JP5361484B2

JP5361484B2 - プラスミドベクター

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Publication number: JP5361484B2
Application number: JP2009071513A
Authority: JP
Inventors: 靖瀧村; 啓文伊澤; 伸行住友
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2008-03-25
Filing date: 2009-03-24
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2029-03-24
Also published as: US20110021751A1; CN101978056B; WO2009119876A1; EP2257623A1; US8389685B2; DK2257623T3; JP2009254361A; CN101978056A; ATE540113T1; EP2257623B1

Description

本発明は、異種タンパク質生産に有用な複製タンパク質遺伝子を有するプラスミドベクターに関する。

近年、遺伝子工学の研究が盛んに行われてきており、遺伝子組換え体微生物を用いて、有用タンパクを大量に生産させる技術が多数報告されている。タンパク質の高生産に関する技術の一つに、高生産プラスミドベクターの開発が挙げられ、例えばアミラーゼ、プロテアーゼやレバンシュクラーゼ等の菌体外酵素の生産に関与する遺伝子の各種プロモーター領域及びこれらのタンパク質の菌体外への分泌に関するシグナルペプチドをコードする領域を組み込んだ発現・分泌ベクター（特許文献１、特許文献２）、プラスミドの複製数を増加させるように、複製領域を変異させたベクター（特許文献３、特許文献４）等が報告されている。

しかしながら、一般的に用いられている宿主ベクター系によるタンパク質生産に於いては、その生産量が未だ十分とはいえず、また高生産されうるタンパク質の種類も限られたものとなっている。

特開平１−２７３５９１号公報特開２０００−２８７６８７号公報特開平６−３２７４８０号公報特開２００３−９８６３号公報

本発明は、産業上有益な、有用タンパク質の大量生産を目的とした高生産プラスミドベクター、及び該プラスミドベクターを用いた形質転換体を提供することに関する。

本発明者らは、プラスミドの改変によるタンパク質の大量生産について検討したところ、プラスミドの複製開始領域（Ｒｅｐ）として一般的にも広く用いられている、ｐＡＭα１由来の複製タンパク質に特定の変異を導入することにより、同プラスミド上に組み込んだ目的タンパク質の構造遺伝子部分より産生される当該タンパク質の菌体外への分泌量が増大され、当該プラスミドがタンパク質の大量生産に有用であることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）〜１１）に係るものである。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位から選ばれる1以上のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ
（ｂ）位置：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ
（ｃ）位置：Ａｓｎ
（ｄ）位置：Ｇｌｕ
に置換してなるプラスミド複製タンパク質をコードするＤＮＡを有するプラスミドベクター。
２）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位の各位置に相当する位置から選ばれる1以上のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ
（ｂ）位置：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ
（ｃ）位置：Ａｓｎ
（ｄ）位置：Ｇｌｕ
に置換してなるプラスミド複製タンパク質をコードするＤＮＡを有するプラスミドベクター。
３）さらにバチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナル領域に由来する塩基配列を含む上記１）又は２）のプラスミドベクター。
４）前記バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナル領域に由来する塩基配列が、配列番号１３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号１４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、あるいは当該塩基配列のいずれかと７０%以上の同一性を有するか又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列である、３）記載のプラスミドベクター。
５）上記４）のプラスミドベクターを含有する形質転換体。
６）宿主が微生物である上記５）の形質転換体。
７）以下の工程を含むポリペプチドの製造方法：
目的ポリペプチドをコードするＤＮＡと、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位から選ばれる1以上のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ
（ｂ）位置：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ
（ｃ）位置：Ａｓｎ
（ｄ）位置：Ｇｌｕ
に置換してなるプラスミド複製タンパク質をコードするＤＮＡを有するプラスミドベクターを構築する工程；
前記プラスミドベクターで宿主微生物を形質転換する工程；および
前記宿主微生物を培養し、生産された目的ポリペプチドを採取する工程。
８）以下の工程を含むポリペプチドの製造方法：
目的ポリペプチドをコードするＤＮＡと、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位の各位置に相当する位置から選ばれる1以上のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ
（ｂ）位置：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ
（ｃ）位置：Ａｓｎ
（ｄ）位置：Ｇｌｕ
に置換してなるプラスミド複製タンパク質をコードするＤＮＡを有するプラスミドベクターを構築する工程；
前記プラスミドベクターで宿主微生物を形質転換する工程；および
前記宿主微生物を培養し、生産された目的ポリペプチドを採取する工程。
９）前記プラスミドベクターが、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナル領域に由来する塩基配列をさらに含む、７）又は８）記載の方法。
１０）前記バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナル領域に由来する塩基配列が、配列番号１３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号１４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、あるいは当該塩基配列のいずれかと７０%以上の同一性を有するか又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列である、９）記載の方法。
１１）７）又は８）記載の方法により製造されるポリペプチド。

