CN116496941B - 一种微生物发酵复合物及其在防治柑橘黄龙病的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种微生物发酵复合物及其在防治柑橘黄龙病的应用，涉及植物病害防控技术领域。该微生物发酵复合物通过猪粪、麸皮、豆粕粉混合物中加入微生物进行发酵获得。本申请还公开了一种采用该微生物发酵复合物处理柑橘苗木的方法，该方法能够有效防治柑橘黄龙病病害；经过该方法处理过的柑橘苗木黄化斑驳症状减轻或斑纹变淡趋向于消失；柑橘苗木叶片表面光滑、外观健壮；柑橘苗木新根数量、发枝量多、枝梢生长茂盛，具有明显的复壮效果。
Description
技术领域
本申请涉及植物病害防控技术领域，具体涉及一种微生物发酵复合物及其在防治柑橘黄龙病的应用。
背景技术
柑橘黄龙病是世界柑橘生产上的毁灭性病害，是由一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌引起，能够侵染包括柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科植物。目前，该病主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区严重制约柑橘产业的健康发展。
由于黄龙病病原不能离体培养，导致韧皮部杆菌的致病机理和柑橘抗病性的研究比较困难，防治黄龙病仍成为一个世界性的难题。黄龙病潜伏期长，症状复杂，甚至在一株树的不同组织、不同部位、不同季节，病原菌的浓度都在变化，针对柑橘黄龙病仍未找到有效的防治手段，要彻底清除十分困难，只能通过挖除病树、捕杀木虱、培育无病苗木进行防控。在进行化学防控木虱时，容易造成环境污染，产生抗药性，不符合可持续发展的理念。
生物防治可以弥补化学防治的缺点，不污染环境，不破坏生态平衡，不产生抗药性，且同样高效，低成本，使用便捷，具有可持续发展的优势。构建有效的生物防治手段可以有效地解决柑橘黄龙病难治理的问题。
发明内容
植物病害的生物防治是指利用有益微生物(生防菌)或微生物的代谢产物对植物病害进行防治，其中有益微生物主要包括细菌、真菌、放线菌和病毒；生防菌的生物防治主要机制包括：拮抗作用、竞争作用、重寄生作用、诱导植物抗性、促进植物生长等。生防菌在田间条件下可以是多种机制的共同作用，也可以在植株不同的发育时期，不同的部位，某一机制在起作用，以达到抑制病原菌的生长和繁殖，或杀灭病原的效果。拮抗作用是指一种微生物在其生命活动过程中产生的次生代谢物质对其它微生物的活性产生抑制，甚至杀灭的作用；竞争作用是指两种或多种微生物争夺生存空间、位点、营养、水分等，生防菌能在植物体内成为优势菌种，从而限制其它致病菌的生长；重寄生是指寄生于植物体的病原微生物再次被其他微生物寄生的现象。植物抗性的产生有两种诱导途径，一是***获得性抗性(Systemic acquired resistance，SAR)，是指病原物侵染后，未接种部位诱导出对病原物的抗性；二是诱导性抗性(Induced systemic resistance，ISR)，是指非病原物刺激植物后，使植物体产生物理或化学屏障，从而增强了抗性。
本申请利用微生物发酵复合物“SS”对柑橘苗木进行多次连续处理，并采用公认的灵敏高的实时定量QPCR检测方法，对韧皮部杆菌RNR基因相对表达量进行跟踪检测，同时对苗木表型特征进行比较观察，旨在确认微生物发酵复合物“SS”杀灭柑橘韧皮部杆菌和促进苗木复壮的效果，为逐步清除苗木中的柑橘黄龙病病原，获得健康无病的柑橘母本苗木提供了切实可行的方法。为此，本申请提供了以下技术方案：
(1)一种微生物发酵复合物“SS”，其通过以下方法获得：
将猪粪、麸皮、豆粕粉三者按90:5:5的质量比例混合均匀，获得第一混合物；往第一混合物加入微生物、水混合，获得第二混合物，第二混合物物料的含水量控制在60～65％之间；
