CN108676745B - 一株防治小麦茎基腐病和赤霉病的解木糖赖氨酸芽孢杆菌lx024及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种防治小麦茎基腐病和赤霉病的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024及其应用。该菌株为解木糖赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus xylanilyticus），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2017年9月19日，保藏编号为CGMCC No.14645。由LX024菌株液体发酵培养制成的生防菌剂，对防治小麦茎基腐病和赤霉病具有较好效果。在小麦苗期和生长期使用生防菌剂LX024对防治小麦茎基腐病和赤霉病有一定程度的防治效果，防效分别达到65.01%和65.81%。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物领域，涉及一株用于防治小麦茎基腐病和赤霉病的生防解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024及其应用。
背景技术
小麦赤霉病和茎基腐病是由禾谷镰孢菌引起的危害小麦的全球性病害，严重影响小麦的产量和品质。其中小麦茎基腐病是一种由多种病原菌入侵，混合发生的一类复合侵染性土传病害，又被称作镰刀根腐病和镰刀茎基腐病等。该病是一种世界性的重要病害，已有10多个国家报道其发生。在我国，江苏曾报道过小麦茎基褐腐病的危害，根据河南农业大学植物保护学院小麦土传病害课题组调查，该病害在我国黄淮小麦主产区各省份普遍发生。小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌综合物种引起，广泛发生在温暖潮湿和半潮湿地区的一种毁灭性病害。中国长江中下游麦区和东北东部春麦区为该病的主要流行区。近年来随着全球气候变化，小麦赤霉病的发病范围已蔓延到黄淮冬麦区南部。患病小麦严重影响小麦产量和品质，还危及人、畜健康。
目前，对小麦茎基腐病和赤霉病的病害防治主要采取化学防治、选育抗病品种、加强田间管理等措施。但由于育种周期长以及田间管理的局限性，化学防治是最常用的防治方法。化学防治虽能有效控制田间病情的发展，但对生态环境和小麦生产极易造成二次污染，因此，环境友好型的生物防治技术逐渐引起重视。生物防治策略具有生物防治资源来源广泛、环境友好型等特点，各个国家和地区的学者及研究人员都在积极探索和评估生物防治方法在禾谷镰刀菌防治手段上的应用前景和潜在价值。因此生物防治作为新型的小麦赤霉病和茎基腐病防治措施具有很好的生产应用价值。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中没有对小麦赤霉病和茎基腐病有较高防效的生防制剂的现状，提供一种防治小麦茎基腐病和赤霉病的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024及其应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一株防治小麦茎基腐病和赤霉病的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024，经鉴定该菌属于解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024（Lysinibacillus xylanilyticus），该生物材料样品已经保藏并且存活，生物材料分类命名为解木糖赖氨酸芽孢杆菌 Lysinibacillusxylanilyticus，保藏日期为2017年 9月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCC No .14645。
上述的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024在防治小麦茎基腐病和赤霉病或制备用于防治小麦茎基腐病和赤霉病的生防菌剂中的应用。
一种用于防治小麦茎基腐病和赤霉病的生防菌剂，该生防菌剂中包含上述的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024。作为一种优选技术方案，该生防菌剂中的活菌总浓度不低于1×108 CFU/mL。
该菌剂的制备方法为：将上述解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024的种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养基中发酵培养，28℃ 150~200 rpm振荡培养40~48 h，然后5000~6000 rpm离心10~15min，取沉淀即得所述的生防菌剂LX024，用灭菌水进行稀释制成菌剂，成品菌剂中活菌总浓度为1×108~1×109 CFU/mL。
当然，利用所述的防治小麦赤霉病和茎基腐病的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024制备生防菌剂并不限于以上方法。凡是能够大量培养LX024，且保持其生防活性的方法均可用于制备本发明请求保护的生防菌剂。
