CN109402069A - 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种假病毒颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109402069A
CN109402069A CN201811343592.1A CN201811343592A CN109402069A CN 109402069 A CN109402069 A CN 109402069A CN 201811343592 A CN201811343592 A CN 201811343592A CN 109402069 A CN109402069 A CN 109402069A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pseudovirion
seq
obtains
srv
monkey
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811343592.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李丹丹
高慎阳
张体银
凌宗帅
邱索平
刘忠梅
王绥家
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inspection And Quarantine Center Of Hainan Entry-Exit Inspection And Quarantine
Original Assignee
Inspection And Quarantine Center Of Hainan Entry-Exit Inspection And Quarantine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inspection And Quarantine Center Of Hainan Entry-Exit Inspection And Quarantine filed Critical Inspection And Quarantine Center Of Hainan Entry-Exit Inspection And Quarantine
Priority to CN201811343592.1A priority Critical patent/CN109402069A/zh
Publication of CN109402069A publication Critical patent/CN109402069A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种假病毒颗粒及其制备方法和应用，其中所述假病毒颗粒包含由MS2噬菌体衣壳蛋白包裹的猴D型逆转录病毒RNA片段；本发明公开的假病毒颗粒的制备方法简单、操作容易、获得的假病毒颗粒纯度高，可以用作猴D型逆转录病毒检测的核酸检测方法的外标质控品，不仅仅具有较高的稳定性和耐核酸酶特性，并且其中目标模板序列仅以RNA形式存在，无传染性，安全性高。

Description

一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种假病毒颗粒及其制备方法，具体地，涉及一种包含猴D型逆转录病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法和在检测猴D型逆转录病毒核酸中的应用。
背景技术
猴D型逆转录病毒(Simian AIDS Type D Retrovirus，SRV)属于逆转录病毒科，肿瘤病毒亚科，D型肿瘤病毒属，具有多种血清型SRV-D1，2，3，4，5型。亚洲的猕猴属是SRV的主要宿主，有地方性感染的特征，疾病表现为一系列的亚临床症状及机会感染和肿瘤形成，最终导致免疫抑制，类似AIDS疾病。SRV在其天然宿主亚洲猕猴中可以致病，有的猴群中其流行程度很高，一旦爆发可能导致整个猴群大批死亡，因此必须定期对猴群进行SRV感染的普查以剔除传染源来保护猴群。目前SRV感染的检测方法主要有：玻片酶免疫法(EIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、斑点免疫法(DIA)、免疫荧光法(IFA)等基于免疫技术的方法。
目前以酶联免疫吸附法(ELISA)使用最为广泛，其原理为用于检测猴血清中的D型逆转录病毒抗体。酶联板预先包被D型逆转录病毒基因工程特异性抗原，待检血清中D型逆转录病毒抗体与包被抗原结合，再与抗猴IgG-HRP反应，形成包被抗原-D型逆转录病毒抗体-抗猴IgG-HRP复合物，以TMB显色与否指示血清中是否有抗猴D型逆转录病毒的抗体存在。并且此类免疫检测方法均需要用到阳性质控品，而最准确的可靠的阳性质控品应为含猴D型逆转录病毒的天然样品，例如被感染动物的血液、粪便处理液或细胞培养液，虽然使用时已做灭活处理，但其仍然存在天然病毒散播的潜在危害性等。目前，针对猴D型逆转录病毒的检测还未见核酸检测方法。也未报道使用含猴D型逆转录病毒的无传染性、安全可靠、稳定性高、特异性强的外标阳性质控品。
背景技术部分的内容仅仅是发明人所知晓的技术，并不当然代表本领域的现有技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对猴D型逆转录病毒的核酸检测方法所用的假病毒颗粒及其制备方法，还提供了一种用于检测猴D型逆转录病毒的试剂盒，对未来特异性检测猴D型逆转录病毒具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。
