CN116555235A - 一组针对底物p1’位点特异性改变的hrv 3c蛋白酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组针对底物P1’位点特异性改变的HRV3C蛋白酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明利用饱和突变和随机突变技术针对野生型HRV3C蛋白酶进行分子改造，使其从识别原有多肽序列LEVLFQ↓G变为识别多肽序列LEVLFQ↓M，得到了一系列HRV3C蛋白酶突变体。与wtHRV3C‑P相比，本发明提供的突变体针对底物LEVLFQ↓M有更好的特异性和切割活性，可以达到无痕切除蛋白融合标签的效果，从而拓宽了HRV3C蛋白酶的实际应用范围。

Description

一组针对底物P1’位点特异性改变的HRV 3C蛋白酶突变体
技术领域
本发明涉及一组针对底物P1’位点特异性改变的HRV 3C蛋白酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
人鼻病毒3C(HRV 3C)蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶家族，具有His40-Glu71-Cys146催化三联体，可识别LEVLFQ↓G多肽序列，并在Gln和Gly之间进行切割，具有高特异性和活性。HRV 3C蛋白酶在温度为4至30℃范围内都具有较高活性，因此被广泛用于融合蛋白标签的移除。特别是在低温蛋白纯化方面，HRV 3C蛋白酶具有明显的高活性优势[Raran-Kurussi,S.,J.,Cherry,S.,et al.,Differential temperature dependenceoftobacco etch virus and rhinovirus 3C proteases.Anal Biochem.2013,436(2),142-4.]。
然而，野生型HRV 3C蛋白酶(wt HRV 3C-P)作为工具酶具有严格的底物特异性，在移除融合蛋白标签后，目的蛋白N端会残留有1个氨基酸Gly，从而可能会使目的蛋白产生免疫原性，因此极大的限制了其应用范围。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一组针对底物P1’位点特异性改变的HRV 3C蛋白酶突变体。
为了实现上述技术目的，本发明人考虑到，由于Met是大多数蛋白质翻译起始的氨基酸，因此通过对野生型HRV 3C蛋白酶针对底物P1’位点特异性进行分子改造，使其从识别原有多肽序列LEVLFQ↓G变为识别多肽序列LEVLFQ↓M，从而实现无痕切除蛋白融合标签的目的。
为了改变HRV 3C蛋白酶的底物P1’位点特异性，以扩宽其实际应用范围，本发明人采取了一种结合结构模拟、饱和突变和随机突变文库设计、ERS优化的YESS(eYESS)***的组合策略，展开了对HRV 3C蛋白酶的分子改造。其中eYESS***是基于前期发表的酿酒酵母内质网滞留筛选(yeast ER sequestration screening，YESS)***[Yi,L.,Gebhard,M.C.,Li,Q.,et al.,Engineering ofTEVprotease variants by yeast ER sequestrationscreening(YESS)of combinatorial libraries.Proc Natl Acad Sci U S A 2013,110(18),7229-7234]，利用内质网滞留信号肽(ER retention sequence，ERS)优化改进的一种可有效针对外源蛋白酶突变体库进行单细胞高通量筛选的蛋白分子改造***。在eYESS***中(图1)，采用三步筛选策略对HRV 3C蛋白酶进行分子改造。首先，在蛋白酶突变体库及其底物端的羧基端均使用ERS(FEHDEL)，来增加蛋白酶及其底物在内质网中的浓度和水解反应时间，提高蛋白酶水解反应几率，可以放大微弱的蛋白酶水解反应信号，进而初步富集足够多的蛋白酶突变体。其次，去除底物羧基端的ERS并保留蛋白酶端的ERS以增加***的筛选压力，从而筛选得到酶活提高的蛋白酶突变体。最后，通过去掉蛋白酶羧基端的ERS以进一步提高***的筛选压力，进而筛选出活性进一步提高的蛋白酶突变体。此外，为了提高突变体库筛选的有效性，eYESS***采用Kex2基因敲除的酿酒酵母菌株EBY100Kex2-进行突变体库的构建，可以有效防止蛋白酶及其底物被酵母分泌途径中的主要内源性蛋白酶Kex2切割[Li,Q.,Yi,L.,Hoi,K.H.,et al.,Profiling Protease Specificity:Combining YeastER Sequestration Screening(YESS)with Next Generation Sequencing.ACS Chem Biol2017,12(2),510-518.]。
本发明提供的一组针对底物P1’位点特异性改变的HRV 3C蛋白酶突变体，其是将wt HRV 3C-P的第22位赖氨酸，第25位苯丙氨酸，第106位天冬酰胺，第129位苏氨酸，第140位丙氨酸，第143位苏氨酸或第145位谷氨酰胺进行了突变。具体地，所述HRV 3C蛋白酶突变体是在野生型HRV 3C蛋白酶的氨基酸序列基础上进行如下至少一种突变而得：
