CN116286438B - 一株豆腐酸浆来源的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株豆腐酸浆来源的植物乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株豆腐酸浆来源的植物乳杆菌及其应用，属于微生物及食品加工技术领域，所述植物乳杆菌SJ‑L‑1的保藏编号为：CGMCC NO.25209。本发明中应用的植物乳杆菌SJ‑L‑1生长速度快，产酸量大，耐冷冻能力强，转糖苷活性高。本发明中应用的植物乳杆菌SJ‑L‑1是可用于食品的安全菌株，通过直接接种发酵液或直投发酵剂的方式可制作无凝固剂发酵豆腐及酸浆豆腐的酸浆。通过接种SJ‑L‑1的方式制备酸浆，缩短了酸浆制备的周期，避免了自然发酵带来的杂菌或致病菌污染等安全风险。通过比较卤水豆腐、酸浆豆腐、L‑1‑16及SJ‑L‑1无凝固剂发酵豆腐品质，发现SJ‑L‑1发酵豆腐结构更均匀，风味物质含量更高。植物乳杆菌SJ‑L‑1发酵使得糖苷型异黄酮最大程度转化为苷元型异黄酮，提高了豆腐的营养价值。

Description

一株豆腐酸浆来源的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株豆腐酸浆来源的植物乳杆菌及其应用，属于微生物以及食品加工技术领域。
背景技术
豆腐作为一类中国特色的传统食品，从古至今一直深受人们的喜爱。不仅因为其美味可口，它还含有多种人体所需的必需氨基酸和非必需氨基酸，以及异黄酮、黄酮和维生素等生物活性成分，对人体有一定的保健作用。豆腐是以大豆为原料经过清洗、泡豆、磨浆、煮浆、凝固、压制、成型等多道工序制备而成。其中凝固是关键，凝固剂能够影响豆腐的微观结构、成型程度和均匀性。常用的豆腐凝固剂有石膏、盐卤、葡萄糖酸δ内酯(GDL)、酸浆等。其中以酸浆为凝固剂制备的酸浆豆腐是我国传统特色食品，在我国山东等地方具有特色的酸浆豆腐已经作为特色食品被列入“非物质文化遗产”。酸浆豆腐具有保水性好、质地细腻、营养价值高且含盐量低的特点。然而，由于酸浆是自然发酵的产物，受环境因素的影响较大，导致酸浆中菌群不稳定，酸浆豆腐质量不稳定、保质期短，尚未实现工业化生产。
尽管部分研究表明酸浆中优势微生物菌群为乳酸菌，也筛选出部分菌株，但对菌株的功能研究不够深入，仍停留在实验室阶段，尚未有能直接应用于工业化生产的直投式菌株。部分研究者将乳品发酵中工业化菌株移植至酸浆的制备，但存在菌株适应性较差、需要多菌株混合使用、发酵时间长、风味不正、获得的豆腐质地不理想等不足。因此从酸浆中筛选适合工业化纯种制备的酸浆专属性乳酸菌菌株，是实现酸浆摆脱目前手工作坊式生产，步入标准化、工业化生产首先要解决的问题。通过工业化纯种制备酸浆，不仅可以提高酸浆制备的效率，同时可以有效避免酸浆自然发酵引起的杂菌或致病菌污染带来的食品安全问题。
另一方面，乳酸菌作为人体肠道益生菌，食用安全性高，而且具有促进消化吸收、维持肠道菌群微生态平衡、免疫调节功能等多种益生作用。若能将乳酸菌直接接种至豆浆发酵制备发酵型豆腐，不仅可以减少酸浆制备的步骤，而且可以改变豆浆体系中的营养构成，实现豆腐品质的进一步提升。例如乳酸菌可利用糖类、矿物质等营养成分进行生长代谢，产生多种生物活性物质，改善发酵食品中营养物质的吸收和利用率，使发酵成品具有独特的风味和更高的营养价值；发酵过程中乳酸菌代谢生成的有机酸可直接诱导大豆蛋白的聚集凝固。这个过程中影响发酵豆腐品质的关键因素依然是菌株的特性，菌株的生长特性及代谢特性不仅会影响大豆蛋白的聚集性行为进而影响豆腐品质，而且会影响豆浆体系中原料物质的生物转化途径，进而影响豆腐的营养构成、风味特性等，因此筛选适合发酵豆腐制备的专属菌株尤为重要。尽管目前部分研究尝试了用乳酸菌发酵制备无凝固剂发酵豆腐这一工艺过程，但关于菌株对豆腐品质的研究不够深入，筛选同时满足适应性强、发酵快、豆腐风味和质地良好的菌种并非易事。
发明内容
