本发明还涉及该疫苗的使用方法。动物实验表明，伪狂犬表位多肽基因工程疫苗在体液免疫与细胞免疫水平上效果与活毒苗相当，可以在细胞水平上刺激产生T淋巴细胞增殖免疫反应，体液水平上产生具有病毒中和活性的抗体免疫反应。

Description

一种伪狂犬表位多肽基因工程疫苗

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种伪狂犬(Pseudorabies virus，PrV)表位多肽基因工程疫苗的制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将PRV主要糖蛋白gB、gC、gD的B细胞中和表位和T细胞免疫表位与牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesvirus 1，BHV-1)被膜蛋白VP22串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到伪狂犬表位多肽基因工程疫苗以及该疫苗在预防重大动物疾病伪狂犬病中的应用。

背景技术

伪狂犬病是一种发生于家畜、野生哺乳动物、伴侣动物和实验动物中，以发热、奇痒(猪除外)以及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PrV)引起的。伪狂犬病病毒的基因组DNA为线状双链，长约150kb，由独特长区段(UL)、独特短区段(US)、短区段两侧的末端重复序列(TR)和内部重复序列(IR)组成。伪狂犬病毒的基因组DNA至少可编码70个基因，其中许多基因是非必需的可通过缺失毒力基因而致弱，而且其庞大的基因组，可以容纳较大外源基因的***。

在UL区已被定位的基因共58种，包括已被测序的编码糖蛋白gB(gII)、gC(gIII)、gH、gK、gL、gM、gN、TK、碱性核酸酶(AN)、核糖核苷还原酶(RR)、DNA多聚酶(POL)、DBP(136kDaDNA结合蛋白质)、MCP(主要衣壳蛋白)、ICP18.5蛋白和早期蛋白O(EPO)等基因。US区已被全部测序，其中包括编码蛋白激酶(PK)、糖蛋白gG(gX)、gp50(gD)、gp63(gI)和gI(gE)的基因及编码11kDa和28kDa的基因。IR区的早期基因(IE)和RSp40基因也得到了鉴定和测序，且证明不同毒株间的IE基因存在差异。另外IR与UL连接区的潜伏基因也已得到鉴定。现已知的9种PrV包膜糖蛋白(gX、gp50、gp63、gI、gII、gIII、gH、gM和gL)中除gX外，其它均为成熟病毒子的结构成分，只有gX是非结构成分，常存在于感染细胞中，病毒子上没有发现。到目前为止，已证实gI、gIII、gp63、gX和gM对病毒体内增殖是非必需的，而gII、gp50、gH和gL为病毒复制所必需。

目前广泛应用的gE单基因缺失疫苗在使用过程中己逐渐爆露其局限性，具体表现在：gE缺失疫苗免疫后，尽管能减少野毒感染后产生临床症状以及感染后野毒的排出，但是在具有高母源抗体的猪如育成猪或育肥猪，使用gE疫苗后不能有效地激发中和抗体，因而在感染后排出病毒较多(Gielkens L J，1984；Molitor T W etal.，1992)， 故母猪需要重复接种，并建议商品猪在8、12、16周分别免疫一次。同时gE的缺失导致病毒在体内增殖很快，尤其是在巨噬细胞、骨髓细胞和淋巴细胞中，虽然gE基因缺失株毒力有所下降，但对免疫***的特别的亲嗜性可能会产生免疫抑制。gG缺失疫苗与其它疫苗的比较方面，也有不同的结论：无论母源抗体存在与否，gX和gE缺失疫苗在诱导中和抗体滴度和阻止感染后排毒方面均无差异(Boeker M，etal.，1999；Pensaert M B，De Waele K，1990)，Vamier Petal(1991)。将gG与gE缺失苗分别溶于水中，gG(gX)免疫后诱导的抗体水平略高于gE缺失苗。RzihaHJetal(1989)比较了TK/gE和gE/TK两种缺失突变株在体内的增殖。结果说明：gE/TK在感染后6周，用免疫抑制剂处理猪后，可从许多组织中检出该缺失株的DNA，而TK/gE只在神经组织和扁桃体中增殖，而且以极低的数量增殖，用免疫抑制剂处理猪后，不能检测到感染性的病毒粒子，这一结果支持早期研究结果(Kit etal.，1985)，即TK基因阴性的疫苗可降低病毒形成潜伏感染的能力。

尽管针对PrV病毒产生的保护性免疫作了大量的研究，但对于保护力产生的机理和抗原的确切性质仍有许多未知的因素，大多数研究都强调了细胞免疫的重要性。但Prv病毒免疫应答的机制较为复杂，被动免疫只能阻断病毒从最初增殖的上皮细胞中扩散，但不能阻止病毒在接种部位的复制和增殖。从表达高水平主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原的上皮细胞消除感染，必须借助细胞毒性T淋巴细胞，而在不表达MHC的神经细胞中消除感染则依赖于抗体。抗体在保护力中发挥一定作用，但是抗体滴度与临床保护力之间的相关性是不完全的，因为有些抗体阴性猪在攻毒时部分获保护(Andries etal，1978；McCawandXu，1993)。