(1)将第22位赖氨酸突变为丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸和色氨酸中的任意一种氨基酸；
(2)将第25位苯丙氨酸突变为缬氨酸；
(3)将第106位天冬酰胺突变为半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和酪氨酸中的任意一种氨基酸；
(4)将第129位苏氨酸突变为异亮氨酸；
(5)将第140位丙氨酸突变为丝氨酸；
(6)将第143位苏氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸和酪氨酸中的任意一种氨基酸；
(7)将第145位谷氨酰胺突变为半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸中的任意一种氨基酸。
需要说明的是，所述的野生型HRV 3C蛋白酶(wt HRV 3C-P)的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述HRV 3C蛋白酶突变体是将wt HRV 3C-P的第22位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第106位天冬酰胺突变为苏氨酸，第143位苏氨酸突变为脯氨酸，第145位谷氨酰胺突变为苏氨酸，获得第一步筛选中最优突变体A3，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，其余突变体突变位点见表1。
在本发明的另一个实施方式中，所述HRV 3C蛋白酶突变体是将wt HRV 3C-P的第22位赖氨酸突变为亮氨酸，第25位苯丙氨酸突变为缬氨酸，第106位天冬酰胺突变为酪氨酸，第143位苏氨酸突变为甲硫氨酸，第145位谷氨酰胺突变为甲硫氨酸，获得第二步筛选中最优突变体B22，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其余突变体突变位点见表1。
在本发明的另一个实施方式中，所述HRV 3C蛋白酶突变体是将wt HRV 3C-P的第22位赖氨酸突变为亮氨酸，第25位苯丙氨酸突变为缬氨酸，第106位天冬酰胺突变为酪氨酸，第129位苏氨酸突变为异亮氨酸，第143位苏氨酸突变为甲硫氨酸，第145位谷氨酰胺突变为甲硫氨酸，获得第三步筛选中最优突变体C3，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其余突变体突变位点见表1。
其次，本发明还提供了编码上述突变体A3、B22、C3的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～7所示。
第三，本发明还提供了含有所述基因的重组质粒。在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒是在pRK792或pYSD载体的基础上构建得到的。
第四，本发明还提供了表达所述HRV 3C蛋白酶突变体的基因工程菌。在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为大肠杆菌或酿酒酵母。
第五，本发明还提供一种筛选针对底物P1’位点特异性改变的HRV 3C蛋白酶突变体的方法，所述方法是构建了一个覆盖6个位点、库容量大小为2.7×108的HRV 3C蛋白酶饱和突变体库，利用eYESS***，针对底物LEVLFQ↓M进行了三步高通量筛选。具体包括如下步骤：
1)基于已报道的HRV 3C蛋白酶的结构(PDB:2B0F)[Bjorndahl,T.C.,Andrew,L.C.,Semenchenko,V.,et al.,NMR solution structures ofthe apo and peptide-inhibited human rhinovirus 3C protease(Serotype 14):structural and dynamiccomparison.Biochemistry 2007,46(45),12945-12958.]，利用DS中的ZDOCK程序分析找到HRV 3C蛋白酶上的S1’底物结合区域中距离与底物(LEVLFQ↓G)P1’位点为的6个氨基酸，包括Lys22、Phe25、Asn106、Thr143、Gly144和Gln145(图2)。最后，针对这6个位点构建了一个大小为2.7×108的HRV 3C蛋白酶饱和突变体库；
2)以wt HRV 3C-P基因为模板，设计含有简并密码子NNS，NDT,VMA,ATG,TGG组合的突变引物，进行PCR；
3)将步骤2)获得的PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶回收后，与经过限制性核酸内切酶PstⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pYSD-GAL1-Aga2-FLAG-LEVLFQ↓M-HA-FEHDEL载体，按照摩尔比3：1混合，再电转化至酿酒酵母EBY100Kex2-感受态细胞中，从而得到一个含有6个位点突变的HRV 3C蛋白酶饱和突变体库；