为了解决目前存在的问题，本发明提供了一株豆腐酸浆来源的植物乳杆菌及其应用，具体的技术方案如下：
本发明提供一株豆腐酸浆来源的菌株SJ-L-1，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏登记编号为CGMCC No.25209，保藏日期为2022年6月29日。
本发明提供的菌株SJ-L-1的个体形态特征：杆状或短杆状，单个、成对或呈链状排列，革兰氏阳性。菌落形态特征：菌落正面类圆形，侧面稍有突起，乳白色或淡黄色，不透明，菌落边缘整齐，表面光滑，质地柔软有弹性。最适生长温度为37℃，最适pH为6.2-6.4。
本申请提供的菌株SJ-L-1的生理生化学特征：能够利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、甘露醇等碳源，不能利用甘油、山梨糖、肌醇、淀粉、肝糖、木糖醇等碳源。不能水解吐温40，不能利用柠檬酸。能够利用葡萄糖醛酸、葡糖醛酰胺，不能利用丝氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、乙酰乙酸、丙酸、醋酸、甲酸、粘液酸、奎尼酸、D-葡糖二酸等。对洁霉素敏感，对万古霉素不敏感。
本申请提供的菌株SJ-L-1的基因特征：与近型菌株戊糖乳杆菌(Lactiplantibacilluspentosus)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)和阿根廷乳杆菌(Lactiplantibacillus argentoratensis)的dDH值分别为24.20％、93.9％和63.40％；与近型菌株戊糖乳杆菌(Lactiplantibacilluspentosus)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)和阿根廷乳杆菌(Lactiplantibacillusargentoratensis)的ANI值分别为82.11％、99.24％和95.56％；与植物乳杆菌的dDH值大于细菌物种的70％的阈值，ANI值大于建议划界物种的95-96％的阈值，是一株植物乳杆菌。
通过形态学特征、生理生化特征和基因特征分析，菌株SJ-L-1符合植物乳杆菌的特征。
本申请提供植物乳杆菌SJ-L-1在直投发酵剂制备中的应用，包括以下步骤：
菌种活化后，37℃条件下在50mL锥形瓶中扩大培养24h，制备浓缩菌液，然后在菌体悬浮液中加入保护剂溶液，再将其真空冷冻干燥，最后保藏冷冻干燥所得的直投发酵剂。
上述步骤中，优选的，在制备缩菌液过程中，将培养好的菌液置于离心机中，8000×g，4℃条件下离心10min，用0.85％无菌生理盐水洗涤菌体两次。
上述步骤中，优选的，保护剂溶液为脱脂乳粉+5％蔗糖，菌液与保护剂比例(v/v)为1：1。
可选的，本申请提供的的植物乳杆菌SJ-L-1在酸浆豆腐制备中的应用，包括以下步骤：
0.1-0.5g/L直投发酵剂或1-3％(体积百分比)菌种培养液的接种量将植物乳杆菌SJ-L-1接入灭菌后的黄浆水。发酵10-15h酸浆pH即可降低至pH3.6-3.8，该pH范围的酸浆，在90℃下蹲脑至凝乳，蹲脑完成之后压制成型，可制备获得质地优良、风味独特、成品得率高的酸浆豆腐成品。
本申请还提供植物乳杆菌SJ-L-1在无凝固剂发酵豆腐制备中的应用。
可选的，本申请提供的的植物乳杆菌SJ-L-1在无凝固剂发酵豆腐制备中的应用，包括以下步骤：
(1)制备豆酪步骤：按0.1-0.5g/L直投发酵剂接种量将植物乳杆菌接种于灭菌后的豆浆中，30℃-35℃发酵20-26h形成豆酪；
(2)豆腐发酵：按1-3％(体积百分数)菌种培养液的接种量将豆酪接种于灭菌后的豆浆中，30℃-35℃发酵至pH分别为5.0-6.2。
(3)蹲脑温度的确定：豆浆发酵至pH5.0-6.2时，立即加热至75-95℃进行蹲脑。