目前已经发现PRV有11种糖蛋白，其中，gB、gC、gD均为刺激机体产生中和抗体的蛋白，所产生的抗体无论是在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和PRV的能力。因此，gB、gC、gD是研制PRV亚单位疫苗的首选糖蛋白。在PRVgB、gC糖蛋白中检测到B细胞表位(Ober，B.T.，etal，1998；K.H.Wiesmuller，etal，2000；Zaripov，M.M.，etal，1998)也检测到gC蛋白T细胞表位能够诱导体液免疫和细胞毒性反应(Ober，B.T.，etal，2000；)。PRV gD诱导强烈的中和抗体和微弱的细胞毒性反应。(van Rooij，E.M.，etal，2000)充分了解保护相关的免疫参数是提高抗PRV病毒疫苗的前提。基于Th1型细胞调节是抗PRV感染的重要保护效应机制(Bianchi，A.T.，1998；Fischer，L.，2003；Van Rooij，E.M.，2004；)。因此，有报道免疫诱导Th1偏好免疫反应能够提供有效保护抵抗致命PRV感染。(Yoon，H.A.etal，2007).在这三个主要糖蛋白中，表达gB蛋白的质粒DNA肌肉注射免疫动物能够诱导Th1偏好免疫反应，随后提供了最有效的抗致命性攻毒的保护。(Yoon，H.A.etal，2006).而且Th1偏好免疫反应来源的免疫调节细胞因子的结合有助于增强抗致命性PRV感染的抵抗力。(Yoon，H.A.etal，2006；Yoon，H.A.etal，2007)。特异性病毒中和血清抗体在控 制PRV感染的控制中发挥了相当大的作用(Kimman，T.G.，etal，1992；Marchioli，C.，R.etal，1988)。Marchioli等将PRV保护性抗原基因gD***到人巨细胞病毒启动子的下游，然后转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中，经氨喋呤筛选出1株表达gD蛋白的CHO gD-17细胞株，经大量培养后用表达产物配以佐剂，免疫小鼠能产生较高滴度的抗体，免疫3次后攻毒，小鼠能抵抗强毒攻击。鼻内接种免疫猪，能诱导猪产生中和抗体并保护猪抵抗PRV强毒的攻击。Katayama等(1991)用肝素亲和层析纯化的gC和用免疫亲和层析纯化的gB、gC、gD分别接种猪，均能使其抵抗PRV的攻击。杆状病毒表达的PRV糖蛋白gC能诱导小鼠产生中和抗体。Tulman等将提取的PrV囊膜蛋白gC制成免疫源复合物即亚单位疫苗。用亚单位疫苗免疫小鼠和猪均能够诱导抗体应答和淋巴细胞增殖反应。用此亚单位疫苗免疫小鼠和猪，均能够诱导抗体应答和淋巴细胞增殖反应。用此亚单位疫苗免疫两次，能够保护小鼠免受致死量的PRV强毒的攻击。已证实了几种疱疹病毒蛋白是T细胞或抗体的靶抗原，例如，单纯疱疹病毒I型(HSV-1)特异性马细胞毒性淋巴细胞识别极早期糖蛋白(Ballksetal.，1991)。因此，感染细胞在感染性病毒产生之前就被裂解。晚期Hsv-1糖蛋白gB、gC和gD是人、马、猪细胞毒性T细胞的靶抗原，也己被认为是中和抗体的靶抗原(Ben-Poratetal，1986)，抗体吸附试验表明猪已产生针对gE、极早期蛋白、核衣壳蛋白的抗体。Zuckermann F A(1999)证明了gC抗体是康复猪血清中发挥中和作用的主要抗体成分；gC糖蛋白也是细胞毒性CD8+和CD4+T细胞的靶细猪和免疫猪产生的细胞免疫和体液免疫的靶抗原。辅助性T细胞识别的gC糖蛋白两个抗原决定簇已被证实。因此gC是自然感染性，不依赖补体的作用。gD糖蛋白也是T细胞的靶抗原。gG都不能刺激产生中和抗体(Thomsenetal1987)，因为gG不是病毒囊膜的组成部分。用纯化的gC或gD免疫猪和小鼠，比gG免疫更能产生较好的保护力，抵抗高毒力PRV毒株攻击。gB、gC和gD的单克隆抗体能被动保护鼠和猪对于PRV的致死性感染，而gE单抗仅能保护鼠。gE含有几个抗体结合位点，需要补体才能中和病毒，gE也含能被辅助性T细胞识别的抗原表位，但在鼠中未能证明细胞毒性淋巴细胞(CTL)对gE识别，用gE的真核或原核表达产物免疫鼠也能保护小鼠。伪狂犬病毒gC糖蛋白是鼠和猪CTLS的靶抗原，gC的功能是多种的：在PRV的附着中发挥关键作用，而且是主要的免疫原。该蛋白质在小白鼠和猪体内诱导了在补体存在时具有中和作用的抗体，而且是T细胞应答的靶细胞；