所述保藏号为CGMCC No.14645 的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024种子菌液的制备方法为：将保藏号为CGMCC No.14645的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024菌株接种到LB 培养液中28℃培养180 rpm振荡培养至 600 nm 处的OD值为 0 .8时结束培养。
一种防治小麦茎基腐病和赤霉病的方法，用所述的生防菌剂对小麦进行接种处理。
将所述的生防菌剂稀释100-200倍后分别在温室和大田环境下对小麦进行接种处理，发病时开始统计病情。解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024对小麦茎基腐病和赤霉病的防效分别为65 .01% 和65 .81%。
本发明的有益效果：
本发明是专门针对小麦赤霉病和茎基腐病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于小麦的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留。
温室实验和大田实验表明：该解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024（CGMCC No . 14645）能显著降低小麦赤霉病和茎基腐病的发生。利用该菌制备的生防菌剂稀释100~200倍进行灌根处理，对小麦茎基腐病和赤霉病的防效分别可达65.01 %和65 .81%。
生物样品保藏信息
一株解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024，分类命名为 Lysinibacillus xylanilyticus，于2017年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为 CGMCCNo .14645。
具体实施方式
实施例1
筛选方法：解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024（CGMCC No . 14645）由江苏省淮安市码头镇小麦根围土中分离获得。将小麦根系切成1cm的小片，用1%的次氯酸钠浸泡5 min，70%酒精浸泡1-2 min，无菌水清洗3次（取最后一次清洗的溶液 100μl 涂于R2A固体培养基上培养，若48 h 后无菌生长则认为表面消毒干净，无菌）。取3 g消毒好的样品置于菌研钵中，加入27ml无菌的0 .85% NaCl，浸软组织，研磨，用无菌的0 .85% NaCl 梯度稀释。取10-1、10-2、10-3 三个梯度的稀释液各100μl 涂于R2A上，28℃培养48 h。挑取最大的单菌落接种到新鲜R2A固体培养基，经反复转接得到纯化菌株。将纯化后的菌株用40%甘油保存于-70℃超低温冰箱中。
鉴定方法：通过形态特征，生理生化实验和16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定。
形态学特征：革兰氏阳性菌，杆状，产生芽孢，菌落为圆形，淡黄色，表面光滑。
基因扩增和序列分析: 解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024在LB培养基中 28℃ 培养至对数期，以12000 r/min离心5 min收集菌体，采用宝生物工程（大连）有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16S rRNA扩增通用引物U8-27 (5’-AGAGTTTGATC (AC) TGGCTCAG-3’)、L1494-1514 (5’-CTACGG (AG)TACCTTGTTACGAC-3’) 从基因组DNA中扩增出16S rDNA基因片段。PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。通过 BLAST 软件对测定 16S rRNA 基因序列进行同源性比较，结果简表，因此，将该菌株鉴定为解木糖赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus xylanilyticus）。
表1 LX024测序比对结果
| 菌株 | 最相似菌株及登录号 | 相似度(%) |
| LX024 | Lysinibacillus xylanilyticus KX703024 .1 | 99 |
实施例2 LX024生防菌剂的制备
将解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024（CGMCC No.14645）菌株接种到LB培养液中28℃180rpm 振荡培养16 h后，每隔2 h在超净工作台中取样测其在600 nm处的OD值，当OD值为0.8时结束培养，此菌液作为种子菌液。把种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28℃、180 rpm 培养48h，然后6000 rpm离心10 min，取沉淀即得所述的生防菌剂LX024。用灭菌水进行稀释生防菌剂LX024，所得生防菌剂中活菌总浓度为 1×108~1×109CFU/mL。
实施例3 温室和小区试验生防菌LX024对小麦赤霉病和茎基腐病的防效
实验1：温室试验检测LX024对小麦茎基腐病的防效（2016 .09-2016 .12）
地点：淮阴工学院生科学院温室