4)将上述构建好的HRV 3C蛋白酶突变体文库进行培养和诱导，再利用Anti-HA-FITC和Anti-FLAG-iFluor 647进行荧光抗体标记，最后用流式细胞仪针对高iFluor 647和低FITC荧光信号的酵母细胞进行3轮的高通量筛选。将最后一轮筛选得到的酵母涂布于YNB-CAA-Glucose平板，长出单菌落后，分别挑取50个单菌落进行活性和序列分析，结果发现大部分突变体都可以切割新底物，而A3突变体的活性最高，针对底物LEVLFQ↓M的切割效率为84.2％(图3)；
5)提取上述最后一轮筛选的酵母细胞质粒，并以其为模板扩增蛋白酶的基因，然后与经过PstⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pYSD-GAL1-Aga2-FLAG-LEVLFQ↓M-HA载体，按照摩尔比3：1混合，再电转化至酿酒酵母EBY100Kex2-感受态细胞中，得到第二步筛选的蛋白酶突变体库。在该文库中，通过去掉底物端的ERS来降低第二步筛选的筛选压力。经过三轮的流式细胞仪筛选得到高iFluor 647和低FITC荧光信号的酵母细胞。同样分析最后一轮筛选细胞中的50个蛋白酶突变体的活性和序列，鉴定得到一个针对底物LEVLFQ↓M切割活性最强的蛋白酶突变体B22。为了验证在不含ERS条件下，B22突变体是否可以维持该切割效率。于是将B22蛋白酶基因构建在了载体pYSD-GAL1-Aga2-FLAG-LEVLFQ↓M-HA上，再用YESS***检测其活性，发现其针对底物LEVLFQ↓M的切割效率从原有的95％降到了50％(图3)。由此可见，B22突变体的活性有待进一步提高；
6)为了进一步提高***的筛选压力，本发明在第三步筛选中去掉了蛋白酶羧基端的ERS。以B22基因为模板，通过易错PCR扩增得到蛋白酶突变体DNA片段，随后与经过PstⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pYSD-GAL1-Aga2-FLAG-LEVLFQ↓M-HA载体，按照摩尔比3：1混合，再电转化至酿酒酵母EBY100Kex2-感受态细胞中，得到第三步筛选的蛋白酶突变体库。之后同样针对高iFluor 647和低FITC荧光信号的酵母细胞进行了三轮的分选，并分析了最后一轮筛选细胞中的50个突变体的活性和序列，鉴定得到了一种针对底物LEVLFQ↓M活性最高的突变体C3，在无ERS时切割效率为98％(图3)。
第六，本发明还提供一种检测HRV 3C蛋白酶及其突变体的动力学参数的方法，具体包括如下步骤：
1)采用PCR克隆法分别得到LEVLFQ↓X-6His-GFP(X为20种氨基酸中的任意一种)、LEVLFQ↓G-6His-wt HRV 3C-P、LEVLFQ↓M-6His-C3基因片段，再分别与经过限制性核酸内切酶NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后的pRK792载体酶连。酶连产物分别转化到大肠杆菌XL-GOLD(Invitrogen公司)感受态细胞中，经菌落PCR验证和测序确认后分别得到重组质粒pRK792-MBP-LEVLFQ↓X-6His-GFP(X为20种氨基酸中的任意一种)、pRK792-MBP-LEVLFQ↓G-6His-wtHRV 3C-P和pRK792-MBP-LEVLFQ↓M-6His-C3；
2)将上述质粒分别转化至BL21(DE3)感受态细胞中，得到含有wt HRV 3C-P及其突变体或MBP-LEVLFQ↓X-6His-GST(X为20种氨基酸中的任意一种)融合蛋白底物的大肠杆菌表达菌株；
3)将上述不同的大肠杆菌表达菌株用LB(含有Amp抗生素)培养基培养，之后利用IPTG诱导HRV 3C蛋白酶及其突变体和融合蛋白底物的表达；
4)利用Ni-NTAHis树脂纯化上述HRV 3C蛋白酶及其突变体和融合蛋白底物；
5)将上述纯化后的蛋白酶与底物按不同浓度比例反应，取0、5、10、15、25和45min时的反应液，利用SDS-PAGE和多功能激光分析仪分析蛋白胶图上含有GFP融合蛋白的荧光强度，从而计算HRV 3C蛋白酶突变体针对不同融合蛋白底物的切割效率和动力学参数(表2)。
第七，本发明还提供一种检测HRV 3C蛋白酶突变体C3针对底物P1’位点特异性的方法，具体包括如下步骤：
1)采用PCR克隆方法分别得到C3、C3-FEHDEL、Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA和Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA-FEHDEL(X为20种氨基酸中任意一种)基因片段；
2)将步骤1)得到的C3、C3-FEHDELPCR产物用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切和琼脂糖凝胶回收后，再分别与经过限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后的pYSD载体酶连。酶连产物转化到大肠杆菌XL-GOLD(Invitrogen公司)感受态细胞中，经菌落PCR验证和测序确认后分别得到重组质粒pYSD-GAL10-C3和pESD-GAL10-C3-FEHDEL；