表位多肽疫苗可针对性选择的不同毒株的相同抗原保守区域进行设计，含有广谱的表位信息，排除全病毒蛋白中存在的抑制性表位、病理、耐受性及导致不同毒株间差异的表位等不利因素，提供不同毒株之间的交叉免疫保护，进而有效应对宿主自身基因突变所造成的免疫逃避问题。表位疫苗还具备了传统疫苗技术所不具备的优势，其摆脱了体外培养的限制，生产中不需要活病毒参与，不包含病原生物的完整组分，彻底摆脱了潜在威胁，无毒力返祖现象，更安全；人工合成或工程表达，质量更稳定； 能够克服MHC的遗传限制而得到高效递呈，不会引起自身免疫反应或免疫抑制；分子结构小而简单，很少会出现严重的过敏反应及医源性感染问题；具有可操作性，在分子水平上进行不同病原多表位的联合修饰或改造。

牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesvims 1，BHV-1)被膜蛋白VP22是蛋白转导相关蛋白，具有独特的蛋白转导功能(Harms J S et al，2000)，能将与之融合的外源蛋白在无任何辅助条件介导下直接跨膜转运进入细胞，并可在细胞间传递，而且被转导进入细胞内的外源蛋白仍保留其原有的生物活性(Wills K N et al.，2001，Elliott G O，1997，KretzA，Wybranietz WA，Hermening S et al.，2003)。因此其能显著提高外源蛋白的提呈效率进而提高其免疫原性。尽管迄今对于蛋白转导的跨膜机理仍未得以完全阐释，但关于VP22蛋白转导特性应用基础研究仍得到广泛开展，并取得令人鼓舞的研究成果。目前已有多篇文献报道证实将VP22与靶抗原基因融合表达显著增强DNA疫苗的免疫效应(Oliveira SC etal，2001，Hung C F et al.2004)。目前已有多篇研究报道证实将VP22与靶抗原基因融合表达显著增强DNA疫苗的免疫效应(Oliveira S C et al，2001，Hung CF et al.2004)。因此将目的基因与VP22融合表达是基因工程疫苗设计中的的一条新思路。

发明概述

本发明根据目前国内主要流行株糖蛋白gB、gC、gD氨基酸序列，利用相关生物信息学软件DNASTAR、BIMAS和SYFPEITHI对其进行亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Gamier-Robson的二级结构进行分析，再根据B细胞中和表位和T细胞表位位置和氨基酸序列的保守性设计寡核苷酸片段，同时引入牛疱疹病毒I型被膜蛋白VP22作为佐剂分子。将所设计伪狂犬病毒中和表位以及BVP22分子多肽串联后在大肠杆菌中共表达，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的伪狂犬表位多肽基因工程疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防伪狂犬病。

本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于预防伪狂犬病毒流行毒株感染的表位多肽疫苗及其疫苗组合物。

本发明的目的之二在于提供了所述表位多肽疫苗的构建及获得方法。

本发明的目的之三在于提供了能够表达所述伪狂犬表位多肽疫苗的基因工程菌株。

本发明的目的之四在于提供了所述伪狂犬表位多肽疫苗的制备方法。

本发明的目的之五在于提供了所述表位多肽疫苗在预防伪狂犬病中的用途。

在第一方面，本发明提供了一种用于伪狂犬流行毒株感染的表位多肽疫苗氨基酸其组合物。其含有3个主要糖蛋白gB、gC、gD B细胞中和表位，gB、gC糖蛋白的T细胞表位以及牛疱疹病毒被膜蛋白VP22分子佐剂。所述表位多肽疫苗包括gB、gC、gD多个B细胞及T细胞表位以及分子佐剂串联到一起所形成的蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及共表达抗原表位和分子佐剂多肽蛋白所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，或者单独编码分子佐剂BVP22结合序列。串联可以通过遗传工程方法进行，蛋白工程疫苗中除了含有3个主要糖蛋白gB、gC、gD B细胞中和表位，gB、gC糖蛋白的T细胞表位以及牛疱疹病毒被膜蛋白VP22分子佐剂外，还包含非免疫活性物质。所述非免疫活性物质为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和***反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。