针对现有技术存在问题中的一个或多个，在本发明的一个方面，本发明提供一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒包含由MS2噬菌体衣壳蛋白包裹的猴D型逆转录病毒RNA片段。
根据本发明的一个方面，上述猴D型逆转录病毒RNA片段包含由SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示的引物扩增得到的产物的序列。
在本发明的另一方面，本发明提供一种假病毒颗粒的制备方法，包括：
S1.使用针对MS2噬菌体基因组的第一引物对，以MS2噬菌体基因为模板，进行RT-PCR扩增得到第一扩增产物；
S2.将步骤S1中所述第一扩增产物克隆，得到第一克隆质粒，并采用限制性内切酶Nco I和BamH I分别双酶切所述第一克隆质粒和质粒pET-28b(+)，纯化后进行连接，得到第一连接产物；
S3.将步骤S2中所述第一连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒鉴定，得到重组质粒pET-28b-MS2；
S4.使用针对猴D型逆转录病毒基因组的第二引物对，以猴D型逆转录病毒基因为模板，进行RT-PCR扩增得到第二扩增产物；
S5.将步骤S4所述第二扩增产物克隆，得到第二克隆质粒，并采用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ分别双酶切所述第二克隆质粒和所述重组质粒pET-28b-MS2，纯化后进行连接，得到第二连接产物；
S6.将步骤S5中所述第二连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒鉴定，得到重组质粒pET-28b-MS2-SRV；和
S7.诱导所述重组质粒pET-28b-MS2-SRV的表达与纯化，得到所述假病毒颗粒。
根据本发明的一个方面，上述步骤S1中所述第一引物对的核苷酸序列为：
MS2F：5’-GGTCCATGGCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTT-3’(SEQ ID NO:1)和
MS2R：5’-GGTGGATCCGCTGAGGGAATCGGGTTTCCATCTT-3’(SEQ ID NO:2)。
根据本发明的一个方面，上述步骤S1中所述第一扩增产物包含MS2噬菌体的装配蛋白基因和包膜蛋白基因，其核苷酸序列包含由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物扩增得到的产物的序列。
根据本发明的一个方面，上述步骤S4中所述第二引物对的核苷酸序列为：
SRVF：5’-GAGGATCCTTATTCAGTAACCAACTCCCTAAAG-3’(SEQ ID NO:3)和
SRVR：5’-GTAAGCTTCTACTATGATTAGAGACAAATCTCC-3’(SEQ ID NO:4)。
根据本发明的一个方面，上述步骤S4中所述第二扩增产物的核苷酸序列包含由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物扩增得到的产物的序列。
根据本发明的一个方面，上述步骤S7中所述表达与纯化的步骤包括：
S71.将步骤S6中所述重组质粒pET-28b-MS2-SRV的阳性菌落接种到含卡那霉素的LB液体培养基中；
S72.培养至OD600值为0.5-1.0时，加入IPTG，诱导表达所述假病毒颗粒；
S73.采用溶菌酶和/或超声破碎法裂解出所述假病毒颗粒，并加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I将裸露的RNA与DNA降解；和
S74.离心收集上清液，纯化得到所述假病毒颗粒。
根据本发明的一个方面，上述步骤S74中所述纯化包括PEG纯化和超滤纯化。
在本发明的另一方面，本发明提供上述的假病毒颗粒作为猴D型逆转录病毒检测中的外标质控品的应用。
在本发明的又一方面，本发明提供一种猴D型逆转录病毒核酸检测试剂盒，包含检测试剂和外标质控品，其中所述外标质控品为上述的假病毒颗粒。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是根据本发明的重组质粒pET-28b-MS2-SRV的双酶切鉴定结果；
图2是根据本发明的重组质粒pET-28b-MS2-SRV的诱导表达结果；
图3是根据本发明的假病毒颗粒纯化浓缩后的电镜检测结果；
图4是根据本发明的假病毒颗粒的RT-PCR鉴定结果；
图5是根据本发明的假病毒颗粒的核糖核酸酶(RNase A)抗性检测结果；和
图6是根据本发明的假病毒颗粒对温度的敏感性鉴定结果。
具体实施方式
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。在本发明的公开中提到“实施方式”或“实施例”意指结合该实施方式或实施例所述的特定特征、结构或特性被包括在所公开主题的至少一个实施方式或实施例中，并且多次提到“实施方式”或“实施例”不应被理解为必然地全部涉及相同的实施方式或实施例。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个所述特征。
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方面。本发明提供了各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒包含由MS2噬菌体衣壳蛋白包裹的猴D型逆转录病毒RNA片段。
