CN112876570B

CN112876570B - 非洲猪瘟病毒疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN112876570B
Application number: CN202110178173.2A
Authority: CN
Inventors: 张志芳; 李轶女; 高新桃; 刘兴健; 易咏竹; 张伟业; 曾振; 王海宁
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-02-09
Filing date: 2021-02-09
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2041-02-09
Also published as: CN112876570A

Abstract

本发明公开了非洲猪瘟疫苗及其制备方法。本发明将非洲猪瘟病毒结构蛋白P72、P30、P54或CD2v‑AC分别展示在自组装铁蛋白笼形结构表面，提高疫苗的体液免疫效力与宽度，提高了非洲猪瘟病毒结构蛋白的免疫原性。本发明还将结构蛋白P30、P54和CD2v进行重组得到重组蛋白并将其与泛素相连得到两种重组蛋白，进一步提高非洲猪瘟病毒结构蛋白对细胞免疫效应，对动物提供更好的免疫保护。本发明还提供了制备所述重组蛋白或非洲猪瘟疫苗的方法。本发明提供的非洲猪瘟疫苗能够引发广泛中和性抗非洲猪瘟抗体，不仅提高免疫效力还能扩大免疫范围，对强毒感染提供有效的免疫保护，有成为具有多重保护效果的通用安全疫苗的潜力。

Description

非洲猪瘟病毒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及猪瘟病毒疫苗，尤其涉及基于非洲猪瘟自组装铁蛋白纳米抗原的非洲猪瘟病毒疫苗及其制备方法，属于非洲猪瘟亚单位疫苗领域。

背景技术

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种烈性传染病,其症状主要为高热、呼吸障碍、全身各组织器官严重出血,感染强毒株者死亡率可高达100％。此病自2018年进入我国以来,对中国养猪业造成了严重打击。该病病程短,死亡率高,对养猪业危害巨大,被世界动物卫生组织(OIE)列为法定通报动物疫病,中国将其列为一类动物疫病。ASFV是具有囊膜的双股DNA病毒,长达175～193kb，具有151个开放阅读框ORFs，共编码大约150～200种蛋白，该病毒成熟粒子中含有50种以上的主要蛋白，在感染过程中起着重要作用。其中，P72占病毒粒子总蛋白量的1/3，P72由B646L基因编码的主要衣壳蛋白，序列保守，具有良好的抗原性，感染后可产生高滴度的抗P72抗体，通常用于非洲猪瘟的血清学诊断。CP204L基因位于中间稳定的基因区,编码的磷蛋白p30具有参与病毒内化的功能,是在病毒DNA合成开始至病毒生命周期结束一直持续表达的早期转录蛋白,在病毒进入宿主细胞时期具有重要作用,具有良好的抗原性。P54连同P30和P72是代表了检测ASFV抗体的一组理想的抗原靶标。它是病毒基因E183L的产物，是一种包膜蛋白，位于内包膜病毒体中。同时，P54与P30共同参与了病毒颗粒与靶细胞的结合，P54与宿主蛋白相互作用，导致病毒粒转运到细胞的核周区域。CD2v蛋白是由ASFV EP402R基因编码，为ASFV晚期表达蛋白，作为一种跨膜结构蛋白而存在于病毒粒子的囊膜，其胞外区含有2个免疫球蛋白样结构域。其能介导红细胞与感染细胞或病毒颗粒结合，引起红细胞吸附现象。有研究证明在缺失EP402R的重组毒与野生型病毒相比，病毒的扩散被推迟，虽然死亡率并未降低，因此可作为缺失疫苗的强有力候选。目前非洲猪瘟病疫在全球范围内仍然尚未研发出有效的预防非洲猪瘟疫苗。对非洲猪瘟病毒与宿主免疫***互作机制的深入研究，非洲猪瘟疫苗的研制也获得了较大的进展。但是这些疫苗仍然存在安全性较差，不能对强毒攻击提供有效的免疫保护等缺陷。

铁蛋白外形近似球体,主要由蛋白外壳和富含铁磷的铁核两部分组成,蛋白外壳是由24个亚基高度对称性地组成内空腔结构,而铁核是由超过四千个氢氧化铁分子和数百磷酸盐分子构成的不均匀的中心核结构。铁蛋白壳外直径约为11-13nm,壳内直径为8-9nm,铁核位于蛋白壳中心,直径约为7-8nm。近年来，铁蛋白笼作为一种多样化的纳米平台，可以通过生物和化学修饰对铁蛋白笼进行表面修饰，在多个领域得到应用。铁蛋白外壳由24个铁蛋白亚基自组装而成，其中每三个亚基组成一个三聚体亚单位。铁蛋白的N末端伸向外表面，易于进行基因修饰，融合蛋白多肽。并且铁蛋白有着很灵活的可控的自组装能力，可以通过调节构建元件的尺寸和组装体系的离子强度对自组装结构实现可控。铁蛋白纳米颗粒展示抗原，能够显著地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应，因此铁蛋白是理想的纳米疫苗平台。

发明内容

本发明的目的之一是提供包含融合蛋白的非洲猪瘟自组装铁蛋白纳米抗原；

本发明的目的之二是提供非洲猪瘟融合蛋白抗原；

本发明的目的之三是提供制备所述非洲猪瘟自组装铁蛋白纳米抗原或非洲猪瘟融合蛋白抗原的方法；

本发明的目的之四是提供基于非洲猪瘟自组装铁蛋白纳米抗原或非洲猪瘟融合蛋白抗原制备的非洲猪瘟疫苗。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先提供一种包含融合蛋白的非洲猪瘟自组装铁蛋白纳米抗原，所述融合蛋白选自由非洲猪瘟病毒主要衣壳蛋白P72、非洲猪瘟病毒磷蛋白P30、非洲猪瘟病毒包膜蛋白P54或非洲猪瘟病毒血凝蛋白CD2v-AC中的任何一种和单体铁蛋白亚基连接得到的融合蛋白；

优选的，所述融合蛋白选自由非洲猪瘟病毒主要衣壳蛋白P72、非洲猪瘟病毒磷蛋白P30、非洲猪瘟病毒包膜蛋白P54或非洲猪瘟病毒血凝蛋白CD2v-AC中的任何一种和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白；

优选的，所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌铁蛋白单体；

优选的，所述非洲猪瘟病毒血凝蛋白CD2v-AC是非洲猪瘟病毒血凝蛋白CD2v胞外域与胞内域融合构成的序列。

作为本发明一种优选的具体实施方案，所述融合蛋白选自以下(1)-(4)中所述融合蛋白中的任何一种：(1)由非洲猪瘟病毒主要衣壳蛋白P72和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白，其同感序列为SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示；(2)由非洲猪瘟病毒磷蛋白P30和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白，其同感序列为SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQID NO.6所示；(3)由非洲猪瘟病毒包膜蛋白P54和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白，其同感序列为SEQ ID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.7所示；(4)由非洲猪瘟病毒血凝蛋白CD2v-AC和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白，其同感序列为SEQ ID NO.4所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.8所示。

本发明进一步提供了一种非洲猪瘟融合蛋白抗原，包括将非洲猪瘟病毒磷蛋白P30序列***到非洲猪瘟病毒包膜蛋白P54中Not I的识别酶序列位点得到PQ重组蛋白，在PQ重组蛋白的前端连接非洲猪瘟病毒CD2v结构蛋白胞外域得到非洲猪瘟融合蛋白抗原；作为本发明一种优选的具体实施方案，所述非洲猪瘟融合蛋白抗原的同感序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示。

优选的，所述非洲猪瘟病毒CD2v结构蛋白是非洲猪瘟病毒CD2v胞外域序列。

本发明进一步提供了一种非洲猪瘟融合蛋白抗原，是将SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列N末端连接ubiquitin-linker氨基酸序列C末端得到融合蛋白抗原；作为本发明一种优选的具体实施方案，所述融合蛋白抗原的同感序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示。

本发明更进一步提供了一种非洲猪瘟融合蛋白抗原，是将SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列前后两端分别连接UBITh 1和2氨基酸序列得到融合蛋白抗原；作为本发明一种优选的具体实施方案，所述融合蛋白抗原的同感序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示。

本发明提供了制备所述包含融合蛋白的非洲猪瘟自组装铁蛋白纳米抗原或者所述非洲猪瘟融合蛋白抗原的方法，包括：

(Ⅰ)将所述融合蛋白编码基因采用原核表达***或真核表达***在原核细胞或真核细胞中进行表达；

优选的，将所述的融合蛋白编码基因在家蚕表达***中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；或者将所述的融合蛋白编码基因在AcMNPV-昆虫细胞真核表达***中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；

(Ⅱ)将所述的融合蛋白编码基因克隆到基因呈递载体上构建得到向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体，将重组杆状病毒转移载体转染家蚕细胞得到重组病毒。

本发明提供了一种非洲猪瘟疫苗，包括：预防上有效量的所述的包含融合蛋白的非洲猪瘟自组装铁蛋白纳米抗原和药学上可接受的佐剂或载体；优选的，所述的包含融合蛋白的非洲猪瘟自组装铁蛋白纳米抗原的融合蛋白选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示融合蛋白中的任何一种。

本发明进一步提供了一种非洲猪瘟疫苗，包括：预防上有效量的非洲猪瘟融合蛋白抗原和药学上可接受的佐剂或载体；优选的，所述的非洲猪瘟融合蛋白抗原选自SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.13所示的融合蛋白抗原中的任何一种。

本发明更进一步提供了一种非洲猪瘟混合疫苗，包括：预防上有效量的所述的包含融合蛋白的纳米抗原颗粒和非洲猪瘟融合蛋白抗原以及药学上可接受的佐剂或载体；其中，所述的包含融合蛋白的纳米抗原颗粒是由SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示融合蛋白组成的混合抗原；所述非洲猪瘟融合蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示。