优选在本发明第一方面的多表位疫苗多肽中所述的主要糖蛋白抗原表位序列来自主要流行毒株主要糖蛋白gB、gC、gD B细胞中和表位和T细胞表位，分子佐剂为牛疱疹病毒被膜蛋白VP22。

另外优选，本发明第一方面所述表位多肽疫苗的氨基酸序列如下：

(1)gB糖蛋白B细胞抗原表位1：

NRFTDRVPVPVQEITDVIDRRGKCVSKAEYVRNNHKVTAFDRDENPVEVDLRPSRLNALGTRGWHTTNDTYTKIG

(2)gB糖蛋白B细胞抗原表位2：

APGRFQQVEHYYPIDLDSRLRASESVTRNFLRTPHFTVAWDWAPKTRRVCSLAKWREAEEMIRDETRDGSF；

(3)gB糖蛋白T细胞抗原表位1：

ISRLRRNPMKALYPVTTKALKEDGVEEDDVDEAKLDQARDMIRYMSIVSALEQQEHKARKKNSGPALLASRVGAMATRRRHYQRLESEDPDAL

(4)gC糖蛋白B细胞抗原表位1：

TPRVPPPSVSRRKPQRNGNRTRVHGDEATSHGR

(5)gC糖蛋白B细胞抗原表位2：GRFRSPDADPEYFDEPPRPELPRE

(6)gC糖蛋白T细胞抗原表位1：DYYPRRSV；

(7)gC糖蛋白T细胞抗原表位2：DTQRYDAS；

(8)gD糖蛋白B细胞抗原表位1：FYQQPPHREVVNYWYRKNGRTLP

(9)gD糖蛋白B细胞抗原表位2：GSPRPRPRPRPRPSPRPKPEPAP

(10)gD糖蛋白B细胞抗原表位3：RPTPRPPRPETPHRPF

(11)分子佐剂为牛疱疹病毒被膜蛋白VP22：

FHRPSEDEDDYEYSDLWVRENSLYDYESGSDDHVYEELRAATSGPEPSGRGGPARRSSSRASSRPGGDSDPPKSNERLGGSRLRGERARP

在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的伪狂犬表位多肽疫苗。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式合成多抗原表位串联序列和分子佐剂序列，然后经过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得表位多肽疫苗蛋白。在本发明中可以 对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切，连接等，核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点。优选本发明中的核苷酸序列如下：

GGATCCTTCCACAGGCCCTCCGAAGACGAGGACGATTACGAGTACAGCGACCTTTGGGTGCGAGAAAACAGCCTCTATGACTACGAGTCCGGCTCGGATGACCACGTATACGAAGAGCTGCGCGCCGCGACGAGCGGACCCGAGCCGAGCGGGCGGGGTGGTCCGGCCCGCCGCTCGAGCAGCCGGGCGTCCTCGCGCCCGGGTGGTGACCCCCCAAAGAGCAACGAGCGATTGGATCGCGGTGGTAGCCGCCTTCGCGGCGAGCGGGCCCGGCCGGGTGATATCCCAGGTTGCAAGACGCCCCGGGTCCCGCCGCCCTCGGTCTCGCGCCGGAAGCCCCAGCGGAACGGCAACAGGACGCGCGTCCACGGCGACGAGGCCACCTCGCACGGGCGCGGTGGTGGGCGCTTCCGCTCGCCCGACGCCGACCCCGAGTACTTTGACGAGCCCCCGCGCCCGGAGCTCCCGCGGGAGGGTGGTGACTACTACCCGCGGCGCAGCGTGGGTGGTACGCAGCGCTACGACGCCTCCCCCGGTTCTGGTAACCGCTTCACGGACCGCGTGCCCGTCCCCGTGCAGGAGATCACGGACGTGATCGACCGCCGCGGCAAGTGCGTCTCCAAGGCCGAGTACGTGCGCAACAACCACAAGGTGACCGCCTTCGACCGCGACGAGAACCCCGTCGAGGTGGACCTGCGCCCCTCGCGCCTGAACGCGCTCGGCACCCGCGGCTGGCACACCACCAACGACACCTACACCAAGATCGGCGGTGGTGCGCCCGGGCGCTTCCAGCAGGTGGAGCACTACTACCCCATCGACCTGGACTCGCGCCTCCGCGCCTCCGAGAGCGTGACGCGCAACTTTCTGCGCACGCCGCACTTCACGGTGGCCTGGGACTGGGCCCCCAAGACGCGGCGCGTGTGCAGCCTGGCCAAGTGGCGCGAGGCCGAGGAGATGATCCGCGACGAGACGCGCGACGGGTCCTTCGGTGGTATCTCGCGCCTGCGCCGCAACCCCATGAAGGCCCTGTACCCCGTCACGACGAAGGCGCTCAAGGAGGACGGCGTCGAAGAGGACGACGTGGACGAGGCCAAGCTGGACCAGGCCCGGGACATGATCCGGTACATGTCCATCGTGTCGGCCCTCGAGCAGCAGGAGCACAAGGCGCGCAAGAAGAACAGCGGGCCCGCGCTGCTGGCCAGCCGCGTCGGGGCGATGGCCACGCGCCGCCGGCACTACCAGCGCCTCGAGAGCGAGGACCCCGACGCCCTGGGTTCTGGTTTCTACCAGCAGCCCCCGCACCGGGAGGTGGTGAACTACTGGTACCGCAAGAACGGCCGGACGCTCCCGGGTGGTGGCTCGCCGAGGCCCAGGCCCAGGCCCAGGCCCAGGCCCAGCCCCCGGCCGAAGCCCGAGCCCGCCCCGGGTGGTCGCCCCACGCCGCGACCCCCGAGGCCCGAGACGCCGCACCGCCCCTTCTAAGCTT

