CN112980962A

CN112980962A - 一种与猪初生重性状相关的snp标记及应用

Info

Publication number: CN112980962A
Application number: CN201911277000.5A
Authority: CN
Inventors: 王然; 杨漫漫; 魏强
Original assignee: Shenzhen Huada Agricultural Application Research Institute; BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Huada Agricultural Application Research Institute; BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2039-12-12
Also published as: CN112980962B

Abstract

本申请公开了一种与猪初生重性状相关的SNP标记及应用。本申请与猪初生重性状相关的SNP标记，位于猪国际基因组11.1版本参考序列的第4号染色体上第112031589核苷酸位点，具有G或A多态性。本申请与猪初生重性状相关的SNP标记，可以用于仔猪的初生重量预测和猪的分子标记辅助选择选育。采用本申请的SNP标记进行育种，不仅可缩短育种时间，提高选育准确性；而且不易受其他外界环境等因素影响；能够更有效的提高仔猪的初生重量，从而提高成活率、断奶重和育肥效果，对猪的养殖生产具有重大意义。采用本申请的SNP标记进行辅助育种，可进行早期选育，及时淘汰，减少育种成本，快速获得纯合亲本，提高育种效率和质量。

Description

一种与猪初生重性状相关的SNP标记及应用

技术领域

本申请涉及猪育种技术领域，特别是涉及一种与猪初生重性状相关的SNP标记及应用。

背景技术

猪肉含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质，是我国居民日常生活中主要的副食品。虽然我国的人口增长速度在减缓，但人口数量仍然处于持续增长的状态，对猪肉的需求也将保持增长状态。所以养殖产业需要提高优质猪肉的供给能力。

仔猪出生时的体重即猪初生重，是衡量猪的一个重要数量性状，影响猪一生的生长发育、生产性能和胴体等级等。猪初生重与猪肉的出栏重呈正相关，与出栏日龄呈负相关。据报道，初生重低于1.0kg的仔猪，大多生长发育不良，初生重1.5kg以上则发育明显较好。研究表明，仔猪初生重与断奶成活率、断奶重、出栏重之间都具有积极的正相关性；仔猪初生重每增加0.1kg，断奶重将提高1kg，出栏重将提高10kg。因此有针对性的对提高仔猪初生重，可使得仔猪有更高的成活率和更优良的生产性能，进而为生产者带来更大的经济效益。

仔猪初生重是一个复杂的数量性状，由多基因共同调控，且受到品种、胎次、营养及环境等诸多因素的影响。传统的育种方法多采用传统表型选育技术，即根据后代表型信息推断亲本生产力，选育周期长，遗传进展缓慢。采用分子标记辅助选择(maker assistedselection，MAS)进行选育，其优势在于不易受其他外界环境等因素的影响，可缩短育种时间，提高选育的准确性。利用MAS技术改良种猪的初生重性状，仔猪的初生重越大，成活率越高、断奶重越大、育肥效果越好，对养殖生产中经济效益的提升具有重大意义。

因此，亟需对影响猪初生重的基因和分子标记进行深入的研究和挖掘，以满足猪的分子标记辅助选择育种需求。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的与猪初生重性状相关的SNP标记及应用。

本申请具体采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种与猪初生重性状相关的SNP标记，该SNP标记位于猪国际基因组11.1版本参考序列的第4号染色体上第112031589核苷酸位点，具有G或A多态性。

需要说明的是，本申请通过对674头母猪的139634个SNP标记进行研究，最终得出母猪的第4号染色体上第112031589核苷酸位点与其所产仔猪的猪初生重性状直接相关。研究显示，该SNP位点的多态性为G或A，并且，AA基因型的母猪所产仔猪的猪初生重显著大于AG基因型或GG基因型的母猪。

优选的，本申请的SNP标记位于SEQ ID No.1所示序列自5’端起的第127位碱基。

需要说明的是，SEQ ID No.1所示序列的第127位碱基，只是为了更简单、明了的展示出本申请的SNP标记。SEQ ID No.1所示序列只是本申请的一种实现方式中，具体设计的SNP标记检测引物的扩增序列；可以理解，如果采用不同的检测引物，本申请SNP标记的位置可能不是在第127位碱基；但是，如果按照猪国际基因组11.1版本参考序列，本申请的SNP标记的准确位置即第4号染色体上第112031589核苷酸位点。

