CN116287311A - 一组微卫星标记、其检测引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，提供了一种进行近交衰退风险评估或者遗传评估的方法，以及在该方法中采用的微卫星标记组合或者引物组合。本发明将牛23号染色体的微卫星标记由已知的6个增加至34个，基本覆盖了整个牛23号染色体，大大提高了微卫星标记的密度，并且空间分布均匀性好。使用本发明筛选获得的28个微卫星标记可以预防近交衰退造成的经济风险，提前对不同个体的近交程度进行遗传评估，对群体的遗传多态性进行更精确的评估，为养牛过程的科学决策提供依据。

Description

一组微卫星标记、其检测引物及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记的开发与利用，特别是涉及一组微卫星标记、其检测引物及其应用。

背景技术

现代养牛中近交衰退是一个严重的问题。造成近交衰退的原因主要有两方面，一方面是人工繁殖技术的使用，由于人工授精技术的使用，配种时一头公牛的***用于好几万头母牛，超数***又加剧了对母牛的利用；另一方面是在育种环节，无论采用基因组选择、系谱选择、最佳线性无偏估计、还是分子标记辅助选择，都属于淘汰性选择技术，随着育种过程的实施，一些重要的基础群、核心群遗传方差逐步下降。上述因素综合在一起导致了近交衰退在养牛业中成了一种非常普遍的现象。近交衰退的具体表现有牛胚胎死亡、母牛流产、犊牛畸形、生产水平下降等等。在人类的习惯性流产分子机制上已经确认多个MHC基因座的杂合子缺失会导致孕妇不能产生保护胎儿的封闭性抗体，从而引发流产。

在养牛业中，利用分子标记进行遗传评估被应用于引种、育种核心群构建、扩繁群构建、近交风险评估、个体识别、谱系构建、遗传多样性评估等许多环节，其中主要组织相容性复合体(MHC,Major Histocompatibility Complex)在所有分子标记中具有举足轻重的地位，它是脊椎类动物基因组中遗传多态性最高的一个区域，这也决定了该区域是一个物种的群体遗传多态性变化最具有敏感性的区域，其具有紧密连锁且呈单体型遗传的特征。在牛基因组中MHC区域位于第23号染色体，该区域遗传多态性与多种经济性状及抗病力具有广泛的联系。

因此，如何利用MHC区域以及MHC的扩展区的DNA多态性成为牛分子标记开发与利用中的一个热点。微卫星是使用最为广泛的分子遗传标记之一。要发现单个对基因组物理位置、遗传多态性水平及生物学性状相关性不做任何要求的微卫星很容易，但是不同分子遗传标记的组合对同一遗传指标的计算结果是不尽相同的，相应的遗传评估效果是否能够满足实际需求也是不一定的。另外，由于潜在的微卫星本身的数量众多，如何筛选出一套微卫星标记同时满足遗传多态性水平、分子标记密度合理、标记均匀性恰当、覆盖范围充分，且遗传评估效果能够满足实际需求并非易事。

当前，在牛的MHC区域中，已报道的微卫星标记仅有6个，即BF1，BM1258，DYMS1，BM1818，BM1443，BM1905。牛第23号染色体全长约60000000bp，在牛的基因组中MHC区域的物理位置范围大致位于第7000000～28000000bp。已有学者利用其中部分微卫星标记进行牛MHC单倍型分型和遗传多态性评估。在育种实践中，如何提高选择准确性是项目成功的关键，而要实现选择准确性则必须提高基因分型的准确性，因此以MHC区域DNA多态性为育种的分子标记必须提高该区域的单倍型分辨率。单倍型是指在一条染色体上不同多态性标记的等位基因组合。在基因与表型的关系研究中，较长范围与高分辨率的单倍型往往对构建基因与表型的关系方面具有更佳的表现。

目前现有的6个微卫星标记在牛23号染色体上覆盖的范围小，且标记密度低，无法覆盖牛MHC的扩展区以及23号染色体全长范围，无法识别牛基因组第23号染色体第7000000-28000000碱基之外的DNA多态性产生的不同单倍型，从而导致不同单倍型混淆的情况。这导致仅使用现有的这6个微卫星标记对牛MHC分型容易产生其所覆盖的区域与其他区域出现假的连锁不平衡关系，这对选种过程或其他遗传评估会产生误导。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，提供一套能满足遗传多态性水平、分子标记密度合理、标记均匀性恰当、覆盖范围充分，且遗传评估效果能够满足实际需求的微卫星标记。

微卫星(microsatellite)是高等生物基因组内一类长度较短、变异性极高的DNA序列。通常由2～6个核苷酸为重复单位呈串联重复形式存在，所以也被称为简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)或串联重复序列(Short Tandem Repeat，STR)。