在25～34℃条件下堆制发酵，每隔2天翻动1次，持续发酵21天；即获得所述微生物发酵复合物“SS”。
如(1)所述的微生物发酵复合物“SS”，其中，所述微生物包括(a)和(b)中微生物的至少一种：(a)Bacillus sp TD 3-1；(b)Bacillus sp TD 3-2。
如上所述的微生物中，其中“Bacillus sp TD 3-1”、“Bacillus sp TD 3-2”两种微生物均已被保藏，保藏单位为中国典型培养物培养中心，地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号分别为CCTCC NO:M 2020563、CCTCC NO:M2020564，保藏日期均为2020年9月30日。
(2)一种防治柑橘黄龙病的方法，其包括：
获得如(1)所述的微生物发酵复合物“SS”；
按每7天1次，每次按5～20g/株的量施于栽苗盆中；
每2周松1次盆土；
每2周施用1次颗粒状复合肥，其中复合肥N:P:K＝15:15:15，施用量为5克/株；
每4周施用1次螯合型中微量元素，所述微量元素含硅钙硼锌铁钾，按1克/株的量施到盆中；
日常管理：期间施用2次海藻有机肥；盆栽苗按常规浇水，保持土壤湿润。
(3)前述微生物发酵复合物“SS”、前述方法在防治柑橘黄龙病的应用。
本申请提供的一种微生物发酵复合物及其在防治柑橘黄龙病的应用的技术效果将在实施例中具体阐明。
附图说明
图1为本申请实施例提供的微生物发酵复合物“SS”处理柑橘苗木引起的枝梢特征变化，共有三株处理前后的柑橘苗木；其中，A、D分别为第一株处理后及处理前的柑橘苗木，B、E分别为第二株处理后及处理前的柑橘苗木，C、F分别为第三株处理后及处理前的柑橘苗木。
图2为本申请实施例提供的微生物发酵复合物“SS”处理和对照苗木生长情况的比较；其中，A为处理组苗木，B为对照组苗木。
图3为本申请实施例提供的过量使用微生物发酵复合物“SS”处理的3～4年生的柑橘苗的叶片实物图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
在本申请实施例中，其中“Bacillus sp TD 3-1”、“Bacillus sp TD 3-2”为两种芽孢杆菌菌种，筛选于华中农业大学生猪良种繁育基地周边的堆积物，两种菌种均已被保藏，保藏单位为中国典型培养物培养中心，地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号，“Bacillus sp TD 3-1”和保藏编号为CCTCC NO:M 2020563，“Bacillus sp TD 3-2”的保藏编号为CCTCC NO:M 2020564，保藏日期均为2020年9月30日。
本申请实施例中，上述芽孢杆菌菌种来源于华中农业大学生猪良种繁育基地周边的堆积物。
微生物发酵复合物“SS”
在本申请实施例中，微生物发酵复合物“SS”，通过在第一混合物加入微生物发酵获得，其中，第一混合物由猪粪、麸皮、豆粕粉混合而成。在一些实施例中，猪粪、麸皮、豆粕粉的质量比为90:5:5。
在本申请实施例中，微生物可以包括一种或二种，具体地，有(a)Bacillus sp TD3-1(CCTCC NO:M 2020563),(b)Bacillus sp TD 3-2(CCTCC NO:M2020564)中的至少一种。在一些优选的实施例中，微生物包括(a)和(b)2种。
在本申请实施例中，微生物、第一混合物、水形成第二混合物，其中，微生物与第一混合物的混合质量比例为8:1000，如每80g微生物加入10kg第一混合物进行混合；第二混合物中，含水量控制在60～65％。
