CN107602707B - 一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9-ω融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9‑ω融合蛋白及其应用。dcas9‑ω融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，该融合蛋白可被引导至特定靶向位点并与其结合，RNA聚合酶ω亚基在此位点招募RNA聚合酶其他亚基组装成RNA聚合酶，促进下游基因转录，从而提高靶基因的表达量，即融合蛋白dcas9‑ω保留dcas9的DNA结合能力与RNA聚合酶亚基的转录激活能力，从而特异性提高靶基因表达。

Description

一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9-ω融合 蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一种表达dcas9与RNA聚合酶亚基的融合蛋白dcas9-ω，尤其涉及一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9-ω融合蛋白及其应用。

背景技术

大肠杆菌表达***是目前最常用的原核表达***，然而，该表达***仍存在一定的缺陷，比如外源蛋白容易形成包涵体，产内毒素等。近年来，枯草杆菌表达***被越来越多的研究者用来表达目的蛋白。枯草芽孢杆菌具有很强的分泌能力，能将外源蛋白直接分泌到培养基中，不仅有效避免蛋白形成包涵体，且能够极大简化后续纯化步骤，降低生产成本。枯草芽孢杆菌不产脂多糖等内毒素，属于GRAS菌株，可用于生产食品、医药等相关蛋白及代谢产物。此外，目前已有很成熟的枯草芽孢杆菌遗传操作手段和大规模发酵技术。经过很多年的努力，许多原核和真核基因都已经在芽孢杆菌表达***中得以克隆和表达，其中有的已应用于工业生产。然而，以枯草芽孢杆菌作为表达宿主表达的蛋白主要来源于芽孢属近缘种，其表达非芽孢属来源的蛋白表达能力较差，因此，如何提高外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达量，是进一步开发枯草芽孢杆菌作为细胞工厂，拓展枯草芽孢杆菌应用范围的关键问题。

目前，已有多种策略用于提高外源蛋白的表达量，包括基因水平、转录水平、翻译水平及翻译后修饰方面等都可作为改造的靶点，如提高基因拷贝数、核糖体工程、密码子优化等方法。对于原核生物来说，在转录水平方面提高目的基因的转录本量以提高其表达量，这是最简单、有效的方式，比如通过启动子工程等方式筛选高效启动子，用于提高目的基因表达量。目前已有在大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等构建启动子文库筛选高效启动子的报告。本发明人前期研究中在枯草芽孢杆菌中构建了以GFP为报告基因的启动子文库。然而，我们将筛选到的启动子用于表达我们的目的基因时，基因的表达量很低，且表达量与启动子强度不成比例，暗示启动子具有一定的基因特异性，即以A基因作为报告基因筛选到的强启动子用于表达B基因时，往往很难保证高效的表达量。因此，建立一种适用性更广的提高基因转录的方法尤为重要。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的技术目的在于建立一种适用性更广的提高枯草芽孢杆菌外源基因转录表达的方法，基于该技术目的，本发明提供了一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9-ω融合蛋白及其应用。

为了实现本发明的目的，发明人选择革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌为研究对象，通过融合表达RNA聚合酶和dcas9蛋白，首次在革兰氏阳性菌中建立了CRISPRa***，并实现了对外源基因的特异性表达。

具体地，dcas9是一种缺失核酸内切酶活性的cas9突变体(dead cas9)，但仍保留识别向导RNA并与向导RNA靶向DNA双链结合的能力。枯草芽孢杆菌RNA聚合酶由五个亚基组成，全酶为α2ββ’σω，具有识别启动子序列，并起始和延伸DNA转录的功能。本发明将dCas9与枯草芽孢杆菌RNA聚合酶ω亚基融合表达，通过设计靶向枯草芽孢杆菌细胞中靶基因启动子上游不同区域的向导RNA，融合蛋白dCas9-ω被引导至特定靶向位点并与其结合，RNA聚合酶ω亚基在此位点招募RNA聚合酶其他亚基组装成RNA聚合酶，促进下游基因转录，从而提高靶基因的表达量，即融合蛋白dcas9-ω保留dcas9的DNA结合能力与RNA聚合酶亚基的转录激活能力，从而实现特异性提高靶基因表达。

进一步地，本发明的技术方案概况如下：一种dcas9-ω融合蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