本発明のプラスミドベクターにおいては、同プラスミド上に組み込んだ目的タンパク質の構造遺伝子部分より産生される当該タンパク質の菌体外への分泌量が増大する。従って、本発明のプラスミドベクターを用いることにより、目的タンパク質を効率よく生産することが可能となる。

本発明のプラスミドベクターの構築例

本発明のプラスミドベクターに含まれる、プラスミド複製タンパク質をコードするＤＮＡは、以下の（ｉ）又は（ii）のタンパク質をコードするものである。
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位から選ばれる1以上のアミノ酸残基が下記の（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸残基に置換してなるタンパク質。
（ａ）位置：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ
（ｂ）位置：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ
（ｃ）位置：Ａｓｎ
（ｄ）位置：Ｇｌｕ
（ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位の各位置に相当する位置から選ばれる1以上のアミノ酸残基が下記の（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸残基に置換してなるタンパク質。
（ａ）位置：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ
（ｂ）位置：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ
（ｃ）位置：Ａｓｎ
（ｄ）位置：Ｇｌｕ

配列番号２で示されるアミノ酸配列からタンパク質としては、エンテロコッカスフェーカリス（Enterococcus faecalis）由来のプラスミドｐＡＭα１の複製タンパク質が挙げられる。
配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプラスミド複製タンパク質としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列とは異なるが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上の同一性を有するものが挙げられる。
斯かるプラスミド複製タンパク質としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものが包含される。
具体的には、例えば、Staphylococcus saprophyticus由来の複製タンパク質などが挙げられる。
このうち、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるプラスミド複製タンパク質が有する、プラスミドの自立増殖に関する機能を有するのが好ましい。

本発明のプラスミド複製タンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の（ａ）４８位若しくはこれに相当する位置、（ｂ）２６２位若しくはこれに相当する位置、（ｃ）１４９位若しくはこれに相当する位置及び（ｄ）１９８位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基から選択される１以上が他のアミノ酸残基に置換されたタンパク質を意味するが、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
なお、アミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。

従って、本発明のプラスミド複製タンパク質には、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４８位のアミノ酸残基（Ｌｙｓ残基）が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ残基に置換されたもの、２６２位のアミノ酸残基（Ａｓｐ残基）がＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ残基に置換されたもの、１４９位のアミノ酸残基（Ｌｙｓ残基）がＡｓｎ残基に置換されたもの、及び１９８位位のアミノ酸残基（Ｌｙｓ残基）がＧｌｕ残基に置換されたもの、ならびに配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプラスミド複製タンパク質において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４８位に相当する位置のアミノ酸残基が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ残基に置換されたもの、２６２位に相当する位置のアミノ酸残基がＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ残基に置換されたもの、１４９位に相当する位置のアミノ酸残基がＡｓｎ残基に置換されたもの、及び１９８位に相当する位置のアミノ酸残基がＧｌｕ残基に置換されたものが包含される。
尚、（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位等のアミノ酸置換は、何れか一でも、複数を同時に行っても良い。

ここで、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各プラスミド複製タンパク質のアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行なうことができる。プラスミド複製タンパク質のアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各プラスミド複製タンパク質における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプラスミド複製タンパク質の特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。

本発明のプラスミドベクターは、プラスミド複製タンパク質をコードするＤＮＡを一般的に行われている部異特異的変異の方法により変異を導入することにより構築することができる。より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(タカラ)等を用いて行なうことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic Press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を、他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。

本発明のプラスミド複製タンパク質をコードするＤＮＡに、ＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片、薬剤耐性遺伝子、複製起点を含むＤＮＡ領域、転写を開始させるプロモーター領域及び分泌シグナル領域と、目的とする異種遺伝子産物をコードする遺伝子を連結することにより、タンパク質又はポリペプチド等の目的遺伝子産物を大量に生産させ得る組換えプラスミドが構築できる。

