CN112442474B

CN112442474B - 一种(-)γ-内酰胺的制备方法

Info

Publication number: CN112442474B
Application number: CN202011449726.5A
Authority: CN
Inventors: 倪晔; 周彤彤; 韩瑞枝; 许国超; 周婕妤; 董晋军
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112442474A

Abstract

本发明公开了一种(‑)γ‑内酰胺的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明的(+)γ‑内酰胺酶来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，可作为催化剂用于制备光学纯(‑)γ‑内酰胺。其稳定性好、立体选择性强、适用的反应条件温和、对环境友好，并且全细胞催化避免了破碎离心等繁琐步骤，操作更简单，具有很好的应用开发前景。

Description

一种(-)γ-内酰胺的制备方法

技术领域

本发明涉及一种(-)γ-内酰胺的制备方法，属于生物工程及酶工程技术领域。

背景技术

γ-内酰胺作为一种重要的手性化合物，可以被用来合成抗病毒药物阿巴卡韦、帕拉米韦，还可以用于合成神经酰胺酶抑制剂，在医药化学领域的应用引起广泛关注。γ-内酰胺酶作用于酰胺键，而非蛋白质肽键，并形成羧酸。具有立体选择性的γ-内酰胺酶可以不对称水解γ-内酰胺获得光学纯的γ-内酰胺。

(-)γ-内酰胺最初的生产工艺是利用碱性蛋白酶在水/四氢呋喃的混合溶剂中对外消旋γ-内酰胺选择性水解，底物浓度可达100g/L。1996年Nakano hiroto等人，利用脂肪酶拆分水解外消旋γ-内酰胺(Nakano hiroto et al.Tetrahedron：Asymmetry，1996，7(8)：2381-2386)。1999年，Mahmoudian等以N-乙酰基-L-苯丙氨酸为唯一碳源筛选得到了来源于假单胞菌属产生的(+)γ-内酰胺酶，该酶能够高立体选择性的拆分外消旋γ-内酰胺，但稳定性差，易丧失活性，无法对酶的性质进行表征(Mahmoudian et al.Tetrahedron：Asymmetry，1999，10(6)：1201-1206)。2000年，Wisdom等人报道筛选到一株是食酸毛单胞菌，该酶较以往鉴定的酶具有更高的稳定性，能在较高底物浓度下进行拆分反应(Microorganism，lactamase enzyme obtained therefrom,and their use，2000，UnitedStates patent,US006090616A)，但是野生菌遗传背景复杂，发酵成本高，且γ-内酰胺酶表达量有限，在全细胞催化文斯内酯拆分反应时需要添加大量细胞，限制了在工业上的应用。

2015年，郑等人发现了来源嗜热古菌的(+)γ-内酰胺酶，其最适反应温度超过100℃(Zheng G et al.Appl Biochem Biotechnol，2015，176:170–184.)，然而过高的最适温度使反应条件更为严苛，违背工业生产要求。近年来，随着海量基因组数据的公开，从数据库中挖掘具有优越性能的新的γ-内酰胺酶成为热点研究。实现γ-内酰胺酶合适的稳定、高效、可溶表达，并应用于立体选择性拆分外消旋γ-内酰胺，是工业化制备光学纯(-)γ-内酰胺的潜在方法。

由于大肠杆菌表达***的优势，成为在工业上应用比较广泛的生产菌株，发明人课题组前期尝试将代尔夫特菌(Delftia acidovorans)来源的γ-内酰胺酶在大肠杆菌E.coli BL21中表达，但是其可溶性差，几乎以包涵体形式存在，限制了在拆分文斯内酯反应中的应用。因此，如何得到一种稳定、高效、可溶表达的γ-内酰胺酶以高效催化制备光学纯(-)γ-内酰胺成为研究的热点和难点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对已经报道的(+)γ-内酰胺酶的对底物文斯内酯的低催化活性，热稳定性差等问题，提供一种通过基因工程菌表达稳定、高效、可溶表达的γ-内酰胺酶以高效催化制备光学纯(-)γ-内酰胺的方法。

本发明首先提供了一种重组大肠杆菌，表达了来源于尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的(+)γ-内酰胺酶。

在本发明的一种实施方式中，所述(+)γ-内酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述(+)γ-内酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，以pET28a、pET32a、pET41a、pQE80L、pET20b、或pBAD为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以BL21(DE3)为宿主，以pET28a为载体，表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的(+)γ-内酰胺酶。

本发明还提供了一种制备上述重组大肠杆菌的方法，包括如下步骤：

1)采用化学合成或PCR方法克隆编码所述(+)γ-内酰胺酶的基因FoLM；

2)将步骤1)获得的FoLM基因与质粒pET28a同时用限制性核酸内切酶BamH I和XhoI双酶切，然后使用T4 DNA连接酶进行连接，获得重组表达载体pET28a-FoLM；

3)将步骤2)获得重组表达载体pET28a-FoLM转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-FoLM。

本发明还提供了一种全细胞转化制备(-)γ-内酰胺的方法，所述方法为以上述重组大肠杆菌为细胞催化剂，在含有底物文斯内酯的反应体系中反应。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌在反应体系中的细胞浓度为1～10g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应条件为：温度30～80℃，pH 6～8。

在本发明的一种实施方式中，所述底物文斯内酯的浓度为5～500mmol/L；。

本发明还提供了一种酶法制备(-)γ-内酰胺的方法，应用上述重组大肠杆菌生产(+)γ-内酰胺酶，再将生产的(+)γ-内酰胺酶用于文斯内酯的酶催化反应。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌生产的(+)γ-内酰胺酶的方法为：将重组大肠杆菌接种至培养基中培养至OD₆₀₀达0.5～0.7，添加IPTG，在16～30℃诱导培养8～24h后离心收集菌体，并细胞破碎获得(+)γ-内酰胺酶粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基是LB液体培养基。

在本发明的一种实施方式中，LB液体培养基含有：蛋白胨10～20g/L，酵母膏5～10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将上述重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中培养至OD₆₀₀达0.5～0.7，在终浓度为0.1～1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，16～30℃诱导培养8～24h后，即可高效表达本发明的重组(+)γ-内酰胺酶，离心收集菌体并细胞破碎获得(+)γ-内酰胺酶粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述的文斯内酯的浓度为5～500mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述的(+)γ-内酰胺酶的用量为1～10g/L。

在本发明的一种实施方式中，反应条件为：pH 6～8，温度为30～80℃。

有益效果

(1)本发明实现了来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的(+)γ-内酰胺酶在大肠杆菌中的可溶性表达。

(2)采用本发明提供的重组大肠杆菌，其可表达可溶性较好，Km值较低，催化效率高(转化率≥50％)、立体选择性强(e.e.>99.9％)、适用的反应条件温和、环境友好的(+)γ-内酰胺酶，并且本发明的(+)γ-内酰胺酶催化效果佳，底物亲和力较好，具有很好的应用开发前景。

附图说明

图1：基因FoLM的PCR扩增电泳图谱；M，Marker；1，基因FoLM。

图2：pET28a-FoLM重组质粒物理图谱。

图3：重组(+)γ-内酰胺酶的蛋白电泳图；M，Marker；泳道1、2分别为重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-FoLM诱导后上清、沉淀。

图4：重组(+)γ-内酰胺酶的蛋白电泳图；M，Marker；泳道1为FoLM纯酶。

图5：(+)γ-内酰胺酶的选择性分析液相检测图。

图6：(+)γ-内酰胺酶FoLM的热稳定性曲线图。

具体实施方式

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。

LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

(+)γ-内酰胺酶酶活的检测：

测定体系为：适量酶液、10mmol·L^-1文斯内酯置于反应容器中，于30℃震荡反应30min；反应结束后，取样进行液相检测。液相检测条件：色谱柱为Diamonsil Plus C18(25cm×4.6mm,5μm)，流动相为甲醇：水(20：80)，流速为0.2～1mL·min^-1,检测波长为225nm。

酶活力单位定义(U)：在30℃下，(+)γ-内酰胺酶催化水解1μmol的γ-内酰胺所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。

实施例1：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-FoLM的构建及培养

(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的(+)γ-内酰胺酶基因FoLM。

(2)重组大肠杆菌的构建：

用限制性内切酶BamH I和Xho I将质粒pET28a和FoLM于37℃水浴中过夜双酶切，次日经琼脂糖凝胶电泳纯化并利用琼脂糖回收试剂盒回收目标片段(如图1所示)。37℃下，使用T4 DNA连接酶将基因FoLM与酶切过的质粒pET28a进行连接，即得重组表达载体pET28a-FoLM(如图2所示)，将构建好的重组表达载体pET28a-FoLM热转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂布含卡那霉素抗性LB固体培养基中，过夜培养后进行菌落PCR验证，阳性克隆子即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-FoLM。

(3)重组大肠杆菌的培养：

挑取阳性克隆子于LB液体培养基中培养12h，得到种子液，将种子液按1％(v/v)的转接量转接入新鲜LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入0.2mmol·L^-1IPTG，16℃诱导培养24小时后，4℃、8000r/min离心10min收集菌体。

将收集好的菌体悬浮于磷酸钠缓冲液(100mmol·L^-1，pH 7.0)中，超声破碎，并通过SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(由图3所示)。

由图3可知，目的蛋白较大部分都在上清中，说明重组酶在大肠杆菌中能够得到可溶表达。

实施例2：重组大肠杆菌产酶及(+)γ-内酰胺酶的分离纯化

(1)将实施例1得到的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-FoLM悬浮于A液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，20mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)中，超声波破碎离心后获得粗酶液。

(2)(+)γ-内酰胺酶的纯化：

纯化所使用的柱子为亲和柱HisTrap FF crude(镍柱)，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和结合来完成。首先使用A液将镍柱平衡，将步骤(1)得到的粗酶液上样，继续使用A液将穿透峰洗脱下来，待平衡后用B液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，1000mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组(+)γ-内酰胺酶。

对纯化后的蛋白进行酶活测定(文斯内酯为底物)及SDS-PAGE分析(如图4所示)。由图4可知，镍柱纯化后，在45kDa左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。之后使用HiTrap Desalting脱盐柱(GE Healthcare)将纯化后的(+)γ-内酰胺酶置换到PBS(100mmol·L^-1，pH 7.0)缓冲液中。

实施例3：(+)γ-内酰胺酶的性质

(1)在30℃，pH 7.0的条件下，按照(+)γ-内酰胺酶酶活的检测方法，反应30min后测定(+)γ-内酰胺酶对底物文斯内酯的酶活力，酶活为：0.8U·mg^–1。

(2)配制100mmol·L^-1不同pH的缓冲液：Tris-HCl(8.0～9.0)、磷酸钠缓冲液(pH6.0～8.0)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0～6.0)。然后以外消旋γ-内酰胺为底物，测定FoLM在不同pH缓冲液的相对酶活力，具体如表1所示。FoLM的最适反应pH为7.0～8.0，酶活力为0.7～0.8U·mg^–1。

表1 FoLM在不同pH缓冲液的相对酶活力

(3)以外消旋γ-内酰胺为底物，分别测定FoLM在不同温度(20～80℃)下的酶活，测得的最高酶活定义为100％，其他温度下测得的酶活按照相对于最高酶活的百分比计算，具体如表2所示。结果显示FoLM的最适反应温度为60～70℃，为2.7～2.8U·mg^–1。

表2 FoLM在不同温度下的相对酶活力

(4)以外消旋γ-内酰胺为底物，分别测定FoLM在不同温度(50、70、90℃)下保温不同时间后的酶活，同一温度下，保温0h测得的最高酶活定义为100％，其他时间测得的酶活按照相对于最高酶活的百分比计算。结果显示FoLM在50、70、90℃下的半衰期分别为32、17、4h。如图6，FoLM在50℃下保温60h后仍有接近30％的残余活力。

(5)测定FoLM对底物外消旋γ-内酰胺的动力学参数。酶活测定体系列举如下：磷酸钠缓冲液(100mmol·L^-1，pH 7.0)，外消旋γ-内酰胺(0～100mmol·L^-1)。通过计算比酶活来表征反应速率，从而计算动力学参数。测定的FoLM对底物外消旋γ-内酰胺的动力学参数分别为K_m为37.6mmol·L^-1，V_max为4.4μmol·min^–1·mg^–1。

(6)底物谱分析

测定(+)γ-内酰胺酶(FoLM)催化不同的底物的酶活力，以文斯内酯为底物测得的酶活为100％对照，其他底物测得的酶活力以二者的百分比计算。测定结果如表3所示。

表3 FoLM的底物谱

表3显示，FoLM能够催化辛内酰胺，其相对活力只有γ-内酰胺的7％，对底物庚内酰胺，己内酰胺，月桂精内酰胺，丁酰胺，戊酰胺的活力非常低。

(7)立体选择性分析

测定FoLM催化底物外消旋γ-内酰胺的选择性。反应体系(10mL)为：适量纯化的酶液、10mmol·L^-1外消旋γ-内酰胺。于30℃震荡反应24h。反应结束后，取样进行液相检测。检测条件：Daicel Chiralpack AS-H色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为230nm，流动相为乙腈：异丙醇(80：20)，流速为0.2～1mL/min。由图5可知，该酶具有非常好的立体选择性，优先水解(+)γ-内酰胺，e.e.值可达99.9％。

实施例4：(+)γ-内酰胺酶应用于文斯内酯的不对称拆分制备(-)γ-内酰胺

取5～10g所得的表达重组(+)γ-内酰胺酶细胞于磷酸盐缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，加入100～500mmol·L^-1文斯内酯(表4)，反应液总体积为10mL。将反应置于50～70℃下，取样检测转化过程，条件如下：Daicel Chiralpack AS-H色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为230nm，流动相为乙腈：异丙醇(80：20)，流速为0.2～1mL/min。

表4 FoLM全细胞催化应用于文斯内酯不对称拆分制备(-)γ-内酰胺

结果显示，反应周期：14h，单位质量催化剂催化转化底物的量：5.4g/g。

10g/L FoLM全细胞可催化500mmol/L文斯内酯在14h内完成拆分，底物与催化剂用量比(S/C)为5.4，高于已报导的大肠杆菌RutB(S/C,0.872)(参见Zhu et al.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2014,24(20):4899-4902.)，以及重组E.coli rosetta(DE3)/pDxcc-est-gla(S/C,2.5)(参见Wang et al.Applied Microbiology andBiotechnology,2014,98(16):6991-7001.)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种(-)γ-内酰胺的制备方法

<130> BAA201259A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcctggca agatccgtac agctcaatcc gtgtcctttg acaaacccgc ctctgaacaa 60

ccccatctcc acaatagatg gcatccagat gttccgagta ttgcaaccgt tgaacctggt 120

gagacagtca agatagagtg tctcgactgg acaggcggtc aaatcggcaa caatgacagc 180

gcagatgatg ttcgcgatgt tgacctgaca aagatccact atcttaccgg cccattcgac 240

atcaaaggca gtcagcccgg cgatctactc gtcgtcaaca taaccgacgt ccaacccttt 300

gagcattcac cctggggttt cacaggaatc ttcgccaagg acaacggcgg gggcttccta 360

gatgaacact accccaccgc cgcaaaagca atctgggact ttgacggcgt atactgttca 420

agccgtcata ttcccggagt gcgattcccc ggcttaatcc accccggaat tctaggctgt 480

gccccatctg ccgagattct cgcagagtgg aaccgtcgag aggcagagct cgtttcttca 540

atggctgatt ctaccaagat tgtagctcaa ccaccgaatg agatcaatgc acatggtgga 600

aaagccacag gcgatgtttt ggcaaagatt gcgagggagg gagcgaggac tatacctgga 660

cgaccagaac acggaggaaa ttgtgatata aacaatattt ctcgcggatc tacgacgtat 720

cttcccgttc atgttgaggg agccaagttt tctgttggag atctccattt tagtcagggt 780

gatggtgaaa tcagcttctg tggtgccatt gaaatggctg gcatcattac gatcaagttt 840

gatctcatca agggcggcat gaaatcgcgt ggcctcaaga gcccagtgta cagaccaggt 900

gacatgggcc ctacctttag tccctcacgc tacctaatct ttgaaggctt ctccgtcgac 960

gagaatggaa agcagcattt catggatgca accgttgctt atagacaatc atgtctccgc 1020

gcaatcgaat acctcaaaca attcggctac tctggagaac aaatctacct cttactctcc 1080

tgcgcaccca ttcgcggcgc catcgcagga atagtcgaca ttcccaacgc ctgcacaact 1140

ctcggcatac cgatggacat tttcgacttt gacatttcta ttgaaagcga gcctgttgct 1200

cgagatctgg gtgcttgtcc tgtatctaaa tag 1233

<210> 2

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Pro Gly Lys Ile Arg Thr Ala Gln Ser Val Ser Phe Asp Lys Pro

1 5 10 15

Ala Ser Glu Gln Pro His Leu His Asn Arg Trp His Pro Asp Val Pro

20 25 30

Ser Ile Ala Thr Val Glu Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Glu Cys Leu

35 40 45

Asp Trp Thr Gly Gly Gln Ile Gly Asn Asn Asp Ser Ala Asp Asp Val

50 55 60

Arg Asp Val Asp Leu Thr Lys Ile His Tyr Leu Thr Gly Pro Phe Asp

65 70 75 80

Ile Lys Gly Ser Gln Pro Gly Asp Leu Leu Val Val Asn Ile Thr Asp

85 90 95

Val Gln Pro Phe Glu His Ser Pro Trp Gly Phe Thr Gly Ile Phe Ala

100 105 110

Lys Asp Asn Gly Gly Gly Phe Leu Asp Glu His Tyr Pro Thr Ala Ala

115 120 125

Lys Ala Ile Trp Asp Phe Asp Gly Val Tyr Cys Ser Ser Arg His Ile

130 135 140

Pro Gly Val Arg Phe Pro Gly Leu Ile His Pro Gly Ile Leu Gly Cys

145 150 155 160

Ala Pro Ser Ala Glu Ile Leu Ala Glu Trp Asn Arg Arg Glu Ala Glu

165 170 175

Leu Val Ser Ser Met Ala Asp Ser Thr Lys Ile Val Ala Gln Pro Pro

180 185 190

Asn Glu Ile Asn Ala His Gly Gly Lys Ala Thr Gly Asp Val Leu Ala

195 200 205

Lys Ile Ala Arg Glu Gly Ala Arg Thr Ile Pro Gly Arg Pro Glu His

210 215 220

Gly Gly Asn Cys Asp Ile Asn Asn Ile Ser Arg Gly Ser Thr Thr Tyr

225 230 235 240

Leu Pro Val His Val Glu Gly Ala Lys Phe Ser Val Gly Asp Leu His

245 250 255

Phe Ser Gln Gly Asp Gly Glu Ile Ser Phe Cys Gly Ala Ile Glu Met

260 265 270

Ala Gly Ile Ile Thr Ile Lys Phe Asp Leu Ile Lys Gly Gly Met Lys

275 280 285

Ser Arg Gly Leu Lys Ser Pro Val Tyr Arg Pro Gly Asp Met Gly Pro

290 295 300

Thr Phe Ser Pro Ser Arg Tyr Leu Ile Phe Glu Gly Phe Ser Val Asp

305 310 315 320

Glu Asn Gly Lys Gln His Phe Met Asp Ala Thr Val Ala Tyr Arg Gln

325 330 335

Ser Cys Leu Arg Ala Ile Glu Tyr Leu Lys Gln Phe Gly Tyr Ser Gly

340 345 350

Glu Gln Ile Tyr Leu Leu Leu Ser Cys Ala Pro Ile Arg Gly Ala Ile

355 360 365

Ala Gly Ile Val Asp Ile Pro Asn Ala Cys Thr Thr Leu Gly Ile Pro

370 375 380

Met Asp Ile Phe Asp Phe Asp Ile Ser Ile Glu Ser Glu Pro Val Ala

385 390 395 400

Arg Asp Leu Gly Ala Cys Pro Val Ser Lys

405 410

Claims

1.一种全细胞转化制备(-)γ-内酰胺的方法，其特征在于，以重组大肠杆菌为细胞催化剂，在含有底物文斯内酯的反应体系中反应，所述重组大肠杆菌表达了来源于尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的(+)γ-内酰胺酶，所述(+)γ-内酰胺酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌以pET28a、pET32a、pET41a、pQE80L、pET20b、或pBAD为表达载体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述(+)γ-内酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌在反应体系中的细胞浓度为1~10g/L。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述文斯内酯的浓度为5~500mmol/L。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，反应条件为：温度30~80℃，pH 6~8。

7.一种酶法制备(-)γ-内酰胺的方法，其特征在于，应用重组大肠杆菌生产(+)γ-内酰胺酶，再将生产的(+)γ-内酰胺酶用于文斯内酯的酶催化反应，所述重组大肠杆菌表达了来源于尖孢镰刀菌的(+)γ-内酰胺酶，所述(+)γ-内酰胺酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将重组大肠杆菌接种至培养基中培养至OD₆₀₀达0.5~0.7，添加IPTG ，在16~30℃诱导培养8~24 h后离心收集菌体，并细胞破碎获得(+)γ-内酰胺酶粗酶液。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述的文斯内酯的浓度为5 ~500 mmol/L。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的(+)γ-内酰胺酶的用量为1~10 g/L。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，反应条件为：pH 6~8，温度为30~80℃。