在本申请实施例中，第二混合物置于25～34℃条件下进行堆制发酵，发酵周期为21天。在一些优选的实施例中，在发酵周期内，每隔2天翻动第二混合物1次，可以达到更好的发酵效果。
防治柑橘黄龙病的方法
在本申请实施例中，提供了一种防治柑橘黄龙病的方法，即通过前述微生物发酵复合物“SS”对柑橘苗木进行多次连续处理。在一些实施例中，所采用的柑橘苗木选用从江西购买的3年生南丰蜜桔苗木(砧木为枳壳)，用7号加仑盆栽种苗木。苗木放置在华中农业大学农业微生物国家工程中心网室内隔离种植。培养基质为：菜园土50％，泥炭和蛭石各25％。
在一些实施例中，微生物发酵复合物“SS”对柑橘苗木的处理过程为：首先，按每7天1次，每次按5～20g/株的量施于栽苗盆中，在其中的一个实施例中，从2023年7月到2023年1月期间，每隔7天施用1次微生物发酵复合物“SS”，共施用了25次；在某个优选的实施例中，微生物复合物“SS”施于栽苗盆中的量为5g/株。其次，每2周松1次盆土，每2周施用1次颗粒状复合肥，其中复合肥N:P:K＝15:15:15(N-P2O-K2O总氧分>45％)，施用量为5克/株。
在一些实施例中，微生物发酵复合物“SS”对柑橘苗木的处理过程还包括：每4周施用1次螯合型中微量元素，所述微量元素含硅钙硼锌铁钾，按1克/株的量施到盆中。
在本申请实施例中，微生物发酵复合物“SS”对柑橘苗木的处理过程还包括日常管理，即处理期间施用2次海藻有机肥；盆栽苗按常规浇水，保持土壤湿润。
微生物发酵复合物“SS”及其处理方法的应用
本申请实施例还提供了前述微生物发酵复合物“SS”及其对柑橘苗木的处理方法的应用，并对处理结果进行了验证分析，验证分析采用对柑橘黄龙病韧皮部杆菌的进行QPCR检测的方法来实现，主要采集柑橘的叶脉和枝皮进行病原的分子检测。在其中的某个实施例中，处理前的采样时间为2022年7月15日，处理后的采样时间为2022年12月6～9日，-80℃保存，待检测用。
在本申请实施例某些实施例中，采用CTAB法提取柑橘样品的总DNA，用核酸蛋白测定仪检测DNA质量。在试验过程中，采集叶脉检测黄龙病病原的滴度变化，从而获得微生物发酵复合物“SS”对柑橘处理之后的验证结果。
本申请实施中，所采用的QPCR检测方法的反应体系及反应程序如下表1所示；
表1
| 反应体系 | 体系(μl) | 反应程序 |
| 2×SYBR PCR mix | 5 | 94℃，5min |
| DNA | 0.5 | 94℃，15s |
| Forward primer(10μm) | 0.1 | 60℃，20s |
| Revese primer(10μm) | 0.1 | 72℃，20s |
| ddH2O | 4.3 | 2to 4for 40cycles |
| 72℃，10min | ||
| 40℃，10s |
试验中所用的主要仪器如下表2所示。
表2
| 主要仪器 | 所属公司 |
| 荧光定量PCR仪 | Corbett RG 6000 |
| 常规PCR仪 | 美国Bio-Rad公司 |
| 核酸蛋白测定仪 | Amersham公司 |
| DYY-5型电泳仪 | 北京六一仪器厂 |
| 凝胶成像仪 | Segrate公司 |
| 高压灭菌锅 | 德国systec公司 |
| 超净工作台 | 上海微行炉业有限公司 |
| 数显恒温水浴锅HH-Z | 国华电器有限公司 |
| 光照培养箱 | 宁波海曙赛福实验仪器厂 |
| GNP-9080型恒温培养箱 | 上海精宏实验设备有限公司 |
| 电子天平 | 上海花潮电器有限公司 |
| 全温振荡器HZQ-Q | 哈尔滨市东联电子有限公司 |
| ***生物显微镜 | NIKON仪器(上海)有限公司 |
| Fast-prep组织研磨仪 | MP biomedicals公司 |
| 多功能酶标仪 | PerkinElmer公司 |