3)将步骤1)得到的Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA和Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA-FEHDELPCR产物用限制性内切酶PstI和EcoRI双酶切和琼脂糖凝胶回收后，再分别与经过限制性核酸内切酶PstI和EcoRI双酶切后的pYSD-GAL10-C3和pYSD-GAL10-C3-FEHDEL载体酶连。酶连产物转化到大肠杆菌XL-GOLD(Invitrogen公司)感受态细胞中，经菌落PCR验证和测序确认后分别得到重组质粒pYSD-C3-GAL10-GAL1-Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA和pYSD-FEHDEL-C3-GAL10-GAL1-Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA-FEHDEL；
4)将上述质粒分别转化至酿酒酵母EBY100Kex2-感受态细胞中，得到同时含有HRV3C蛋白酶突变体C3及其底物的酿酒酵母表达菌株；
5)将上述不同的酿酒酵母表达菌株分别用YNB-CAA-Glucose培养基培养，随后换成YNB-CAA-Galactose培养基诱导HRV 3C蛋白酶突变体C3及其底物的表达。
6)取上述诱导后的酵母细胞用Anti-HA-FITC和Anti-FLAG-iFlor647荧光抗体标记。再用流式细胞仪检测酵母细胞的荧光，最后计算C3突变体针对不同底物的切割效率。
分析结果发现：当蛋白酶和底物端都带有FEHDEL的时候，C3突变体能切割20种底物，并且切割效率都达到了80％-99％(图4)。而当去掉蛋白酶和底物端的ERS时，C3突变体也能够切割20种底物，只是呈现出不同的切割效率。分析发现C3突变体针对P1’位点为Asp、Glu、Phe、His、Lys、Pro、Arg、Val、Trp和Tyr等带电荷或者芳环氨基酸的底物切割效率较弱，只有10％-40％(图5)。与之前验证的野生型HRV 3C蛋白酶在不含ERS的时候只能切割底物LEVLFQ↓G的结果相比，说明本发明筛选得到的C3突变体针对底物P1’位点有较宽的底物特异性，拓宽了HRV 3C蛋白酶作为工具酶的实际应用范围。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明利用一种结合结构模拟、饱和突变、随机突变技术和eYESS***的组合策略对wt HRV 3C-P进行分子改造，使其从识别原有多肽序列LEVLFQ↓G变为识别多肽序列LEVLFQ↓M，得到了一系列HRV 3C蛋白酶突变体。
(2)本发明提供的一组针对底物P1’位点特异性改变的HRV 3C蛋白酶突变与wtHRV 3C-P相比，针对底物LEVLFQ↓M有更好的特异性和切割活性，可以达到无痕切除蛋白融合标签的效果。
附图说明
图1：一种用于蛋白酶分子改造的eYESS***。
图2：野生型HRV 3C蛋白酶与底物LEVLFQ↓G的分子对接图。
黄色区域显示的是HRV 3C蛋白酶(灰色)的底物结合袋。底物LEVLFQ↓G以蓝色显示，P1位点的Gln和P1’位点的Gly以蓝色球体表示。催化三联体His40-Glu71-Cys146以绿色表示。在S1底物结合口袋中，P1位点的Gln分别与Thr141和His160形成了一个H键(红色，左边)。在S1’底物结合袋中，距离底物P1’位点的Gly为的氨基酸有Lys22、Phe25、Asn106、Thr143、Gly144和Gln145，用粉红色球体表示(右)。
图3：HRV 3C蛋白酶突变体库高通量筛选示意图。
在第一步筛选中，HRV 3C蛋白酶突变体库及其底物羧基端都带有ERS。第二步中，底物羧基端的ERS去掉了，而蛋白酶端的ERS保留。第三步中，同时去掉了蛋白酶及其底物端的ERS。在整个酵母细胞筛选过程中，均针对高iFluor 647荧光和低FITC荧光信号的细胞进行了三轮分离富集，ERS为FEHDEL。
图4：C3突变体在双ERS条件下的底物P1’位点特异性分析。
图5：C3突变体在无ERS条件下的底物P1’位点特异性分析。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案和原理进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：HRV3C蛋白酶突变体库的构建方法
设计26条引物，以HRV 3C蛋白酶的基因为模板，扩增4个短片段，再通过重叠PCR组装HRV 3C蛋白酶基因、ERS(FEHDEL)基因和与载体的同源序列(40bp)。引物序列如下：
F1：ATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCCATGCAGTTACTTCG
R1：GATGTGGTAATAGTCATGATATTC
F2-1：GAATATCATGACTATTACCACATCTNNKGGTGAANDTACTGGCTTGGGTATTCATGAC
F2-2：GAATATCATGACTATTACCACATCTNNKGGTGAAVMAACTGGCTTGGGTATTCATGAC
F2-3：GAATATCATGACTATTACCACATCTNNKGGTGAAATGACTGGCTTGGGTATTCATGAC
F2-4：GAATATCATGACTATTACCACATCTNNKGGTGAATGGACTGGCTTGGGTATTCATGAC
R2：GAATGAACAACCAAAGTAGCATCAAC
F3：GTTGATGCTACTTTGGTTGTTCATTCTNNKAATTTTACTAATACTATTTTAG
R3：TTTAGTAGCGTAATCGTAACG
F4-1：CGTTACGATTACGCTACTAAANDTNNKNDTTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-2：CGTTACGATTACGCTACTAAANDTNNKVMATGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-3：CGTTACGATTACGCTACTAAANDTNNKATGTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-4：CGTTACGATTACGCTACTAAANDTNNKTGGTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-5：CGTTACGATTACGCTACTAAAVMANNKNDTTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-6：CGTTACGATTACGCTACTAAAVMANNKVMATGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-7：CGTTACGATTACGCTACTAAAVMANNKATGTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-8：CGTTACGATTACGCTACTAAAVMANNKTGGTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-9：CGTTACGATTACGCTACTAAAATGNNKNDTTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-10：CGTTACGATTACGCTACTAAAATGNNKVMATGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-11：CGTTACGATTACGCTACTAAAATGNNKATGTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-12：CGTTACGATTACGCTACTAAAATGNNKTGGTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-13：CGTTACGATTACGCTACTAAATGGNNKNDTTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-14：CGTTACGATTACGCTACTAAATGGNNKVMATGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-15：CGTTACGATTACGCTACTAAATGGNNKATGTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
F4-16：CGTTACGATTACGCTACTAAATGGNNKTGGTGTGGTGGTGTTTTGTGTGC
R4：TCGATTTTGTTACATCTACACTGTTGTTATCAGATCTCGAGTCACAATTCGTCGTGTTC
上述21条简并引物使用了NNS和NDT，VMA，ATG，TGG简并密码子(N是任意核苷酸，S＝G/C，D＝A/G/T，V＝A/C/G，M＝A/C，NDT/VMA/ATG/TGG的4个简并密码子组合覆盖了20个氨基酸，可以有效减少文库的密码子冗余)，Lys22、Asn106、Gly144三个位点使用NNK简并密码子，Phe25、Thr143和Gln145三个位点使用NDT/VMA/ATG/TGG的4个简并密码子组合。
对于eYESS的第一步筛选，将上述扩增得到的HRV 3C蛋白酶突变体DNA片段与经过限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后的pYSD-GAL1-Aga2-FLAG-LEVLFQ↓M-HA-FEHDEL载体，按照摩尔比3：1混合，再电转化至酿酒酵母EBY100Kex2-感受态细胞中，从而得到一个含有6个位点的HRV 3C蛋白酶饱和突变体库。
在eYESS的第二步筛选中，提取第一步筛选的最后一轮酵母细胞的质粒，以其作为模板，用上述引物F1和R4，扩增得到含有ERS的HRV 3C蛋白酶突变体DNA片段，再与经过限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后的pYSD-GAL1-Aga2-FLAG-LEVLFQ↓M-HA载体，按照摩尔比3：1混合，电转化至酿酒酵母EBY100Kex2-感受态细胞中，从而得到用于第二步筛选的HRV3C蛋白酶突变体库。