微卫星标记是当前应用极为广泛的多态DNA标记，具有以下显著特点：

1、在高等生物的基因组内广泛分布，据估计大约每间隔10-50kb就存在一个微卫星标记，2004年公布的牛遗传图谱已包含3802个微卫星标记；

2、多态性高，信息含量丰富，许多微卫星都具有5个以上等位基因；

3、呈共显性遗传，易于区分纯合型和杂合型；

4、通过PCR扩增和电泳分型，可直接获得个体基因型，检测简便；

5、大部分微卫星标记是位于基因组非编码区，不受自然选择和人工选择的影响，是一种中性标记。

因此，在人类法医学鉴定、动物系谱确认等遗传检测中，微卫星标记具有不可替代的作用。

此外，微卫星检测所需检材量少，灵敏度和成功率高，且适用于各种来源的生物性检材。

为此，本发明一方面提供了一种覆盖牛23号染色体全长序列的微卫星标记组合。

在本发明优选的实施方案中，所述微卫星标记组合包含微卫星标记BANX001-BANX028。

在本发明更加优选的实施方案中，所述微卫星标记BANX001-BANX028分别包含SEQID NO.1-28所示的序列。

微卫星标记的检测包括PCR扩增和基因分型两个步骤。针对亲子鉴定、个体鉴定或群体遗传变异分析等情况，通常需要对多个微卫星座位进行扩增和检测，工作量大、试验成本高。

为此，本发明另一方面提供了一种对覆盖牛23号染色体全长序列的微卫星标记组合进行检测的引物组合。

在本发明优选的实施方案中，所述引物组合包含SEQ ID NO.29-84所示的引物序列。

目前，商品化的牛微卫星标记检测试剂盒还比较少，存在两个突出问题：

1、试剂盒标记座位相对固定，无法针对特殊检测需要增加标记数量；

2、试剂盒价格昂贵，检测成本高。

这些缺点限制了试剂盒在牛育种实践和科学研究中的应用。

为此，本发明另一方面提供了一种包含本发明所述的微卫星标记组合或者包含本发明所述的引物组合的试剂盒。

在牛的MHC区域中，目前已报道的微卫星标记仅有BF1、BM1258、DYMS1、BM1818、BM1443、BM19056这6个。对于牛23号染色体而言，这6个微卫星标记覆盖率差，微卫星标记的密度低，并且空间分布均匀也不好。因此，如果仅仅使用这6个微卫星标记，无法有效地进行近交衰退风险评估以及遗传评估。

为此，本发明另一方面提供了本发明所述的微卫星标记组合、引物组合或者试剂盒在进行近交衰退风险评估中的应用。

在本发明优选的实施方案中，上述应用为在进行牛近交衰退风险评估中的应用。

本发明另一方面提供了本发明所述的微卫星标记组合、引物组合或者试剂盒在进行遗传评估中的应用。

在本发明优选的实施方案中，上述应用为在进行牛遗传评估中的应用。

单倍型是单倍体基因型的简称，在遗传学上是指在同一染色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因的组合。

单倍型多样度是衡量一个群体变异程度的重要指标。单倍型多样度是指样本中随机抽取到两个不同单倍型的频率。单倍型多样性高的群体说明其遗传多样性高，遗传资源丰富。

为此，本发明另一方面提供了一种对MHC区域以及MHC扩展区进行遗传多态性测定的方法，包括采用本发明所述的微卫星标记组合、引物组合、或者试剂盒对生物样本进行检测分析。

在本发明优选的实施方案中，上述检测分析为对来自牛的样本进行检测分析。

近交衰退产生的原因是近交增加了有害等位基因的纯合几率，导致个体适应能力下降，同时这也是近亲交配产生致病基因的原因之一。种群变小是导致近交衰退的主要原因，在实际研究中发现近交衰退并非一定明显表现出来，这提示我们近交衰退与生态及遗传密切相关。

为此，本发明再一方面提供了一种进行近交衰退风险评估或者遗传评估的方法，包括采用本发明所述的微卫星标记组合、引物组合、或者试剂盒对生物样本进行基因分型分析。

在本发明优选的实施方案中，上述基因分型分析为对来自牛的样本进行基因分型分析。

本发明通过采用上述技术方案，获得了以下的有益效果：

1、本发明将牛23号染色体的微卫星标记由已知的6个增加至34个，使得牛MHC区域微卫星标记密度提高至15个，同时在MHC区域之外，另有13个微卫星标记覆盖了牛23号染色体2000000碱基至58500000碱基，基本覆盖整个牛23号染色体，大大提高了微卫星标记的密度。此外，不同微卫星标记的物理间隔约500000-2000000bp，微卫星标记的空间分布均匀性好。