另一方面，本发明还可以提供编码上述dcas9-ω融合蛋白的DNA片段。在本发明的一个最优选的实施例中，上述的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

另一方面，本发明还可以提供含有上述核苷酸序列的重组表达载体。

另一方面，本发明还可以提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含有上述的重组表达载体。进一步优选地，本发明所述遗传工程化的宿主细胞，其还含有靶向靶基因的载体，该载体含有P-RS-sgRNA元件，其中P为sgRNA的转录启动子，RS为IIs型限制性酶切位点，sgRNA为不含向导RNA的sgRNA骨架，该骨架能连接向导RNA靶向序列。再进一步优选地，所述的P-RS-sgRNA元件为P242-BsmBI-BsmBI-sgRNA，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所示。在本发明的一个最优选的实施例中，上述遗传工程化的宿主细胞，其含有的靶向靶基因的载体中，在转录启动子与sgRNA骨架中间含有两个酶切位点，用于酶连向导RNA靶向序列。

由于本发明人首次在革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌中建立了CRISPRa***，并实现了对外源基因的特异性表达，因此所述的宿主细胞优选为枯草芽孢杆菌。

另一方面，本发明还可以提供上述的dcas9-ω融合蛋白在提高枯草芽孢杆菌中外源蛋白表达量中的应用。

另外，本发明还提供了一种基于融合表达dcas9与RNA聚合酶亚基特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的方法，该方法包括如下步骤：

1)构建pDGT-P43-GFP载体，该载体将T1-P43-GFP-T1T2表达单元整合到枯草芽孢杆菌amyE位点；其中，P43为启动子，GFP为报告基因，整合位点为枯草芽孢杆菌淀粉酶基因AmyE，但并不限于上述表达元件、报告基因和整合位点，比如启动子可以为P242等其它合适的启动子；pDGT-P43-GFP构建流程具体参见专利CN105296486A，T1-P43-GFP-T1T2表达单元序列见SEQ ID NO.4；

2)将步骤1)得到的载体转化枯草芽孢杆菌SCK6，得到重组菌株SG；

3)构建pHT01-dcas9-ω载体，该载体用于表达dcas9-ω融合蛋白；

4)将步骤3)得到的重组载体pHT01-dcas9-ω转化SG，得到菌株SG/pHT01-dcas9-ω；

5)构建pHY-P242-BsmBI-BsmBI-sgRNA载体，该载体用于连接向导RNA靶向序列；

6)构建向导RNA靶向载体：pHY-P242-sgR1，pHY-P242-sgR2，pHY-P242-sgR3,pHY-P242-sgR4,pHY-P242-sgR5，这些载体分别靶向P242-GFP表达单元上游不同位点，将上述载体分别命名为sgR1，sgR2，sgR3，sgR4，sgR5；

7)将步骤6得到的重组载体分别转化SG/pHT01-dcas9-ω，得到菌株SG/pHT01-dcas9-ω/sgR1，SG/pHT01-dcas9-ω/sgR2，SG/pHT01-dcas9-ω/sgR3，SG/pHT01-dcas9-ω/sgR4，SG/pHT01-dcas9-ω/sgR5；

8)培养步骤7)得到的重组菌株，添加IPTG诱导dcas9-ω融合蛋白表达。

进一步优选地，如上所述基于融合表达dcas9与RNA聚合酶亚基特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的方法，其中步骤5)构建的载体的流程为，先人工合成P242-BsmBI-BsmBI-sgRNA(SEQ ID NO.3)，将其克隆至载体pHY300PLK载体，得到载体pHY-P242-BsmBI-BsmBI-sgRNA。其中，P242为sgRNA的转录启动子，sgRNA为不含20bp靶向序列的sgRNA骨架，BsmBI为IIs型限制性酶切位点，在P242与sgRNA骨架中间含有两个BsmBI酶切位点。

进一步优选地，如上所述基于融合表达dcas9与RNA聚合酶亚基特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的方法，其中步骤6)构建的向导RNA靶向载体的流程为，先根据靶向序列设计一对互补的引物，两条引物混合退火后，获得具有粘性末端的DNA双链片段，将其酶连至BsmBI酶切后的pHY-P242-BsmBI-BsmBI-sgRNA载体上。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和显著进步：本发明显著提高了外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达量。通过具体实施例可以看出，本发明以整合到枯草芽孢杆菌基因组上的P43-GFP表达单元作为报告***，通过设计靶向启动子P43上游不同位点的向导RNA，成功实现特异性提高GFP的转录和表达，其中，GFP表达量(相对荧光强度)最高提高了1.5倍，在转录水平上最高提高2.3倍。