优选的，本申请的SNP标记为AA基因型的母猪所产仔猪的猪初生重显著大于AG基因型或GG基因型的母猪。

本申请的第二方面公开了一种检测本申请的SNP标记的引物对，该引物对的上游引物为Seq ID No.2所示序列，下游引物为Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.2：5’-TCTTCGGGTCAGAAAGAGA-3’

Seq ID No.3：5’-CTTCCTGCAGATATTGGGG-3’。

需要说明的是，Seq ID No.2所示序列和Seq ID No.3所示序列的引物对只是本申请的一种实现方式中，能够将本申请的SNP标记包含其中的引物对；可以理解，一方面，在本申请引物对的基础上，本领域技术人员可以根据需求在其5’端或3’端进行若干碱基的增减，只要不影响PCR扩增即可；另一方面，针对本申请的SNP标记，不排除还可以设计其它的引物对，只要能够在扩增的靶标序列中包含本申请的SNP标记，能够实现本申请的SNP标记检测即可。

本申请的第三方面公开了一种检测本申请的SNP标记的试剂盒，该试剂盒中包括本申请的引物对。

优选的，本申请的试剂盒中还包括用于PCR扩增的试剂。

需要说明的是，本申请的引物对能够用于检测本申请的SNP标记，因此，为了使用方便可以将其组装成检测本申请的SNP标记的试剂盒；原则上，试剂盒中可以包含检测所需的所有试剂，例如PCR扩增试剂，以方便使用；但是，可以理解，除了本申请的引物对以外，其它试剂都可以直接购买获得；因此，本申请的试剂盒中除了本申请的引物对以外，其它试剂可以根据产品设计需求组装，在此不作具体限定。

本申请的第四方面公开了一种检测本申请的SNP标记的方法，包括采用本申请的引物对，或者本申请的试剂盒，对待测母猪的基因组DNA进行PCR扩增，通过对PCR扩增产物序列的测定，获得本申请的SNP标记的碱基情况。

可以理解，对基因组DNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行测序，获得SNP标记的碱基信息，是比较常规且准确性较高的获知SNP标记碱基信息的方式，不排除还可以采用其它方式获得本申请的SNP标记的碱基信息，例如在进行PCR扩增后，对扩增产物进行质谱分析获得本申请的SNP标记的碱基信息，在此不作具体限定。

本申请的第五方面公开了一种预测仔猪的猪初生重的方法，包括采用本申请的引物对，或者本申请的试剂盒，对母猪的基因组DNA进行PCR扩增，通过对PCR扩增产物序列的测定，获得本申请的SNP标记的碱基情况，根据本申请的SNP标记的碱基情况预测母猪所产仔猪的猪初生重。

需要说明的是，本申请的研究显示，AA基因型的母猪所产仔猪的猪初生重显著大于AG基因型或GG基因型的母猪；因此，采用本申请的预测仔猪的猪初生重的方法，通过检测母猪的SNP标记的基因型，可以大概预测其所产仔猪的猪初生重。但是，可以理解，仔猪的猪初生重是一个复杂的数量性状，除了本申请的SNP标记的基因型影响以外，还受品种、胎次、营养及环境等诸多因素的影响；因此，本申请的预测仔猪的猪初生重的方法，一方面，仅仅是对同等或近似条件下母猪的仔猪的猪初生重进行预测和评估；另一方面，本申请的预测仔猪的猪初生重的方法，仅仅是统计学意义上的，对猪育种有重要意义的预测，并非准确的预测每头仔猪的猪初生重的具体重量。

本申请的第六方面公开了本申请的SNP标记在猪初生重预测或猪的分子辅助筛选育种中的应用。

可以理解，本申请的研究显示，本申请的SNP标记与猪初生重性状紧密相关，因此，可以将其用于猪初生重预测或猪的分子辅助筛选育种。采用本申请的SNP标记进行猪的分子辅助筛选育种，与传统的育种方法相比，可缩短育种时间，提高选育的准确性，且不易受其他外界环境等因素的影响；采用本申请的SNP标记，利用MAS技术改良种猪的初生重性状，提高仔猪的初生重，从而提高成活率、断奶重和育肥效果等，对养殖生产经济效益的提升具有重大意义。

本申请的第六方面公开了本申请的引物对或本申请的试剂盒在猪初生重预测或猪的分子辅助筛选育种中的应用。

可以理解，本申请的引物对和试剂盒都是用于检测本申请的SNP标记，而本申请的SNP标记与猪初生重性状紧密相关，因此，本申请的引物对和试剂盒可以用于猪初生重预测或猪的分子辅助筛选育种。