2、本发明在28个微卫星标记的基础上筛选获得的对所述微卫星标记进行检测的引物特异性好，扩增稳定性好。

3、与仅使用现有的6个微卫星标记相比，使用本发明筛选获得的28个微卫星标记对牛MHC及扩展区进行单倍型测定，可以实现更高的单倍型分辨率，可以对个体水平的近交程度进行更有效的预测，对近交程度严重的个体提前进行筛选，对群体的遗传多态性进行更精确的评估，进而为养牛过程的科学决策提供依据。

附图说明

图1为以1-2G-1为样本对座位BANX001进行测序的部分测序图谱。

图2为以1-4G-1为样本对座位BANX001进行测序的部分测序图谱。

图3为以1-3G-1为样本对座位BANX001进行测序的部分测序图谱。

图4为以5-1G-1为样本对座位BANX005进行测序的部分测序图谱。

图5为以5-10M-1为样本对座位BANX005进行测序的部分测序图谱。

图6为以6-1G-1为样本对座位BANX006进行测序的部分测序图谱。

图7为以6-2G-2为样本对座位BANX006进行测序的部分测序图谱。

图8为以7-2G-1为样本对座位BANX007进行测序的部分测序图谱。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本申请进一步详细说明。通过这些说明，本申请的特点和优点将变得更为清楚明确。

实施例1：微卫星标记的筛选

在NCBI数据库中下载文库号为CM024457.1的牛23号染色体fasta序列，使用SSR_pipeline 0.951(https://pubs.usgs.gov/ds/778/downloads/)软件进行微卫星位点筛选，筛选的位点重复单位长度分别为2核苷酸、3核苷酸和4核苷酸。再根据基因组物理位置分布的均匀性，筛选出28个SSR标记，分别命名为：BANX001、BANX002、BANX003、BANX004、BANX005、BANX006、BANX007、BANX008、BANX009、BANX010、BANX011、BANX012、BANX013、BANX014、BANX015、BANX016、BANX017、BANX018、BANX019、BANX020、BANX021、BANX022、BANX023、BANX024、BANX025、BANX026、BANX027、BANX028。

微卫星标记BANX001-BANX028的核苷酸序列如表1所示。

表1微卫星标记BANX001-BANX028的核苷酸序列表

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微卫星标记BANX001-BANX028在基因组23号染色体上的物理位置如表2所示。

表2微卫星标记BANX001-BANX028在基因组中的物理位置

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由表2可知，微卫星标记BANX001-BANX025可以均匀的将牛基因组第23号染色体从头至尾覆盖。

实施例2：微卫星标记扩增引物的筛选

利用Primer5.0软件对28个微卫星标记BANX001-BANX028批量设计扩增引物，PCR扩增产物的长度为500bp以内，引物GC的含量为40％-60％，无回文结构。

对筛选出的扩增引物在NCBI数据库中采用引物BLAST进行特异性验证。扩增的PCR产物适合在毛细管电泳仪进行基因分型。所述的微卫星标记扩增引物序列如表3所示。

表3微卫星标记BANX001-BANX028的扩增引物核苷酸序列表

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利用16个西门塔尔牛的基因组DNA样本对28个微卫星标记引物的扩增稳定性与多态性进行PCR实验与毛细管电泳分型验证。其中，PCR扩增程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃-63℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸7min，PCR反应体系如表4所示。

表4微卫星位点PCR扩增反应体系

为验证从NCBI数据库中筛选到的位点的序列信息的可靠性，我们对PCR产物进行了一代测序，测序服务商为上海生工生物工程有限公司，部分测序结果如附图1-8所示。

结果显示各个位点扩增稳定，多态性良好，各个位点的PCR产物大小范围如表5所示。

表5 28个微卫星位点PCR产物大小

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实施例3：近交衰退风险的遗传学评估

根据现有的6个牛MHC微卫星标记对362个样本进行筛选，其中172个样本为青海柴达木福牛，160个样本为北京华牛天俊窦店肉牛养殖基地安格斯牛，27个样本为内蒙古通辽地区农民自养的西门塔尔牛，3个样本为黄牛。

从上述362个样本中筛选出10个样本，采用现有的6个微卫星标记构建这10个样本的单倍型，单倍型结果显示都是相同的。然后采用本发明筛选得到的28个微卫星标记进行毛细管电泳基因分型，并同时采用Arlequin3.5软件进行单倍型推断，结果如表6所示。