根据本发明的一个优选实施方案，上述猴D型逆转录病毒RNA片段包含由由SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的引物针对猴D型逆转录病毒基因为模板扩增得到的产物的序列。
在本发明的另一实施方案中，本发明提供一种假病毒颗粒的制备方法，包括：
S1.使用针对MS2噬菌体基因组的第一引物对，以MS2噬菌体基因为模板，进行RT-PCR扩增得到第一扩增产物；
S2.将步骤S1中所述第一扩增产物克隆，得到第一克隆质粒，并采用限制性内切酶Nco I和BamH I分别双酶切所述第一克隆质粒和质粒pET-28b(+)，纯化后进行连接，得到第一连接产物；其中所述克隆是将所述第一扩增产物连接至克隆T载体pMD18-T，构建pMD18-T-MS2克隆质粒；所述纯化是将酶切产物进行胶回收纯化；所述连接可以采用Ligation kit连接酶试剂盒进行连接；
S3.将步骤S2中所述第一连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒鉴定，得到重组质粒pET-28b-MS2；其中所述大肠杆菌感受态细胞可以为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞，然后经过涂板，挑取单克隆菌落鉴定、测序，得到目标重组质粒pET-28b-MS2；
S4.使用针对猴D型逆转录病毒基因组的第二引物对，以猴D型逆转录病毒基因为模板，进行RT-PCR扩增得到第二扩增产物；
S5.将步骤S4所述第二扩增产物克隆，得到第二克隆质粒，并采用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ分别双酶切所述第二克隆质粒和所述重组质粒pET-28b-MS2，纯化后进行连接，得到第二连接产物；其中所述克隆是将所述第二扩增产物连接至克隆T载体pMD18-T，构建pMD18-T-SRV克隆质粒；所述纯化是将酶切产物进行胶回收纯化；所述连接可以采用Ligation kit连接酶试剂盒进行连接；
S6.将步骤S5中所述第二连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒鉴定，得到重组质粒pET-28b-MS2-SRV；其中所述大肠杆菌感受态细胞可以为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞，然后经过涂板，挑取单克隆菌落提取质粒后用Nco Ⅰ、Hind Ⅲ及BamH Ⅰ限制性内切酶进行酶切鉴定。将酶切鉴定正确的质粒进行测序得到重组质粒pET-28b-MS2-SRV；和
S7.诱导所述重组质粒pET-28b-MS2-SRV的表达与纯化，得到所述假病毒颗粒。
根据本发明的一个优选实施方案，上述步骤S1中所述第一引物对的核苷酸序列为：
MS2F：5’-GGTCCATGGCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTT-3’(SEQ ID NO:1)和
MS2R：5’-GGTGGATCCGCTGAGGGAATCGGGTTTCCATCTT-3’(SEQ ID NO:2)；其中所述第一引物对可以利用常规引物设计软件，例如OLIGO7.0软件，参考GenBank数据库中的MS2噬菌体基因序列(NC_001417)通过人工合成的方法制备；并且在上述第一引物对的MS2F中引入酶切位点Nco Ⅰ，在MS2R中引入酶切位点BamH Ⅰ，两者均用下划线在所述第一引物对中表示。
根据本发明的一个优选实施方案，上述步骤S1中所述第一扩增产物包含MS2噬菌体的装配蛋白基因和包膜蛋白基因，其核苷酸序列包含由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物扩增得到的产物的序列。
根据本发明的一个优选实施方案，上述步骤S4中所述第二引物对的核苷酸序列为：
SRVF：5’-GAGGATCCTTATTCAGTAACCAACTCCCTAAAG-3’(SEQ ID NO:3)和
SRVR：5’-GTAAGCTTCTACTATGATTAGAGACAAATCTCC-3’(SEQ ID NO:4)；其中所述第二引物对可以利用常规引物设计软件，例如OLIGO7.0软件，参考GenBank数据库中的SRV病毒的参考序列并标识目标序列，通过人工合成的方法制备；并且在上述第二引物对的SRVF中引入酶切位点BamH Ⅰ，在SRVR中引入酶切位点Hind Ⅲ，两者均用下划线在所述第二引物对中表示。
根据本发明的一个优选实施方案，上述步骤S4中所述第二扩增产物的核苷酸序列包含由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物扩增得到的产物的序列。
根据本发明的一个方面，上述步骤S7中所述表达与纯化的步骤包括：
S71.将步骤S6中所述重组质粒pET-28b-MS2-SRV的阳性菌落接种到含卡那霉素的LB液体培养基中；例如可以首先通过将重组质粒pET-28b-MS2-SRV的阳性菌落涂布于含氨苄霉素的LB固体培养基平板，然后挑选单菌落接种到含氨苄霉素的LB液体培养基中；
S72.培养至OD600值为0.5-1.0时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mol/L，继续在37℃，200r/m条件下培养4h诱导表达所述假病毒颗粒；以12000r/min，离心5min收集含有所述假病毒颗粒的菌体；