以第二步筛选得到的活性最好的突变体B22的基因为模板，用引物F1和R5，进行易错PCR(错配率为1.0-1.5％)，扩增得到不含ERS的HRV 3C蛋白酶突变体DNA片段，再与经过限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后的pYSD-GAL1-Aga2-FLAG-LEVLFQ↓M-HA载体，按照摩尔比3：1混合，电转化至酿酒酵母EBY100Kex2-感受态细胞中，从而得到用于第三步筛选的HRV 3C蛋白酶突变体库。其中R5引物序列如下：
R5：TCGATTTTGTTACATCTACACTGTTGTTATCAGATCTCGAGTCATTGCTTTTCAACGAA
实施例2：HRV3C蛋白酶突变体库的高通量筛选
将实施例1中构建好的HRV 3C蛋白酶突变体库用YNB-CAA-Glucose培养基培养至OD600为3.0-4.0，然后在YNB-CAA-Galactose培养基中诱导，初始OD600为0.5。在30℃诱导12小时后，收集2×109的酵母细胞，先用溶液A洗一次，再用溶液B洗一次，4℃，3000rpm，离心2min。再用0.1μMAnti-HA-FITC和0.1μMAnti-FLAG-iFluor647荧光抗体标记。
将上述标记好的酵母细胞于3000rpm，离心2min，去掉上清。再用溶液B洗一次，最后用1×PBS重悬细胞。使用美国Beckman公司的MoFloTM XDP 4激光超速分选型流式细胞仪对细胞进行分选。检测通道为FITC通道(525/40nm带通)和APC通道(660/20nm带通)。在每一轮分选中，收集107-108个具有高iFluor647和低FITC荧光信号的细胞。分选富集的细胞继续用YNB-CAA-Glucose培养和YNB-CAA-Galactose诱导，经荧光抗体标记后，再进行下一轮分选。经过3轮分选后，将收集的细胞涂布在YNB-CAA-Glucose固体培养基上。
从上述固体平板上挑取单菌落接种于3mLYNB-CAA-Glucose培养液中，30℃摇床培养至OD600达到3.0，3000rpm离心2min，收集菌体，弃掉上清。再用溶菌酶裂解酵母细胞，提取酵母质粒。提取的酵母质粒再转化至大肠杆菌XL-Gold感受态细胞，扩增质粒，最后进行测序，以获得筛选后的HRV 3C蛋白酶突变体的序列信息(表1)。
表1HRV 3C蛋白酶突变体突变位点信息
实施例3：含HRV3C蛋白酶突变体C3及其底物质粒的酿酒酵母表达菌株构建
采用PCR克隆方法分别得到C3、C3-FEHDEL、Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA和Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA-FEHDEL(X为20种氨基酸中任意一种)基因片段；
将上述获得的C3和C3-FEHDELPCR产物分别用0.8％的琼脂糖凝胶回收后，用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切体系为：BamHⅠ，1μL；XhoⅠ，1μL；10×Cutsmartbuffer，5μL；PCR回收产物，30μL，加ddH2O至50μL。37℃酶切5h后，用0.8％的琼脂糖凝胶回收；
再与经过限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后的pYSD载体酶连。酶连体系为：酶切片段，1.2μL；酶切载体，0.3μL；T4 DNA连接酶缓冲液(NEB公司)，1μL；T4 DNA连接酶(NEB公司)，0.3μL；加ddH2O至10μL，于22℃酶连1h。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD感受态细胞中，经菌落PCR验证和测序确认后分别得到重组质粒pYSD-GAL10-C3和pYSD-GAL10-C3-FEHDEL；
将上述获得的Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA和Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA-FEHDEL(X为20种氨基酸中任意一种)PCR产物回收后，用PstI和EcoRI双酶切和琼脂糖凝胶回收后，再与经PstI和EcoRI双酶切和琼脂糖凝胶回收的pYSD-GAL10-C3和pYSD-GAL10-C3-FEHDEL载体酶连。酶连产物转化到大肠杆菌XL-GOLD感受态细胞中，经菌落PCR验证和测序确认后得到重组质粒pYSD-C3-GAL10-GAL1-Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA和pYSD-FEHDEL-C3-GAL10-GAL1-Aga2-FLAG-LEVLFQ↓X-HA-FEHDEL；
将上述构建好的重组质粒，通过化学转化法分别转入酿酒酵母EBY100Kex2-中，然后涂布于YNB-CAA-Glucose平板，于30℃培养3-4天。