表6 10个样本的基因分型结果

注：表6中仅有1个等位基因表示该座位是纯合子，没出现在表中的微卫星标记在所有样本中基因型均相同。

根据表6可知，当采用现有的6个牛MHC微卫星标记(BF1、BM1258、DYMS1、BM1818、BM1443、BM1905)对这10个样本进行基因分型时，全部10个样本均仅有1个等位基因，被鉴定为纯合子。而在采用本发明筛选得到的28个微卫星标记进行基因分型时，样品ID为10的样本在BANX001、BANX0019、BANX022、BANX025 4个座位表现为杂合，杂合度最高；其次为样品ID为6的样本，在BANX022、BANX025 2个座位表现为杂合。经核实，样品ID为10的样本和样品ID为6的样本都属于黄牛。样品ID为3的样本在BANX001、BANX0019、BANX022、BANX025 4个座位的杂合度最低。经核实，属于西门塔尔牛。样品ID分别为1、2、7、8的样本为柴达木福牛，样品ID为5和9的样本为安格斯牛、样本ID为4的样本为西门塔尔牛，它们分别在BANX001座位表现为杂合。

在牛类的养殖实践中，较高的近交程度意味着更高的近交衰退风险。因此，根据表6的分型结果，如果按照现有的6个牛MHC微卫星标记进行基因分型，则无法提前淘汰任何可能引起近交衰退风险的样本。而采用本发明筛选得到的28个微卫星标记进行基因分型，在养殖实践中可以将样品ID为3的样本提前淘汰，从而提前避免了近交衰退风险，避免了经济损失。

单倍型多样度定义为一组序列同时抽取出2个不同单倍型序列的比率，是一个常用的可以对群体样本进行遗传多样性评估的指标，单倍型多样度高的群体说明其遗传多样性高，遗传资源丰富。根据该定义，如果利用现有的6个微卫星标记对这10个样本进行单倍型多样度计算，其值为0；如果联合本发明筛选的28个微卫星标记，其单倍型多样度为0.667，显然本发明所采用的一套微卫星标记可对牛23号染色体遗传多样性进行更合理的评估，从而为养牛实践中群体构建提供更加丰富的遗传资源，以满足辅助养牛实践中群体构建的评估需求。

进一步对表6的分型结果从连锁不平衡的衰减特征进行分析，当联合使用28个微卫星标记时，除样品ID为3的样本之外，可探测到仅使用现有6个微卫星标记所不能探测到的连锁不平衡的衰减特征，而样品ID为6和10的样本品种为黄牛，其连锁不平衡特征表现出了具有更短的Block结构，这种特征符合地方品种的遗传特点，为进一步的品种改良和性状优化提供了丰富的遗传资源。

以上结合了优选的实施方式对本申请进行了说明，不过这些实施方式仅是范例性的，仅起到说明性的作用。在此基础上，可以对本申请进行多种替换和改进，这些均落入本申请的保护范围内。

Claims (14)

1.一种覆盖牛23号染色体全长序列的微卫星标记组合。

2.根据权利要求1所述的微卫星标记组合，其包含微卫星标记BANX001-BANX028。

3.根据权利要求1或2所述的微卫星标记组合，其中微卫星标记BANX001-BANX028分别包含SEQ ID NO.1-28所示的序列。

4.一种对覆盖牛23号染色体全长序列的微卫星标记组合进行检测的引物组合。

5.根据权利要求4所述的引物组合，其包含SEQ ID NO.29-84所示的引物序列。

6.一种包含权利要求1-3中任一项所述的微卫星标记组合或者包含权利要求4或5所述的引物组合的试剂盒。

7.权利要求1-3中任一项所述的微卫星标记组合、权利要求4或5所述的引物组合、或者权利要求6所述的试剂盒在进行近交衰退风险评估中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其中所述应用为在进行牛近交衰退风险评估中的应用。

9.权利要求1-3中任一项所述的微卫星标记组合、权利要求4或5所述的引物组合、或者权利要求6所述的试剂盒在进行遗传评估中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中所述应用为在进行牛遗传评估中的应用。

11.一种对MHC区域以及MHC扩展区进行遗传多态性测定的方法，包括采用权利要求1-3中任一项所述的微卫星标记组合、权利要求4或5所述的引物组合、或者权利要求6所述的试剂盒对生物样本进行检测分析。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的检测分析为对来自牛的样本进行检测分析。

13.一种进行近交衰退风险评估或者遗传评估的方法，包括采用权利要求1-3中任一项所述的微卫星标记组合、权利要求4或5所述的引物组合、或者权利要求6所述的试剂盒对生物样本进行基因分型分析。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的基因分型分析为对来自牛的样本进行基因分型分析。

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