上述步骤(1)中，优选的，植物乳杆菌以菌悬液的形式进行接种，接种量为3％。植物乳杆菌菌悬液的制备方法具体为：取-18℃保藏的植物乳杆菌甘油管，在无菌操作下接种到灭菌MRS液体培养基中，37℃培养24h，传代2次，得到植物乳杆菌菌悬液。
上述步骤(1)中，优选的，植物乳杆菌以直投发酵剂形式接种，接种量为0.2g/L。植物乳杆菌直投发酵剂制备方法具体为：保护剂溶液为脱脂乳粉+5％蔗糖，菌液与保护剂比例(v/v)为1：1，冷冻干燥获得直投发酵剂。
上述步骤(1)中，优选的，培养条件为：37℃恒温中发酵24h。
上述步骤(2)中，优选的，豆酪的接种量为3％。相对于低于3％的发酵量，3％的发酵量能在较短时间内达到所需的发酵结果；相对于3％的发酵量，高于3％的接种量，达到相同的发酵结果并没有明显优势。
上述步骤(2)中，优选的，培养条件为：37℃恒温中发酵至pH 5.8左右，豆浆处于半凝固状态，此时进行蹲脑，所得豆腐持水率高，质地最好；pH低于5.6时，豆浆处于完全凝固状态，经加热蹲脑后失水严重，质地发硬；pH高于6.0时，豆浆凝固不够充分，经加热蹲脑不能获得成型豆腐。
上述步骤(3)中，优选的，蹲脑温度为90℃。相对于75-85℃及95℃的蹲脑温度，在90℃的蹲脑温度下，豆腐的出品率更高。即，在豆浆品质和用量相同，且其他工艺条件步骤相同的情况下，相对于75-85℃及95℃的蹲脑温度，在90℃的蹲脑温度下所获得的豆腐的重量更高；也就是说豆腐的出品率更高。
有益效果
1、本发明中应用的植物乳杆菌SJ-L-1为从众多酸浆乳酸菌中筛选出的适合酸浆制备及无凝固剂发酵豆腐制备的专属菌株，同时具有以下多方面优良性状，这是现有报道的菌株无法达到的。
2、本发明中应用的植物乳杆菌SJ-L-1生长速度及产酸速度快、产酸能力强，在24h内产酸量为17.38g/L，对SJ-L-1的生长条件进行优化，产酸量可进一步提高至26.01g/L。SJ-L-1在黄浆水中发酵10-15h即可用于酸浆豆腐制备，而通常多菌种混合发酵黄浆水制备酸浆需要24h。通过SJ-L-1纯种发酵，实现了单菌株短时间发酵，缩短生产周期，且避免多菌株混合发酵工艺不稳定的缺点；豆浆发酵4-6h即可达到发酵终点，用于无凝固剂发酵豆腐的生产，相比酸浆豆腐的生产周期，无凝固剂发酵豆腐因不需要单独酸浆制备的过程进一步缩短生产周期，节约成本。
3、本发明的植物乳杆菌SJ-L-1耐冷冻能力强，通过菌液中添加的常规菌种保护剂，菌株存活率接近90％，活菌数可达到1.2×1012CFU/g，活菌数水平很高，可将其制备成高活力直投式发酵剂，具有操作方便，可实现连续生产，稳定性好等优点，为酸浆及无凝固剂发酵豆腐的标准化、工业化生产提供保障。
4、基于本发明的植物乳杆菌SJ-L-1全基因组分析，该菌株碳水化合物代谢的基因在基因组中占比最大，通过CAZy数据库注释共鉴定出13个与β-葡萄糖苷酶有关的基因。β-葡萄糖苷酶可以将异黄酮从糖苷型转化为生物活性较高的苷元型，从而提高大豆异黄酮的生物利用度。因此SJ-L-1在黄浆水发酵及豆浆发酵过程中可有效将糖苷型异黄酮转化为生物利用度更高的苷元型，提高酸浆豆腐及无凝固型发酵豆腐的营养价值。
5、本发明的植物乳杆菌SJ-L-1无凝固剂发酵豆腐的总异黄酮含量高，是卤水豆腐的3倍多，亦高于L-1-16发酵豆腐。SJ-L-1发酵豆腐中的异黄酮从结合糖苷到苷元的转化率最高，提高了豆腐的营养功能价值。
6、本发明的植物乳杆菌SJ-L-1基因组中具有合成抗菌肽的基因簇，且通过抑菌实验发现其能够产生抑菌物质，该性能是使得通过植物乳杆菌SJ-L-1制备的酸浆具有天然抗菌性，进而可以使得纯种发酵酸浆制备的酸浆豆腐保质期比自然发酵酸浆制备的酸浆豆腐保质期长。
7、本发明的植物乳杆菌SJ-L-1的抗菌特性使得SJ-L-1无凝固剂发酵豆腐的保质期大于8天，L-1-16发酵豆腐的保质期约为6天，卤水豆腐、酸浆豆腐的保质期约为2天。
8、本发明的植物乳杆菌SJ-L-1无凝固剂发酵豆腐具有硬度适中的特性，其硬度接近新鲜卤水豆腐的硬度，低于L-1-16发酵豆腐，但高于酸浆豆腐的硬度；且相比较L-1-16发酵豆腐，SJ-L-1发酵豆腐的结构更均匀。