本申请的有益效果在于：

本申请与猪初生重性状相关的SNP标记，可以用于仔猪的初生重量预测和猪的分子标记辅助选择选育。采用本申请的SNP标记进行育种，不仅可缩短育种时间，提高选育准确性；而且不易受其他外界环境等因素影响；能够更有效的提高仔猪的初生重量，从而提高成活率、断奶重和育肥效果，对猪的养殖生产具有重大意义。采用本申请的SNP标记进行辅助育种，可进行早期选育，及时淘汰，减少育种成本，快速获得纯合亲本，提高育种效率和质量。

附图说明

图1是本申请实施例中与猪初生重性状显著相关的SNP标记的曼哈顿图；

图2是本申请实施例中所设计引物对三种基因型的母猪的基因组DNA进行PCR扩增的扩增产物部分琼脂糖凝胶电泳图；

图3是本申请实施例中所设计引物对三种基因型的母猪的基因组DNA进行PCR扩增的扩增产物部分测序结果图。

具体实施方式

分子标记辅助选择(maker assisted selection，MAS)进行选育，即MAS技术，相对传统的根据后代表型信息推断亲本生产力的育种方式而言，MAS技术可根据定位到的显著相关位点，对候选群体进行分型鉴定，可进行早期选育，及时淘汰，减少育种成本，快速获得纯合亲本，提高育种进度。但是，并非所有的性状都具有显著相关位点，或者并非所有性状都能够有效的对应或研发出相关的SNP位点，从而用于分型鉴定和分子标记辅助育种。

本申请在对仔猪的初生重量进行大量的研究和试验的过程中发现，位于猪国际基因组11.1版本参考序列的第4号染色体上第112031589核苷酸位点与猪初生重性状紧密相关，并且，研究显示，该位点具有G或A多态性，AA基因型的母猪所产仔猪的猪初生重显著大于AG基因型或GG基因型的母猪。基于以上研究，本申请提出了一种与猪初生重性状相关的SNP标记，即第4号染色体上第112031589核苷酸位点，也就是本申请的SEQ ID No.1所示序列自5’端起的第127位碱基。

本申请的SNP标记与猪初生重紧密相关，通过该SNP标记的检测，可以预测仔猪的初生重量，也可以用于猪的分子标记辅助育种，选育AA基因型的母猪，提高仔猪的初生重量，提高仔猪成活率、断奶重和育肥效果。采用本申请的SNP标记进行育种，可进行早期选育，及时淘汰，减少育种成本，快速获得纯合亲本，提高育种效率和质量。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、猪初生重相关SNP位点的获得

本例选择453头大白和221头长白共计674头母猪，通过标准体重秤，称取其后代仔猪出生2小时的体重，作为猪初生重性状表型值。猪初生重相关SNP位点的研究如下：

1.基因组DNA提取

采集黄豆大小的组织样，保存于75％乙醇中备用。DNA提取采用长春志昂生物科技有限公司，货号为GO-BTCD-400的血液/组织DNA磁珠提取试剂盒，按照说明书标准流程进行提取。提取后的DNA应用INVITROGEN公司Qubit^TM dsDNAHS Assay Kit试剂盒进行定量，-20℃保存。

2.猪全基因组测序分型

利用限制性位点相关DNA测序技术(Restriction-site associated DNAsequencing,RAD-seq)，按照MGIEasy简化基因组文库制备试剂盒标准流程进行建库，采用BGISEQ-500测序平台对猪耳组织样提取的基因组DNA进行双端测序(PE100)。

测序数据下机后，根据标签序列提取个体数据，并过滤掉低质量测序片段，然后采用BWA软件(Li,Durbin,2009)将高质量片段比对到国际猪参考基因组11.1版本(Sscrofa11.1)上；然后，采用gatk进行变异检测，本例从674头母猪的基因组DNA测序结果中初步得到4199546个SNP标记。

对初步得到4199546个SNP标记，按照硬过滤条件：“QUAL<30||QD<2.0||FS>60.0||MQ<40.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0”进行硬过滤，去除假阳性位点，得到3949591个质量较高的SNP标记。

采用vcftools软件，按照最小等位基因频率为0.05(maf＝0.05)、SNP检出率为0.5(snp call rate＝0.5)、哈代温伯格平衡系数为10^-6(hwe＝10^-6)的质控标准进行质量控制，最后，进一步筛选得到140948个SNP标记。