本申请实施例中，PCR检测模板通过提取的叶脉样品的DNA作为模板，柑橘植物细胞色素氧化酶基因COX(Li et al.，2006)为内参基因，引物为COX+/COX-；选用高敏感度黄龙病引物RNR+/RNR-对目标基因进行扩增(表3)，RNR+/RNR-在黄龙病检测中是非常灵敏的公认引物，有5个拷贝。每个样品设置3次重复。健康的“纽荷尔”的愈伤组织DNA作为阴性对照，将其2-△△CT值设定为1(Li et al.，2006)。经实验室检测为阳性植株的“砂糖橘”叶片DNA作为QPCR的阳性对照。试验数据采用2-△△CT法进行分析，若样品的2-△△CT值大于1则认为是阳性植株。数据用Excel 2016软件和SPSS 25.0软件进行方差分析和显著性水平检验。
表3
| 引物 | 核酸序列(5’—3’) | Genebank编号 |
| COX+ | 序列如SEQ ID NO.1所示 | CX297817 72-93 |
| COX- | 序列如SEQ ID NO.2所示 | CX297817 118-139 |
| RNRf | 序列如SEQ ID NO.3所示 | CP010804.1 5434-5455 |
| RNRr | 序列如SEQ ID NO.4所示 | CP010804.1 5493-5514 |
本申请实施例，所采用的荧光定量检测方法为相对定量检测，具体采用的是“-ΔΔCT法”，其中：
CT值：Cycle Threshold，扩增循环数。表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定域值所经历的扩增循环数；
ΔCT(目的基因)＝CT(试验细胞目的基因)-CT(对照细胞目的基因)；
ΔCT(参考基因)＝CT(试验细胞参考基因)-CT(对照细胞参考基因)；
ΔΔCT＝ΔCT(目的基因)-ΔCT(参考基因)；
试验细胞与对照细胞中目的基因表达量的比值＝2-ΔΔCT；
阴性对照2-△△CT＝1，当样品检测结果CT值经过计算，相对表达量为2-△△CT>1时，植株为阳性，带黄龙病病原；当2-△△CT<1时，样品不带病原。
本申请还提供了一个对照例，即在高温(2022年7月)条件下，微生物发酵复合物“SS”施用于柑橘苗的用量超过20g/株，为21g/株，其它处理过程及检测方法跟前述实施例一样。
结果：
(1)微生物发酵复合物“SS”处理后柑橘苗木的表型变化。
通过本申请实施例提供的微生物发酵复合物“SS”处理柑橘苗木后，柑橘叶片的表型发生了明显的变化。观察发现：处理组的阳性苗木在处理之前，表现出典型的黄化斑驳症状(如图1A所示)，从2022年7月中旬开始用微生物发酵复合物“SS”处理，每周1次，当处理10次时，叶片上黄化斑驳症状减轻或斑纹变淡趋向于消失(如图1B所示)，继续处理到20次时叶片颜色转绿，表面光滑，具有蜡质，外观健壮(如图1C所示)。而黄龙病阳性对照植株，其枝梢上一直可以观察到叶片有不同程度的黄化斑驳症状，随着生长周期的加长，叶片变得老熟一些，但顶端叶片仍然表现出黄化斑驳的特征(如图1D～F所示)。这说明，微生物发酵复合物“SS”对苗木叶片转绿起到显著的作用。
从苗木的全株生长情况看，微生物发酵复合物“SS”处理后的苗木根系发达，新根数量多，发枝量多，枝梢生长繁茂(如图2A所法)，而对照组的苗木根系有褐变现象，植株生长状况没有处理植株的苗木健壮(如图2B所示)。由此可见，微生物发酵复合物“SS”对柑橘苗木复壮具有良好的效果。
(2)微生物发酵复合物“SS”处理对韧皮部分杆菌滴度的影响。
本申请实施例采用QPCR对韧皮部杆菌病原的关键致病基因RNR设计引物进行检测，处理和对照组各有6个生物学重复。结果表明：苗木经过微生物发酵复合物“SS”处理20次时，处理组样品叶脉阳性率从5/6转变为1/6，枝皮阳性率从4/6转变为2/6，综合评价黄龙病滴度的结果是，处理前阳性率占5/6(83.3％)，处理20次后，阳性率为2/6(33.3％)，阳性率下降了50％。在试验开始时，对照组叶脉的阳性率为1/6，对照组枝皮的阳性率为3/6，综合评价试验开始时的阳性率为4/6(66.6％)，到处理20次的时间点时，对照组叶脉阳性率仍保持1/6，枝皮的阳性率从3/6(66.6％)变为5/6(83.3％)，综合评价阳性率为5/6(83.3％)，详细结果如下表4所示。
表4
(3)黄龙病病原韧皮部杆菌主要存在于韧皮部中。由于在每株树的不同组织、不同季节，病原菌的浓度是波动的。本申请实施例为了更准确地判断苗木中韧皮部杆菌病原的带毒情况，同时对叶脉和枝皮进行了跟踪检测。从黄龙病病原的变化趋势判断，微生物发酵复合物“SS”处理能使50％的阳性材料转为阴性，对于降低韧皮部杆菌病原滴度和在部分苗木上清除病原是有效的。
(4)前人研究还表明，在秋冬季节，在感病苗木中韧皮部杆菌病原浓度是处于较高水平的，叶片的黄化斑驳症状最为明显。而在本申请实施例中，通过微生物发酵复合物“SS”处理后，在2022年12月6～9日进行采样检测，其结果更能说明微生物发酵复合物“SS”能经受秋冬季节的考验。
(5)在气温较高的季节，温度达38℃左右，对于3～4年生的柑橘苗木，微生物发酵复合物“SS”使用量每次最好不要超过20g/株。使用量过大，会引起部分叶片枯萎和脱落(所图3所示)，同时还要注意复合肥、中微量元素和有机肥的配合使用，以防止多种微生物与柑橘植株发生营养竞争。
综上所述，本申请提供的微生物发酵复合物“SS”及用所述微生物发酵复合物“SS”处理柑橘苗木的方法，能明显地改善柑橘苗木的生长状态。通过QPCR分子检测方法对柑橘苗叶脉和枝皮的韧皮部杆菌进行分析和评价，结果表明微生物发酵复合物“SS”处理连续处理20次，柑橘黄龙病的阳性率可以下降50％，这项研究为柑橘无病苗木培育可提供有利的母本材料，为控制和消除韧皮部杆菌提供了实用、安全和有效的手段，对于柑橘树的复壮，具有巨大的应用价值和广泛的市场前景。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种微生物发酵复合物在防治柑橘黄龙病的应用；
所述微生物发酵复合物的制备方法包括：
获得第一混合物，所述第一混合物包含重量比为90:5:5的猪粪、麸皮和豆粕粉；
往所述第一混合物中加入微生物和水混合以获得第二混合物，其中，第一混合物与微生物的混合质量比例为1000:8，第二混合物物料的含水量控制在60～65％之间；以及
将所述第二混合物于25~34℃条件下堆积发酵，每隔2天翻动1次，持续发酵21天；即获得所述微生物发酵复合物；
其中，所述微生物为Bacillus sp. TD 3-1和Bacillus sp. TD 3-2；所述Bacillus sp. TD 3-1 于2020年9月30日保藏于中国典型培养物培养中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020563；所述Bacillus sp. TD 3-2 于2020年9月30日保藏于中国典型培养物培养中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2020564；
所述应用的步骤包括：
将所述微生物发酵复合物按每7天1次，每次按5~20g/株的量施于柑橘栽苗盆中，每2周松1次盆土。
2.根据权利要求1所述的应用，所述步骤还包括每2周施用1次颗粒状复合肥，其中复合肥中N:P:K＝15:15:15，施用量为5克/株。
3.根据权利要求1所述的应用，所述步骤还包括日常管理，即期间施用2次海藻有机肥；盆栽苗按常规浇水，保持土壤湿润。
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