9、本发明的植物乳杆菌SJ-L-1无凝固剂发酵豆腐质构稳定性高，优于卤水豆腐及酸浆豆腐。卤水豆腐及酸浆豆腐的硬度在第4天时明显下降，此时卤水豆腐及酸浆豆腐已经发生变质。L-1-16发酵豆腐的硬度在第8天时明显下降，相比之下，植物乳杆菌发酵豆腐在第8天时硬度仍然无显著差异性。
10、本发明的植物乳杆菌SJ-L-1无凝固剂发酵豆腐的风味物质总量高。
11、纯种乳酸菌发酵，无杂菌等致病菌污染，提高了生产速度并保证了豆腐食用安全性。
附图说明
图1为本发明中7株酸浆来源的乳酸菌(SJ-L-1、SJ-L-2、SJ-L-3、SJ-L-4、SJ-L-5、SJ-L-6、L-1-16)发酵过程中的生长曲线；
图2为本发明中7株酸浆来源的乳酸菌(SJ-L-1、SJ-L-2、SJ-L-3、SJ-L-4、SJ-L-5、SJ-L-6、L-1-16)发酵过程中的产酸曲线；
图3为本发明中植物乳杆菌SJ-L-1的菌落形态；
图4为本发明中植物乳杆菌SJ-L-1的镜检结果；
图5为本发明中植物乳杆菌SJ-L-1基于16S rRNA基因序列的Neighbour-joinin***发育树；
图6为本发明中植物乳杆菌SJ-L-1直投发酵剂检测结果；
图7为本发明中植物乳杆菌SJ-L-1发酵豆腐的扫描电镜图；
图8为本发明中卤水豆腐的扫描电镜图；
图9为本发明中酸浆豆腐的扫描电镜图；
图10为本发明中L-1-16发酵豆腐的扫描电镜图。
保藏信息
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所保藏日期：2022年6月29日
保藏编号：CGMCC No.25209
分类命名：Lactobacillus plantarum
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1乳酸菌的初步筛选
为了筛选适合酸浆发酵及无凝固剂发酵豆腐加工的专属乳酸菌，本发明收集来自云南、山东、贵州等地不同加工作坊的酸浆样品80余份，通过分离筛选获得产酸菌株200余株，根据平板菌落形态、钙溶圈大小、MRS试管培养菌密度、显微形态、发酵豆乳凝固时间、发酵液气味等初步分选鉴定出7株产酸能力较强的菌株，分别是SJ-L-1、SJ-L-2、SJ-L-3、SJ-L-4、SJ-L-5、SJ-L-6、L-1-16。为进一步筛选性能优良的专属菌株，本发明对这7株菌的生长性能、产酸性能、产酶性能、抑菌性能、发酵豆浆性能等多方面进行考察，获得SJ-L-1及L-1-16综合评价较好的菌株。
实施例2乳酸菌在MRS中的生长曲线
将7株酸浆来源的乳酸菌(SJ-L-1、SJ-L-2、SJ-L-3、SJ-L-4、SJ-L-5、SJ-L-6、L-1-16)接种于5mL MRS液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养24h，可以观察到菌液明显变浑浊，即收集长出的乳酸菌。将收集到的乳酸菌用平板划线法稀释涂布于MRS固体培养基上，37℃培养箱中培养24h。挑选单菌落再次接种于MRS液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养48h。利用紫外分光光度计在2h、4h、8h、10h、12h、24h、36h、48h测定OD600吸光度按时间绘制生长曲线，结果见图1。由图1可知，植物乳杆菌SJ-L-1在24h前生长速度明显高于其他6株。
实施例3乳酸菌在MRS中的产酸量
将7株酸浆来源的乳酸菌(SJ-L-1、SJ-L-2、SJ-L-3、SJ-L-4、SJ-L-5、SJ-L-6、L-1-16)按1％的接种量接种到3mL液体MRS培养基中，37℃下培养24h，活化至第三代。分别在2h、4h、8h、10h、12h、24h、36h、48h时取发酵液并用蒸馏水稀释25倍，滴加5滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至终点。以灭菌后的MRS液体培养基作为空白对照。乳酸菌在MRS中的酸产量(X)根据以下公式计算：