在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码伪狂犬表位多肽疫苗的核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。在一优选实施方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。

在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的伪狂犬表位多肽疫苗蛋白。

在第五方面，本发明提供了一种伪狂犬表位多肽疫苗的制备方法，其包括以下步骤：工程菌发酵表达表位多肽疫苗蛋白，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续乳化工艺，获得所需要的表位多肽疫苗。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、阴离子交换色谱、反相色谱、复性、乳化等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。

在第六方面，本发明提供了一种用于预防伪狂犬病的表位多肽疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。所述伪狂犬疫苗能够预防伪狂犬流行毒株的侵染。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为进口白油佐剂。

在第七方面，本发明提供了第六方面所述的伪狂犬表位多肽疫苗的应用。疫苗可以一定有效剂量肌肉注射，皮内或皮下注射或鼻内接种注射动物，能够产生足够量的中和抗体及细胞因子(如IFN等)提供抗病毒活性，保护动物。此外，在本发明的实施方案中，通过对疫苗进行靶动物免疫对比试验、实验室安全性试验等，表明本发明所述的伪狂犬表位多肽基因工程疫苗是安全的，伪狂犬表位多肽基因工程疫苗在体液免疫与细胞免疫水平上效果与活毒苗相当，可以在细胞水平上刺激产生T淋巴细胞增殖免疫反应，体液水平上产生具有病毒中和活性的抗体免疫反应。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1为伪狂犬表位多肽基因工程疫苗编码基因的表达载体pRSETB-PRV(gB/gC/gD)-BVP22示意图。图2为限制性内切酶酶切鉴定电泳图。1：DL2000DNAMarker；2：空载体对照；3：pRSETB-PRV(gB/gC/gD)-BVP22质粒双酶切；4：pRSETB-PRV(gB/gC/gD)-BVP22质粒。图3为菌种诱导表达SDS-PAGE电泳图。1：蛋白分子 量Marker：97.2KD，66.4KD，44.3KD，29.0KD，20.1KD，14.3KD；2-3诱导表达(箭头所指为目的蛋白)；4：未诱导表达的对照菌。图4为样品纯化Western Blot印迹结果。1：预染Marker；2：样品；3：阴性对照。图5为发酵样品SDSPAGE电泳图。1：蛋白分子量Marker：97.2KD，66.4KD，44.3KD，29.0KD，20.1KD，14.3KD；2：未表达对照；3：发酵样品。图6为发酵纯化蛋白Western Blot印迹结果。1：预染蛋白分子量Marker；2：发酵纯化样品；3：空白对照。图7为免疫小鼠血清ELISA检测gC糖蛋白特异性抗体检测结果；图8为PRV刺激鼠肾细胞T淋巴细胞增殖反应检测结果；图9为PRV刺激PBMC T淋巴细胞增殖反应检测结果。

具体实施方式

实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制，依据本发明的许多变化为本领域的技术人员所熟知。

实施例一 伪狂犬表位多肽疫苗蛋白的设计思路

本发明根据目前国内伪狂犬主要流行株糖蛋白gB、gC、gD氨基酸序列，利用相关生物信息学软件DNASTAR、BIMAS和SYFPEITHI对其进行亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二级结构进行分析，再根据B细胞中和表位和T细胞表位位置和氨基酸序列的保守性设计寡核苷酸片段，同时引入牛疱疹病毒I型被膜蛋白VP22作为佐剂分子。将所设计伪狂犬病毒B细胞和T细胞表位以及BVP22分子多肽串联后在大肠杆菌中共表达，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的伪狂犬表位多肽疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防伪狂犬病。