温室盆栽实验：将小麦种子先用无菌水冲洗两遍，用75%酒精清洗两分钟灭菌后重复用无菌水冲洗三遍，消毒后的小麦种子在培养皿中培养发芽。播种至盆钵中，生长至二叶一心期接种生防细菌。一周后接种病原菌，7d后进行观察统计一个月。温室（温度25 ℃）培养小麦苗每盆三株，在二叶一心期时，生防菌LX024菌液和对照组灌根处理，每个处理重复三次，7d后接种病原菌，接种后在25 ℃下采取保湿48h，温室生长。每天对小麦茎基部茎基腐病进行观察调查。
小麦茎基腐病调查依据《小麦赤霉病测报技术规范》(GB/T 15796-2011)结合本实验的实际情况，记录分析试验数据。
0级，外层叶鞘无明显症状；
1级，第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/4；
2级，第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/4—1/2；
3级，第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/2—3/4；
4级，第一叶鞘全部脱绿腐烂；
5级，第三叶鞘有明显褐枯或全株枯死,
病害严重程度(病情指数)=Σ（病级数×该病级植株数）/（最高病级数×总植株数）×100%
生防效果=（对照组病害严重度—处理组病害严重度）/对照组病害严重度×100%
注：计算不同处理的病情指数及防效，并利用DPS数据分析软件进行差异显著性分析及多重比较。
在生防菌剂LX024处理15天后的调查结果显示，生防菌剂 LX024对小麦茎基腐病的生物防治效果（以下简称防效）达到 65 .01%（表2）。
表2 生防菌剂LX024对小麦茎基腐病的生防效果
| 处理 | 病害严重度% | 防效% |
| LX024菌剂 | 21 .57±2 .33b | 65 .01 |
| 对照 | 61 .63±3 .05a | --- |
实验2：田间小区试验检测LX024对小麦赤霉病的防效（2016 .10-2017 .05）
地点：淮阴工学院农学试验田
试验地前茬为玉米，土壤质地为砂壤土。2014年10月24日：小麦播种，播种密度为100粒·m-1，行间距为25cm，两行行间施种肥（复合肥）10g；2014年11月14日：小麦间苗，间苗至70-80株·m-1；11月23日：施分蘖肥，行间施尿素5g。其他管理按照淮安市本地高产栽培方式进行。
试验田15m×10m=150m2，试验田四周种植保护行。本试验2个处理，每个处理4个重复。
本试验选择小麦品种为淮麦27；赤霉病菌接种时期为小麦扬花期，进行单花滴注接种，接种前各品种均未发病，每穗接种中部小穗的2个小花，每个处理小区均接种20穗，接种生防菌 LX024 并保湿 1d后 接种病原菌；21d 后，每个处理小区取样 10株。对照及每个处理重 4次。
表3 小麦赤霉病病害严重度分级
| 严重度分级 | 赤霉病病害症状描述 |
| 0 | 穗部无明显可见发病症状 |
| 1 | 仅接种小穗或相邻小穗发病 |
| 2 | 发病小穗占穗长的1/4以下 |
| 3 | 发病小穗占穗长的1/4-1/2 |
| 4 | 发病小穗占穗长的1/2以上 |
病害严重程度(病情指数)=Σ（病级数×该病级植株数）/（最高病级数×总植株数）×100%
生防效果=（对照组病害严重度—处理组病害严重度）/对照组病害严重度×100%
注：计算不同处理的病情指数及防效，并利用DPS数据分析软件进行差异显著性分析及多重比较。
在生防菌剂 LX024 第1次处理 35天后的调查结果显示，生防菌剂 LX024 对小麦赤霉病的生物防治效果（以下简称防效）达到 65 .81%（表4）。
表4 生防菌剂LX024对小麦赤霉病的生防效果
| 处理 | 病害严重度% | 防效% |
| LX024菌剂 | 20 .94±1 .56b | 65 .81 |
| 对照 | 61 .24 ±1 .43a | --- |
Claims (7)
1.一株防治小麦茎基腐病和赤霉病的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024，经鉴定该菌株属于解木糖赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus xylanilyticus），2017年 9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No .14645。
2.权利要求1所述的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024在防治小麦茎基腐病和赤霉病中的应用。
3.权利要求1所述的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024在制备用于防治小麦茎基腐病和赤霉病的生防菌剂中的应用。
4.一种用于防治小麦茎基腐病和赤霉病的生防菌剂，其特征在于，该生防菌剂中包含权利要求1所述的解木糖赖氨酸芽孢杆菌LX024。
5.根据权利要求4所述的用于防治小麦茎基腐病和赤霉病的生防菌剂，其特征在于，该生防菌剂中的活菌总浓度不低于1×108 CFU/mL。
6.权利要求4或5所述的生防菌剂在防治小麦茎基腐病和赤霉病中的应用。
7.一种防治小麦茎基腐病和赤霉病的方法，其特征在于，用权利要求4或5所述的生防菌剂对小麦进行接种处理。
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