CN103773697B - 一株淡紫拟青霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有促进番茄等作物生长功能的淡紫拟青霉菌及其菌剂的制备方法和应用。本发明的菌株淡紫拟青霉菌Paecilomyces lilacinus(Thom)Samson CGMCC No.7994。对番茄等的促生长作用：麦麸与水按1：1比例混合均匀，取适量菌株淡紫拟青霉菌Paecilomyces lilacinus CGMCC No.7994扩大培养后，制备麸皮菌剂。取长势一致的番茄苗，对其根部周围撒播菌剂处理。本发明的菌株为淡紫拟青霉菌，能够显著促进番茄，烟草等的生长，且效果稳定，具有很好的推广应用前景。

Description

一株淡紫拟青霉菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术防治领域，具体涉及一株淡紫拟青霉菌(Paecilomyceslilacinus(Thom)SamsonCGMCCNo.7994)及其菌剂的制备方法及其在防治植物虫害中的应用。
背景技术
多年实践证明：淡紫拟青霉对多种线虫都有防治效能，其寄主有根结线虫、胞囊线虫、金色线虫、异皮线虫，是防治根结线虫最有前途的生防制剂。由于该菌可适应不同的气候条件，对线虫卵具有较高的寄生率，可以有效控制土壤线虫数量，明显减少危害，已被广泛用于生产实践中。
在拟青霉的培养过程中，特别是在特殊培养基与深层发酵培养过程中，该菌能产生丰富的衍生物，其一是类似吲哚乙酸产物，它最显著的生理功效是低浓度时促进植物根系与植株的生长，因此在植物根系施菌不仅能明显抑制线虫侵染，而且能促进植株营养器官的生长，同时对种子的萌发与生长也有促进作用。但此类研究还很有限，有必要加强淡紫拟青霉对植物尤其是经济作物促生长作用的研究
发明内容
本发明的目的在于提供了一株淡紫拟青霉的制备方法。
更进一步的，本发明的目的在于提供了一株淡紫拟青霉的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案采用了一株淡紫拟青霉，Paecilomyceslilacinus，其保藏号为CGMCCNO.7994。菌株鉴别特征如下：
分子***学鉴定：
DNA提取方法：采用石英砂研磨CTAB提取法(Scotteta1.，2000)。
遗传标记：rDNAITS1-5.8S-ITS2，扩增引物：ITS5，ITS4(Whiteeta1.，1990)。
PCR扩增反应条件：先94摄氏度加热3分钟使模板DNA变性，然后进入下列温度循环：94摄氏度变性30秒，50摄氏度退火30秒，72摄氏度延伸45秒，共进行35个循环，最后在72摄氏度延伸5分钟(Wang，2012)。
PCR产物检测和测序：PCR产物与100bpDNAladder(MBIFermentas)用2.0％的琼脂糖凝胶(agarosegel)在O.5×TBE电泳缓冲液中于80V电压下电泳20分钟，然后置于0.5μg/ml的溴乙锭(EB，ehidiumbromide)溶液中染色15分钟，在波长365和254nm的紫外光下检测为明显单一条带的产物由擎科生物技术有限公司纯化后用ABI3700(AppliedBiosystems)进行双向直通测序。
数据处理和统计学分析：原始序列用生物软件Bioedit7.0.9(Hall，1999)编辑后得到准确无误的序列，与GenBank下载的模式和权威菌株序列组成序列数据矩阵。对于序列矩阵，在Bioedit7.0.9下做必要的人工编辑和调整得到的新矩阵。将该矩阵用MEGA5.0(Tamuraeta1.，2011)进行邻居连接法(neighbor-joining，NJ)分析，推断出***发育树，并用自展法(bootstrap)进行1000次重复评估各分支的可靠性。
菌株TRCC23001rDNAITS1-5.8S-ITS2序列如下(见附图1)：
5’-TCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCCCAAACCCACTGTGAACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGAACGCCCCGGCCGCCTGCCCCCGCGCCGGCGCCGGACCCGCGCCCGCCGCAGGGACCCCAAACTCTCTTGCATTACGCCCAGCGGGCGGAATTTCTTCTCTGAGTTGCACAAGCAAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCAGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCTCAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGTTGGGGGACGGCACACCAGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCCCGCCGCAGCCTCCCCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCACCGGAGCGCGGAGGCGGTCCGCGTAAAACGCCCAACTTTCTTAGAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA-3’