综合分析国内伪狂犬病毒流行株SA、Bartha、HNQX、ZJNB、HuNXT等基因组序列，抗原结构、流行病学研究进展，对重组伪狂犬表位多肽疫苗进行了优化设计。本发明利用生物信息学软件对其糖蛋白gB、gC、gD进行的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Gamier-Robson的二级结构进行分析，预测可能的B细胞抗原表位以及T细胞表位的基础上，根据表位位置和氨基酸序列的相似性，分析各流行毒株共有抗原表位，并参考GenBank中的序列信息，对预测的抗原表位进行比对，进一步分析抗原表位在不同病毒株中的保守性，从而确定与gB糖蛋白B细胞优势抗原表位多肽2段，T细胞表位1段，gC糖蛋白B细胞表位2段，T细胞表位2段，gD糖蛋白B细胞表位3段。将所有表位串联后形成疫苗的骨架结构，同时在骨架氮末端加入分子佐剂。该疫苗的总体结构为：

Molecular Adjuvant(BVP22)-gC B Cell Epitope 1-gC B Cell Epitope 2-gCT Cell Epitope 1-gC T Cell Epitope 2-gB B Cell Epitope 1-gB B Cell Epitope 2-gB T Cell Epitope 1-gD B Cell Epitope 1-gD B Cell Epitope 2-gD B Cell Epitope3

实施例二 大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建

将实施例一中设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了BamH I(5’端)和HindIII(3’端)限制性酶切位点，把这2个片段合成后分别克隆到pMD18T载体上，序列测定证实***基因片段与设计序列一致(见序列表)。将重组质粒命名为pMD18T-PRV(gB/gC/gD)-BVP22，用相应的限制性内切酶将两种质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用Invitrogen公司的pRSETB质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μl反应体系，体系内加入2μl质粒，限制性内切酶为5个活性单位(NewEngland biolabs)，加入10×缓冲液1μl，去离子水补齐，37℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μl 200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2.9kbpRSETB质粒、1480bp的PRV(gB/gC/gD)-BVP22片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段1∶2-3的比例将多表位核苷酸片段单独和表达载体混合，反应体系15μl，由T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒命名为pRSETB-PRV(gB/gC/gD)-BVP22(见图1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

转化：将pRSETB-PRV(gB/gC/gD)-BVP22置冰上融化，加入2μl链接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入1ml LB培养液，37℃，静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μlLB培养基重悬菌体；将菌液均匀涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12-16小时，直至克隆形成。

鉴定：挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养12小时，提取质粒，使用内切酶BamH I和HindIII进行双酶切，可以切出相应伪狂犬病疫苗基因大小片段的克隆，1480bp，可初步确定为阳性克隆(见图2)；阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。

诱导表达。即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1∶100转接，培养3小时后，加入0.5mM IPTG，继续培养3小时，制备样品；常规SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况——在56KD分子量处(见图3)，见到特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Western-blot进一步证实其表达准确性(见图4)；经过上述构建及鉴定程序后，可将挑选的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立，菌种命名为pRSETB-PRV(gB/gC/gD)-BVP22/BL21(DE3，Plys)。

实施例三 工程菌的发酵、纯化与乳化

发酵取生产菌种，接种于2ml LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃，180rpm振荡培养12小时活化菌种。再以1∶100的接种量接入摇瓶，37℃振荡培养至OD600＝3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和pH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37.0℃时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0±0.1℃，溶氧控制在20％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600＝1.0～1.2时流加补料500ml，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检定表达情况。

纯化将收集到的菌体，用包含体洗液I(1％Triton X-100，20mMTris-cl PH8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包含体，并用包含体洗液II(1％DOC，4M尿素，20mMTris-cl PH8.0)混悬二次超声洗涤包含体，二次低温离心收集包含体。包含体沉淀用8M尿素，0.3％β-ME，20mM Tris-cl(pH＝8.00)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30min，弃去沉淀。变性蛋白1∶100稀释，复性液用Tris(PH8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱；再用1.5M(NH₄)₂SO4、100mMEDTA、pH＝8.5的10mM Na₂HPO₄平衡上疏水层析柱，再平衡，用pH＝8.5的10mM Na₂HPO₄洗脱，即得伪狂犬多肽表位疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及Westernblot印记检定纯化产物是否为目标蛋白(图5、图6)。

乳化将纯化的半成品用灭菌的PBS稀释至200μg/ml。取进口白矿物油佐剂DUOPRIME(医药级)经121℃，灭菌15分钟，备用。按油相∶水相＝50∶50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2min，然后以5500r/min高速循环乳化9min，制成油包水单相疫苗。

实施例四 伪狂犬表位多肽疫苗安全性试验

材料

疫苗：伪狂犬表位多肽疫苗，批号为20120604、20120608、20120612。

试验动物(1)18-22g小白鼠17只，购自青岛市药检所。(2)妊娠母猪8头，5周龄仔猪12头，IDEXX ELISA商业化试剂盒检测PRV阴性，广东永顺生物制药有限公司试验动物中心提供，猪在开始试验前环境适应一周。