異種遺伝子としては、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシゲナーゼ、カタラーゼ等の酵素、インシュリン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、カルシトニン、インターロイキン等の生理活性ペプチドをコードする遺伝子が挙げられるが、遺伝子の種類は特に限定されるものではない。

前記転写を開始させるプロモーター領域及び分泌シグナル領域とは、当該異種遺伝子の転写、翻訳及び分泌に関わる制御領域の塩基配列をいう。転写を開始させるプロモーター領域の例としては、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位、開始コドンを含む翻訳開始領域、又はこれらの組み合わせが挙げられる。分泌シグナル領域の例としては、分泌シグナルペプチド領域が挙げられる。
本発明のプラスミドベクターには、目的の異種遺伝子と、転写、翻訳及び分泌に関わる制御領域とが、作動可能に連結されている（例えば、異種遺伝子の上流に制御領域が連結されている）。当該制御領域は、好ましくは、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域であり、より好ましくは、分泌シグナル領域は、バチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域は、当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kbの領域である。さらに好ましくは、当該制御領域は、バチルス（Bacillus）属細菌KSM-S237株（FERM BP-7875）又はKSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域である。さらにより好ましくは、当該制御領域は、配列番号１３で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号１４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらにより好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列である。上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持している配列を意味する。

以下に、バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のＫＰ４３プロテアーゼを生産するための本発明のプラスミドベクターの構築例を示す（図１参照）。
バチルスエスピーＫＳＭ−６４株(FERM BP-2886)のセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナル領域の下流にバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のＫＰ４３プロテアーゼ遺伝子を連結させ、さらに複製領域としてｐＡＭα１、薬剤耐性遺伝子としてテトラサイクリン耐性遺伝子を連結して構築した組換えプラスミドベクターにおいて、ＫＰ４３遺伝子の下流に存在する制限酵素サイト（ＸｂａＩ）を挟むように双方向のプライマー（図１中ａとｄ）を作成する。また、Ｏｒｉ−ｐＡＭα１遺伝子の下流に新たに制限酵素サイト（ＮｈｅＩ）を作成するように双方向のプライマー（図１中ｂとｃ）を作成し、ＰＣＲにより得られる２断片（ＴｃとＫＰ４３を含む領域とｐＡＭα１を含む領域）は、双方ＸｂａＩ、ＮｈｅＩにて消化後、連結可能となるようにする。図中プライマーｂとｄにより増幅されるｐＡＭα１を含む領域において、増幅過程でのエラー導入を促進させることにより、複製蛋白質にランダムに変異が入ったプラスミドベクターを構築することができる。

斯くして得られるプラスミドベクターで、宿主微生物を形質転換すれば、本発明組換え微生物を得られ、この組換え微生物を培養し、該培養物から目的タンパク又はポリペプチドを採取すれば目的タンパク質又はポリペプチドが大量に生産できる。形質転換に用いられる宿主微生物としては、Staphylococcus属、Enterococcus属、Listeria属、Bacillus属等が挙げられるが、このうち、Bacillus属が好ましい。

ここで用いられる培地の種類は、当該組換え微生物が生育し、当該酵素を生産することのできるものであれば特に限定されるものではない。また培地には、窒素源と炭素源を適当な濃度で組み合わせ、この他に適当な濃度の無機塩類、金属塩等を添加したものが用いられ、培地のｐＨ及び温度は、用いる組換え微生物が生育し得る範囲内のｐＨ及び温度であれば特に限定されない。

さらに生産された目的のタンパク質又はポリペプチドの単離は常法により行われ、必要により精製、結晶化、造粒化できる。

実施例１Ｒｅｐ４８位の変異効果
特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報又は特開２００４−１２２号公報に記載のバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼで分泌能力や比活性の向上している変異プロテアーゼ（配列番号３及び４において、４６位のＰｈｅをＬｅｕ、６５位のＴｈｒをＰｒｏ、１９５位のＴｙｒをＨｉｓ、２７３位のＶａｌをＩｌｅ、３５９位のＴｈｒをＳｅｒ、３６９位のＡｓｐをＡｓｎ、３８７位のＳｅｒをＡｌａに置換したアルカリプロテアーゼ）（以下、ＫＰ４３Ｈ２と称する）の生産量を指標にＲｅｐ４８位変異の効果を検証した。