采用Beagle软件对缺失基因型进行填充，并在填充后按照相同质控标准进行二次质控，最终得到139634个高质量SNP标记备用。

3.猪初生重的全基因关联分析：

使用EMMAX程序(http://genetics.cs.ucla.edu/emmax/index.html)对母猪初生重进行GWAS分析。分析模型如下：

y＝Xb+Zu+Mg+e

模型中，y表示性状记录真实值；X表示固定效应关联矩阵；b表示固定效应向量；固定效应包括品种、年-季节和出生胎次；Z表示加性遗传效应关联矩阵；u表示个体加性遗传效应向量，服从正态分布，

M表示SNP标记效应关联矩阵；g表示SNP标记效应；e表示残差，服从正态分布，

G表示基因组亲缘关系矩阵；I表示单位矩阵；

和

分别表示加性遗传效应方差和残差方差。

GWAS结果显示，与猪初生重性状相关的SNP标记位于猪国际基因组11.1版本参考序列的第4号染色体上第112031589核苷酸位点，具有G/A多态性(g.112031589G/A)，该位点达到染色体显著水平。

与猪初生重性状显著相关的SNP标记的曼哈顿图，如图1所示，图1中，纵坐标为关联分析计算出的P值，即-log₁₀(pvalue)，横坐标为染色体编号，箭头所指即为第4号染色体上第112031589核苷酸位点。

二、猪初生重相关SNP位点的多因素方差分析

本例分析了获得的SNP位点g.112031589G/A，在实验群669头母猪中的不同基因型对仔猪初生重的效应。本例实际测序和变异检测了674头母猪，但是，在表型质控过程中有5个个体被过滤去除，因此后续分析仅用了669头母猪。利用R软件aov()函数进行多因素方差分析，分析g.112031589G/A核苷酸位点的不同基因型对仔猪初生重的效应。分析模型如下：

y_ijk＝u+B_i+HYS_j+M_k+e_ijk

其中，y_ijk为仔猪初生重，B_i为第i个母猪品种效应；HYS_j为第j个分娩场-年-季效应；M_k为本g.112031589G/A位点的第k个基因型；e_ijk为随机残差。

研究显示，g.112031589G/A的基因型包括GG、GA和AA三种，统计分析不同基因型对仔猪初生重的影响，结果如表1所示。对三种基因型的显著性分析结果如表2所示。

表1 g.112031589G/A不同基因型对仔猪初生重的影响

基因型	个体数	平均初生重(mean±S.E.)
			GG	97	1.27±0.28kg
GA	260	1.33±0.27kg
			AA	312	1.40±0.26kg

表2 P-value检测结果

基因型	P-value
		GG-AA	0.0000085
GG-GA	0.0658851
		AA-GA	0.0022926

表1和表2的结果显示，在试验母猪群体中，g.112031589G/A位点具有AA基因型母猪的初生重极显著高于GG基因型母猪的初生重(P<0.01)；g.112031589G/A位点具有AA基因型母猪的初生重，均高于GG或AG基因型母猪的初生重(P>0.05)。因此，A等位基因为仔猪初生重相关的优势等位基因，该等位基因数量越多，母猪初生重越大，或具有此种趋势。

三、初生重相关SNP位点检测方法的建立

1.检测引物设计

本例进一步的，针对获得的SNP位点g.112031589G/A，设计检测该位点的上下游引物，用于该SNP位点的PCR检测。本例检测SNP位点g.112031589G/A的上游引物为Seq IDNo.2所示序列，下游引物为Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.2：5’-TCTTCGGGTCAGAAAGAGA-3’

Seq ID No.3：5’-CTTCCTGCAGATATTGGGG-3’。

2.提取猪基因组DNA

根据全基因组DNA测序结果，分别选取g.112031589G/A核苷酸位点为GG、GA和AA基因型的母猪耳样若干，放置于装70％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。利用“一、猪初生重相关SNP位点的获得”中的基因组DNA提取和质量检测方法，提取耳组织基因组DNA，经过质量、浓度检测后置于-20℃保存备用。

3.目的片段PCR扩增与测序

用已提取的DNA为模板，根据所设计的引物，进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为：DNA模板2.5μL、10mmol/L的上游引物和下游引物各1.25μL、PCRMix试剂25μL、双蒸水20μL；总计50μL。

