CN117004589A - 一种氨肽酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及热稳定性提高的氨肽酶突变体，属于基因工程、酶工程及食品工程技术领域。所述氨肽酶突变体是在SEQ ID NO：2所示的野生型氨肽酶基础上，发生Q137P突变获得的。氨肽酶突变体Q137P最适反应温度提高了5℃，Q137P在60℃保温30min后仍有29.5％的残余酶活，相较于原始氨肽酶提高了40.5％。有利于拓宽氨肽酶在食品加工技术领域高温条件下的应用。
Description
技术领域：
本发明涉及热稳定性提高的氨肽酶突变体，属于基因工程、酶工程及食品工程技术领域。
背景技术：
氨肽酶(Aminopeptidases，简称APs，EC 3.4.11)是一类外切蛋白酶，它能够选择性地降解多肽链和蛋白质N末端氨基酸残基，释放出游离氨基酸。其通过催化降解苦味肽N末端的疏水性氨基酸残基，可达到降低苦味的目的。因此，利用氨肽酶可以显著改善酪蛋白和大豆蛋白水解液的水解程度，降低苦味。氨肽酶酶法脱苦的水解效率高，条件温和，易于操作，因此被广泛应用于食品等现代工业中。
氨肽酶具有巨大的商业应用价值，然而很少天然氨肽酶能够在生产便捷和经济节约等条件下，高效率地催化人们所期望的反应。现有的氨肽酶普遍存在产量低、酶活力较差且在高温条件下容易失活等问题。在食品加工等领域缺乏高催化活性和稳定性的氨肽酶。
发明内容：
针对上述问题，本发明的目的在于提供了一种酶活和稳定性提高的氨肽酶突变体。本发明主要通过定点突变，筛选获得了氨肽酶稳定性提高的突变体。
本发明目的之一是，提供一种氨肽酶突变体，所述氨肽酶突变体是在SEQ ID NO：2所示的野生型氨肽酶基础上，发生Q137P突变获得的，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
本发明目的之二是，提供编码所述氨肽酶突变体的基因；
本发明目的之三是，提供包含所述氨肽酶突变体基因的重组载体或重组菌株；
所述重组载体采用的表达载体可以是本领域技术人员已知的通过基因重组制备蛋白质的载体之一，例如表达载体WB980、LY-3等；
在本发明一种具体实施方式中，所述表达载体是pET28；
在本发明一种具体实施方式中，所述重组菌株采用的宿主细胞是E.coli BL21。
本发明目的之四是，上述重组载体或重组菌株的应用，特别是在生产技术方案一所述氨肽酶突变体中的应用。
本发明目的之五是，技术方案一所述氨肽酶突变体的应用，特别是在催化蛋白质降解中的应用，其用于水解蛋白质的肽键生成多肽或氨基酸；并且，所述氨肽酶突变体相比野生型稳定性有所提高。
有益效果：
本发明利用定点突变技术，在体外对枯草芽胞杆菌来源氨肽酶进行定向进化，获得酶活和稳定性提高的氨肽酶突变体。Q137P的比酶活为4935U/g，野生型氨肽酶W168AP的比酶活为4253U/g。Q137P最适反应温度提高了5℃，在60℃保温30min后仍有29.5％的残余酶活，相较于原始菌株提高了40.5％。
附图说明：
图1：氨肽酶基因验证图。
图2：WT与突变体Q137P的最适温度曲线。
图3：WT与突变体Q137P的温度稳定性曲线。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明中采用如下定义：
氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母/单字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
在本发明中，168AP表示B.subtilis 168来源野生型氨肽酶的基因序列，如SEQ IDNO：1所示；氨肽酶突变体Q137P编码基因序列如SEQ ID NO：3所示。
W168AP表示B.subtilis 168来源野生型氨肽酶氨基酸序列，如SEQ ID NO：2所示：
MKKLLTVMTMAVLTAGTLLLPAQSVTPAAHAVQISNSERELPFKAKHAYSTI
SQLSEAIGPRIAGTAAEKKSALLIASSMRKLKLDVKVQRFNIPDRLEGTLSSAG
RDILLQAASGSAPTEEQGLTAPLYNAGLGYQKDFTADAKGKIALISRGDLTYY
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氨肽酶突变体Q137P氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示：MKKLLTVMTMAVLTAGTLLLPAQSVTPAAHAVQISNSERELPFKAKHAYSTISQLSEAIGPRIAGTAAEKKSALLIASSMRKLKLDVKVQRFNIPDRLEGTLSSAGRDILLQAASGSAPTEEQGLTAPLYNAGLGYPKDFTADAKGKIALISRGDLTYYEKAKNAEAAGAKAVIIYNNKESLVPMTPNLSGNKVGIPVVGIKKEDGEALTQQKEATLKLKAFTNQTSQNIIGIKKPKNIKHPDIVYVTAHYDSVPFSPGANDNGSGTSVMLEMARVLKSVPSDKEIRFIAFGAEELGLLGSSHYVDHLSEKELKRSEVNFNLDMVGTSWEKASELYVNTLDGQSNYVWESSRTAAEKIGFDSLSLTQGGSSDHVPFHEAGIDSANFIWGDPETEEVEPWYHTPEDSIEHISKERLQQAGDLVTAAVYEAVKKEKKPKTIKKQMKAKASDIFEDIK。
本发明所用氨肽酶酶活测定方法如下：
氨肽酶的酶活力测定方法参照LNA法，即1个酶活力单位(U/mL)定义为1mL酶液在一定条件(如未特别说明，条件为60℃、pH 9)下反应1min水解亮氨酸对硝基苯胺产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量。每一样品设三次重复，结果取平均值。
(1)测定步骤
a.发酵液13000r/min离心2min取上清作为粗酶液，并使用pH 9的Tris-HCl缓冲液进行n倍稀释；
b.对照组：取0.2mL稀释后的酶液，加入到含有2.6mL pH 9的Tris-HCl缓冲液的酶活试管，60℃条件下预热5min，加入1mL 40％的乙酸溶液，反应10min，再加入50mM LNA溶液(称取0.1256g亮氨酸对硝基苯胺用无水乙醇溶解定容至10mL)0.20ml，混匀后静置10min；
c.实验组：取0.2mL稀释后的酶液，加入到含有2.6mL pH 9的Tris-HCl缓冲液的酶活试管中，60℃条件下预热5min，向试管中加入50mM的LNA溶液0.20ml，反应10min，加入1mL40％的乙酸终止反应，混匀后静置10min；
d.使用可见光分光光度计测定波长在405nm条件下的吸光度。
(2)计算公式
酶活按照下面公式计算：
式中：
ΔOD—实验组吸光值与对照组吸光值之差；
n—稀释倍数；
4—反应试剂的总体积；
0.2—加入反应体系的酶液的体积；
K-对硝基苯胺标准曲线的斜率0.0411；
1/10—反应时间10，以1min计。
参考文献Y.Fundoiano-Hershcovitz,L.Rabinovitch,S.Shulami,V.Reiland,G.Shoham,and Y.Shoham(2005).The ywad gene from Bacillus subtilis encodes adouble-zinc aminopeptidase.FEMS Microbiol Lett,243,157-163.
本发明提供高效生产氨肽酶方法，所述方法是在适宜条件下培养表达氨肽酶菌株，并从其培养物中收集氨肽酶。
根据本发明优选的实施方式，所述适宜条件是指培养温度35-37℃，转速200-220r/min，采用发酵培养基和种子液培养基均为LB培养基，其组成如下：
LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，其余为水；
酶纯化过程中涉及的部分缓冲液如下(所有溶液配制结束后用水系膜抽滤，纯化蛋白所用水均为过膜水)：
Lysis Buffer：25mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，10mM NaCl，1mM PMSF，pH 7.4；
Wash Buffer：25mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，5mM咪唑，pH 7.4；
Elution Buffer：25mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，150mM咪唑，pH 7.4。
本发明及实施例所涉及的引物信息如表1所示：
表1
| 引物名称 | 序列 |
| 137-F | CGGGATTGGGCTATCCTAAGGACTTTACCGCTGACGC |
| 137-R | ATAGCCCAATCCCGCATTGTAAAGCGGG |
| B.subtilis168AP-F | ATCGAATGAGCTTACAGGATCATGAAAAAGCTTTTGACTGTCAT |
| B.subtilis168AP-R | TTCTAATTACCCTCCCCCGGGTTATTTGATATCTTCAAAAATGTCAGATGC |
以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。
实施例1：氨肽酶基因的获得
(1)氨肽酶基因的获取
通过NCBI数据库查找，得到B.subtilis 168来源的氨肽酶基因序列(SEQ IDNO.1)，设计引物。以B.subtilis 168基因组为模板，选用上下游引物Bacillussubtilis168AP-R、Bacillus subtilis168AP-F通过PCR进行扩增，扩增反应体系及反应条件如下表2：
表2
扩增程序的设置为：预变性：98℃5min；变性：98℃10s；退火：55-65℃5-15s；延伸：72℃5s；反应30个循环；延伸：72℃，10min。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，氨肽酶基因电泳条带大小约为1400bp(如图1所示)，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，即获得氨肽酶基因片段168AP。
(2)氨肽酶质粒的构建
1)对质粒进行双酶切获取线性载体，使用Nde I和Xho I对载体pET-28a(+)进行双酶切，酶切的体系如表3所示。
表3酶切的反应体系
按照表3将酶切体系制备完成后，在37℃水浴锅中反应2h，反应完毕后对反应产物进行琼脂糖凝胶回收，获取pET-28a(+)线性载体。
2)重组质粒的构建
(1)按照表4制备无缝克隆体系，各组分加入后轻柔混匀。
表4无缝克隆的连接体系
(2)将制备完成的样品在50℃条件下反应15min。
(3)反应结束后将样品放到冰上冷却数秒，连接产物pET28-168AP可直接用划转到大肠杆菌E.coli BL21中。
3)连接产物化转到E.coli BL21中，方法如下；
(1)从-80℃冰箱取出含有E.coli BL21感受态细胞的离心管，放入冰中静止5min左右，待其融化后加入连接产物pET28-168AP用移液枪轻轻混匀，冰浴30min。
(2)将离心管从冰浴取出并迅速转到42℃水浴热激90s，然后转冰浴2min。
(3)在超净工作台中，向每个离心管加入750μl的LB培养基，于37℃200r/mim的摇床中培养45min以上，涂板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证，将验证正确的重组菌株命名为BL21/pET28-168AP。
(4)突变体质粒的构建
以质粒pET28-168AP为模板，选用137-F、137-R，进行Q137P定点突变，扩增反应体系如下：
扩增程序的设置为：预变性：98℃5min；变性：98℃10s；退火：55-65℃5-15s；延伸：72℃5s；反应30个循环；延伸：72℃，10min。
将扩增的产物使用DpnⅠ酶去除质粒模板，将去除模板后的PCR产物用T4连接酶进行自身环化质粒为pET28-Q137P，然后将新构建的质粒pET28-Q137P化转至大肠感受态细胞中，挑取转化子，对每个转化子进行菌落PCR并将PCR产物送金唯智生物科技有限公司进行测序，将测序正确的含有Q137P的突变菌株命名为BL21/pET28-Q137P。
实施例2：氨肽酶及其突变体在E.coli BL21中的摇瓶表达和酶学性质测定
1)摇瓶发酵：
将基因工程菌株BL21/pET28-168AP、BL21/pET28-Q137P分别三区划线至含有卡那霉素的LB固体平板上，培养过夜，挑取单菌落，将单菌落接种到5ml LB试管中，200rpm，37℃培养10h后，按2％的接种量转接至50mL LB培养基(250mL摇瓶)中，200rpm，37℃培养至菌体密度(OD600)为0.6，加入IPTG进行诱导表达，28℃表达12h。
2)氨肽酶蛋白的纯化回收
采用镍离子亲和层析的方法进行蛋白纯化，具体纯化步骤：
(1)将发酵后的发酵液分别进行8000rpm，10min离心收集菌体，用Lysis Buffer重悬，20mL Lysis Buffer的量，加入1％溶菌酶，1％PMSF(先加溶菌酶后加PMSF)。
(2)将重悬的菌体在冰浴条件下磁力搅拌25min。
(3)将上述菌体用超声破碎仪破碎25min，破碎完成后，10000rpm离心30min，离心结束后，收集上清，此时用Lysis Buffer过两遍树脂。
(4)将上清与树脂混合倒入烧杯，磁力搅拌结合40min(转速不要超过100rpm)。
(5)结合结束后将上清倒入树脂管，使其自然流出，树脂沉淀下来。
(6)用枪头吹吸烧杯中残留的树脂，打入树脂管，Flow through流完，用两倍柱体积的Wash Buffer(10mL)洗掉树脂中的杂蛋白，最后用10mL Elution Buffer洗脱目的蛋白，目的蛋白洗脱时先让Elution Buffer与树脂充分结合5min，再将其流出，接收流出的目的蛋白。
(7)选择30KD的置换管，先用过膜水充分冲洗置换管的滤膜，再加入过膜水用高心机离心20min，清洗干净后将目的蛋白倒入置换管进行浓缩，浓缩至1mL时加入10mL 20mM磷酸盐缓冲液进行置换，当置换液剩余1mL时重复上述操作，置换两次，收集收集管中的酶液为纯化后酶液，4℃保存用于酶学性质测定。
对纯化后的氨肽酶W168AP、Q137P进行氨肽酶酶活力检测，测得酶活力(U/mL)除以蛋白浓度(g/mL)获得比酶活(U/g)，野生型氨肽酶W168AP的比酶活为4253U/g，Q137P的比酶活为4935U/g。
3)氨肽酶突变体的最适反应温度和温度稳定性
最适反应温度：
将纯化后的氨肽酶W168AP、Q137P蛋白分别在30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃下测定酶活(pH 9)，以所测的不同反应温度下最高酶活力为100％，从图2中可以看出，Q137P在50℃-65℃温度区间明显有提升，其最适反应温度从60℃提高到了65℃。
温度耐受性：
将纯化后的氨肽酶W168AP、Q137P蛋白分别在30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃下放置30min后测定酶活，以初始酶活力为100％，由图3可知突变体Q137P，在60℃保温30min后仍有29.5％残余酶活，W168AP残余21％，Q137P相较于野生型氨肽酶提高了40.5％。
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。
Claims (8)
1.一种氨肽酶突变体，其特征在于，所述氨肽酶突变体是在SEQ ID NO：2所示的野生型氨肽酶基础上，发生Q137P突变获得的。
2.如权利要求1所述的氨肽酶突变体，其特征在于，所述氨肽酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.权利要求1所述氨肽酶突变体的编码基因。
4.含有权利要求3所述编码基因的重组载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，采用的表达载体包括但不限于WB980、LY-3、pET28。
6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，采用的宿主细胞是E.coli BL21。
7.权利要求4所述的重组载体或重组菌株在生产权利要求1所述氨肽酶突变体中的应用。
8.权利要求1所述氨肽酶突变体在催化蛋白质降解中的应用。
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| YIFAT FUNDOIANO-HERSHCOVITZ等: "The ywad gene from Bacillus subtilis encodes a double-zinc aminopeptidase", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 243, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 1 - 2 * |
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