プラスミドｐＡＭα１またはｐＵＢ１１０の複製起点および複製タンパク質（Ｒｅｐ）と薬剤耐性領域を含むプラスミドベクター（特開平３−２５９０８６号公報）でバチルスエスピーＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼＫ−６４のプロモーター領域及び分泌シグナル領域を有する発現ベクターｐＨＡ６４（特開２０００−２８７６８７号公報）のＢａｍＨＩ、ＸｂａＩサイトに、ＫＰ４３Ｈ２構造遺伝子およびターミネーターを連結させたｐＨＡ６４−ＫＰ４３Ｈ２を鋳型にＴａｋａｒａサーマルサイクラー４８０型を用いたＰＣＲによりＲｅｐに変異を導入した。すなわち、鋳型となる環状プラスミド０．１〜０．５ｎｇに対して変異導入プライマー対（配列番号５と配列番号９または配列番号７と配列番号１０）を各々２０ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰを２０ｎｍｏｌ、ＴａｋａｒａピロベストＤＮＡポリメラーゼ添付バッファーを５μＬおよびピロベストＤＮＡポリメラーゼを２Ｕ添加し反応液（５０μＬ）を調製した。ＰＣＲ条件は９４℃で1分間変性させた後、９４℃ １分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間を１サイクルとし、３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間恒温した。

得られたＰＣＲ産物をＨｉｇｈＰｕｒｅＰＣＲＰｒｏｄｕｃｔＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ロッシュ）にて精製し、１００μＬの滅菌水で溶出した後、２断片を両端を挟むプライマー（配列番号５と配列番号７）にて1断片として増幅させた。つまり１回目のＰＣＲで得られた２断片を各々１００分の１に希釈、混合し、上記同様の条件でＰＣＲを行った。増幅したDNA断片を電気泳動にて確認した後、ＮｈｅＩ、ＸｂａＩで消化し、配列番号６および配列番号８のプライマーを用いてｐＨＡ６４−ＫＰ４３Ｈ２を鋳型に常法により増幅させたテトラサイクリン耐性遺伝子およびＫＰ４３Ｈ２遺伝子部分を含む断片をＮｈｅＩ、ＸｂａＩで消化したものとＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いて連結させた。

反応液をＨｉｇｈＰｕｒｅＰＣＲＰｒｏｄｕｃｔＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ロッシュ）にて精製し、１００μＬ滅菌水にて溶出したＤＮＡ溶液を用いてジーンパルサーキュベット（バイオラッド）を用いたエレクトロポレーション法によりバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株を形質転換した。スキムミルク含有アルカリ寒天培地[スキムミルク(ディフコ）１％（ｗ／ｖ）、バクトトリプトン(ディフコ）１％、酵母エキス（ディフコ）０．５％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．５％、無水炭酸ナトリウム０．０５％、テトラサイクリン１５ｐｐｍ]上に生育してきた形質転換株のスキムミルク溶解斑の形成状況により、プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。プロテアーゼ遺伝子がｐＨＡ６４に挿入されたプラスミドを保持している形質転換株を選抜し、以後の培養に供した。

各形質転換株について単集落分離、ハロー形成の確認を行い、試験管中の5mL種母培地[ポリペプトンＳ（日本製薬）６．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％、マルトース１．０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、リン酸２水素カリウム０．１％、無水炭酸ナトリウム０．３％、テトラサイクリン３０ｐｐｍ]に植菌し、３０℃、３２０ｒｐｍで一晩前培養した。この種母培養液を５００ｍＬ容坂口フラスコ中の20mL主培地[ポリペプトンＳ８％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．３％、マルトース１０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０４％、リン酸２水素カリウム０．２％、無水炭酸ナトリウム１．５％、テトラサイクリン３０ｐｐｍ]に１％植菌（ｖ／ｖ）し、３０℃、１２１ｒｐｍで3日間培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清中のプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性はカゼイン法により、タンパク質量はプロテインアッセイキット（和光純薬）を用いて測定した。その結果、変異Ｒｅｐを有すプラスミドで生産させたアルカリプロテアーゼＫＰ４３Ｈ２の培養活性はコントロール（ｐＨＡ６４−ＫＰ４３Ｈ２の形質転換株を同条件で培養したもの）のそれに比べ８〜１２％向上した（表１）。尚、培養上清中のタンパク質量はプロテアーゼ活性とほぼ比例して増加していることから、得られた変異体はタンパク質の分泌量が向上するのに必要な変異が導入されたといえる。また、選抜された形質転換株からプラスミドを回収し、塩基配列を決定し、目的の変異体であることを確認した。