作为本发明中的一种优选的实施方案，所述的佐剂优选是细胞因子，更优选为猪干扰素。

本发明具体技术方案详述

本发明分别分析了最近年份的13条主要衣壳蛋白P72氨基酸序列、15条磷蛋白P30氨基酸序列、15条包膜蛋白P54氨基酸序列和14条血凝蛋白CD2v-AC氨基酸序列，流行于不同地区的ASFV菌株的4种结构蛋白氨基酸序列分别进行比对分析，找出最为通用的4种结构蛋白的同感序列，作为相应毒株的抗原基因，以期取得最佳的保护效果；在此基础上，本发明利用OptimumGene^TM技术对4四种结构蛋白氨基酸序列进行优化，将优化后的抗原蛋白氨基酸序列和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据大肠杆菌密码子偏好性对氨基酸序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。此外，为了提高铁蛋白的表达量，同时提高可溶表达，对铁蛋白单体亚基进行点突变N19Q；最终，本发明非洲猪瘟病毒主要衣壳蛋白P72、磷蛋白P30、包膜蛋白P54和血凝蛋白CD2v-AC结构蛋白的氨基酸序列C端与幽门螺杆菌铁蛋白单体N端结合构成所示的融合蛋白的同感序列按照上述优化方式得到优化序列的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，相应的，所述同感序列编码基因的优化的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明将优化后的同感序列在大肠杆菌表达***和杆状病毒表达***中进行表达。

为进一步提高非洲猪瘟病毒重组结构蛋白疫苗的免疫原性，对动物提供更好的免疫保护，本发明将磷蛋白P30、包膜蛋白P54和血凝蛋白CD2v胞外域按照Jord：2012构建方案设计sHAPQ氨基酸序列，将非洲猪瘟病毒P30结构蛋白的氨基酸序列***到非洲猪瘟病毒P54结构蛋白的氨基酸序列中对应Not I的识别酶序列内，并在非洲猪瘟病毒P54结构蛋白氨基酸序列N端连接上非洲猪瘟病毒CD2v结构蛋白胞外域(sHA)氨基酸序列的C端得到重组蛋白sHAPQ，其氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示。

本发明进一步将sHAPQ氨基酸序列N末端连接上ubiquitin-linker氨基酸序列的C末端，得到重组蛋白UBi-sHAPQ，其氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示。

本发明更进一步将重组蛋白sHAPQ的氨基酸序列N末端和C末端分别连接UBITh 1和2氨基酸序列，得到重组蛋白Th1-sHAPQ-Th2，其氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示氨基酸序列。

本发明将获得的重组蛋白sHAPQ、UBi-sHAPQ或Th1-sHAPQ-Th2的编码基因分别在家蚕表达***中进行表达，根据检测结果可见：相比于重组蛋白sHAPQ和UBi-sHAPQ，重组蛋白Th1-sHAPQ-Th2的免疫原性和保护力的免疫原性和保护力均有显著提升。

本发明将获得的四种自组装铁蛋白纳米颗粒混合抗原与Th1-sHAPQ-Th2重组蛋白编码基因克隆到杆状病毒哺乳动物的表达载体中构建得到呈递基因的重组杆状病毒；将重组杆状病毒呈递给小鼠，结果发现四种自组装铁蛋白纳米颗粒混合抗原与Th1-sHAPQ-Th2重组蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价明显高于健康蚕蛹对照和传统抗原，其中Th1-sHAPQ-Th2重组蛋白抗原免疫获得的抗体效价最高。

另外，本发明还发现，将猪干扰素作为佐剂与Th1-sHAPQ-Th2重组蛋白乳化后免疫小鼠，其产生的抗体效价呈明显提高。

因此，本发明所提供的Th1-sHAPQ-Th2重组蛋白和四种自组装铁蛋白纳米颗粒混合物能应用于制备非洲猪瘟病毒疫苗，其应用方法包括：

(Ⅰ)将所述的4种融合蛋白编码基因采用原核表达***在原核细胞中进行表达得到纳米抗原颗粒，纯化后将所表达的4种纳米抗原颗粒产物进行混合，与医学上可接受的免疫佐剂或载体混合在一起得到非洲猪瘟疫苗；

作为参考，采用原核表达***在原核细胞中表达纳米抗原颗粒的步骤包括：

(1)将4种融合蛋白序列克隆到表达载体pET28a上，得到重组质粒pET28a-P72-Ferritin、pET28a-P30-Ferritin、pET28a-P54-Ferritin和pET28a-CD2v-AC-Ferritin。

(2)将重组质粒pET28a-P72-Ferritin、pET28a-P30-Ferritin、pET28a-P54-Ferritin和pET28a-CD2v-AC-Ferritin转化到BL21(DE3)感受态细胞中表达，随后经过镍柱纯化，即得。

(Ⅱ)将所述的4种融合蛋白编码基因采用真核表达***在真核细胞中进行表达，纯化后将所表达的4种纳米抗原颗粒产物进行混合，与医学上可接受的免疫佐剂或载体混合在一起得到非洲猪瘟疫苗。

作为参考，所述的4种融合蛋白编码基因分别采用真核表达***在真核细胞中进行表达的方法包括以下步骤：

将所述的4种融合蛋白编码基因在家蚕表达***中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；分别将所述的4种融合蛋白编码基因构建到家蚕杆状表达载体中制备得到4种重组家蚕杆状病毒；将这4种重组家蚕杆状病毒在家蚕细胞中扩增后在家蚕或蚕蛹中进行表达；

或者将所述的这4种融合蛋白编码基因在AcMNPV-昆虫细胞真核表达***中进行表达，收集并纯化所表达的4种抗原；将4种融合蛋白编码基因分别克隆到杆状病毒转移载体中构建得到4种重组杆状病毒转移载体；将4种重组杆状病毒转移载体分别与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得4种重组杆状病毒；将重组杆状病毒分别感染昆虫宿主或昆虫细胞，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的4种抗原，纯化即得。

(Ⅲ)将所述的sHAPQ、UBi-sHAPQ和Th1-sHAPQ-Th2三种重组蛋白基因采用真核表达***在真核细胞中进行表达，纯化后将所表达的3种重组蛋白产物与医学上可接受的免疫佐剂或载体混合在一起得到非洲猪瘟疫苗。

作为参考，所述的3种重组蛋白编码基因分别采用真核表达***在真核细胞中进行表达的方法包括以下步骤：

将3种重组蛋白序列克隆到家蚕杆状病毒表达载体pCMV上，得到重组质粒pCMV-sHAPQ、pCMV-UBi-sHAPQ和pCMV-Th1-sHAPQ-Th2。

将所述的3种重组质粒在家蚕表达***中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；将所述的3种重组蛋白基因构建到家蚕杆状表达载体中制备得到3种重组家蚕杆状病毒；将这3种重组家蚕杆状病毒在家蚕细胞中扩增后在家蚕或蚕蛹中进行表达。

(Ⅳ)还可将所述的P72-Ferritin、P30-Ferritin、P54-Ferritin和CD2v-AC-Ferritin和Th1-sHAPQ-Th2重组蛋白编码基因克隆到基因呈递载体上构建得到向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体，将重组杆状病毒转移载体转染家蚕细胞得到重组病毒；将所得到的重组病毒Bm-CAG-P72-Ferritin、Bm-CAG-P30-Ferritin、Bm-CAG-P54-Ferritin和Bm-CAG-CD2v-AC-Ferritin等比例混合，与重组病毒Bm-CAG Th1-sHAPQ-Th2分别通过注射或口服的方式在动物体内呈递抗原并诱导动物产生抗体。

本发明进一步提供了一种防治非洲猪瘟的混合疫苗，包括：预防或治疗上有效量的四种包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原和Th1-sHAPQ-Th2重组蛋白抗原以及药学上可接受的免疫佐剂或载体。

本发明的疫苗可以以各种不同的药物赋形剂或载体配制。它们可以包括盐和缓冲剂以提供生理学的离子强度和pH，表面活性剂诸如聚山梨醇酯20和80以防止抗原聚集，用于抗原稳定的稳定剂，诸如PEG、海藻糖、和明胶及用于缓释的聚合物诸如CMC、HEC和葡聚糖。疫苗还可以受控释放或增强的展示***配制，诸如水凝胶、病毒体、纳米颗粒和乳液。疫苗还可以佐剂配制，以进一步增加交叉反应免疫应答和交叉保护，所述合适的佐剂可以选自多糖诸如脂多糖和皂苷、核酸诸如CpG、脂质诸如MPL(单磷酰脂质A)、蛋白质诸如细菌鞭毛蛋白、无机盐诸如铝盐和磷酸钙、乳剂诸如弗氏不完全佐剂、MF59和AS03和各种Toll样受体配体。可以用处理的抗原测试不同的佐剂，以鉴定在合适的佐剂剂量产生较高水平的交叉反应免疫应答和交叉保护，包括完全的或100％的保护的合适的佐剂。

作为一种优选的具体实施方案，本发明的疫苗中所用的佐剂优选为细胞因子，更优选为猪干扰素。

本发明的非洲猪瘟疫苗可通过各种途径使用，如肌内、皮下、局部、舌下、或口服。

本发明所提供的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒疫苗能通过在幽门螺杆菌铁蛋白笼形结构表面展示非洲猪瘟病毒蛋白三聚体结构，从而能够引起广泛中和性非洲猪瘟抗体。此种疫苗诱导个体产生的中和性抗体不仅增加了免疫效力，还增加了免疫范围，能免疫不同年份同型病毒。

本发明所提供的Th1-sHAPQ-Th2重组蛋白疫苗由非洲猪瘟病毒P30、P54和CD2v胞外域三部分设计构成，另加入UBITh 1和2氨基酸序列，进一步提高了疫苗的免疫效力，增加免疫范围，对动物提供更好的免疫保护。

本发明将非洲猪瘟病毒的主要衣壳蛋白P72、磷蛋白P30、包膜蛋白P54和血凝蛋白CD2v-AC分别与自组装铁蛋白纳米颗粒亚基N端融合表达，将非洲猪瘟病毒的主要衣壳蛋白P72、磷蛋白P30、包膜蛋白P54和血凝蛋白CD2v-AC分别展示在自组装铁蛋白笼形结构表面，提高疫苗的体液免疫效力与宽度，有效提高了非洲猪瘟病毒结构蛋白的免疫原性。本发明利用大肠杆菌原核表达***、家蚕及AcMNPV-昆虫细胞真核表达***来表达重组蛋白疫苗，也可通过重组杆状病毒在脊椎动物体内组织进行基因呈递产生抗原诱导抗体产生。本发明的非洲猪瘟疫苗可以引发广泛中和性抗非洲猪瘟抗体，不仅可以提高免疫效力还能扩大免疫范围，具有成为一种具有交叉免疫效力的通用疫苗的潜力。