S73.采用溶菌酶和/或超声破碎法裂解出所述假病毒颗粒，并加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I至终浓度均为1mg/L将裸露的RNA与DNA降解；例如可以使用含有溶菌酶的裂解液(50mM Tris-HCl，pH 8.5～9.0，2m M EDTA，100m M NaCl，0.5％Triton X-100，溶菌酶10mg/L)重悬菌体，然后再通过超声破碎法裂解出所述假病毒颗粒；
S74. 4℃，10000r/min离心10min收集上清液，纯化得到所述假病毒颗粒。
根据本发明的一个优选实施方案，上述步骤S74中所述纯化包括PEG纯化和超滤纯化。其中PEG纯化法是将上述上清液按体积比例换算，加入NaCl至终浓度0.5mol/L，加入等体积的10％PEG6000，混匀后4℃过夜或放置一段时间；8000r/min离心30min，收集沉淀，沉淀即为浓缩的假病毒颗粒样品。超滤纯化法是使用15ml密理博超滤离心管(Ultra-4&15离心过滤器)进行操作，即取15ml诱导菌体裂解离心后的上清液加入超滤管中，以3000g离心30分钟，移液器吸取收集约0.2ml浓缩液即为纯化制备的假病毒颗粒样品。
在本发明的另一实施方案中，本发明提供上述的假病毒颗粒作为猴D型逆转录病毒检测中的外标质控品的应用。
在本发明的又一实施方案中，本发明提供一种猴D型逆转录病毒核酸检测试剂盒，包含检测试剂和外标质控品，其中所述外标质控品为上述的假病毒颗粒。
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：扩增MS2噬菌体的MS2基因的引物对的设计和构建pMD18-T-MS2克隆质粒
利用OLIGO7.0软件，参考GenBank数据库中的MS2噬菌体基因序列(NC_001417)设计包含MS2的编码装配蛋白和包膜蛋白的有效基因序列11-1699nt(共1689bp)，同时根据该基因设计引物对MS2F、MS2R，并对其进行人工合成。设计的引物对如下表1所示：
表1.MS2基因扩增引物核苷酸序列
根据常规操作，利用上述引物对MS2F和MS2R，以MS2基因为模板进行PCR扩增，得到含有MS2的编码装配蛋白和包膜蛋白的基因序列的扩增产物，将该扩增产物连接至克隆T载体pMD18-T，构建pMD18-T-MS2克隆质粒。
实施例2：构建重组质粒pET-28b-MS2
使用NEB快酶NcoⅠ和BamHⅠ分别双酶切上述构建的克隆质粒pMD18-T-MS2和空质粒pET28b(+)表达载体(均为本实验室保存)。使用的酶切体系如下表2所示：
表2.酶切体系
37℃酶切15min后，分别将酶切目标产物进行胶回收纯化，产物分别命名为MS2-T(N/B)、pET28b(N/B)。
将上述回收的酶切产物MS2-T(N/B)、pET28b(N/B)用Ligation kit连接酶试剂盒进行连接，连接体系如下表3所示：
表3.连接体系
16℃连接30min后立即冰浴。将连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞、涂板，挑取单克隆菌落鉴定、测序正确的菌株命名为pET-28b-MS2。
实施例3：猴D型逆转录病毒目标基因序列的扩增引物设计和构建pMD18-T-SRV克隆质粒
首先根据已发表的国内外相关参考文献进行初步理论筛选，之后在GenBank获取SRV病毒的参考序列(GenBank登录号M11841)并标识目标序列，同时将SRV目标序列进行重复性合成，根据合成序列人工设计扩增引物，具体引物对信息如下表4所示：
表4.猴SRV病毒目标基因序列扩增引物
根据常规操作，利用上述引物对SRV目标序列进行PCR扩增，获得含有SRV目标序列的扩增产物，将上述扩增产物连接至克隆T载体pMD18-T，构建pMD18-T-SRV克隆质粒。
实施例4：构建重组质粒pET-28b-MS2-SRV和酶切鉴定
使用BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切上述构建的克隆质粒pMD18-T-SRV和重组质粒pET-28b-MS2。酶切体系如下表5所示：
表5.酶切体系
37℃酶切15min后，分别将酶切目标产物进行胶回收纯化，产物命名为SRV-T(E/X)、pET-28b-MS2(E/X)。将回收的酶切产物MS2-T(N/B)、pET28b(N/B)用Ligation kit连接酶试剂盒进行连接，连接体系如下表6所示：
表1.连接体系
16℃连接30min后立即冰浴。将连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞、涂板，挑取单克隆菌落提质粒后用Nco Ⅰ、Hind Ⅲ及BamH Ⅰ限制性内切酶进行酶切鉴定。将酶切鉴定正确的质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pET-28b-MS2-SRV。如图1所示为重组质粒pET-28b-MS2-SRV的Nco Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切鉴定结果，其中：泳道1为DNAMarker1kbp Ladder；泳道2为pET-28b-MS2-SRV重组质粒Nco Ⅰ、HindⅢ的双酶切结果。图1表明经过连续两轮的克隆将MS2与SRV基因连接并***到载体pET-28b中获得了重组质粒pET-28b-MS2-SRV，经过酶切鉴定，得到了预期大小的目的片断和载体片断，由此表明成功构建了目标载体质粒且该质粒与原理论设计完全相符。