式中，V0(mL)为稀释前发酵液的体积，V1(mL)为发酵液消耗的氢氧化钠溶液体积，V2(mL)为空白对照消耗的氢氧化钠溶液的体积。CNaOH(0.1mol/L)为用于滴定的氢氧化钠浓度，M(g/mol)为乳酸的摩尔质量。
本发明实施例所使用的乳酸菌在48h内产酸量的结果如图2所示，由图2可知，SJ-L-1在18h前的产酸率高于其他菌株，在24h时的产酸率最高，为17.38g/L。
实施例4乳酸菌产糖苷酶及抑菌特性
将7株酸浆来源的乳酸菌(SJ-L-1、SJ-L-2、SJ-L-3、SJ-L-4、SJ-L-5、SJ-L-6、L-1-16)按1％的接种量接种到3mL液体MRS培养基中，37℃下培养24h，活化至第三代。从表1可以看出SJ-L-1及L-1-16具有较高的糖苷酶活力及较强的抑菌性能。
表17株乳酸菌产糖苷酶及抑菌特性
注：“+++”是指抑菌圈直径超过12mm，“++”是指抑菌圈直径6-12mm，“+”是指抑菌圈直径0.5-6mm，“-”是指无抑菌活性。
实施例5乳酸菌发酵豆浆
将活化好的7株乳酸菌分别接种于灭过菌的豆浆中，接种量为1％。置于培养箱中，37℃静置培养。每隔30min观察一次样品状态，待样品完全凝固，记录凝固所需时长。
7株乳酸菌发酵豆浆，凝固时间各不相同，但均在10h内完全凝固。菌株SJ-L-1发酵的豆浆凝固得最快，4h左右即可凝固，这与SJ-L-1生长速度快、产酸速度快、产酸量大呈相关关系。其次是菌株L-1-16和SJ-L-6，5h左右凝固。菌株SJ-L-2、SJ-L-4、SJ-L-5发酵的豆浆在7h左右凝固。耗时最长的是菌株SJ-L-3，发酵豆浆使其凝固大约需要9h。
邀请10名同学分别对7株乳酸菌发酵24h得到的豆酪进行感官评价，评分标准如下：
表2感官评价评分标准
感官评价结论如下：从外观方面来看，7株菌发酵的豆酪均呈乳白色，颜色较好。从气味方面来看，菌株SJ-L-1及L-1-16发酵的豆酪酸味柔和，菌株SJ-L-6发酵的豆酪酸味较刺激，其余菌株发酵的豆酪酸味可接受。从持水性来看，菌株SJ-L-1、L-1-16发酵的豆酪较好，菌株SJ-L-2、SJ-L-4、SJ-L-5发酵的豆酪较差。总体来说菌株SJ-L-1、L-1-16在豆浆基质中的发酵性能较为突出。
实施例6植物乳杆菌的鉴定及注释
6.1形态学特征
菌株SJ-L-1的菌落特征为：该菌株在固体MRS培养基上的形态如图3所示，24h左右时菌落呈白色，边缘为圆形，不透明，凸起，较小。镜检结果如图4所示，菌体呈杆状或短杆状，革兰氏染色结果为紫色，即为革兰氏阳性菌。
6.2生理生化特征
检测方法：菌株的生理生化特征检测方法参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌***鉴定手册》进行。
检测结果如表2所示。
表3菌株SJ-L-1生理生化鉴定结果
注：“-”是指阴性(未检测到)，“+”是指阳性(检测到)“W”是指无法检出。
6.3基因特征
通过美吉生物公司对本申请的菌株SJ-L-1进行DNA测序。本申请的植物乳杆菌SJ-L-1基因组序列数据显示，其全基因组序列为320,994,0bp，DNA中G+C含量为44.64％。将本申请的菌株YP1的基因序列通过基因库(Genebank)序列比对，利用MEGA7.0建立***发育树，结果见图5。通过16S rDNA序列***发育分析，ANI与dDH值分析，菌株SJ-L-1鉴定为植物乳杆菌。
6.4基因注释