上記変異部位により得られるアルカリプロテアーゼは、形質転換株での酵素の分泌を向上させる以外は親アルカリプロテアーゼの特性、すなわち、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であり、アルカリ性域で活性を有する性質を保持していることを確認した。

実施例２Ｒｅｐ２６２位の変異効果
実施例１同様、バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来の変異アルカリプロテアーゼの生産量を指標にＲｅｐ２６２位変異の効果を検証した。
ｐＨＡ６４−ＫＰ４３Ｈ２を鋳型とし、０．１〜０．５ｎｇに対して変異導入プライマー対（配列番号５と配列番号１１または配列番号７と配列番号１２）を用いて実施例1と同様な手法により増幅した２断片を得、両端を挟むプライマー（配列番号５と配列番号７）にて1断片として増幅させた。得られたDNA断片を電気泳動にて確認した後、ＮｈｅＩ、ＸｂａＩで消化し、配列番号６および配列番号８のプライマーを用いてｐＨＡ６４−ＫＰ４３Ｈ２を鋳型に常法により増幅させたテトラサイクリン耐性遺伝子およびＫＰ４３Ｈ２遺伝子部分を含む断片をＮｈｅＩ、ＸｂａＩで消化したものとＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いて連結させ、形質転換を行った。
スキムミルク含有アルカリ寒天培地（実施例１）上に生育してきた形質転換株のスキムミルク溶解斑の形成状況により、プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。プロテアーゼ遺伝子がｐＨＡ６４に挿入されたプラスミドを保持している形質転換株を選抜し、実施例１と同様の培養に供した。

その結果、変異Ｒｅｐを有すプラスミドで生産させたアルカリプロテアーゼＫＰ４３Ｈ２の培養活性はコントロール（ｐＨＡ６４−ＫＰ４３Ｈ２の形質転換株を同条件で培養したもの）のそれに比べ３〜１３％向上した（表２）。尚、培養上清中のタンパク質量はプロテアーゼ活性とほぼ比例して増加していることから、得られた変異体はタンパク質の分泌量が向上するのに必要な変異が導入されたといえる。また、選抜された形質転換株からプラスミドを回収し、塩基配列を決定し、目的の変異体であることを確認した。

実施例３Ｒｅｐのランダム変異効果
特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００４−１２２号公報又は特開２００４−３０５１７６号公報に記載のバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼで分泌能力や比活性の向上している変異プロテアーゼ（配列番号３及び４において、１５位のＳｅｒをＨｉｓ、１６位のＳｅｒをＧｌｎ、４６位のＰｈｅをＬｅｕ、６５位のＴｈｒをＰｒｏ、１６６位のＡｓｎをＧｌｙ、１６７位のＧｌｙをＶａｌ、１８７位のＡｓｎをＳｅｒ、１９５位のＴｙｒをＧｌｎ、２７３位のＶａｌをＩｌｅ、３４６位のＬｙｓをＡｒｇ、３５９位のＴｈｒをＳｅｒ、３６９位のＡｓｐをＡｓｎ、３８７位のＳｅｒをＡｌａ、４０５位のＡｓｎをＡｓｐに置換したアルカリプロテアーゼ）（以下、ＫＰ４３Ｈ３と称する）の生産量を指標にＲｅｐ４８位変異の効果を検証した。

ｐＨＡ６４のＢａｍＨＩ、ＸｂａＩサイトにＫＰ４３Ｈ３を挿入したｐＨＡ６４−ＫＰ４３Ｈ３を鋳型にＴａｋａｒａサーマルサイクラー４８０型を用いたＰＣＲによりＲｅｐにランダム変異を導入した。すなわち、鋳型となる環状プラスミド０．１〜０．５ｎｇに対してプライマー対（配列番号５と配列番号７）を各々２０ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰを２０ｎｍｏｌ、ＴａｋａｒａピロベストＤＮＡポリメラーゼ添付バッファーを５μＬおよびピロベストＤＮＡポリメラーゼを２Ｕ添加し、さらに７．５％のＤＭＳＯ、０．０５〜０．１ｍＭの硫酸マンガンを添加し反応液（５０μＬ）を調製した。ＰＣＲ条件は９４℃で1分間変性させた後、９４℃ １分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間を１サイクルとし、３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間恒温した。