实施例5：本发明的SRV假病毒颗粒的表达与纯化
将重组质粒pET-28b-MS2-SRV的阳性菌落BL21(DE3)pLysS-pET-28b-MS2-SRV涂布于含氨苄霉素的LB固体培养基平板，然后挑选单菌落接种到含氨苄霉素的LB液体培养基中；培养至OD600值为0.5-1.0时，加入诱导剂IPTG终浓度为0.5mol/L，在37℃，200r/min条件下继续培养4h诱导表达假病毒颗粒；然后再12000r/min下离心5min，弃上清、收集菌体沉淀。收集菌液将表达产物跑SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，如图2所示，示出了重组质粒pET-28b-MS2-SRV的诱导表达结果，其中M表示：蛋白Marker；泳道1-3分别为诱导后的pET-28b-MS2-SRV重组菌；泳道4-6为诱导前的pET-28b-MS2-SRV重组菌对照；箭头所示为诱导后表达的蛋白条带。由图2可见诱导后的pET-28b-MS2-SRV重组菌泳道可见约14kD的目的蛋白条带(1-3泳道)。
用10mL裂解液(50mM Tris-HCl，pH 8.5～9.0，2m M EDTA，100m M NaCl，0.5％Triton X-100，溶菌酶10mg/L)重悬上述菌体沉淀，37℃水浴作用30min(间隔10min轻轻摇匀)，之后冰浴降至于4℃下超声波破碎，条件为400W，超声5s，间歇10s，总共超声作用5min，待菌液逐渐变得透明后保持4℃条件下持续10000r/min离心10min，收集上清液。加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶Ⅰ至终浓度均为1mg/L，37℃水浴作用1h，然后在4℃，10000r/min条件下离心10min，收集上清液。可以使用以下两种方法中任一种纯化获得的假病毒颗粒：
(1)PEG纯化法：将上述上清液按体积比例换算，加入NaCl至终浓度0.5mol/L，加入等体积的10％PEG6000，混匀后4℃过夜或放置一段时间；8000r/min离心30min，收集沉淀，沉淀即为浓缩的SRV假病毒颗粒样品。
(2)超滤纯化法：使用15ml密理博超滤离心管( Ultra-4&15离心过滤器)进行行操作，即取15ml诱导菌体裂解离心后的上清液加入超滤管中，以3000g离心30分钟，移液器吸取收集约0.2ml浓缩液即为纯化制备的SRV假病毒颗粒样品。
对上述纯化浓缩后的SRV假病毒颗粒进行电镜分析，检验其纯度，如图3所示，示出了SRV假病毒颗粒纯化浓缩后的电镜检测结果，经2％磷钨酸负染色，低温电镜下观察结果可见分散的约30nm大小的假病毒颗粒。
实施例6：本发明的SRV假病毒颗粒的可靠性分析
在该实施例中所用RT-PCR和PCR引物对均为PS1：GGAATCGGGTTTCCATCTT(SEQ IDNO:5)和PS2：TAGCAGCCGGATCTCAGTG(SEQ ID NO:6)；反转录引物为通用引物OligoDT(15)“TTTTTTTTTTTTTTT”(SEQ ID NO:7)。
在该实施例中所用RT-PCR反应体系均为：
反应条件均为：反转录45℃30min；预变性95℃2min；变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环；终延伸72℃5min。
(1)SRV假病毒颗粒的RT-PCR鉴定分析
取浓缩、纯化后的SRV假病毒颗粒表达产物1mL，进行104倍稀释分别作为待测样本A组和B组；A组样本进行正常RT-PCR鉴定，B组样本不经过反转录直接进行PCR鉴定，琼脂糖电泳检测扩增结果。如图4所示，示出了SRV假病毒颗粒的RT-PCR鉴定结果，其中泳道M为DNAMarker100bp Ladder；1-8分别为104倍稀释的纯化后SRV假病毒颗粒样本RT-PCR检测结果；9-10分别为ddH2O为模板的RT-PCR和PCR对照检测结果；11-16分别为104倍稀释的纯化后SRV假病毒颗粒样本的未经反转录直接PCR检测结果。由图4可见，经梯度稀释的SRV假病毒颗粒分组比较检测结果表明：A组电泳检测结果均为阳性(1-8道/104)，表明SRV病毒保守区基因片段已经重组于MS2假病毒颗粒之中，并且目标模板序列以RNA形式存在；B组样本检测结果为阴性(11-16道/104)，表明制备的SRV假病毒颗粒样品液中无DNA模板污染。
(2)SRV假病毒颗粒的核糖核酸酶(RNase A)抗性分析
取104倍稀释度的SRV假病毒颗粒样本5份，分别加入RNase A(1mg/mL)5μL，于37℃水浴作用30min，同时设立不加RNase A处理的对照组。将所有样品平行进行RNA抽提并进行RT-PCR检测。如图5所示，示出了SRV假病毒颗粒的核糖核酸酶(RNase A)抗性检测结果，其中泳道M为DNA Marker DM2000；1-4分别为经过5μL RNase A处理过的SRV假病毒颗粒样本的RT-PCR检测结果；5-6为不加RNase A处理的SRV假病毒颗粒样本RT-PCR检测对照。由图5可见，经核糖核酸酶处理的SRV假病毒颗粒样本与未经处理的对照样本检测结果一致，表明制备的SRV假病毒颗粒能够很好的抵抗核糖核酸酶的降解作用。
(3)SRV假病毒颗粒的温度敏感性鉴定分析
取104倍稀释度的SRV假病毒颗粒样本6份，分别置于以下条件：37℃/10h、25℃/10d。之后将所有样品平行进行RNA抽提并进行RT-PCR检测。如图6所示，示出了SRV假病毒颗粒对温度的敏感性鉴定结果，其中泳道M为DNA Marker100bp Ladder；1-6道分别为每份250μL的104稀释纯化后的SRV假病毒颗粒样本置于如下条件：37℃/10h、25℃/10d之后进行RT-PCR检测的结果。由图6可见制备的SRV假病毒颗粒在：37℃/10h、25℃/10d条件下均表现出较好的稳定性。