附图说明

图1：五种sgRNA靶向的位置；

图2：pHT01-dcas9-ω载体图谱；

图3：pHY-P242-BsmBI-BsmBI-sgRNA载体图谱；

图4：靶向不同位点sgRNA引起GFP表达分析图；

图5：靶向不同位点sgRNA导致GFP转录水平变化分析图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例一：

构建一种融合表达dcas9与RNA聚合酶ω亚基的载体pHT01-dcas9-ω，它可以表达出dcas9-ω融合蛋白。具体地，先构建出表达dcas9的载体pHT01-dcas9，再扩增RNA聚合酶ω亚基基因，酶切之后与同样酶切后的载体pHT01-dcas9酶连，得到载体pHT01-dcas9-ω。

步骤1，构建pHT01-dcas9-ω载体，该载体用于表达dcas9-ω蛋白，载体图谱参见图2。

1)针对dcas9基因的扩增模板为pET-dcas9-VP64-6xHis设计引物，用

DNA Polymerase进行PCR，将dcas9基因克隆至pHT01载体得到pHT01-dcas9。扩增dcas9的引物为：

dcas9-F：CGCGGATCCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCA

dcas9-R：gctctagaTCCTGATGAGCCTGAGCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTC

PCR反应体系：2×PrimeSTAR Mix，25μl；正向引物(10mM)，2.5μl；反向引物(10mM)，2.5μl；模板，0.5μl；加ddH₂O至50μl。扩增条件为：98℃，10s；55℃，5s；72℃，20s；28x；72℃，5min；4℃，∞。

2)将dcas9基因片段和pHT01载体用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切。酶切体系为：Xba Ⅰ，0.5μl；BamH Ⅰ，1.5μl；10×buffer，5μl；PCR回收产物，30μl。37℃处理2h后，用1％的琼脂糖凝胶回收。

3)将2)中处理过的dcas9基因和pHT01载体用T4连接酶进行酶连，酶连体系为：10×T4DNA ligase buffer，1μl；T4DNA ligase，0.5μl；酶切片段与酶切载体摩尔比1:3；加ddH₂O至10μl，25℃反应2h。

4)将3)的酶连产物转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR验证阳性克隆，测序验证后，得到重组载体pHT01-dcas9。

步骤2，构建pHT01-dcas9-ω，该载体用于表达dcas9-ω融合蛋白。

5)以枯草芽孢杆菌SCK6的基因组为模板，扩增RNA聚合酶ω亚基，PCR产物琼脂糖凝胶回收。ω亚基的引物为：

ω-F：GCTCTAGAATGTTAGATCCGTCAATTGATTCTTTAATGAA

ω-R：TCCCCCCGGGCTATTCGCGGTCTTCCTTTTCAAACG

PCR反应体系：10×Pfu buffer，5μl；dNTP(2.5mM)，2μl；正向引物(10μM)，2μl；反向引物(10μM)，2μl；Pfu聚合酶，2μl；模板，1μl；加ddH₂O至50μl。扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，30个循环；72℃，5min；4℃，∞。

6)将5)得到的片段和步骤1得到的载体pHT01-dcas9用Xba Ⅰ/Xma Ⅰ酶切，酶切体系为：Xba Ⅰ，0.5μl；Xma Ⅰ，1.5μl；10×buffer，5μl；PCR回收产物，30μl。37℃处理2h后，用1％的琼脂糖凝胶回收。

7)将酶切后的载体和片段使用T4连接酶酶连，酶连体系如3)，酶连产物转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR验证阳性克隆，测序验证后，得到重组载体pHT01-dcas9-ω。

所述重组载体pHT01-dcas9-ω诱导型表达载体，是通过IPTG诱导dcas9-ω的表达。

实施例二：

构建能够表达出sgRNA的载体pHY-P242-BsmBI-BsmBI-sgRNA，载体图谱参见图3。

1)人工合成(上海生工生物工程股份有限公司)基因序列P242-BsmBI-BsmBI-sgRNA，该基因序列包括P242启动子，两个BsmB Ⅰ酶切位点和sgRNA骨架(SEQ ID NO.3所示)。