方法

疫苗对小白鼠的安全性

皮下注射小白鼠，每只注射0.5ml，每批疫苗注射5只，共注射15只小白鼠，同时设定2只阴性对照，连续观察10天，观测小白鼠的健康状况。

疫苗对妊娠母猪的安全性

6头长白母猪在妊娠40～60天时，分别肌肉注射lmL伪狂犬表位多肽疫苗，每批次免疫两头，另外设2头母猪作为未免疫对照，观察产仔情况。

疫苗对仔猪的安全性

PRV抗体阴性仔猪9头用于注射中心所提供的表位多肽疫苗，每批疫苗注射3头猪，每头猪耳后肌肉各注射1ml共计2ml。同时设立阴性对照3头，每头注射白油佐剂2ml，临床观察14天。试验结束，每头猪称重。

结果

疫苗对小白鼠的安全性试验

结果如表1，20120612免疫组1只受试动物第二天体温略有升高，第三天恢复正常，食欲和健康状况无异常，与对照组一致，无死亡发生，可见伪狂犬表位多肽疫苗对小白鼠是安全的，见表1。

表1 疫苗对小白鼠的安全性试验结果

组别	动物数量	体温	食欲	健康状况	死亡数量
						20120604	5	1头体温升高，其他正常。	正常	健康状况良好	0
20120608	5	正常	正常	健康状况良好	0
						20120612	5	正常	正常	健康状况良好	0
对照	2	正常	正常	健康状况良好	0

疫苗对妊娠母猪的安全性试验

由表2结果表明试验母猪饲养至分娩后，除有个别的弱胎和死胎，没有出现流产、早产和产木乃伊胎现象，证明本疫苗对妊娠母猪是安全、可靠的，对妊娠母猪的生产 性能没有影响。试验期间疫苗组和对照组试验猪均没有出现异常临床反应，精神、采食正常，注射部位没有炎症症状。

表2 怀孕母猪生产性能结果

疫苗对仔猪的安全性试验

结果如表3，疫苗组和对照组试验猪均没有出现异常临床反应，精神、采食正常，注射部位没有炎症症状，体温均正常，免疫组仔猪平均增重本疫苗组分别为2.5Kg、2.4Kg，空白对照组平均增重2.3Kg，组间未呈现显著差异(P＞0.05)。详见表1。整个试验观察期14天内，所有免疫的共9头5周龄仔猪，体温和食欲均正常，没有出现任何临床异常现象，试验结束后，9头仔猪均健活，与对照组无差别。这说明，伪狂犬表位多肽疫苗对仔猪是安全的。

表3 仔猪安全性检测结果

实施例五 动物分组与免疫

为了尽可能多的得到疫苗的有效性评价参数，本发明检测了免疫BALB/C小鼠后的特异性抗体、小鼠及仔猪的病毒中和抗体以及细胞免疫有关的T淋巴细胞增殖情况。

1疫苗与攻毒用病毒

伪狂犬表位多肽疫苗由红桥明勤研发中心提供，批号为20120604、20120608、20120612，gE基因自然缺失疫苗毒株(Bartha-K61)活疫苗由广东永顺制药研发中心惠赠，批号为2012016。

2试验动物及分组

25只5周龄的BalB/C雌性小鼠，随机分为5组，表位多肽疫苗三个批号组、活疫苗组以及对照组，每组5只/笼；25头5～6周龄仔猪，雌雄各半，随即分为5组，表位多肽疫苗三个批号组、活疫苗组以及对照组，每组5头，实验前试验动物预饲一周，适应环境。

3试验设计与方法

按照分组情况对Balb/C小鼠及仔猪进行免疫，首免后两周加强免疫一次，20μg/只或20μg/头。首免后2周、4周、6周、8周，小鼠断尾采血并分离血清，并于最后一次采血后，宰杀小鼠，分离鼠肾细胞用于T淋巴细胞增殖试验；首免后6周、8周、10周，仔猪前腔静脉采血并分离血清及PBMC用于细胞免疫检测。

实施例六 间接ELISA检测gC抗体反应

重组蛋白纯化样品用50mmol/l的CBS(PH9.6)稀释至1μg/ml，加入96孔ELISA板，每孔100μl，4℃过夜包被。PBST洗液buffer洗涤三次后，用封闭液5％马血清(PBS缓冲体系)于37℃，封闭1小时。洗涤三次后，小白鼠血清样品用封闭液(5％马血清，PBS缓冲体系)稀释至1∶20，每孔加入100μl，两个重复，37℃孵育1小时；洗涤三次后，每孔加入稀释至1∶10000的HRP-标记二抗(羊抗鼠)，37℃孵育1小时；洗涤三次后，每孔加入50μl TMB底物，室温、避光、反应10min，加入2M H₂SO₄停止反应。在450nm波长下读取吸光值(BIORAD 680酶标仪)。