***发育树见附图2。
同时，本发明采用了一种淡紫拟青霉菌菌剂的制备方法，麦麸与水按1：1比例混合均匀，取适量置于500毫升三角瓶中，加盖后湿热灭菌(121摄氏度，20分钟)，待麸皮培养基冷至室温后，接入淡紫拟青霉菌孢子悬浮液，置于霉菌恒温培养箱中(28摄氏度)，培养3d后菌丝布满培养基，至第6d孢子基本长好，可以取出待用。
所述的培养基具体成分的组成为硝酸铵1.5克，磷酸氢二钠1克，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5克，氯化钾0.5克，硫酸亚铁0.01克，蔗糖30克，蒸馏水1000亳升。
进一步的，本发明的技术方案采用了淡紫拟青霉菌对防治番茄根结线虫以及促进番茄生长的应用。
本发明将淡紫拟青霉按照常规方法对番茄生长的促进作用进行实验：制备淡紫拟青霉菌剂，对番茄种子预处理，挑选饱满且大小一致的种子在室温培养育苗，
选取长势一致的番茄苗(3～4片叶)置于盆中，每盆1颗番茄苗，在根部周围撒上菌剂，做9个重复，定期测量植株地上部高度。
本发明涉及的淡紫拟青霉对番茄促生长的作用明显优于不添加淡紫拟青霉的对照组。
对照组实验设置：不接菌的麸皮培养基和清水处理。
促生长效果的测定：盆栽试验过程中，除了及时补充水分外，每隔3d测量并记录植株地上部的高度。
每隔3d各处理组番茄植株地上部的累积生长量，淡紫拟青霉麸皮菌剂处理的番茄植株生长速度快，第6d开始，其生长速度明显快于麦麸培养基和清水处理组，每隔3d的生长量超过1cm，第5个3d的生长量达到了2.2cm，而麦麸培养基和清水对照处理的番茄苗则生长缓慢，每3d生长量均在1cm以下，其中生长最快的时候也只有0.6cm。
本发明的菌株：淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位详细地址为：中国，北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2013年08月13日，其保藏号为CGMCCNO.7994。
具体实施方式
实施例1淡紫拟青霉麸皮菌剂对番茄促生长作用
麦麸与水按1∶1比例混合均匀，取适量置于500毫升三角瓶中，加盖后湿热灭菌(121摄氏度，20分钟)，待麸皮培养基冷至室温后，接入淡紫拟青霉孢子悬浮液，置于霉菌恒温培养箱中(28摄氏度)，培养3d后菌丝布满培养基，至第6d孢子基本长好，取出待用。
实施例2淡紫拟青霉麸皮菌剂的应用效果
番茄种子处理：采用温汤浸种法除菌，即将番茄种子在凉水中浸泡10分钟，然后放入50摄氏度的热水中，不断快速地搅动，使种子受热均匀，并随时补充热水，用温度计测水温，使水温稳定在50～52摄氏度，20～30分钟后捞出放在凉水中散去余热，然后浸种在25～30摄氏度的温水中4～6小时。
育苗：挑选饱满，大小接近的番茄种子，放入育苗穴盘，每穴1粒种子，室温下保湿培养。
盆栽用土处理：120摄氏度烘箱中烘4h，静置至室温后，敲碎土壤，按每kg土壤加6g复合肥，混合均匀，装入15×20cm的花盆。
试验设置：选取长势一致的番茄苗(3～4片叶)置于盆中，每盆1颗番茄苗，在根部周围撒上菌剂，试验设淡紫拟青霉麸皮菌剂、不接菌的麸皮培养基和清水三组处理，每组处理9个重复，定期测量植株地上部高度。
盆栽试验过程中，除了及时补充水分外，每隔3d测量并记录植株地上部的高度。
最后应说明的是，以上实例仅用于说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或同等替换，扩展本发明菌种的应用对象，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改和局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
实施例3淡紫拟青霉菌剂对其他植物的促生长作用
制备淡紫拟青霉菌剂方法如上述实施实例1，对以下植物的实验结果如下：
作物 烟草 茶叶 白菜 茄子 黄瓜 草莓 柑橘 柿子 油菜
增产(％) 14.6 13.3 10.7 11.9 10.1 11.7 13.9 12.2 11.1
表1淡紫拟青霉菌剂的促生长效果
注：累积生长量＝生长量平均值±SE，其后的字母为用Dps7.05进行Duncan新复极差分析后的差异显著性，p＜0.05。
附图说明
图1为淡紫拟青霉菌(Paecilomyceslilacinus(Thom)SamsonCGMCCNo.7994)的16SrDNA序列。
图2为淡紫拟青霉菌(Paecilomyceslilacinus(Thom)SamsonCGMCCNo.7994)基于16sRNA序列构建的***发育树。

Claims (4)

1.一株淡紫拟青霉菌，Paecilomyceslilacinus(Thom)Samson，其保藏号为CGMCCNO.7994。
2.权利要求1所述的淡紫拟青霉菌的菌剂的制备方法，其特征在于：麦麸与水按质量比1∶1比例混合均匀，取适量置于500毫升三角瓶中，加盖后在121摄氏度湿热灭菌20分钟，待麸皮培养基冷至室温后，接入淡紫拟青霉菌孢子悬浮液，置于霉菌恒温培养箱中，28摄氏度培养3天后菌丝布满培养基，至第6天孢子基本长好后取出待用。
3.根据权利要求2所述的淡紫拟青霉菌剂的制备方法，其特征在于：所述的培养基具体成分的组成为硝酸铵1.5克，磷酸氢二钠1克，硫酸镁0.5克，氯化钾0.5克，硫酸亚铁0.01克，蔗糖30克，蒸馏水1000毫升。
4.根据权利要求1-3所述淡紫拟青霉菌在促进番茄生长中的应用。
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