实施例4：利用YESS***检测HRV3C蛋白酶突变体的活性
将实施例3转化有HRV 3C蛋白酶突变体C3及其底物质粒的酵母转化子接种于1mLYNB-CAA-Glucose培养液中，30℃摇床培养过夜，待其OD600达到3.0-4.0之间，换成YNB-CAA-Galactose培养液诱导，起始OD600为0.5，于30℃诱导12h。取106个细胞用0.1μM Anti-HA-FITC和0.1μMAnti-FLAG-iFluor647荧光抗体标记。再用美国Beckman公司的CytoFLEX分析型流式细胞仪进行检测。检测通道为FITC通道(525/40nm带通)和APC通道(660/20nm带通)。C3突变体针对不同底物的切割效率计算公式为：[底物切割效率]＝[仅具有iFluor647荧光信号的细胞百分比]/([仅具有iFluor647荧光信号的细胞百分比]+[同时具有iFluor647和FITC荧光信号的细胞百分比])。
实施例2和4所述培养基及洗细胞溶液组成成分如下：
YNB-CAA-Glucose：20g/L葡萄糖,6.7g/L YNB,5.4g/L Na2HPO4,8.6g/LNaH2PO4·H2O,5g/L casamino acids,pH7.4；
YNB-CAA-Galactose：20g/L半乳糖,6.7g/L YNB,5.4g/L Na2HPO4,8.6g/LNaH2PO4·H2O,5g/L casamino acids,pH7.4；
溶液A：1X PBS，0.5％BSA，1mM EDTA，pH7.4；
溶液B：1X PBS，0.5％BSA，pH7.4。
实施例5：含HRV3C蛋白酶及其底物质粒的大肠杆菌表达菌株构建
采用PCR克隆方法分别得到LEVLFQ↓X-6His-GFP(X为20种氨基酸中的任意一种)、LEVLFQ↓G-6His-wt HRV 3C-P、LEVLFQ↓M-6His-C3基因片段；
将上述获得的PCR产物分别用0.8％的琼脂糖凝胶回收后，用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切体系为：NcoⅠ，1μL；XhoⅠ，1μL；10×Cutsmart buffer，5μL；PCR回收产物，30μL，加ddH2O至50μL。37℃酶切5h后，用0.8％的琼脂糖凝胶回收；
再与经过限制性核酸内切酶NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后的pRK792载体酶连。酶连体系为：酶切片段，1.2μL；酶切载体，0.3μL；T4 DNA连接酶缓冲液(NEB公司)，1μL；T4 DNA连接酶(NEB公司)，0.3μL；加ddH2O至10μL，于22℃酶连1h。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD感受态细胞中，经菌落PCR验证和测序确认后分别得到重组质粒pRK792-MBP-LEVLFQ↓X-6His-GFP(X为20种氨基酸中的任意一种)、pRK792-MBP-LEVLFQ↓G-6His-wt HRV 3C-P和pRK792-MBP-LEVLFQ↓M-6His-C3；
将上述构建好的重组质粒，通过化学转化法分别转入BL21(DE3)中，然后涂布于LB(含有氨苄抗生素)平板，于37℃过夜培养。
实施例1、3和5所述PCR反应体系为：10×KOD buffer，5μL；dNTP(2.5mM)，4μL；引物F(10μM)，3μL；引物R(10μM)，3μL；Pfu聚合酶，2μL；模板，1μL；加ddH2O至50μL。PCR扩增体系：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，25个循环；72℃，5min；12℃，10min。
实施例6：HRV3C蛋白酶及其突变体的动力学实验
将实施例5转化有HRV 3C蛋白酶及其突变体和融合蛋白底物质粒的大肠杆菌转化子分别接种于2mL LB培养液中，37℃摇床培养过夜；转接到200mL LB液体培养基中(加有氨苄抗生素)，37℃摇床培养2-3h至OD600为0.6-0.8，再加入终浓度为0.5mM IPTG诱导蛋白表达，18℃摇床培养20-24h。4℃、4000rpm离心10min收集菌体，弃掉上清，用无菌水洗涤细胞两次。用20mL Lysis Buffer重悬细胞后，4℃搅拌1h；冰浴状态下超声波破菌，超声2s停4s，35％功率破菌15min；将破菌液在4℃、17000rpm离心30min，使细胞碎片与上清液完全分离；向蛋白纯化柱中加入1mLNi-NTAHis树脂，再用Wash Buffer洗涤树脂2次，每次2mL；取2mL破菌上清加入到蛋白纯化柱中，静置5min后将杂蛋白释放出来，再用2mLWash Buffer洗涤树脂，去掉未结合的杂蛋白。每加一次破菌上清，就用等量的Wash Buffer洗涤树脂，直至目标蛋白全部结合到蛋白纯化柱中。最后，用AKATA蛋白纯化仪对洗脱下来的目标蛋白进行脱盐，储存在Storage Buffer中，去掉高浓度的咪唑，避免对后期蛋白实验造成影响。
将上述纯化的wt HRV 3C-P及其突变体(100nM)与不同浓度的融合蛋白底物MBP-LEVLFQ↓X-6His-GFP(5μM,15μM,30μM,60μM,120μM,and 320μM；X为A、C、G、I、L、M、N、Q、S、T中的任意一种氨基酸)混匀，并加入20μL Cleavage buffer，在4℃下反应，反应总体积为200μL。