本发明提供了一种用于核酸检测猴D型逆转录病毒的假病毒颗粒及其制备方法，所获得的假病毒颗粒包含猴D型逆转录病毒RNA片段，其包裹在假病毒的衣壳蛋白之内，可以抵抗外界核酸酶的作用，不易被降解，具有较好的稳定性和抗核酸酶的特性。本发明的SRV假病毒颗粒与天然病毒相似，因此可以把病毒颗粒等同为病毒材料，一同经过RNA提取、反转录后进行PCR扩增，很好地对靶RNA病毒的检测过程进行了全程的质量监控，保证了试验数据的可靠性。另外，本发明的SRV病毒颗粒仅具有类似病毒核衣壳，包裹核酸RNA不具有传染性，丧失了病毒的自我复制能力，所以SRV假病毒颗粒，不会对实验人员构成伤害，具有很高的安全性，特别适合用于猴D型逆转录病毒核酸检测方法中的外标质控品。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtccatggc ctttcggggt cctgctcaac tt 32
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtggatccg ctgagggaat cgggtttcca tctt 34
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggatcctt attcagtaac caactcccta aag 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtaagcttct actatgatta gagacaaatc tcc 33
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaatcgggt ttccatctt 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tagcagccgg atctcagtg 19
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttttttttt ttttt 15

Claims (9)

1.一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒包含由MS2噬菌体衣壳蛋白包裹的猴D型逆转录病毒RNA片段。
2.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，所述猴D型逆转录病毒RNA片段包含由SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的引物扩增得到的产物的序列。
3.一种假病毒颗粒的制备方法，包括：
S1.使用针对MS2噬菌体基因组的第一引物对，以MS2噬菌体基因为模板，进行RT-PCR扩增得到第一扩增产物；
S2.将步骤S1中所述第一扩增产物克隆，得到第一克隆质粒，并采用限制性内切酶NcoI和BamH I分别双酶切所述第一克隆质粒和质粒pET-28b(+)，纯化后进行连接，得到第一连接产物；
S3.将步骤S2中所述第一连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒鉴定，得到重组质粒pET-28b-MS2；
S4.使用针对猴D型逆转录病毒基因组的第二引物对，以猴D型逆转录病毒基因为模板，进行RT-PCR扩增得到第二扩增产物；
S5.将步骤S4所述第二扩增产物克隆，得到第二克隆质粒，并采用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ分别双酶切所述第二克隆质粒和所述重组质粒pET-28b-MS2，纯化后进行连接，得到第二连接产物；
S6.将步骤S5中所述第二连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒鉴定，得到重组质粒pET-28b-MS2-SRV；和
S7.诱导所述重组质粒pET-28b-MS2-SRV的表达与纯化，得到所述假病毒颗粒。
4.根据权利要求3所述的假病毒颗粒的制备方法，其中所述步骤S1中所述第一引物对的核苷酸序列为：
MS2F：5’-GGTCCATGGCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTT-3’(SEQ ID NO:1)和
MS2R：5’-GGTGGATCCGCTGAGGGAATCGGGTTTCCATCTT-3’(SEQ ID NO:2)；
所述步骤S1中所述第一扩增产物包含MS2噬菌体的装配蛋白基因和包膜蛋白基因，其核苷酸序列包含由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物扩增得到的产物的序列。
5.根据权利要求3所述的假病毒颗粒的制备方法，其中所述步骤S4中所述第二引物对的核苷酸序列为：
SRVF：5’-GAGGATCCTTATTCAGTAACCAACTCCCTAAAG-3’(SEQ ID NO:3)和
SRVR：5’-GTAAGCTTCTACTATGATTAGAGACAAATCTCC-3’(SEQ ID NO:4)；
所述步骤S4中所述第二扩增产物的核苷酸序列包含由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物扩增得到的产物的序列。