对本申请的植物乳杆菌SJ-L-1的编码基因通过COG(http://eggnog.embl.de/)和KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)数据库进行功能注释，通过CAZy数据库(http://www.cazy.org/)对其碳水化合物活性酶进行分析。COG数据库注释结果表明，植物乳杆菌SJ-L-1中最丰富的是碳水化合物转运和代谢(278个基因)和转录(242个基因)氨基酸转运与代谢(203个基因)。KEGG数据库注释的结果表明，植物乳杆菌SJ-L-1中碳水化合物代谢和氨基酸代谢占主导地位，与COG注释结果一致。以上结果表明，参与SJ-L-1碳水化合物的基因占比很大，推测SJ-L-1具有良好的糖苷水解能力。
本申请的植物乳杆菌SJ-L-1的CAZy注释结果表明，糖苷水解酶在碳水化合物活性酶中的占比最大(46.73％)。在糖苷水解酶分类中共鉴定出13个β-葡萄糖苷酶基因，β-葡萄糖苷酶可以将异黄酮从糖酮转化为苷元形式，因此推测SJ-L-1在异黄酮转化方面具有很大的潜力。
实施例7植物乳杆菌直投发酵剂的制备
将活化三代的植物乳杆菌SJ-L-1按照2％的接种量接种至50mL MRS锥形瓶中扩大培养，在37℃下培养24h。将培养好的菌液置于离心机中，8000×g，4℃条件下离心10min，弃上清液，用0.85％无菌生理盐水洗涤菌体两次后，再以同样的条件离心即得菌体沉淀。
以脱脂乳粉和5％蔗糖为冻干保护剂溶液，按菌液(未离心前体积)与保护剂比例(v/v)为1∶1制备菌体悬浮液。将菌液分装并置于冰箱-80℃预冻，冻结完全后将样品放入真空冷冻干燥机内冻干24h，然后置于-20℃冰箱中保存。SJ-L-1具有良好的耐冷冻能力，冷冻干燥后活菌率为冷冻干燥前的接近90％。将植物乳杆菌SJ-L-1直投发酵剂送至善恩康生物科技(苏州)进行检测，结果如图6所示，直投发酵剂活菌数高达1.2×1012CFU/g。
实施例8植物乳杆菌酸浆的制备
0.1-0.5g/L直投发酵剂或1-3％(体积百分比)菌种发酵液的接种量将植物乳杆菌SJ-L-1接入灭菌后的黄浆水。发酵10-15h酸浆pH即可降低至pH3.6-3.8。该pH范围的酸浆，在90℃下蹲脑至凝乳，蹲脑完成之后压制成型，可制备获得质地优良、风味独特、成品得率高的酸浆豆腐成品。
以自然发酵的酸浆在相同的加工条件下制备酸浆豆腐为对照，将自然发酵酸浆豆腐及纯种发酵酸浆豆腐置于室温保藏，每隔1天取样品观察酸浆豆腐形态并测定菌落总数，结果发现自然发酵酸浆制备的酸浆豆腐在第二天就出现浆水浑浊的现象，菌落总数亦超标。而纯种发酵的酸浆豆腐直到第3天才开始出现浆水浑浊的现象。
实施例9植物乳杆菌在无凝固剂发酵豆腐制作中的应用
按3％的接种量将植物乳杆菌SJ-L-1接种于灭过菌的豆浆中，37℃发酵24h得到的豆酪；将豆酪按照3％接种量接种于灭过菌的豆浆中，37℃培养，等豆浆处于半凝固状态时取出、放入90℃水浴锅中进行蹲脑；蹲脑完成之后压制成型，即获得SJ-L-1发酵豆腐。
取上述无凝固剂发酵豆腐黄浆水自然发酵15h，该发酵液即为酸浆凝固剂；在90℃下蹲脑至凝乳；蹲脑完成之后压制成型，即获得酸浆豆腐。
以鼠李糖乳杆菌L-1-16作为接种菌种，按照实施例4的方法制备获得L-1-16发酵豆腐。
以MgCl2为盐卤，90℃蹲脑至凝乳，蹲脑完成之后压制成型，即获得卤水豆腐。
9.1质构测定
将豆腐分别切成1.5cm×1.5cm×1.5cm的方块，用TMS-PRO质构仪进行分析。实验参数为：触发力0.5N，前试速度30mm/s，试验速度20mm/s，后试速度20mm/s。每个豆腐样品平行测定三次。
结果如表4所示，SJ-L-1发酵豆腐的硬度为290.96g，与卤水豆腐最相近。弹性、黏性和咀嚼性变化趋势相似，L-1-16发酵豆腐最高，酸浆豆腐最低。以上结果表明加工方法及发酵菌株会影响豆腐的质地。植物乳杆菌SJ-L-1发酵产酸使蛋白凝胶化，并通过加热进一步完全凝胶化，因而形成了一个紧凑且均匀的三维凝胶网络结构，从而产生了较大的硬度、黏性和咀嚼性。
分别取放置0d、2d、4d、6d、8d的卤水豆腐及酸浆豆腐、L-1-16发酵豆腐、SJ-L-1发酵豆腐样品，使用质构仪进行质构测试硬度(g)，测试结果如表5所示。根据豆腐的质构变化可初步推测卤水豆腐和酸浆豆腐的保质期约为2天，L-1-16发酵豆腐的保质期约为6天，SJ-L-1发酵豆腐的保质期大于8天。