2)对合成的基因序列和pHY300PLK载体用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ进行酶切处理，酶切体系为：EcoR Ⅰ，0.5μl；Hind Ⅲ，1.5μl；10×buffer，5μl；合成序列，30μl。37℃处理2h后，用1％的琼脂糖凝胶回收获得酶切产物。

3)将酶切后的载体和片段酶连，酶连体系为：酶切载体与酶切片段的摩尔比为1:3；10×T4DNA ligase buffer，1μl；T4DNA ligase，0.5μl；加ddH₂O至10μl，25℃反应2h。

4)酶连产物转化大肠杆菌DH5α菌株，转化子将菌落PCR、测序验证后，得到重组载体pHY-P242-BsmBI-BsmBI-sgRNA。该载体的启动子为组成型启动子，不需要诱导剂即可转录下游基因，由于启动子P242后面没有核糖体结合位点(RBS序列)，因此，该载体仅能将启动子P242下游的基因转录为RNA，但不能将其翻译为多肽，从而得到sgRNA序列。

5)设计靶向特定位点的向导RNA序列，根据向导RNA序列合成两条互补的引物，将两条引物退火，同时使用BsmB I酶切载体pHY-P242-BsmB I-BsmBI-sgRNA。退火条件为：95℃，5min；95℃，-1℃/循环，40个循环；55℃，30min；55℃，-1℃/循环，30个循环；4℃，∞。酶切体系为：BsmB Ⅰ，0.5μl；10×buffer，5μl；pHY-P242-BsmB I-BsmBI-sgRNA质粒，30μl，加ddH₂O至50μl。55℃处理2h后，用1％的琼脂糖凝胶回收获得酶切载体。

6)将退火后的引物与酶切后的pHY-P242-BsmBI-BsmBI-sgRNA质粒酶连，构建靶向载体：pHY-P242-sgR1，pHY-P242-sgR2，pHY-P242-sgR3，pHY-P242-sgR4，pHY-P242-sgR5，这些载体分别靶向P43-GFP表达单元上游不同位点，将上述载体分别命名为sgR1，sgR2，sgR3，sgR4，sgR5。酶连体系为：退火片段(50mM)，1μl；酶切载体，1μl；10×T4DNA ligase buffer，1μl；T4DNA ligase，0.5μl；加ddH₂O至10μl，25℃反应2h。

上述靶向GFP启动子不同位置的sgRNA，其靶向序列分别为(参见图1)：

sgR1：GATGGCCTTTTACGCGTCGA，距离GFP的转录起始位点(TSS)267bp；

sgR2：TAAGCAGAAGGCCATCCTGA，距离GFP的转录起始位点(TSS)283bp；

sgR 3：CGGTGAACGCTCTCCTGAGT，距离GFP的转录起始位点(TSS)323bp；

sgR 4：TCGTTTTATCTGTTGTTTGT，距离GFP的转录起始位点(TSS)343bp；

sgR 5：ACTGGTCTGATCGGATCTTC，距离GFP的转录起始位点(TSS)410bp。

实施例三：

将pHT01-dcas9-ω和sgRs(包括sgR1，sgR2，sgR3，sgR4，sgR5)分别转化枯草芽孢杆菌SG。

1)制备枯草芽孢杆菌感受态，具体步骤如下：SG在YN培养基(营养肉汤18g/L,酵母提取物8g/L)中过夜培养，过夜培养物转移至新鲜YN培养基，使OD₆₀₀等于1，用1.5％的木糖诱导2h，得到感受态细胞。

2)将pHT01-dcas9-ω转化SG感受态细胞，涂布于含有氯霉素的LB培养基，得到SG/pHT01-dcas9-ω。按照1)制备SG/pHT01-dcas9-ω感受态细胞，分别转化质粒sgRs，涂布于含有氯霉素和四环素的LB培养基中，得到菌株SG/pHT01-dcas9-ω/sgRs。

实施例四：

分析不同靶向sgRNA对靶向基因GFP表达量的影响，结果参见图4。

1)将含有sgR1/pHT01-dcas9-ω，sgR2/pHT01-dcas9-ω，sgR3/pHT01-dcas9-ω，sgR4/pHT01-dcas9-ω，sgR5/pHT01-dcas9-ω载体的枯草芽孢杆菌SG接种于氯霉素抗性和四环素抗性的3ml LB液体培养基中，37℃过夜培养。