本发明还将非洲猪瘟病毒的磷蛋白P30、包膜蛋白P54和血凝蛋白CD2v胞外域依据设计成sHAPQ重组蛋白，进一步提高疫苗的细胞免疫的效力与保护宽度。本发明将ubiquitin-linker氨基酸序列和sHAPQ重组蛋白连接构建成UBi-sHAPQ重组蛋白，将UBITh1和2氨基酸序列连接到sHAPQ重组蛋白前后两端构建成Th1-sHAPQ-Th2重组蛋白，进一步提高了非洲猪瘟病毒结构蛋白对细胞免疫效应，对动物提供更好的免疫保护。本发明还利用家蚕及AcMNPV-昆虫细胞真核表达***来表达重组蛋白疫苗，以猪干扰素作为佐剂诱导抗体产生。本发明通过重组杆状病毒在脊椎动物体内组织进行基因呈递产生Th1-sHAPQ-Th2抗原。本发明的非洲猪瘟疫苗可以引发广泛中和性抗非洲猪瘟抗体，不仅可以提高免疫效力还能扩大免疫范围，对强毒感(污)染提供有效的免疫保护，具有成为一种有多重保护效果的通用安全疫苗的潜力。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“抗原”和“免疫原”可互换使用，且是指能够诱导特异性体液(抗体)和细胞免疫应答的分子、物质、蛋白质、糖蛋白、或活病毒。

术语“抗原性”是指抗原与其所诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力；术语“免疫原性”是指抗原或疫苗诱导特异性免疫应答的能力；术语“免疫应答”是指针对抗原、疫苗或感染因子的体液或抗体介导的和细胞介导的免疫应答；术语“疫苗”是指用于针对感染性或非感染性疾病的治疗性处理或预防性免疫的包括抗原的组合物；术语“免疫”是指通过接种疫苗或感染产生的免疫应答，其提供针对感染性或外来试剂的保护；术语“重组蛋白质或抗原”是指以重组DNA技术产生的蛋白质或抗原，其可用于在包括细菌、哺乳类细胞、昆虫细胞和植物的各种宿主中克隆和表达基因以产生蛋白质。术语“效力”是指如通过指定的效力测定测量的在抗原制剂或疫苗中抗原的量。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行***以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

附图说明

图1ASFV P72-Ferritin在大肠杆菌原核表达***中诱导表达沉淀与上清的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1-7分别为ASFV P72-Ferritin原核表达样品；空载为pET-28a载体的原核表达样品；未诱导为未诱导的ASFV P72-Ferritin原核表达样品。

图2ASFV P72-Ferritin在家蚕表达***中表达产物Western blotting检测图；1为ASFV P72-Ferritin家蚕表达产物；2为阴性对照。

图3ASFV P30-Ferritin在大肠杆菌原核表达***中诱导表达沉淀与上清的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1-7分别为ASFV P30-Ferritin原核表达样品；空载为pET-28a载体的原核表达样品；未诱导为未诱导的ASFV P30-Ferritin原核表达样品。

图4ASFV P30-Ferritin在家蚕表达***中表达产物Western blotting检测图；1为ASFV P30-Ferritin家蚕表达产物；2为阴性对照。

图5ASFV P54-Ferritin在大肠杆菌原核表达***中诱导表达沉淀与上清的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1、2分别为ASFV P54-Ferritin原核表达样品；空载为pET-28a载体的原核表达样品；未诱导为未诱导的ASFV P54-Ferritin原核表达样品。

图6ASFV P54-Ferritin在家蚕表达***中表达产物Western blotting检测图；1为ASFV P54-Ferritin家蚕表达产物；2为阴性对照。

图7ASFV CD2v-AC-Ferritin在大肠杆菌原核表达***中诱导表达沉淀与上清的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1-5分别为ASFV CD2v-AC-Ferritin原核表达样品；空载为pET-28a载体的原核表达样品；未诱导为未诱导的ASFV CD2v-AC-Ferritin原核表达样品。

图8ASFV CD2v-AC-Ferritin在家蚕表达***中表达产物Western blotting检测图；1为ASFV P72-Ferritin家蚕表达产物；2为阴性对照。

图9家蚕表达的P30-铁蛋白的纳米颗粒的透射电镜和免疫电镜图；A:透射电镜，B：金标免疫电镜。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、试验材料与试剂

(1)菌株、病毒株与载体：原核表达载体pET-28a(+)、大肠杆菌TOP10菌株、转移载体pVL1393-CMV、原核表达菌株BL21(DE3)、家蚕细胞BmN、Sf-9细胞、Hi5昆虫细胞、家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid、苜蓿斜纹夜蛾多角体病毒亲本株AcBacmid、家蚕品种JY1均为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；

(2)铁蛋白序列和非洲猪瘟病毒P72、P30、P54和CD2v-AC 4种蛋白的基因序列：通过分析得到的共有序列送至金斯瑞公司合成并克隆到原核表达载体pUC57载体上。

(3)sHAPQ、UbsHAPQ和Th1-sHAPQ-Th2蛋白基因序列：通过分析得到的共有序列送至金斯瑞公司合成，并克隆到原核表达载体pUC57载体上。

(4)酶与试剂：限制性内切酶、T₄ DNA连接酶及所对应的缓冲液均购自Promega公司；LA Taq聚合酶及缓冲液购自TaKaRa公司；各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为TranGen Biotech公司产品；2K Plus ⅡDNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自MBL公司；DEPC、M-MLV-Rtase(逆转录酶)购自Promega公司；

(5)生化试剂：Tris、Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)、过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、卡那霉素(Kanamycin)购自Sigma公司；bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal购自Promega公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；0.2um、0.45um滤器购自Gelman Sciences公司；溴化乙锭(EB)、考马斯亮兰R-250购自Fluka公司；Ni-NTA Agarose、Proteinase K、胎牛血清购自Invitrogen公司；牛血清白蛋白购自罗氏公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。

(6)培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基；家蚕昆虫细胞培养基为TC-100购自AppliChem公司；

(7)非洲猪瘟病毒与铁蛋白融合构建的纳米疫苗的动物实验在隔离实验室进行。

2、实验方法中用于定点突变的融合PCR方法

参照邝翡婷等人(一种载体构建的新方法：重组融合PCR法，基因组学与应用生物学，2012年，第31卷，第6期，第634-639页)所描述的方法进行。

实施例1 ASFV P72-Ferritin,ASFV P30-Ferritin,ASFV P54-Ferritin和ASFVCD2v-AC-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测

一、ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测

1有关溶液和培养基的配置

有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(Joseph et al.,分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998)。

2 ASFV主要衣壳蛋白P72基因序列和铁蛋白基因序列的合成

本发明从NCBI上获取了13条ASFV主要衣壳蛋白P72氨基酸序列进行比对，得到一条同感序列，为了使主要衣壳蛋白P72同感序列与铁蛋白更好的融合表达，利用信号肽分析软件(SignalP)和跨膜结构域分析软件(TMHMM)分别对ASFV主要衣壳蛋白P72的氨基酸序列进行分析，得出ASFV主要衣壳蛋白P72的氨基酸序列无信号肽和跨膜区存在，该蛋白总长度为646个氨基酸。

为了促进主要衣壳蛋白P72与铁蛋白融合纳米颗粒的表达效率，并提高可溶表达，将幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列(NCBI上GenBank序列号：WP_000949190)中第19位天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)，以消除糖基化位点。其中ASFV主要衣壳蛋白P72序列与铁蛋白序列之间由一段连接肽连接(SGG)，将铁蛋白氨基酸序列前4个氨基酸去掉，然后将连接肽连在铁蛋白N端第5个氨基酸上。

进一步利用OptimumGene^TM技术对ASFV病毒的抗原蛋白氨基酸序列进行优化，将优化后的抗原蛋白氨基酸序列和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据家蚕密码子偏好性对氨基酸序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。为了提高目的基因在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了Kozak序列AAC，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为TAA。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pVL1393中。利用pET-28a(+)载体上的ATG进行起始起始翻译。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到原核载体pET-28a(+)上。将上述所设计的ASFV主要衣壳蛋白P72基因序列和铁蛋白序列交由相关生物科技有限公司合成。

3非洲猪瘟病毒抗原和铁蛋白融合蛋白的质粒构建

3.1非洲猪瘟病毒抗原和铁蛋白融合蛋白的PCR扩增

用融合PCR技术将非洲猪瘟病毒和铁蛋白融合在一起。具体实验方法见上述实验方法2。

3.1.1大肠杆菌表达质粒的PCR扩增

PCR扩增ASFV P72序列：以质粒pUC57-ASFV P72为模板，引物序列如下：

F1	5’-CGGGATCCATGGCTAGCGGTGGA-3’
		R1	5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGAAGTGGAGTATCTCAACACAGCGCT-3’

PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，引物序列如下：

F2	5’-AGCGCTGTGTTGAGATACTCCACTTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
		R2	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

以PCR产物ASFV P72和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出ASFV P72-Ferritin，引物序列如下：

F1	5’-CGGGATCCATGGCTAGCGGTGGA-3’
		R2	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

3.1.2家蚕表达***中表达质粒的PCR扩增

F3	5’-CGGGATCCAACATGGCTAGCGGTGGA-3’
		R3	5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGAAGTGGAGTATCTCAACACAGCGCT-3’

PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，引物序列如下：

F4	5’-AGCGCTGTGTTGAGATACTCCACTTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
		R4	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

F3	5’-CGGGATCCAACATGGCTAGCGGTGGA-3’
		R4	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

PCR反应体系为表1：

表1 PCR反应体系

PCR参数设置：

3.2玻璃奶纯化回收DNA片段

配置1％(w/v)琼脂糖凝胶，对PCR扩增的产物进行电泳；将琼脂糖凝胶置于紫外灯下，快速切下含有单一的目的核酸条带的凝胶，放入1.5mL的离心管中，称重，加三倍体积的6M NaI，放于37℃恒温培养箱中融化；向已经完全融化的溶液中加8μL Glassmilk，混匀，冰浴5min，中间摇匀两次；8000rpm离心10s，弃掉上清；加800μL New Wash洗涤，轻轻弹起后离心，重复2次；弃去上清，将离心管放37℃恒温培养箱干燥2～3min；干燥后加20μL 0.1×TE溶解，混合充分溶解DNA，12000rpm离心5min，取上清立即用于连接，其余放-20℃保存。

3.3目的基因PCR产物酶切处理

将PCR产物跑胶，胶回收正确的产物用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切反应获得目的片段ASFV P72-Ferritin，酶切体系如下表2所示：

表2酶切体系

3.4感受态细胞的小量制备

制备大肠杆菌Top10感受态细胞，－80℃保存。

3.5目的基因与pET-28a(+)载体和pVL1393载体的连接与转化

3.5.1酶切处理pET-28a(+)和pVL1393载体

用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对转移载体pVL1393和pET-28a(+)进行双酶切，65℃灭活20min，保存于－20℃备用。