表4四种豆腐质构特性
质构参数 卤水豆腐 酸浆豆腐 L-1-16发酵豆腐 SJ-L-1发酵豆腐
硬度(g) 285.26±45.62 181.34±41.38 395.93±42.30 290.96±22.36
弹性(mm) 2.66±0.34 2.04±0.64 3.01±0.20 2.93±0.21
内聚性 0.60±0.00 0.55±0.58 0.63±0.05 0.65±0.58
黏性(g) 177.15±32.99 99.72±27.58 248.94±37.71 193.04±22.67
咀嚼性(mj) 4.7±1.50 2.15±1.34 7.63±1.21 5.58±1.05
表5四种豆腐硬度随时间变化特性
0d 2d 4d 6d 8d
卤水豆腐 285.26 265.31 183.67 153.06
酸浆豆腐 181.34 142.86 91.84 81.63
L-1-16发酵豆腐 395.93 379.13 419.95 463.86 309.24
SJ-L-1发酵豆腐 290.96 285.71 306.12 326.53 306.12
9.2微观结构测定
将豆腐样品切成小片(5mm×2mm×2mm)，4℃下在2.5％戊二醛下中浸泡24h，然后用0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝7.2-7.4)冲洗2次。测量前分别用30％、50％、70％、90％乙醇洗脱1小时，最后用100％乙醇洗脱3次，每次1小时。然后将样品冻干，表面喷金。在Sigma300扫描电镜下观察豆腐样品凝乳的微观结构。
如图7所示所示，SJ-L-1发酵豆腐的质地均匀，结构紧凑，硬度高。SJ-L-1发酵是一个缓慢的酸生产过程，因此获得的豆腐凝胶的质地均匀。如图8所示所示，氯化镁是一种快速作用的凝固剂，凝乳步骤难以控制，在局部的快速凝固导致卤水豆腐的凝胶结构不均匀。如图9所示，酸浆豆腐的结构松散；如图10所示，L-1-16发酵豆腐的微观结构致密，但有较大的孔隙。
9.3异黄酮含量测定
将1m豆浆与4mL 80％(v/v)甲醇混合，超声提取60min。将提取液以10000rpm，4℃离心10min，收集上清液。将豆腐样品冻干，每克冻干产物加入10mL80％乙醇重溶，于室温超声提取6h，超声功率70w。提取液以10000rpm，4℃离心10min。用旋转蒸发仪将醇提上清液中的乙醇蒸干，并用80％甲醇将剩余液体重新定容至10mL。将上清液用0.22μm的滤膜过滤，通过高效液相色谱分析异黄酮的含量，平行测定三次。
色谱条件：色谱柱为岛津AQ-C18(4.6×250mm，5μm)柱；流动相为0.5％(v/v)冰醋酸水溶液(A)和100％乙腈(B)；流速为0.6mL/min；柱温为30℃；检测波长为260nm；进样量为15μL；梯度洗脱条件如表6所示。
豆浆和四种豆腐样品中异黄酮的含量如表7所示。与豆浆、卤水豆腐、酸浆豆腐和L-1-16发酵豆腐相比，SJ-L-1发酵豆腐的异黄酮总含量最高。豆浆中的异黄酮的存在形式主要是结合糖苷，豆腐中的糖苷含量降低，游离苷元含量增加。SJ-L-1发酵豆腐的异黄酮转化率最高，与豆浆相比，SJ-L-1发酵豆腐中苷元含量提高了60倍；与卤水豆腐相比，SJ-L-1发酵豆腐中苷元含量提高至将近四倍。这与SJ-L-1中含有大量的β-葡萄糖苷酶有关，β-葡萄糖苷酶能够水解豆浆中大豆异黄酮的糖苷结构，转化为生物活性较高的苷元形式，从而提高大豆异黄酮的生物有效性。将SJ-L-1发酵豆腐的酸浆作为凝固剂应用于酸浆豆腐生产中，高含量的苷元型异黄酮随着酸浆凝固剂被重新添加到豆腐制作过程中而被保留下来，最终得到富含苷元型异黄酮的酸浆豆腐，大大提高了豆腐的营养价值。
SJ-L-1发酵豆腐中含有大量的大豆苷和染料木素，分别占总异黄酮含量的52.50％和44.21％。大豆黄酮和染料木素具有较强的DPPH和羟基自由基清除能力，可以保护细胞免受自由基的破坏作用，具有良好的抗氧化活性。此外，大豆苷和染料木素还在大豆的抗癌活性中起主导地位。因此，植物乳杆菌SJ-L-1作为一株功能性乳酸菌，在发酵食品的开发应用中具有巨大潜力。