结果

结果

如图7所示，不同组产生不同水平的gC蛋白特异性抗体。整个试验期间，表位多肽疫苗以及活苗组小鼠产生了明显的gC蛋白特异性IgG抗体，与对照呈极显著差异(P＜0.01)。结果表明本发明提供的表位多肽疫苗可以刺激Balb/C小鼠产生体液免疫反应，且抗体水平与现有的活疫苗相当，无显著差异(P＞0.05)。

实施例七 抗体中和试验

对首免后4、6、8周采集的血清，进行病毒中和抗体(SN)检测。血样在进行血清中和实验前进行56℃灭活30min，两倍系列稀释后加入等量的100TCID₅₀PRVBartha-K61株，加入96孔培养板，5％CO₂培养箱(Sanyo MCO-15AC)，37℃培养1小时，然后，加入100μl Vero细胞悬液，每孔含有2×10⁴个细胞。培养板置于5％CO₂的湿润环境，37℃培养3天，读测病毒稀释度的细胞病变，各感染孔的数目表示为每病毒稀释度接种各孔数的比例。中和滴度以未观察到CPE的最高稀释倍数为准。每个样品做三个重复。

结果

见表4，首免后4周(首免后2周加强免疫)在所有的免疫组首次检测到中和抗体。整个试验期间，表位多肽疫苗组和弱毒苗组产生的中和抗体水平相当，但免疫组明显高于对照组的中和抗体，呈现极显著差异(P＜0.01)；至首免后8周，对照组未产生任何中和抗体。

表4 免疫小鼠中和抗体检测

注：1抗体滴度＜1∶8视为无中和抗体；2NR代表抗体滴度无确切结果；3a代表小鼠的数量

实施例八 淋巴细胞增殖检测

为了进一步对比细胞调节免疫反应，在首免后8周进行了细胞增殖试验，首免后6、8、10周进行了猪PBMC增殖试验，以检测疫苗免疫的细胞免疫反应。将鼠肾细胞或仔猪PBMC放入96孔细胞板，100μl/孔(2×10⁵细胞/孔)。随后加入100μl/培养基，或者加入经紫外照射灭活的PRV，混匀。伴刀豆球蛋白(5μg/ml，Sigma)作为阳性对照。肾细胞或PBMC样品做三个重复。依据Bounous提供的方法，用改进的MTT比色法进行鼠肾细胞或猪PBMC增殖活性检测：鼠肾细胞72小时，或PBMC培养96小时后，每孔加入10μl WST，孵育5小时，孵育后在490nm波长下读数。刺激指数(SI)用抗原刺激细胞孔的平均值比细胞(未刺激)孔的平均值来计算。

结果

与中和抗体反应类似，在表位多肽疫苗组和活疫苗组观察了最高水平的肾细胞增殖活性，见图8、图9。对照组的T淋巴细胞增殖明显低于其他免疫组(P＜0.05)，表位多肽疫苗组和活疫苗组的刺激指数相近，未呈现显著差异(P＞0.05)。与鼠肾细胞类似，免疫后6周、8周、10周，对猪PBMC增殖检测中也发现了这一规律(图9)。这些数据表明表位多肽疫苗能够在天然宿主体内诱导加强细胞免疫反应。

实施例九 疫苗免疫仔猪细胞免疫反应的检测

方法见实施例七，结果见表5。首免后6周、8周、10周，采集血清样品用于病毒中和试验。整个试验期间，对照组仔猪样品未检测到PRV中和抗体，这与鼠肾细胞的结果一致。所有免疫组在首免后6周检测到中和抗体，免疫后8周、10周表位多肽疫苗组和活疫苗组全部免疫仔猪检测到中和抗体。表位多肽疫苗组有四头仔猪中和抗体滴度达到1∶32，活毒苗组有一头达到1∶32；活疫苗组在免疫后10周，有一头猪中和抗体滴度为1∶8，其他免疫仔猪均达到1∶16。

表5 免疫仔猪中和抗体检测

注：1抗体滴度＜1∶8视为无中和抗体；2NR代表无确切结果；3a代表猪的数量。

Claims (7)

1.一种法氏囊蛋白工程疫苗融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。

2.一种核酸分子，其编码权利要求1项所述融合蛋白。

3.一种载体，其含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其含有权利要求3所述的载体。

5.权利要求2所述的核酸分子，其具体序列如下：

6.一种用于预防伪狂犬病的疫苗，其包含权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。

7.权利要求1所述的融合蛋白在制备伪狂犬表位多肽基因工程疫苗中的应用。