6.根据权利要求3所述的假病毒颗粒的制备方法，其中所述步骤S7中所述表达与纯化的步骤包括：
S71.将步骤S6中所述重组质粒pET-28b-MS2-SRV的阳性菌落接种到含卡那霉素的LB液体培养基中；
S72.培养至OD600值为0.5-1.0时，加入IPTG，诱导表达所述假病毒颗粒；
S73.采用溶菌酶和/或超声破碎法裂解出所述假病毒颗粒，并加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I将裸露的RNA与DNA降解；和
S74.离心收集上清液，纯化得到所述假病毒颗粒。
7.根据权利要求6所述的假病毒颗粒的制备方法，其中所述步骤S74中所述纯化包括PEG纯化和超滤纯化。
8.根据权利要求1或2所述的假病毒颗粒作为猴D型逆转录病毒检测中的外标质控品的应用。
9.一种猴D型逆转录病毒核酸检测试剂盒，包含检测试剂和外标质控品，其中所述外标质控品为根据权利要求1或2所述的假病毒颗粒。
CN201811343592.1A 2018-11-13 2018-11-13 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用 Pending CN109402069A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811343592.1A CN109402069A (zh) 2018-11-13 2018-11-13 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811343592.1A CN109402069A (zh) 2018-11-13 2018-11-13 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109402069A true CN109402069A (zh) 2019-03-01

Family

ID=65473141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811343592.1A Pending CN109402069A (zh) 2018-11-13 2018-11-13 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109402069A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112609023A (zh) * 2020-12-25 2021-04-06 广州邦德盛生物科技有限公司 一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物及其制备方法
CN112877366A (zh) * 2020-03-10 2021-06-01 广州复能基因有限公司 用于检测来自dna或rna生物体的样品靶标的可掺入参照标准品
CN113265413A (zh) * 2021-06-17 2021-08-17 北京中科生仪科技有限公司 一种假病毒的制备方法
CN116462742A (zh) * 2023-03-17 2023-07-21 广州凯普医药科技有限公司 一种猴痘病毒假病毒颗粒及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103923887A (zh) * 2014-04-16 2014-07-16 辽宁医学院 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN104845993A (zh) * 2015-05-13 2015-08-19 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 一种含丙型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN105200018A (zh) * 2015-10-27 2015-12-30 广东和信健康科技有限公司 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103923887A (zh) * 2014-04-16 2014-07-16 辽宁医学院 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN104845993A (zh) * 2015-05-13 2015-08-19 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 一种含丙型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN105200018A (zh) * 2015-10-27 2015-12-30 广东和信健康科技有限公司 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EBENEZER TUMBAN 等: "VLPs displaying a single L2 epitope induce broadly cross-neutralizing antibodies against human papillomavirus", 《PLOS ONE》 *
NCBI: "Simian SRV-1 type D retrovirus (L47.1), complete genome", 《GENBANK: M11841.1》 *