3.5.2连接

酶切回收的目的片段与经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切处理后的转移载体pVL1393和pET-28a(+)的连接。用T₄ DNA连接酶，16℃，连接过夜。连接体系如下表3所示：

表3连接体系

3.5.3转化

取-80℃保存的感受态细胞，快速融化一半，加入上述连接产物3μL，冰上放置半小时；42℃恒温水浴锅中放置90s，迅速置于冰上3～5min；向管中加入适量的1mL LB培养基，37℃恒温培养箱中静置培养60min；离心，弃去大部分上清，留200μL涂布于LB平板(100μg/mL Amp)上，37℃恒温培养箱正置培养30min，后倒置培养过夜。

3.6核酸快速抽提法粗筛阳性克隆

挑取LB平板上的单菌落，接种于LB液体培养基(100μg/mL Amp)中，置于37℃恒温震荡培养器中，设置转速为220rpm，过夜培养；取500μL菌液于离心管内，收集菌体；加入30μL Loading Buffer和20μL酚/氯仿(1:1)，用涡旋震荡器充分混匀，使菌体重悬；12000rpm离心3min，取8μL上清进行琼脂糖凝胶电泳，同时以同样方法处理的空载体作为对照。凝胶成像***的紫外灯下观察条带，选取质粒带明显退后的菌液提取质粒。

3.7 SDS碱裂解法提取质粒DNA

收集3mL菌液于离心管中，SDS碱裂解法提取质粒DNA，-20℃保存备用。

3.8阳性克隆的酶切与测序鉴定

酶切体系如下表4所示：

表4酶切体系

37℃反应2h后，取7μL用1％的琼脂糖进行电泳检测。酶切检测正确的质粒DNA测序，结果和目的基因一致，得到的重组质粒命名为pET28a-ASFV P72-Ferritin、pVL1393-ASFV P72-Ferritin。

4重组质粒的表达与纯化

4.1重组质粒在大肠杆菌中诱导表达

将鉴定正确的重组表达质粒pET28a-ASFV P72-Ferritin转化BL21感受态细胞，在37℃，IPTG终浓度为0.5mM的条件下，分别诱导1h、2h、3h、4h、5h后收集菌液，用SDS-PAGE电泳分析表达情况，pET28a-ASFV P72-Ferritin在约96kD处出现了特异条带，这与预期的带His的重组蛋白大小相符，而未诱导的重组表达载体没有产生该特异条带，表明融合蛋白在大肠杆菌内成功表达，在添加IPTG后1～4h，表达量逐渐增加，而诱导5h和诱导4h的多积累的重组蛋白几乎一样多。用超声波将菌体细胞破碎，发现上清有一部分目的蛋白，沉淀中有明显目的条带，说明重组蛋白His-ASFV P72-Ferritin主要以不可溶的包涵体形式存在，聚丙烯凝胶电泳图见图1。

4.2重组蛋白的大量表达与包涵体蛋白样品的处理

将保存于-80℃表达量高的菌种划线，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于4mL LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃培养过夜；1％的菌液转接于200mL含的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃震荡培养，使OD值达0.6左右，加入IPTG(终浓度为0.5mM)，37℃继续培养4h；4℃，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌ddH₂O洗2次，离心收集菌体。用裂解缓冲液重悬菌体，用量为100μL裂解液/mL菌液，冰浴30min，冰上超声波破碎裂解菌体；4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀即为重组蛋白包涵体；沉淀用适量包涵体洗涤液Ⅰ和包涵体洗涤液Ⅱ重悬并洗涤，弃上清；用适量脲NTA-0 Buffer重悬沉淀，4℃，过夜溶解。

4.3镍柱亲和层析纯化重组蛋白

取上述溶解过夜的包涵体溶液，4℃，12000rpm离心15min，取上清，用0.45μm膜过滤；用Ni-NTA树脂层析柱纯化该表达蛋白，在脲NTA-25、脲NTA-50、脲NTA-100、脲NTA-250、脲NTA-500，5个梯度收集洗脱液，收集穿透液、洗脱液，每管收集一个NTA体积，SDS-PAGE分析确定蛋白质的结合情况、目标蛋白在洗脱液中的分布情况。蛋白电泳显示在50mM咪唑浓度洗脱下来的蛋白最多，在100mM浓度也有蛋白洗脱下来，而250mM浓度下洗脱下来的很少。纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，观察大小正确，条带单一的蛋白带，纯化后的蛋白含量为4.8mg/mL。

4.4多克隆抗体的制备

将纯化后的His-Ferritin蛋白定量后收集1.5mg蛋白，经SDS-PAGE电泳后切下含有目的蛋白的凝胶，尽量切碎，37℃烘干后研磨成粉末，用生理盐水将抗原蛋白稀释到2倍最终浓度，充分混合佐剂，无菌条件下取出所需用量与抗原蛋白按体积比1：1迅速混匀，通过后腿小腿肌肉注射免疫小鼠，两免之后收集全部血清，测定血清的抗体效价。

5重组质粒在家蚕表达***及AcMNPV-昆虫细胞表达***中表达与纯化

5.1病毒亲本株的繁殖及病毒DNA的制备

5.1.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备

按AppliChem公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2M NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid感染对数生长期的BmN细胞约50mL，3～4d后收集病毒感染液，10000rpm离心10min，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1mL病毒DNA抽提液(1L中含Tris12.1g，EDTA 33.6g，KCl 14.1g，pH 7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5mL离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/mL，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，用等体积的饱和酚、苯酚:氯仿(1:1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μL TEBuffer中，放4℃保存备用。

5.1.2 AcBacmid DNA的制备参考文献(张志芳，李轶女，易咏竹，等.表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用[P].中国：CN102286534A,2011.)

按AppliChem公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2M NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养Sf-9细胞。用AcBacmid病毒亲本株感染对数生长期的细胞约50mL，3～4d后收集病毒感染液，10000rpm离心10min，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1L中含Tris 12.1g，EDTA 33.6g，KCl14.1g，pH 7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的饱和酚、苯酚:氯仿(1:1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μl TE Buffer中，放4℃保存备用。

5.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid及rAcBacmid的构建和获得

接种大约1×10⁶BmN及Sf-9细胞于15cm²培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5mL无FBS培养基。分别向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBcmidDNA(专利号为：ZL201110142492.4)及AcBcmid DNA，2μg重组转移质粒pVL1393-ASFV P72-Ferritin和5μL脂质体，用无菌双蒸水两个体系补足体积到60μL，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到相应细胞培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5mL无血清培养基和300μL FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rBmBacmid(P_PH-ASFV P72-Ferritin)与AcMNPV(P_PH-ASFV P72-Ferritin)的筛选。接种适量对应细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1mL共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4mL胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-ASFV P72-Ferritin)及昆虫杆状病毒AcMNPV-ASFV P72-Ferritin。

5.3重组病毒在细胞中扩增

5.3.1重组病毒rBmBacmid(P_PH-ASFV P72-Ferritin)在家蚕细胞中的扩增

将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-ASFV P72-Ferritin)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(P_PH-ASFV P72-Ferritin)。

5.3.2重组病毒rAcBacmid-ASFV P72-Ferritin在昆虫Sf-9细胞中的扩增

将上述重组家蚕杆状病毒rAcBacmid-ASFV P72-Ferritin感染正常生长的Sf-9细胞，培养96小时后收集感染的细胞，上清中即含有大量的重组病毒rAcBacmid-ASFV P72-Ferritin。

5.4重组病毒的鉴定

利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μL，加入150μL(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μL(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿抽提一次，酒精沉淀后用20μL的TE溶解DNA。

取上述病毒基因组DNA 1μL进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、58℃1min、72℃3min，30个循环，最后72℃延伸10min。取15μL反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。

5.5重组病毒rBmBacmid(P_PH-ASFV P72-Ferritin)在家蚕体内和蚕蛹中的表达

所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×10⁵pfurBmBacmid(P_PH-ASFV P72-Ferritin)，4～5d后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存以进行ELISA法检测。

5.6重组病毒rAcBacmid-ASFV P72-Ferritin的鉴定和在昆虫Hi5-细胞中的表达

利用PCR方法分析外源基因整合。提取病毒基因组DNA。

取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，取15μl反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒rAcBacmid(P_PH-ASFV P72-Ferritin)。

将上述重组病毒rAcBacmid(P_PH-ASFV P72-Ferritin)培养液按10⁵pfu感染Hi5细胞，96小时后收集感染的细胞，-20℃冻存以进行ELISA检测。

5.7目的表达产物类病毒颗粒的收集与纯化

将含表达有目的基因的蚕蛹用预冷的PBS(料液比为1：9)在匀浆器中研磨后，用0.45um滤器过滤。在30％蔗糖溶液中，1.5×10⁵g超高速离心2h。用含0.1M NaCl的Tris-HCl(pH 7.0)的溶液把沉淀复溶到原体积，过阳离子交换层析填料SP(GE公司)，0.5M NaCl的Tris-HCl(pH 7.0)洗脱。再通过分子筛层析S200(GE公司)。纯度可达95％，得率可达40％以上。同时证明，在家蚕中表达的目的蛋白在高浓度下是可以自组装成类病毒颗粒。

6 Western blotting检测

将重组病毒感染的家蚕血淋巴样品用PBS(pH 7.4)稀释10倍超声波破碎后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶为5％，分离胶浓度为15％，再用半干转法，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用PBST配制3％BSA封闭，原核表达的His-Ferritin、His-Ferritin蛋白免疫小鼠后的血清为一抗(发明人实验室自制，见上文多克隆抗体的制备；1:1000稀释)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗(1:5000稀释)，最后用DAB(二氨基联苯胺)显色，后用去离子水终止，检测结果。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清病毒液中均可检测到92kDa(ASFV P72-Ferritin)大小的特异性条带，见图2。

7 ELISA检测

将待检蚕血淋巴样品及Hi5-细胞表达样品用包被液适度倍比稀释，另设亲本病毒感染的蚕血样品做阴性对照，只加包被液作为空白对照，每孔加100μL于酶标板中，4℃过夜。快速弃掉孔内液体，用PBST洗3次。每孔加300μL3％BSA封闭液，37℃作用3h，用PBST洗涤3次。将实验室自制His-Ferritin多克隆抗体稀释1：1000，每孔加100μL，37℃作用1.5h，用PBST洗4次。每孔加100μLHRP标记的羊抗鼠(1：5000)，37℃温育45～60min，用PBST洗涤4次。再加入新鲜配置的OPD(邻苯二胺)显色液100μL，室温，暗处显色10～30min。于各反应孔中加入2M硫酸50μL终止反应。在酶标仪上用492nm处波长测定OD值，以空白对照孔调零后测各孔OD值，以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值减去空白对照孔OD值)大于或等于2.1为阳性。