PCR扩增条件为：98℃预变性2min；然后进入35个循环：98℃变性15s、52℃退火30s、72℃延伸30s；循环结束后，72℃延伸5min，4℃待机。

取部分PCR扩增产物采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，部分结果如图2所示。图2中，第一泳道为DNAmarkerⅠ，第二泳道为AA基因型的母猪的基因组DNA的PCR扩增结果，第三泳道为AG基因型的母猪的基因组DNA的PCR扩增结果，第四泳道为GG基因型的母猪的基因组DNA的PCR扩增结果。图2的结果显示，本例的引物能够对不同基因型的母猪都扩增出约244bp的靶标片段。

对剩余的PCR扩增产物送至六合华大基因科技有限公司进行测序，测序结果用SnapGene软件与GenBank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读g.112031589G/A的基因型。测序序列符合SEQ ID NO.1所述序列信息，在该序列第112031589位碱基处存在SNP位点g.112031589G/A，部分测序结果如图3所示。

SEQ ID NO.1：

5’-TCTTCGGGTCAGAAAGAGAGCACCTCCCCAGCCATCCCGGGGTTTTACAGGAATAAAGCTGCGTCATGTTCCCCGTCAGTTCAGGATTAAGAAATCTGATGAGTGTGGTTTTGCTGTTGATTGATGRGACATGCACGTTTGTGACTTCACGGCATGCATGGTTTAACATTCTCTTGTGCACCTTTACAGGCTGCCTTTGTTTATATTTTTGCCCAGATGGGTATCCCCCAATATCTGCAGGAAG-3’。

图3分别展示了AA基因型、AG基因型和GG基因型的测序结果。测序结果显示，本例的SNP标记位于SEQ ID No.1所示序列自5’端起的第127位碱基，其基因型包括AA、AG和GG三个基因型。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

深圳市华大农业应用研究院

<120> 一种与猪初生重性状相关的SNP标记及应用

<130> 19I29274

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 244

<212> DNA

<213> 第4号染色体上第112031589核苷酸位点扩增序列

<400> 1

tcttcgggtc agaaagagag cacctcccca gccatcccgg ggttttacag gaataaagct 60

gcgtcatgtt ccccgtcagt tcaggattaa gaaatctgat gagtgtggtt ttgctgttga 120

ttgatgrgac atgcacgttt gtgacttcac ggcatgcatg gtttaacatt ctcttgtgca 180

cctttacagg ctgcctttgt ttatattttt gcccagatgg gtatccccca atatctgcag 240

gaag 244

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcttcgggtc agaaagaga 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cttcctgcag atattgggg 19

Claims

1.一种与猪初生重性状相关的SNP标记，其特征在于：所述SNP标记位于猪国际基因组11.1版本参考序列的第4号染色体上第112031589核苷酸位点，具有G或A多态性。

2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于：所述SNP标记位于SEQ ID No.1所示序列自5’端起的第127位碱基。

3.根据权利要求1或2所述的SNP标记，其特征在于：所述SNP标记为AA基因型的母猪所产仔猪的猪初生重显著大于AG基因型或GG基因型的母猪。

4.一种检测权利要求1-3任一项所述的SNP标记的引物对，其特征在于：所述引物对的上游引物为Seq ID No.2所示序列，下游引物为Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.2：5’-TCTTCGGGTCAGAAAGAGA-3’

Seq ID No.3：5’-CTTCCTGCAGATATTGGGG-3’。

5.一种检测权利要求1-3任一项所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括权利要求4所述的引物对。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括用于PCR扩增的试剂。

7.一种检测权利要求1-3任一项所述的SNP标记的方法，其特征在于：包括采用权利要求4所述的引物对，或者权利要求5或6所述的试剂盒，对待测母猪的基因组DNA进行PCR扩增，通过对PCR扩增产物序列的测定，获得所述SNP标记的碱基情况。

8.一种预测仔猪的猪初生重的方法，其特征在于：包括采用权利要求4所述的引物对，或者权利要求5或6所述的试剂盒，对母猪的基因组DNA进行PCR扩增，通过对PCR扩增产物序列的测定，获得权利要求1-3任一项所述的SNP标记的碱基情况，根据所述SNP标记的碱基情况预测母猪所产仔猪的猪初生重。

9.根据权利要求1-3任一项所述的SNP标记在猪初生重预测或猪的分子辅助筛选育种中的应用。

10.根据权利要求4所述的引物对或权利要求5或6所述的试剂盒在猪初生重预测或猪的分子辅助筛选育种中的应用。