表6色谱柱梯度洗脱条件
保留时间(min) A：0.5％(v/v)冰醋酸水溶液 B：100％乙腈
5 85 15
28 65 35
42 55 45
47 10 90
59 85 15
表7豆浆及四种豆腐异黄酮含量
注：“-”是指是指无法检出。
9.4风味测定
将5g新鲜豆腐样品打碎后放入20ml的顶空瓶中，将样品瓶于60℃振荡孵育10min。在50℃下顶空萃取30min，然后在240℃下解吸2min。挥发性风味物质的测定采用气相色谱-质谱进行分析。
色谱条件：色谱柱为安捷伦DB-WAX(60m×0.25μm×0.25μm)毛细管柱；进样口温度为240℃，不分流进样，柱流速为1.0mL/min；柱温：初始温度为35℃，保持3min，再以3℃/min的速度升至220℃，保持10min。质谱条件：EI，离子源温度230℃，四极杆温度150℃。
将气相色谱-质谱检测结果与NIST质谱库进行比较鉴定豆腐样品中的挥发性化合物，结果如表8所示。在SJ-L-1发酵豆腐中，鉴定出22种挥发性化合物，包括9种醇类、5种醛类、2种酮类、2种酸类、2种酯类和2种呋喃类，且SJ-L-1发酵豆腐的挥发性化合物总含量最高。
表8四种豆腐挥发性化合物含量
注：“-”是指是指无法检出。
9.5感官测定
邀请15名专业的质量感官评价人员分别对实施例制备的发酵豆腐进行质量感官评价，评分标准如表9所示；评价结果如表10所示。
表9感官评价标准
表10四种豆腐感官评价得分
色泽 风味 硬度
卤水豆腐 7.2 6.7 6.9
酸浆豆腐 6.9 6.5 5.7
L-1-16发酵豆腐 7.1 6 6
SJ-L-1发酵豆腐 7.3 6.3 7.3

Claims (7)

1.一株豆腐酸浆来源的植物乳杆菌，其特征在于，所述菌株命名为SJ-L-1，其分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25209。
2.一种植物乳杆菌直投发酵剂，其特征在于，由权利要求1所述的植物乳杆菌制成。
3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2所述的植物乳杆菌直投发酵剂在豆腐酸浆制备中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将植物乳杆菌直投发酵剂或植物乳杆菌的菌种培养液接入灭菌后的黄浆水，其中所述植物乳杆菌直投发酵剂添加量为0.1-0.5g/L，植物乳杆菌的菌种培养液添加量为1-3％v/v，发酵10-15h酸浆pH降低至pH3.6-3.8，该pH范围的酸浆可制备获得质地优良、风味独特、成品得率高的酸浆豆腐成品。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述黄浆水选择无凝固剂发酵豆腐压制过程中的黄浆水。
6.根据权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2所述的植物乳杆菌直投发酵剂在无凝固剂发酵豆腐中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备豆酪步骤：将植物乳杆菌直投发酵剂或植物乳杆菌的菌种培养液接种于灭菌后的豆浆中，其中所述植物乳杆菌直投发酵剂添加量为0.1-0.5g/L，植物乳杆菌的菌种培养液添加量为1-3％v/v，30℃-35℃发酵20-26h形成豆酪；
(2)豆腐发酵：将豆酪接种于灭菌后的豆浆中，所述豆酪添加量为1-3％v/v，30℃-35℃发酵至pH为5.0-6.2时，豆浆处于半凝固状态，于75-95℃下进行蹲脑，所得豆腐持水率较高，质地较好。
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