表5 ASFV P72-Ferritin原始序列表达产物ELISA效价

组别	效价
		亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照)	1：4
ASFV P72-Ferritin(家蚕)	1：4096
		ASFV P72-Ferritin(AcMNPV-昆虫细胞)	1：2048

ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值减去空白对照孔OD值)大于或等于2.1为阳性，结果表明ASFV P72-Ferritin(重组病毒rBmBacmid)基因表达产物ELISA效价可达1：4096，而ASFV P72-Ferritin(重组病毒AcMNPV)基因在AcMNPV-昆虫细胞表达***中的表达产物ELISA效价可达1：2048。

二、ASFV P30-Ferritin原始序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测

1有关溶液和培养基的配置

具体溶液和培养基的配置方法见ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测。

2 ASFV磷蛋白P30基因序列和铁蛋白基因序列的合成。

本发明从NCBI上获取了15条ASFV磷蛋白P30氨基酸序列进行比对，得到一条同感序列，为了使磷蛋白P30同感序列与铁蛋白更好的融合表达，利用信号肽分析软件(SignalP)和跨膜结构域分析软件(TMHMM)分别对ASFV磷蛋白P30的氨基酸序列进行分析，得出ASFV磷蛋白P30的氨基酸序列无信号肽和跨膜区存在，该蛋白总长度为204个氨基酸。

具体设计方案见ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测。

3非洲猪瘟病毒和铁蛋白融合蛋白的质粒构建

具体实验方法见ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测。PCR扩增ASFV P30序列：以质粒pUC57-ASFV P30为模板，扩增引物如下：

PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，扩增引物如下：

F6	5’-CTCAGCCACCTGCACTTGATGTTCTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
		R6	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

以PCR产物ASFV P30和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出ASFV P30-Ferritin，扩增引物如下：

F5	5’-CGGGATCCATGGACTTCATCTTG-3’
		R6	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

3.1.2家蚕表达***中表达质粒的PCR扩增

PCR扩增ASFV P30序列：以质粒pUC57-ASFV P30为模板，扩增引物如下：

F7	5’-CGGGATCCAACATGGACTTCATCTTG-3’
		R7	5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGAGAACATCAAGTGCAGGTGGCTGAG-3’

PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，扩增引物如下：

F8	5’-CTCAGCCACCTGCACTTGATGTTCTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
		R8	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

F7	5’-CGGGATCCAACATGGACTTCATCTTG-3’
		R8	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

3.1目的基因与pVL1393载体的连接与转化

具体实验方法见ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测。

3.2核酸快速抽提法粗筛阳性克隆

3.3SDS碱裂解法提取质粒DNA

3.4阳性克隆的酶切与测序鉴定

4重组质粒的表达与纯化

4.1重组质粒在大肠杆菌中诱导表达

SDS-PAGE电泳分析表达情况，pET28a-ASFV P30-Ferritin在约46kD处出现了特异条带这与预期的带His的重组蛋白大小相符，而未诱导的重组表达载体没有产生该特异条带，表明融合蛋白在大肠杆菌内成功表达。在沉淀中有明显目的条带，说明重组蛋白His-ASFV P30-Ferritin主要以不可溶的包涵体形式存在，聚丙烯凝胶电泳图见图3。

4.2重组蛋白的大量表达与包涵体蛋白样品的处理

4.3镍柱亲和层析纯化重组蛋白

4.4多克隆抗体的制备

5.1病毒亲本株的繁殖及病毒DNA的制备

5.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid及rAcBacmid的构建和获得

5.3重组病毒在细胞中扩增

5.4重组病毒的鉴定

5.5重组病毒rBmBacmid(P_PH-ASFV P30-Ferritin)在家蚕体内和蚕蛹中的表达

具体实验方法见ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测。本申请以本表达产物的自组装纳米颗粒图作为代表，将其透射电镜和免疫电镜的图片列在图9。

5.6重组病毒rAcBacmid-ASFV P30-Ferritin的鉴定和在昆虫Hi5-细胞中的表达

5.7目的表达产物类病毒颗粒的收集与纯化

6 Western blotting检测

Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到43kD(ASFV P30-Ferritin)大小的特异性条带，见图4。

7 ELISA检测

表6 ASFV P30-Ferritin基因表达产物ELISA效价

组别	效价
		亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照)	1：4
ASFV P30-Ferritin(家蚕)	1：2048
		ASFV P30-Ferritin(AcMNPV-昆虫细胞)	1：1024

ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性，结果表明ASFV P30-Ferritin(家蚕)基因表达产物ELISA效价可达1：2048，而ASFV P30-Ferritin(AcMNPV-昆虫细胞)基因在AcMNPV-昆虫细胞表达***中的表达产物ELISA效价可达1：1024。

三、ASFV P54-Ferritin原始序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测

1有关溶液和培养基的配置

2 ASFV包膜蛋白P54基因序列和铁蛋白基因序列的合成。

本发明从NCBI上获取了15条ASFV包膜蛋白P54氨基酸序列进行比对，得到一条同感序列，为了使包膜蛋白P54同感序列与铁蛋白更好的融合表达，利用信号肽分析软件(SignalP)和跨膜结构域分析软件(TMHMM)分别对ASFV包膜蛋白P54的氨基酸序列进行分析，得出ASFV包膜蛋白P54的氨基酸序列无信号肽，胞外区仅有29个氨基酸，由于ASFV包膜蛋白P54全长只有184给氨基酸，我们采用完整的ASFV包膜蛋白P54与铁蛋白基因序列融合表达；具体设计方案见ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测。

3非洲猪瘟病毒和铁蛋白融合蛋白的质粒构建

PCR扩增ASFV P54序列：以质粒pUC57-ASFV P54为模板，扩增引物如下：

F9	5’-CGGGATCCATGGACAGCGAGTTC-3’
		R9	5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGACAGTGAGTTTTCCAGGTCTTTGTG-3’

PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，扩增引物如下：

F10	5’-CACAAAGACCTGGAAAACTCACTGTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
		R10	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

以PCR产物ASFV P54和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出ASFV P54-Ferritin，扩增引物如下：

F9	5’-CGGGATCCATGGACAGCGAGTTC-3’
		R10	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

3.1.2家蚕表达***中表达质粒的PCR扩增

F11	5’-CGGGATCCAACATGGACAGCGAGTTC-3’
		R11	5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGACAGTGAGTTTTCCAGGTCTTTGTG-3’

PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，扩增引物如下：

F12	5’-CACAAAGACCTGGAAAACTCACTGTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
		R12	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

F11	5’-CGGGATCCAACATGGACAGCGAGTTC-3’
		R12	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

3.1目的基因与pVL1393载体的连接与转化

3.2核酸快速抽提法粗筛阳性克隆

3.3SDS碱裂解法提取质粒DNA

3.4阳性克隆的酶切与测序鉴定

4重组质粒的表达与纯化

4.1重组质粒在大肠杆菌中诱导表达

具体实验方法见ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测。SDS-PAGE电泳分析表达情况，pET28a-ASFV P54-Ferritin在约43kD处出现了特异条带这与预期的带His的重组蛋白大小相符，而未诱导的重组表达载体没有产生该特异条带，表明融合蛋白在大肠杆菌内成功表达。在沉淀中有明显目的条带，说明重组蛋白His-ASFV P54-Ferritin主要以不可溶的包涵体形式存在，聚丙烯凝胶电泳图见图5。

4.2重组蛋白的大量表达与包涵体蛋白样品的处理

4.3镍柱亲和层析纯化重组蛋白

4.4多克隆抗体的制备

5.1病毒亲本株的繁殖及病毒DNA的制备

5.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid及rAcBacmid的构建和获得

5.3重组病毒在细胞中扩增

5.4重组病毒的鉴定

5.5重组病毒rBmBacmid(P_PH-ASFV P54-Ferritin)在家蚕体内和蚕蛹中的表达

5.6重组病毒rAcBacmid-ASFV P54-Ferritin的鉴定和在昆虫Hi5-细胞中的表达

5.7目的表达产物类病毒颗粒的收集与纯化

6 Western blotting检测

具体实验方法见ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到43kD(ASFV P54-Ferritin)大小的特异性条带，见图6。

7 ELISA检测

表6 ASFV P54-Ferritin基因表达产物ELISA效价

组别	效价
		亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照)	1：4
ASFV P54-Ferritin(家蚕)	1：2048
		ASFV P54-Ferritin(AcMNPV-昆虫细胞)	1：1024

ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性，结果表明ASFV P54-Ferritin(家蚕)基因表达产物ELISA效价可达1：2048，而ASFV P54-Ferritin(AcMNPV-昆虫细胞)基因在AcMNPV-昆虫细胞表达***中的表达产物ELISA效价可达1：1024。

四、ASFV CD2v-AC-Ferritin原始序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测

1有关溶液和培养基的配置

2 ASFV CD2v-AC基因序列和铁蛋白基因序列的合成。

本发明从NCBI上获取了14条ASFV CD2v-AC氨基酸序列进行比对，得到一条同感序列，为了使CD2v-AC同感序列与铁蛋白更好的融合表达，利用信号肽分析软件(SignalP)和跨膜结构域分析软件(TMHMM)分别对ASFV CD2v(SEQ ID NO.3)的氨基酸序列进行分析，得出ASFV CD2v蛋白其信号肽为前15个氨基酸，其胞外结构域为前206个氨基酸(命名为A区),胞内结构域为后130个氨基酸(命名为C区)。通过分析结果，将该序列的2-23位氨基酸和207-229位氨基酸(命名为B区)去掉将，融合成为ASFV CD2v-AC基因序列，长336个氨基酸。具体设计方案见ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测。

3非洲猪瘟病毒和铁蛋白融合蛋白的质粒构建

PCR扩增ASFV CD2v-A序列：以质粒pUC57-ASFV CD2v为模板，扩增引物如下：

F13	5’-CGGGATCCATGATCATTCTGATC-3’
		R13	5’-GTGTTTCTTTCTCTTTCTGAGGGAGTAGAGTTTGAAGAAAGTGTAGAA-3’