2)取200μl过夜培养物转接到3ml新鲜的含有氯霉素和四环素抗性的LB培养基，添加0.5mM IPTG诱导dcas9-ω的表达，再培养10小时。

3)分别取100μl菌液与100μl水在96孔黑壁透明底荧光板中混合，分别测定菌体密度(OD₆₀₀)和荧光强度(488nm/511nm)，将荧光强度除以菌体密度得到相对荧光强度。

从图4可知，当sgRNA靶向目的基因(GFP)的启动子(P43)的上游时，如sgR1，sgR2，sgR3，sgR4，sgR5，dcas9-ω融合蛋白能促进GFP的表达。GFP表达量(相对荧光强度)最高提高了1.5倍。

实施例五：

分析不同靶向sgRNA对靶向基因GFP转录水平的影响，参见图5。

1)采用含有氯霉素和四环素抗性的3ml LB培养基于37℃培养含有促进GFP表达的sgRs(sgR1，sgR2，sgR3，sgR4，sgR5)载体的菌株，过夜培养以后取200μl过夜培养物转接到3ml新鲜的含有氯霉素和四环素抗性的LB培养基，添加IPTG诱导dcas9-ω的表达，再培养10小时，收集菌体。

2)抽提RNA具体步骤参照试剂盒：Bacterial RNA Kit(Omega公司)。

3)对样品进行DNA酶处理具体步骤为：在无RNA酶的EP管中加入RNA 3μl，10xReaction buffer with MgCl₂ 10μl，DNaseⅠ(RNase-free)1μl，加水至10μl。在37℃孵育1h，再加入50mM EDTA 1μl，在65℃孵育10min。

4)反转录具体操作参见试剂盒：RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher公司)

5)荧光定量PCR具体步骤参照试剂盒：iTaq Universal SYBR Green Supermix(Axygen公司)

内参基因为：rpsj

引物为：RPSJ-F：GATGGAAGCGTTCAACTAGCAGAC

RPSJ-R：GCAGATTGTGTGGACAGGTAATGG

反应条件为：95℃，3min；95℃，10s；55℃，30s；进行39个循环；95℃，10s；65℃，5s，95℃，0.5℃/s。

目的基因：GFP

引物为：GFP-F：ACAAATACAAAGATTCTCGTGAGC

GFP-R：CTAATCGCATAAGAGCATCAACAG

反应条件为：95℃，3min；95℃，10s；55℃，30s；进行39个循环；95℃，10s；65℃，5s，95℃，0.5℃/s。

如图5所示，相对荧光定量分析表明，GFP表达量提高的菌株中，GFP的转录水平也是相应提高的，在转录水平上最高提高2.3倍，说明dcas9-ω确实是在转录水平提高了GFP的表达量，符合本发明的原理。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9-ω融合蛋白及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1441

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser

1025 1030 1035 1040

Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu

1045 1050 1055

Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile

1060 1065 1070

Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser

1075 1080 1085

Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly

1090 1095 1100

Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile

1105 1110 1115 1120

Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser

1125 1130 1135

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1140 1145 1150

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile

1155 1160 1165

Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala

1170 1175 1180

Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys

1185 1190 1195 1200

Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser

1205 1210 1215

Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1220 1225 1230

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val

1265 1270 1275 1280

Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys

1285 1290 1295

His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu

1300 1305 1310

Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp

1315 1320 1325

Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

1330 1335 1340

Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile

1345 1350 1355 1360

Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Gly Ser Ala Ala Ser Arg Met Leu

1365 1370 1375

Asp Pro Ser Ile Asp Ser Leu Met Asn Lys Leu Asp Ser Lys Tyr Thr

1380 1385 1390

Leu Val Thr Val Ser Ala Arg Arg Ala Arg Glu Met Gln Ile Lys Lys

1395 1400 1405

Asp Gln Met Ile Glu His Thr Ile Ser His Lys Tyr Val Gly Lys Ala

1410 1415 1420

Leu Glu Glu Ile Asp Ala Gly Leu Leu Ser Phe Glu Lys Glu Asp Arg

1425 1430 1435 1440

Glu

<210> 2

<211> 4326

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atggataaga aatactcaat aggcttagct atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60

atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120

cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180

gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240

tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300

cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360

aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420

aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480

atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540

gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600

attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660

cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720

ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780

gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840

caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900

ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960

atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020

caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080

ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140

gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200

aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260

gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320

gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380

cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440

gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500

aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560

tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620

tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680

gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740

tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800

attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860

ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920

cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980

cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040

gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100

agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160

catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220

gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280

attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340

atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400

gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460

gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatgcc 2520

attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580

gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640

aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700

acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760

ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820

actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880

aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940

taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000

tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060

atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120

aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180

cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240

gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300

cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360

gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420

tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480

aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540

tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600

tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660

caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720

cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780

cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840

attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900

ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960

cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020

gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080

gatttgagtc agctaggagg tgacggttct gcagcttcta gaatgttaga tccgtcaatt 4140

gattctttaa tgaataaatt agattcaaaa tatacgctgg tgactgtttc tgcgagacgt 4200

gcccgtgaaa tgcaaatcaa aaaagaccaa atgattgaac atacgatttc acacaaatat 4260

gtaggcaaag ctttagaaga aattgatgca ggcctgcttt cgtttgaaaa ggaagaccgc 4320

gaatag 4326

<210> 3

<211> 404

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

aagcttgctc tagatatttt tttgccaaag ctgtaattga ggaatcatag aatttttaat 60

ttaaatttta tttgaatctt tacaatccta ttgatataat aaatgtagtg aggtggagga 120

gacgcgcgtc tccgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 180

aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttcttca gcacaattcc aagaaaaaca 240

cgatttagaa cctaaaaaga acgaatttga actaactcat aaccgagagg taaaaaaaga 300

acgaagtcga gatcagggaa tgagtttata aaataaaaaa agcacctgaa aaggtgtctt 360

tttttgatgg ttttgaactt ggactagtcc gggatcccga attc 404

<210> 4

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ggaaccacaa attaaaactg gtctgatcgg atcttcaggc atcaaataaa acgaaaggct 60

cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 120

aggacaaatc cgccgctcta gctaagcaga aggccatcct gacggatggc cttttacgcg 180

tcgacgggat cctgataggt ggtatgtttt cgcttgaact tttaaataca gccattgaac 240

atacggttga tttaataact gacaaacatc accctcttgc taaagcggcc aaggacgctg 300

ccgccggggc tgtttgcgtt tttgccgtga tttcgtgtat cattggttta cttatttttt 360

tgccaaagct gtaatggctg aaaattctta catttatttt acatttttag aaatgggcgt 420

gaaaaaaagc gcgcgattat gtaaaatata aagtgatagc ggtaccatta tagaaaggag 480

gtgataaaaa tgcgtaaagg agaagaactt ttcactggag ttgtcccaat tcttgttgaa 540

ttagatggtg atgttaatgg gcacaaattt tctgtcagtg gagagggtga aggtgatgca 600

acatacggaa aacttaccct taaatttatt tgcactactg gaaaactacc tgttccatgg 660

ccaacacttg tcactacttt cgggtatggt gttcaatgct ttgcgagata cccagatcat 720

atgaaacggc atgacttttt caagagtgcc atgcccgaag gttatgtaca ggaaagaact 780

atatttttca aagatgacgg gaactacaag acacgtgctg aagtcaagtt tgaaggtgat 840

acccttgtta atagaatcga gttaaaaggt attgatttta aagaagatgg aaacattctt 900

ggacacaaat tggaatacaa ctataactca cacaatgtat acatcatggc agacaaacaa 960

aagaatggaa tcaaagttaa cttcaaaatt agacacaaca ttgaagatgg aagcgttcaa 1020

ctagcagacc attatcaaca aaatactcca attggcgatg gccctgtcct tttaccagac 1080

aaccattacc tgtccacaca atctgccctt tcgaaagatc ccaacgaaaa gagagaccac 1140

atggtccttc ttgagtttgt aacagctgct gggattacac atggcatgga tgaactatac 1200

aaataaaagc ttgggcttaa ttaattaaga ctcctgttga tagatccagt aatgacctca 1260

gaactccatc tggatttgtt cagaacgctc ggttgccgcc gggcgttttt tattggtgag 1320

aat 1323

Claims (5)

1.一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9-ω融合蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述dcas9-ω融合蛋白的DNA片段。

3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求3所述核苷酸序列的重组表达载体。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的重组表达载体，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌。

Images