分别在0、5、10、15、25和45min时，取反应样品与SDS-PAGE上样缓冲液混合并在100℃下煮沸10分钟来终止蛋白酶水解反应，然后在4℃条件下进行SDS-PAGE分析，并利用多功能激光成像仪AmershamTM Typhoon检测蛋白胶图上含有GFP融合蛋白的荧光强度来计算蛋白酶的水解效率，计算公式为：[蛋白酶水解效率]＝([被切割蛋白底物MBP-LEVLFQ↓X-6His-GFP的灰度]/[对照蛋白底物MBP-LEVLFQ↓M/G-6His-GFP的灰度])×100％，最后将数据用Michaelis–Menten酶动力学模型拟合来计算动力学参数(表2)。
所述蛋白纯化试剂组成成分如下：
Lysis Buffer：50mM Tris-HCl(pH 8.0),200mM NaCl,50mM NaH2PO4,25mMImidazole,10％Glycerol；
Wash Buffer：50mM Tris-HCl(pH 8.0),200mM NaCl,50mM NaH2PO4,40mMImidazole；
Elution Buffer：50mM Tris-HCl(pH 8.0),200mM NaCl,50mM NaH2PO4,200mMImidazole；
Storage Buffer：50mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM EDTA；
Cleavage buffer：150mM NaCl,50mM Tris-HCl(pH 7.5)。
表2 HRV 3C蛋白酶及其突变体C3针对融合蛋白底物的动力学参数
通过以上实施例可知，本发明得到的一系列针对底物P1’位点特异性改变的HRV3C蛋白酶突变体，其中C3突变体针对底物LEVLFQ↓M的活性最强，并且针对底物P1’位点有较宽的底物特异性，能够识别P1’位点处的任意20种氨基酸。此外，C3突变体针对10种融合蛋白底物MBP-LEVLFQ↓X-6His-GFP(X为A、C、G、I、L、M、N、Q、S、T中的任意一种氨基酸)的kcat/KM值在0.37±0.01到3.72±0.04mM-1·s-1之间，而野生型HRV 3C蛋白酶只能识别并切割4种融合蛋白底物MBP-LEVLFQ↓X-6His-GFP(X为A、C、G、S中的任意一种氨基酸)，kcat/KM值范围为0.39±0.03到4.73±0.01mM-1·s-1之间。

Claims (10)

1.一种针对底物P1’位点特异性改变的HRV3C蛋白酶突变体，其特征在于，所述HRV3C蛋白酶突变体的氨基酸序列，是在野生型HRV3C蛋白酶的氨基酸序列基础上进行如下至少一种突变而得：
(1)将第22位赖氨酸突变为丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸和色氨酸中的任意一种氨基酸；
(2)将第25位苯丙氨酸突变为缬氨酸；
(3)将第106位天冬酰胺突变为半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和酪氨酸中的任意一种氨基酸；
(4)将第129位苏氨酸突变为异亮氨酸；
(5)将第140位丙氨酸突变为丝氨酸；
(6)将第143位苏氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸和酪氨酸中的任意一种氨基酸；
(7)将第145位谷氨酰胺突变为半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸中的任意一种氨基酸。
2.根据权利要求1所述针对底物P1’位点特异性改变的HRV3C蛋白酶突变体，其特征在于，所述的野生型HRV3C蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述针对底物P1’位点特异性改变的HRV3C蛋白酶突变体，其特征在于，所述HRV3C蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
4.编码权利要求1所述HRV3C蛋白酶突变体的基因。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
6.含有权利要求4所述基因的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是在pRK792或pYSD质粒基础上构建而得。
8.表达权利要求1所述HRV3C蛋白酶突变体的基因工程菌。
9.根据权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为酿酒酵母或大肠杆菌。
10.一种筛选针对底物P1’位点特异性改变的HRV3C蛋白酶突变体的方法，其特征在于，该方法包括构建一个覆盖6个位点、库容量大小为2.7×108的HRV3C蛋白酶饱和突变体库，利用优化的酿酒酵母内质网滞留筛选***，针对底物LEVLFQ↓M进行三步高通量筛选。
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