得られたＰＣＲ産物をＨｉｇｈＰｕｒｅＰＣＲＰｒｏｄｕｃｔＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ロッシュ）にて精製し、１００μＬの滅菌水で溶出し、増幅したDNA断片を電気泳動にて確認した後、ＮｈｅＩ、ＸｂａＩで消化し、配列番号６および配列番号８のプライマーを用いてｐＨＡ６４−ＫＰ４３Ｈ３を鋳型に常法により増幅させたテトラサイクリン耐性遺伝子およびＫＰ４３Ｈ２遺伝子部分を含む断片をＮｈｅＩ、ＸｂａＩで消化したものとＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いて連結させた。

実施例１と同様に形質転換を行い、スキムミルク含有アルカリ寒天培地上に生育してきた形質転換株のスキムミルク溶解斑の形成状況により、プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。プロテアーゼ遺伝子がｐＨＡ６４に挿入されたプラスミドを保持している形質転換株を選抜し培養に供した。

その結果、変異Ｒｅｐを有すプラスミドで生産させたアルカリプロテアーゼＫＰ４３Ｈ３のうちコントロール（ｐＨＡ６４−ＫＰ４３Ｈ３の形質転換株を同条件で培養したもの）のそれに比べ７％向上するＬｙｓ１４９Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９８Ｇｌｕを得た（表３）。尚、培養上清中のタンパク質量はプロテアーゼ活性とほぼ比例して増加していることから、得られた変異体はタンパク質の分泌量が向上するのに必要な変異が導入されたといえる。また、選抜された形質転換株からプラスミドを回収し、塩基配列を決定し、目的の変異体であることを確認した。

Claims

配列番号２で示されるアミノ酸配列において、（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位から選ばれる１以上のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ
（ｂ）位置：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ
（ｃ）位置：Ａｓｎ
（ｄ）位置：Ｇｌｕ
に置換してなるプラスミド複製タンパク質をコードするＤＮＡを有するプラスミドベクター。
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位の各位置に相当する位置から選ばれる１以上のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ
（ｂ）位置：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ
（ｃ）位置：Ａｓｎ
（ｄ）位置：Ｇｌｕ
に置換してなるプラスミド複製タンパク質をコードするＤＮＡを有するプラスミドベクター。
さらにバチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナル領域に由来する塩基配列を含む請求項１又は２記載のプラスミドベクター。
前記バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナル領域に由来する塩基配列が、配列番号１３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号１４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、あるいは当該塩基配列のいずれかと９０％以上の同一性を有する塩基配列である、請求項３記載のプラスミドベクター。
請求項３又は４記載のプラスミドベクターを含有する形質転換体。
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
以下の工程を含むポリペプチドの製造方法：
目的ポリペプチドをコードするＤＮＡと、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位から選ばれる１以上のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ
（ｂ）位置：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ
（ｃ）位置：Ａｓｎ
（ｄ）位置：Ｇｌｕ
に置換してなるプラスミド複製タンパク質をコードするＤＮＡを有するプラスミドベクターを構築する工程；
前記プラスミドベクターで宿主微生物を形質転換する工程；および
前記宿主微生物を培養し、生産された目的ポリペプチドを採取する工程。
以下の工程を含むポリペプチドの製造方法：
目的ポリペプチドをコードするＤＮＡと、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位の各位置に相当する位置から選ばれる１以上のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＧｌｎ
（ｂ）位置：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＶａｌ
（ｃ）位置：Ａｓｎ
（ｄ）位置：Ｇｌｕ
に置換してなるプラスミド複製タンパク質をコードするＤＮＡを有するプラスミドベクターを構築する工程；
前記プラスミドベクターで宿主微生物を形質転換する工程；および
前記宿主微生物を培養し、生産された目的ポリペプチドを採取する工程。
前記プラスミドベクターが、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナル領域に由来する塩基配列をさらに含む、請求項７又は８記載の方法。
前記バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナル領域に由来する塩基配列が、配列番号１３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号１４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、あるいは当該塩基配列のいずれかと９０％以上の同一性を有する塩基配列である、請求項９記載の方法。