PCR扩增ASFV CD2v-C序列：以质粒pUC57-ASFV CD2v为模板，扩增引物如下：

F14	5’-TTCTACACTTTCTTCAAACTCTACTCCCTCAGAAAGAGAAAGAAACAC-3’
		R14	5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGAGATGATTCTATCCACGTGGATCAA-3’

以PCR产物ASFV CD2v-A和ASFV CD2v-C为模板，Overlap-PCR扩增出ASFV CD2v-AC，扩增引物如下：

F13	5’-CGGGATCCATGATCATTCTGATC-3’
		R14	5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGAGATGATTCTATCCACGTGGATCAA-3’

PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，扩增引物如下：

F15	5’-TTGATCCACGTGGATAGAATCATCTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
		R15	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

以PCR产物ASFV CD2v-AC和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出ASFV CD2v-AC-Ferritin，扩增引物如下：

F13	5’-CGGGATCCATGATCATTCTGATC-3’
		R15	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

3.1.2家蚕表达***中表达质粒的PCR扩增

PCR扩增ASFV CD2v-AC序列：以质粒pUC57-ASFV CD2v为模板，扩增引物如下：

F16	5’-CGGGATCCAACATGATCATTCTGATC-3’
		R16	5’-GTGTTTCTTTCTCTTTCTGAGGGAGTAGAGTTTGAAGAAAGTGTAGAA-3’

F17	5’-TTCTACACTTTCTTCAAACTCTACTCCCTCAGAAAGAGAAAGAAACAC-3’
		R17	5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGAGATGATTCTATCCACGTGGATCAA-3’

F16	5’-CGGGATCCATGATCATTCTGATC-3’
		R17	5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGAGATGATTCTATCCACGTGGATCAA-3’

PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，扩增引物如下：

F18	5’-TTGATCCACGTGGATAGAATCATCTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
		R18	5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’

3.1目的基因与pVL1393载体的连接与转化

3.2核酸快速抽提法粗筛阳性克隆

3.3SDS碱裂解法提取质粒DNA

3.4阳性克隆的酶切与测序鉴定

4重组质粒的表达与纯化

4.1重组质粒在大肠杆菌中诱导表达

具体实验方法见ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测。SDS-PAGE电泳分析表达情况，pET28a-ASFV CD2v-AC-Ferritin在约58kD处出现了特异条带这与预期的带His的重组蛋白大小相符，而未诱导的重组表达载体没有产生该特异条带，表明融合蛋白在大肠杆菌内成功表达。在沉淀中有明显目的条带，说明重组蛋白His-ASFVCD2v-AC-Ferritin主要以不可溶的包涵体形式存在，聚丙烯凝胶电泳图见图7。

4.2重组蛋白的大量表达与包涵体蛋白样品的处理

4.3镍柱亲和层析纯化重组蛋白

4.4多克隆抗体的制备

5.1病毒亲本株的繁殖及病毒DNA的制备

5.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid及rAcBacmid的构建和获得

5.3重组病毒在细胞中扩增

5.4重组病毒的鉴定

5.5重组病毒rBmBacmid(P_PH-ASFV CD2v-AC-Ferritin)在家蚕体内和蚕蛹中的表达

5.6重组病毒rAcBacmid-ASFV CD2v-AC-Ferritin的鉴定和在昆虫Hi5-细胞中的表达

5.7目的表达产物类病毒颗粒的收集与纯化

6 Western blotting检测

Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到43kD(ASFV CD2v-AC-Ferritin)大小的特异性条带，见图8。

7 ELISA检测

表6 ASFV CD2v-AC-Ferritin基因表达产物ELISA效价

组别	效价
		亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照)	1：4
ASFV CD2v-AC-Ferritin(家蚕)	1：4096
		ASFV CD2v-AC-Ferritin(AcMNPV-昆虫细胞)	1：2048

ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性，结果表明ASFV CD2v-AC-Ferritin(家蚕)基因表达产物ELISA效价可达1：4096，而ASFV CD2v-AC-Ferritin(AcMNPV-昆虫细胞)基因在AcMNPV-昆虫细胞表达***中的表达产物ELISA效价可达1：2048。

实施例2pCMV-sHAPQ、pCMV-UbsHAPQ和pCMV-Th1-sHAPQ-Th2三种呈递病毒构造的制备与效力检测

一、pCMV-sHAPQ呈递病毒构造的制备与效力检测

1有关溶液和培养基的配置

2 sHAPQ基因序列的合成。

本发明将利用实施例1中ASFV磷蛋白P30、包膜蛋白P54和CD2v(血凝素，HA)的同感序列。依据Jord：2012中质粒构建方案设计sHAPQ氨基酸序列，将ASFV磷蛋白P30氨基酸序列***到ASFV包膜蛋白P54氨基酸序列中对应Not I的识别酶序列处，并在ASFV包膜蛋白P54氨基酸序列N端连接上ASFV CD2v结构蛋白胞外域(sHA)氨基酸序列的C端，该重组蛋白总长度为595个氨基酸。

进一步利用OptimumGene^TM技术对ASFV病毒的抗原蛋白氨基酸序列进行优化，将优化后的抗原蛋白氨基酸序列和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据哺乳动物密码子偏好性对氨基酸序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。

为了提高目的基因在哺乳动物体内的提高翻译起始效率，在基因前面加了Kozak序列GCCACC。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到pCMV质粒中。将上述所设计的sHAPQ基因序列交由相关生物科技有限公司合成。

3 pCMV-sHAPQ的质粒构建

3.1合成质粒pUC-57 sHAPQ的酶切处理

将合成质粒pUC-57 sHAPQ用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切反应获得目的片段sHAPQ。酶切体系如下表9所示：

表9酶切体系

3.2玻璃奶纯化回收DNA片段

配置1％(w/v)琼脂糖凝胶，对酶切的产物进行电泳；将琼脂糖凝胶置于紫外灯下，快速切下相应的目的核酸条带的凝胶，放入1.5mL的离心管中称重。

具体实验方法见实施例1中ASFV P72-Ferritin优化序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测。

3.3感受态细胞的小量制备

3.4目的基因与pCMV载体的连接与转化

3.5核酸快速抽提法粗筛阳性克隆

3.6 SDS碱裂解法提取质粒DNA

3.7阳性克隆的酶切与测序鉴定

4重组质粒在家蚕真核表达***中表达与纯化

4.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备

4.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-pCMV-sHAPQ)的构建和获得

4.3重组病毒rBmBacmid(P_PH-pCMV-sHAPQ)在家蚕细胞中的扩增

4.4重组病毒的鉴定

4.5 pCMV-sHAPQ在家蚕体内和蚕蛹中的表达

4.6 pCMV-sHAPQ类重组病毒颗粒的收集与纯化

具体杆状病毒的纯化实验方法见Summers(1982)的杆状病毒操作手册和吕鸿声先生(1998)的昆虫病毒分子生物学等相关文献。

5 IFNγ-ELISPOT

用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释8.3mg/ml IFNγ捕获抗体，加入到96孔板中包被过夜。然后洗涤平板，在37℃下用0.5％BSA封闭1h。向每孔分配约5×10⁵个用呈递用的相应的外源基因呈递用的杆状病毒免疫动物的PBMC，并加入100μL/well的6mg/ml的相关蛋白为刺激物培养，在37℃，5％CO2气氛中温育20h。弃掉细胞，加入200μL/well的去离子水，4℃冰箱放置10min裂解细胞。用1×Washing buffer，200μL/well洗5次，最后用吸水纸扣干。100μL/well加入2.5mg/ml生物素标记的抗体，37℃温育1h。用1×Washing buffer，200μL/well洗5次，最后用吸水纸扣干。100μL/well加入酶标亲和素继续孵育1h。用1×Washing buffer，200μL/well洗5次，最后用吸水纸扣干。100μL/well加入AEC显色液，25℃避光静置30min。弃掉孔内液体，加入去离子水洗涤5次，终止显示，阴凉处晾干。同时以未刺激的细胞作为空白对照，亲本病毒感染的蚕血样品刺激动物的细胞作为阴性对照。利用ELISPOT测定仪计数斑点，进行分析。

表10 sHAPQ基因表达产物IFNγ-ELISPOT结果

组别	斑点计数(cells/million PBMC)
		亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照)	12
sHAPQ呈递后	76

IFNγ-ELISPOT结果判定：通常正常结果为阴性对照(N)孔斑点数≤20，而阳性对照(P)孔的斑点遍布整个孔。结果表明sHAPQ基因表达产物IFNγ-ELISPOT结果可达76。

二、pCMV-UbsHAPQ呈递病毒构造的制备与效力检测

1有关溶液和培养基的配置

2 UbsHAPQ基因序列的合成。

本发明选用泛素76个氨基酸保守序列(>ABO84843.1 ubiquitin B[Sus scrofa]与>CAA35999.1ubiquitin[Mus musculus])作为Ubiquitin氨基酸序列，根据Rodriguez等的方法，将Ubiquitin氨基酸突变G76A(GGC-CGC)增强递呈作用。按照中国农大2004年PRRSV的DNA疫苗构建方法，使用pcDNA载体ubiquitin-lingker(GGTGGCGGCGGATCC)-GP5蛋白序列。依据Jord：2012中质粒构建方案设计sHAPQ氨基酸序列，将ubiquitin-lingker的C末端连接到sHAPQ序列的N末端。该重组蛋白总长度为679个氨基酸。

具体实验方法见实施例2中pCMV-sHAPQ呈递病毒构造的制备与效力检测。

3 pCMV-UbsHAPQ的质粒构建

3.1合成质粒pUC-57UbsHAPQ的酶切处理

3.2玻璃奶纯化回收DNA片段

3.3感受态细胞的小量制备

3.4目的基因与pCMV载体的连接与转化

3.5核酸快速抽提法粗筛阳性克隆

3.6 SDS碱裂解法提取质粒DNA

3.7阳性克隆的酶切与测序鉴定

4重组质粒pCMV-UbsHAPQ在家蚕真核表达***中表达与纯化

4.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备

4.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-pCMV-UbsHAPQ)的构建和获得

4.3重组病毒rBmBacmid(P_PH-pCMV-UbsHAPQ)在家蚕细胞中的扩增

4.4重组病毒的鉴定

4.5 pCMV-UbsHAPQ在家蚕体内和蚕蛹中的表达

4.6 pCMV-UbsHAPQ重组病毒颗粒的收集与纯化

5 IFNγ-ELISPOT

表11 sHAPQ基因表达产物IFNγ-ELISPOT结果

组别	斑点计数(cells/million PBMC)
		亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照)	12
UbisHAPQ呈递后	102

IFNγ-ELISPOT结果判定：通常正常结果为阴性对照(N)孔斑点数≤20，而阳性对照(P)孔的斑点遍布整个孔。结果表明sHAPQ基因表达产物IFNγ-ELISPOT结果可达102。

三、pCMV-Th1-sHAPQ-Th2呈递病毒构造的制备与效力检测

1有关溶液和培养基的配置

2 Th1-sHAPQ-Th2基因序列的合成。

本发明分别将UBITh 1的C末端连接sHAPQ氨基酸序列的N末端，将UBITh 2的N末端连接到sHAPQ氨基酸序列的C末端，该重组蛋白总长度为633个氨基酸。

3 pCMV-UbsHAPQ的质粒构建

3.1合成质粒pUC-57 UbsHAPQ的酶切处理

3.2玻璃奶纯化回收DNA片段

3.3感受态细胞的小量制备

3.4目的基因与pCMV载体的连接与转化

3.5核酸快速抽提法粗筛阳性克隆

3.6 SDS碱裂解法提取质粒DNA

3.7阳性克隆的酶切与测序鉴定

4重组质粒pCMV-UbsHAPQ在家蚕真核表达***中表达与纯化

4.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备

4.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-pCMV-UbsHAPQ)的构建和获得

4.3重组病毒rBmBacmid(P_PH-pCMV-UbsHAPQ)在家蚕细胞中的扩增

4.4重组病毒的鉴定

4.5 pCMV-UbsHAPQ在家蚕体内和蚕蛹中的表达

4.6 pCMV-UbsHAPQ重组病毒颗粒的收集与纯化

5 IFNγ-ELISPOT

表12 sHAPQ基因表达产物IFNγ-ELISPOT结果

组别	斑点计数(cells/million PBMC)
		亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照)	12
UbisHAPQ呈递后	136

IFNγ-ELISPOT结果判定：通常正常结果为阴性对照(N)孔斑点数≤20，而阳性对照(P)孔的斑点遍布整个孔。结果表明sHAPQ基因表达产物IFNγ-ELISPOT结果可达136。

实施例3 pVL-CAG-Th1-sHAPQ-Th2杆状病毒哺乳动物表达用重组病毒的构建和动物实验

1.构建pVL-CAG载体

具体实验方法参照(张志芳，姚斌，李轶女等。在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法[P].中国：ZL 201210408558.4.)进行，构建向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体。

2.构建呈递报告基因的重组病毒

2.1将ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin、ASFV CD2v-AC-Ferritin和Th1-sHAPQ-Th2基因分别克隆到基因呈递转移载体上

将带有酶切位点的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin、ASFV CD2v-AC-Ferritin和Th1-sHAPQ-Th2基因片段酶切回收连接到同样酶切处理的pVLCAG载体，鉴定正确后获得pVL-CAG-P72-Ferritin、pVL-CAG-P30-Ferritin、pVL-CAG-P54-Ferritin、pVL-CAG-CD2v-AC-Ferritin和pVL-CAG-Th1-sHAPQ-Th2。

2.2构建基因呈递用的重组病毒并大量制备

用pVL-CAG-P72-Ferritin、pVL-CAG-P30-Ferritin、pVL-CAG-P54-Ferritin、pVL-CAG-CD2v-AC-Ferritin和pVL-CAG-Th1-sHAPQ-Th2转移载体分别通过reBmBac共转染BmN细胞获得重组病毒Bm-CAG-P72-Ferritin、Bm-CAG-P30-Ferritin、Bm-CAG-P54-Ferritin、Bm-CAG-CD2v-AC-Ferritin和Bm-CAG Th1-sHAPQ-Th2，在共转染过程中依然需要pVL1393-Luc作为对照来确定共转染的成功与否，病毒纯化过程同上。用重组病毒感染5龄起家蚕幼虫，4-5d后收获蚕血淋巴其中含有大量扩增的重组病毒。

将蚕血淋巴用PBS稀释后超声破碎(10s×10次)，然后用12000rpm离心10分钟去除细胞碎片，再用1.5×10⁵g离心3h，去除上清，沉淀用适量PBS重悬获得初步纯化的重组杆状病毒的病毒粒子，这里一般10mL蚕血的重组病毒离心后用2mLPBS重悬，重悬后重组病毒量约为2.5×10¹²PFU/mL(约为5×10¹²viral genomes(vg)/mL，病毒拷贝数利用BmNPV病毒DNA骨架序列引物，GJ-1F(CGAACGGAGACGATGGATGTGG)和GJ-1R(GTGCCGAGCGATTGTAAGGGATC)通过荧光定量PCR计算。

3重组病毒在哺乳动物细胞中表达

采用VERO细胞作为基因呈递的目标，将重组病毒Bm-CAG-P72-Ferritin、Bm-CAG-P30-Ferritin、Bm-CAG-P54-Ferritin、Bm-CAG-CD2v-AC-Ferritin和Bm-CAG Th1-sHAPQ-Th2各取100MOI的病毒来进行研究。方法步骤如下：

1)在六孔板中接种上VERO细胞(1×10⁶cell/well)，37℃贴壁培养8-12h

2)取1×10⁸PFU纯化后的重组病毒Bm-CAG-P72-Ferritin、Bm-CAG-P30-Ferritin、Bm-CAG-P54-Ferritin、Bm-CAG-CD2v-AC-Ferritin和Bm-CAG Th1-sHAPQ-Th2分别加到六孔板的细胞中，37℃孵育1h。

3)孵育后去掉含有病毒的培养基，换上正常的DMEM含血清培养基，42小时左右处理细胞，收集表达产物，ELISA检测效价各表达产物的效价均不低于1：512。

4动物试验

4.1将大肠杆菌表达的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin和ASFV CD2v-AC-Ferritin表达产物免疫动物

将分析得出的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin和ASFV CD2v-AC-Ferritin基因序列分别在大肠杆菌表达***中表达，纯化后获得相应的融合蛋白，将以上4种融合蛋白按比例混合至总蛋白24mg/ml，按照4种蛋白总量24μg/只来免疫动物。

制备方法：从4种融合蛋白的混合物吸取100μL，加入到9.9mL的PBS缓冲液中，完全混匀后制备成母液放入灭菌瓶中。将206佐剂事先灭菌后放到30℃保温箱中保温。适量的母液先放在冰上并进行调整，与佐剂混合时先在15mL离心管中加佐剂3mL，慢慢滴加母液3mL，用匀浆器匀浆3min。加入盐酸环丙沙星，使用量为30～50mg/1kg小鼠体重。疫苗呈乳白色，检测疫苗质量时可取出少量，3000rpm离心15min，疫苗不分层即为合格。用同样的方法处理pET-28a空载体样品，制成疫苗做对照。

取SPF小鼠40只适应性饲养一周后，随机分为4组，每组10只，其中1组小鼠通过灌注在大肠杆菌表达***中表达的4种融合蛋白混合制备的疫苗1份(0.2mL)。10只接种pET-28a空载体制备的疫苗作为阴性免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组，10只接种原核表达产物作为抗原作为阴性对照。接种15天后，采用眼眶取血，采1mL左右，放试管中倾斜放置，37℃放置2h后，转至室温过夜。将血清转移至离心管中，2000rpmin，10min，收集血清，用家蚕真核表达的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin和ASFVCD2v-AC-Ferritin混合蛋白做为抗原，检测血清中抗体效价。阴性免疫组的抗体效价应不高于1：4，原核表达产物的疫苗株的抗体效价均为1：128以上，同样的但通过家蚕真核表达***中表达的样品组的抗体效价为1：256以上。

4.2将杆状病毒表达的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin和ASFV CD2v-AC-Ferritin表达产物免疫动物

选用家蚕真核表达***进行表达，将分析得出的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin和ASFV CD2v-AC-Ferritin基因序列分别在家蚕真核表达***中表达和定量，所得4种蚕蛹样品制备成母液后按适宜比例混合，按照24μg/只的量来免疫动物，根据定量实验的ELISA效价制备25剂/g蚕蛹的疫苗。

制备方法为：分别称取10g表达ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFVP54-Ferritin和ASFV CD2v-AC-Ferritin纳米颗粒抗原的蚕蛹，加入90mL PBS缓冲液，搅拌器搅拌5～10min使其充分混匀，制备成母液放入灭菌瓶中。206佐剂事先灭菌后放到30℃保温箱中保温。适量的母液先放在冰上并进行调整，与佐剂混合时，先在15mL离心管中加佐剂4mL，将4种纳米颗粒抗原等体积混合，慢慢滴加混合液4mL，用匀浆器匀浆3min。加入盐酸环丙沙星，使用量为30～50mg/1kg小鼠体重。疫苗呈乳白色，检测疫苗质量时可取出少量，3000rpm离心15min，疫苗不分层即为合格。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。

将分析得出的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin和ASFV CD2v-AC-Ferritin基因序列分别在AcBacmid-昆虫细胞真核表达***中表达所得细胞沉淀，将4种表达产物等比例混合，按照总蛋白量24μg/只的量来注射动物。

制备方法：昆虫细胞表达的抗原按测定的制备疫苗所需的蛋白含量的细胞沉淀量经超声破碎后，混合相应的佐剂而成。

取SPF小鼠50只适应性饲养一周后，随机分为5组，每组10只，其中两组小鼠通过灌注混合蛋白在分别家蚕真核表达***和AcMNPV-昆虫细胞表达***中表达产物制备的疫苗1份(0.2mL)。10只接种健康蚕蛹制备的疫苗作为阴性蚕蛹免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组，10只接种原核表达产物作为抗原作为阴性对照。接种15天后，采用眼眶取血，采1mL左右，放试管中倾斜放置，37℃放置2h后，转至室温过夜。将血清转移至离心管中，2000rpmin，10min，收集血清，用原核表达的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFVP54-Ferritin和ASFV CD2v-AC-Ferritin混合蛋白做为抗原，检测血清中抗体效价。阴性蚕蛹免疫组的抗体效价应不高于1：4，原核表达产物作为抗原的抗体效价均为1：128，而通过家蚕真核表达***中表达的样品组的抗体效价为1：256以上，通过AcMNPV-昆虫细胞表达***中表达的样品组的抗体效价为1：128以上。

4.3利用重组病毒向小鼠体内呈递Th1-sHAPQ-Th2基因加强免疫效果

将上述ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin和ASFVCD2v-AC-Ferritin基因序列分别在大肠杆菌表达***中表达，纯化后获得相应的融合蛋白，(具体操作见上)将以上4种融合蛋白按比例混合至总蛋白24mg/ml，按照4种蛋白总量24μg/只来免疫动物，具体实验见上。免疫实验同时与纯化的重组病毒Bm-CAG Th1-sHAPQ-Th2等分别通过尾静脉注射(1×10¹²vg/只)或灌注(1×10¹²vg/只)的方式送入小鼠体内，分别用原核表达的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin和ASFV CD2v-AC-Ferritin混合蛋白，利用相应的抗原检测抗体效价，看细胞因子Th1-sHAPQ-Th2等呈递后免疫效果是否增强。

将分析得出的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin和ASFV CD2v-AC-Ferritin基因序列分别在家蚕真核表达***中表达和定量，所得4种蚕蛹样品制备成母液后按适宜比例混合，按照24μg/只的量来免疫动物，根据定量实验的ELISA效价制备25剂/g蚕蛹的疫苗(具体操作见上)。免疫实验同时与纯化的重组病毒Bm-CAG Th1-sHAPQ-Th2等分别通过尾静脉注射(1×10¹²vg/只)或灌注(1×10¹²vg/只)的方式送入小鼠体内；同样的分别用原核表达的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin和ASFV CD2v-AC-Ferritin混合蛋白，利用相应的抗原检测抗体效价，看细胞因子Th1-sHAPQ-Th2等呈递后免疫效果是否增强。

将纯化的重组病毒Bm-CAG-P72-Ferritin、Bm-CAG-P30-Ferritin、Bm-CAG-P54-Ferritin和Bm-CAG-CD2v-AC-Ferritin混合进行免疫实验，同时与纯化的重组病毒Bm-CAGTh1-sHAPQ-Th2分别通过尾静脉注射(1×10¹²vg/只)或灌注(1×10¹²vg/只)的方式送入小鼠体内；同样的分别用原核表达的ASFV P72-Ferritin、ASFV P30-Ferritin、ASFV P54-Ferritin和ASFV CD2v-AC-Ferritin混合蛋白，利用相应的抗原检测抗体效价，看细胞因子Th1-sHAPQ-Th2等呈递后免疫效果是否增强。

4.4抗体效价测定

具体实验步骤见上，21天时的抗体效价为最高，具体结果见表13。

表13 Th1-sHAPQ-Th2小鼠血清抗体效价(21天)

从表13中的数据可以看出，当Th1-sHAPQ-Th2被呈递到动物体内时，P72-Ferritin、P30-Ferritin、P54-Ferritin和CD2v-AC-Ferritin基因的混合抗原无论是真核表达产物、原核表达产物还是呈递到动物体内作为抗原表达，均能显著提高免疫效果。其中以真核表达的P72-Ferritin、P30-Ferritin、P54-Ferritin和CD2v-AC-Ferritin混合样品免疫小鼠，且Th1-sHAPQ-Th2作为细胞因子存在的情况下，动物所产生的抗体效价最高，作为细胞因子所产生的效价最为明显。

5.猪免疫后的“哨兵猪”监测试验

一窝仔猪平均体重在15-20公斤左右，共16头作为实验材料。根据小鼠实验的结果，调整免疫剂量，采用真核表达的P72-Ferritin、P30-Ferritin、P54-Ferritin和CD2v-AC-Ferritin混合样品注射法免疫仔猪+Th1-sHAPQ-Th2呈递细胞因子加强仔猪免疫效果的接种模式免疫10头仔猪，同样的用阴性表达蚕蛹的产物按同样模式处理6头仔猪作为对照，并检测相应实验动物的抗体变化规律，按正常饲养流程进行。当实验进行过程中，另外饲养场发生了非洲猪瘟的流行，场方按国家规定进行了相应的病猪和环境消毒处理。这些实验猪作为“哨兵猪”在此猪场同一环境进行饲养，监测实验结果表明：10头免疫猪均未发病，样品用PCR检测试剂盒进行检测也未见阳性；而作为对照的6头猪在监测饲养过程中的短时段内均显现较典型的非洲猪瘟病症，6头猪立时进行取样和PCR检测，表明病毒阳性。所有的实验猪按国家规定的要求进行处理。上述结果表明某猪场的消毒不彻底，消毒方式还需改进。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 非洲猪瘟疫苗及其制备方法

<130> BJ-2002-210114A

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

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<212> DNA

<213> Artifical sequence

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Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn

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Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys

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Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys

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Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln

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100 105 110

Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr

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Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn

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Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp

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Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn

165 170 175

Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu

180 185 190

Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr Arg Ser

195 200 205

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Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Met Tyr

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Thr Ile Leu Ile Ala Ile Val Val Leu Val Ile Ile Ile Ile Val Leu

245 250 255

Ile Tyr Leu Phe Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu

260 265 270

Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu

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Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala

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Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala

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Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met

325 330 335

Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser

340 345 350

Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln

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370 375 380

Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser

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Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln

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Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile

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Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln

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Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys Lys Asn Lys Leu Leu Ser His Leu

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Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln Thr Met Ser Ala

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Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu

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aacattacat acaactgcac aaacttcctg atcacatgca agaaaaacaa cggaacaaac 660

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Leu Asn Ile Asn Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu

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<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 14

atgatctcaa ttacagaaat taagggagtg atcgtgcaca gaattgaaac aatcctgttc 60

atgatcattc tgattttcct gatcttctca aacattgtgc tgtcaatcga ctactgggtg 120

tcattcaaca agacaatcat tctggactca aacattacaa atgacaacaa cgacatcaac 180

ggagtgtcat ggaacttctt caacaactca ttcaacacac tggcaacatg cggaaaagca 240

ggaaacttct gcgaatgctc aaactactca acatcaatct acaacatcac aaacaactgc 300

tcactgacaa tcttccccca caacgacgtg ttcgacacaa cataccaggt ggtgtggaac 360

cagatcatta actacacaat caagctgctg acacccgcaa caccccccaa cattacatac 420

aactgcacaa acttcctgat cacatgcaag aaaaacaacg gaacaaacac aaacatctac 480

ctgaacatca acgacacatt cgtgaaatac acaaacgaat caattctgga atacaactgg 540

aacaactcaa acatcaacaa cttcacagca acatgcatca ttaacaacac aatttcaaca 600

tcaaacgaaa caacactgat caactgcaca tacctgacac tgtcatcaaa ctacttctac 660

acattcttca agctgtacag atcaatggac tcagagttct tccagcccgt gtaccccaga 720

cactacggag aatgcctgtc acccgtgaca acaccctcat tcttctcaac acacatgtac 780

acaatcctga ttgcaatcgt ggtgctggtc atcattatca ttgtgctgat ctacctgttc 840

tcatcaagaa agaaaaaggc agcagcaatc gaagaagaag acattcagtt catcaacccc 900

taccaggacc agcagtgggt ggaagtgaca ccccagcccg gaacatcaaa gcccgcagga 960

gcaacaacag catcagtggg aaaacccgtg acaggaagac ccgcaacaaa cagacccgca 1020

acaaacaagc ccgtgacaga caaccccgtg acagacagac tggtcatggc aacaggagga 1080

cccgcagcag caatggactt cattctgaac atctcaatga agatggaagt gatcttcaaa 1140

acagacctga gatcatcatc acaggtggtg ttccacgcag gatcactgta caactggttc 1200

tcagtggaaa tcattaactc aggaagaatt gtgacaacag caatcaaaac actgctgtca 1260

acagtgaagt acgacattgt gaaatcagca agaatctacg caggacaggg atacacagaa 1320

caccaggcac aggaagaatg gaacatgatt ctgcacgtgc tgttcgaaga agaaacagaa 1380

tcatcagcat catcagaaaa catccacgaa aagaacgaca acgaaacaaa cgaatgcaca 1440

tcatcattcg aaacactgtt cgaacaggaa ccctcatcag aagtgcccaa ggactcaaaa 1500

ctgtacatgc tggcacagaa aacagtgcag cacattgaac agtacggaaa ggcacccgac 1560

ttcaacaaag tgatcagagc acacaacttc attcagacaa tctacggaac acccctgaag 1620

gaagaagaaa aagaagtggt gagactgatg gtcatcaagc tgctgaagaa gaacaagctg 1680

ctgtcacacc tgcacctgat gttcgcagca gcatcagcac cagcacaccc cgcagaaccc 1740

tacacaacag tgacaacaca gaacacagca tcacagacaa tgtcagcaat cgaaaacctg 1800

agacagagaa acacatacac acacaaggac ctggaaaact cactgaaaaa gaaaatcatc 1860

acaatcacaa gaatcatcac aatcatcaca acaatcgact ga 1902

Claims

1. 一种非洲猪瘟融合蛋白抗原，其特征在于，是将SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列前后两端分别连接UBITh 1和2氨基酸序列得到融合蛋白抗原；该融合蛋白抗原的同感序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示。

2.一种制备权利要求1所述的非洲猪瘟融合蛋白抗原的方法，包括：

（Ⅰ）将非洲猪瘟融合蛋白抗原编码基因采用原核表达***或真核表达***在原核细胞或真核细胞中进行表达；

或者（Ⅱ）将非洲猪瘟融合蛋白抗原编码基因克隆到基因呈递载体上构建得到向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体，将重组杆状病毒转移载体转染家蚕细胞得到重组病毒。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，将非洲猪瘟融合蛋白抗原编码基因采用原核表达***或真核表达***包括：将非洲猪瘟融合蛋白抗原编码基因在家蚕表达***中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；或者将非洲猪瘟融合蛋白抗原编码基因在AcMNPV-昆虫细胞真核表达***中进行表达，收集并纯化所表达的抗原。

4.一种非洲猪瘟疫苗，其特征在于，包括：预防上有效量的权利要求1所述的非洲猪瘟融合蛋白抗原和药学上可接受的佐剂或载体。

5.一种非洲猪瘟混合疫苗，其特征在于，包括：抗原Ⅰ、抗原Ⅱ以及以及药学上可接受的佐剂或载体；其中，抗原Ⅰ是预防上有效量的由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的非洲猪瘟自组装铁蛋白纳米抗原组成的混合抗原，抗原Ⅱ是预防上有效量的SEQ ID NO.13所示的非洲猪瘟融合蛋白抗原。

6.按照权利要求4所述的非洲猪瘟疫苗、权利要求5所述的非洲猪瘟混合疫苗，其特征在于，所述的佐剂是细胞因子猪干扰素。