王芸 等: "猴D型逆转录病毒的研究进展", 《上海畜牧兽医通讯》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112877366A (zh) * 2020-03-10 2021-06-01 广州复能基因有限公司 用于检测来自dna或rna生物体的样品靶标的可掺入参照标准品
CN112609023A (zh) * 2020-12-25 2021-04-06 广州邦德盛生物科技有限公司 一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物及其制备方法
CN113265413A (zh) * 2021-06-17 2021-08-17 北京中科生仪科技有限公司 一种假病毒的制备方法
CN116462742A (zh) * 2023-03-17 2023-07-21 广州凯普医药科技有限公司 一种猴痘病毒假病毒颗粒及其制备方法
CN116462742B (zh) * 2023-03-17 2023-10-10 广州凯普医药科技有限公司 一种猴痘病毒假病毒颗粒及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Harrison et al. Detection and relationships of cotton leaf curl virus and allied whitefly‐transmitted geminiviruses occurring in Pakistan
CN109402069A (zh) 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
CN110105436B (zh) 猪圆环病毒3型抗体的elisa检测试剂盒及其制备方法与应用
CN108680744B (zh) 一种检测新型鸭呼肠孤病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用
CN113956362B (zh) 一种重组猫细小病毒vp2蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用
CN112877348B (zh) 一种非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白及其应用
AU2020102599A4 (en) Indirect ELISA Detection Method and Application of DHAV-3 Antibody Based on VP2 or VP4 Recombinant Protein Antigen
CN113637056B (zh) 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒
CN110951699A (zh) 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN113684189A (zh) 一株鸡新型圆圈病毒3型毒株及基于该病毒的检测体系
CN108956985B (zh) 一种检测新型鹅星状病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用
CN106046172B (zh) 传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白vp2-vp1及其制备方法和应用
CN109913423A (zh) 一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系及应用
CN113817753A (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用
CN110568189B (zh) 犬腺病毒1型抗体elisa检测试剂盒及其应用
CN108982847B (zh) 一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒的间接elisa检测方法
CN105255931A (zh) 一种基于细菌表面展示***的病毒受体捕获体系
CN112852840A (zh) 一种牛纽布病毒重组vp1基因、重组蛋白及其应用
CN116023506B (zh) Asfv非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白及其试剂盒与应用
CN108693357B (zh) 一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用
CN104497109B (zh) 一种检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白及试剂盒
CN107664694A (zh) 一种基于e2蛋白检测猪非典型瘟病毒抗体的elisa试剂盒
CN110554187B (zh) 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白、elisa试剂盒及其制备方法和应用
CN109136267B (zh) BVDV Erns蛋白和抗体及筛选BVDV感染的牛的方法
CN107446041B (zh) 一种抗苹果坏死花叶病毒的抗血清及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination