CN110257285B - 一株具有高效降解亚硝酸盐及强产酸功能的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株具有高效降解亚硝酸盐及强产酸功能的植物乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株具有高效降解亚硝酸盐及强产酸功能的植物乳杆菌，其命名为植物乳杆菌P42，其保藏编号为：CCTCC NO.M2019369。本发明还提供了所述植物乳杆菌在发酵泡菜上的应用；将该菌株在接种到含有200mg/L的亚硝酸盐的MRS培养基，37℃培养24h后对亚硝酸盐的降解率为97.28±0.64％，培养液pH由5.83±0.01变为3.45±0.02；在37℃培养48h后亚硝酸盐降解率达到99.66±0.29％。将植物乳杆菌P42接种发酵得到的泡菜，第二天达到最大亚硝酸盐含量仅为1.85±0.03mg/kg，且制得的发酵泡菜不论是从色泽、质地、口感、气味还是整体的可接受度都是优于自然发酵泡菜。

Description

一株具有高效降解亚硝酸盐及强产酸功能的植物乳杆菌及其 应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株具有高效降解亚硝酸盐及强产酸功能的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
乳酸菌是一类能够利用可发酵性糖并且产生大量乳酸的细菌的统称。乳酸菌是泡菜中的优势菌种，在泡菜发酵的过程中起着至关重要的作用。它不仅可以缩短泡菜发酵的时间，还能在发酵的过程中生成乳酸、乙酸、氨基酸等各种物质，进一步提高蔬菜的营养价值。
泡菜是中国传统发酵蔬菜之一，其特点是酸爽可口，香气宜人，在中国许多地区被广泛食用，尤其是在中国的北方。泡菜因其良好的口感和较高的营养价值一直深受很多人的喜爱。家庭制作的泡菜一般是以混合新鲜或盐渍蔬菜(如白菜，萝卜，胡萝卜，豇豆，莲藕)为原料，将其浸泡在调味的(例如，姜，辣椒，花椒，大蒜)盐水中，然后放在室温下进行厌氧发酵。然而，泡菜在发酵过程中，蔬菜组织中存在的硝酸盐很容易转化为亚硝酸盐，泡菜中亚硝酸盐的积累成为一种常见的问题。
亚硝酸盐(Nitrite)，简称NIT，它经常被添加到发酵肉制品中能够很好的保持肉制品的鲜红色泽，同时还能增强肉制品的感官质量，还具有防腐作用。但是食用过量的含亚硝酸盐的食品会导致人体亚硝酸盐的摄入量超标，可能会引发高铁血红蛋白血症。同时，亚硝酸盐还可以与食品中蛋白质分解产物次级胺结合，生成致癌性很强的N-亚硝基化合物，会有致癌风险。因此，降低亚硝酸盐含量对于维持食品安全显得非常重要。
目前降解亚硝酸的方法主要有三种，主要有化学方法、生物方法和生物酶解方法。化学法降解亚硝酸盐的能力强，但是抗氧化剂VC和VE却容易被氧化，不利于运用到复杂食品体系当中。生物酶法降解亚硝酸盐，主要是利用微生物产生亚硝酸盐还原酶使亚硝酸盐分解。但是由于目前研究发现的亚硝酸盐还原酶基本都是胞内酶，因此很难将其广泛应用于食品工业生产中。应用生物方法相比较来说是一种既安全又低成本的方法。其中最简单安全有效的一种是应用乳酸菌菌种控制腌制品和泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量。很多研究表明从泡菜中分离的乳酸菌可以降解泡菜中亚硝酸盐，但是想筛选得到一株兼具兼具降解亚硝酸盐和产酸能力强的乳酸菌却是非常的难。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一株具有高效降解亚硝酸盐及强产酸功能的植物乳杆菌及其应用。该菌株具有极强的产酸能力和耐酸能力的同时具有极强地降解亚硝酸盐的能力，经鉴定为植物乳杆菌，将其接种到泡菜中得到的泡菜产品，具有良好的感官评价：经过质构分析和感官分析发现经该植物乳杆菌发酵的泡菜不论是从色泽、质地、口感、气味还是整体的可接受度都是更优于自然发酵泡菜。
本发明的目的之一在于提供一株具有高效降解亚硝酸盐及强产酸功能的植物乳杆菌，其命名为植物乳杆菌P42(Lactobacillus plantarum P42)，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)NO.M2019369。
该植物乳杆菌P42为本发明人从重庆家庭自制泡菜中分离筛选出来的菌株，发现该菌株具有极强的产酸能力和耐酸能力，同时具有极强地降解亚硝酸盐的能力，具体地：将该菌株在接种到含有亚硝酸盐的MRS培养基，37℃培养24h后对亚硝酸盐的降解率为97.28±0.64％，培养液pH由5.83±0.01变为3.45±0.02；在37℃培养48h后亚硝酸盐降解率达到99.66±0.29％，培养液pH由5.83±0.01变为3.49±0.02。
该菌株经菌落形态、生化及16S rRNA测序分析鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，命名为植物乳杆菌P42。
本发明的目的之二在于提供所述的具有高效降解亚硝酸盐及强产酸功能的植物乳杆菌在发酵泡菜上的应用。
本发明的目的之三在于提供一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包括将所述的植物乳杆菌P42进行发酵获得的发酵液，或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。
本发明的目的之四在于提供一种发酵泡菜的制备方法，在泡菜发酵开始时，将权利要求1所述的植物乳杆菌P42制成的菌悬液或干粉菌剂与白菜、食盐水以及调味料一起加入泡菜坛中发酵。
将所述植物乳杆菌P42制备的菌液以1×108CFU/mL～1×1011CFU/mL的接种量接种到泡菜(并添加相应辅料)中，且在发酵刚开始时将菌悬液加入，植物乳杆菌P42的接种量为4％，所述接种量的单位是mL/L。
本发明的目的之五在于一种所述的方法制备得到的泡菜产品。在发酵泡菜时接种乳酸菌P42得到的泡菜产品中第二天达到最大亚硝酸盐含量仅为1.85±0.03mg/kg，远远低于国标(GB15198)规定的20mg/kg。且在泡菜发酵过程中卤水的pH由6.78±0.04变为3.54±0.3。
本发明的有益效果是：
1、本发明人从重庆、四川、陕西和湖北四省家庭自制泡菜中分离筛选出来的多株菌株，最后筛选得到一株菌株，该菌株具有极强的产酸能力和耐酸能力的同时具有极强地降解亚硝酸盐的能力，具体地：将该植物乳杆菌P42在接种到含有200mg/L亚硝酸盐的MRS培养基，37℃培养24h后对亚硝酸盐的降解率为97.28±0.64％，培养液pH由5.83±0.01变为3.45±0.02；在37℃培养48h后亚硝酸盐降解率达到99.66±0.29％，培养液pH由5.83±0.01变为3.49±0.02。经鉴定菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌P42。
2、本发明人将植物乳杆菌P42接种到泡菜中得到的泡菜产品，检测发现其发酵第二天达到最大亚硝酸盐含量仅为1.85±0.02mg/kg，远远低于国标(GB15198)规定的20mg/kg。且发酵3d后，泡菜发酵过程中卤水的pH由6.78±0.04变为3.51±0.25，而自然发酵的卤水变化比较慢由开始的6.72±0.07到第三天变为5.47±0.01。
将该植物乳杆菌P42应用于泡菜发酵过程中能够加快泡菜成熟且发酵的泡菜具有良好的感官评价：经过质构分析和感官分析发现经植物乳杆菌P42发酵的泡菜不论是从色泽、质地、口感、气味还是整体的可接受度都是更优于自然发酵泡菜。
其中，本发明的菌株的保藏日期为2019年5月17日，保藏编号为CCTCCNO.M2019369。其分类命名为植物乳杆菌P42(Lactobacillus plantarum P42)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。
附图说明
图1是乳酸菌P42在显微镜下革兰氏染色的形态照片；
图2是菌株P42的***发育树分析。
具体实施方式
实施例1菌株P42的定向富集分离与鉴定
1、菌株P42的定向富集分离
从重庆、四川、陕西和湖北四省家庭自制泡菜中采集样品，加入90mL pH4.0的植物乳杆菌液体培养基(LPB)，37℃富集培养12小时，用无菌水10倍梯度逐级稀释(10-1～10-5)，取200μL均匀涂布于含0.5％CaCO3植物乳杆菌固体培养基(LPA)平板中，37℃厌氧培养48h，挑取融钙圈较大的菌落，再多次划线分离纯化，筛选到多株融钙圈较大的微生物。
将所述融钙圈较大的微生物菌落分别接种MRS液体培养基，37℃静置培养至稳定期，按4％的接种量接种至含有200mg/L的MRS液体培养液中进行培养，培养24-48h后，采用格里斯比色法测定MRS液体中NaNO2的含量，采用分光光度法检测菌体密度，用pH计测定菌液的pH值。
结果发现，有一株来自于湖北家庭自制泡菜的菌株P42在37℃培养24h后对亚硝酸盐的降解率为97.28±0.64％，培养液pH由5.83±0.01变为3.45±0.02；在37℃培养48h后亚硝酸盐降解率达到99.66±0.29％，培养液pH由5.83±0.01变为3.49±0.02。
2、菌株P42的鉴定
(1)菌株P42的菌体及菌落形态特征
将-80℃冰箱中甘油保藏的菌株P42菌液在冰上解冻，用接种环取一环菌液在MRS琼脂平板上进行划线，将培养皿倒置于恒温培养箱中37℃培养48h左右，观察菌落形态。取MRS琼脂平板上长出的单菌落，进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态，如图1所示。
观察菌落颜色呈乳白色，不透明，菌落形状呈圆形，小凸起，边缘整齐，表面光滑湿润，易挑取，并且有清淡的发酵酸味。革兰氏染色结果表明细胞染色后为蓝紫色，***，菌体形态呈短杆状，单个或成对存在。
(2)遗传学特征
采用16SrDNA基因序列分析对活化后的菌株P42进行了分子生物学鉴定。首先采用SK8255-Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒对菌株进行DNA的提取，然后将菌株的基因组DNA作为PCR的扩增模板，PCR反应引物为细菌的通用引物进行PCR扩增。最后将PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后将符合测序要求的产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
将测序结果与Blast搜索程序从数据库(NCBI)中基因序列进行比对分析，并构建***发育树(图2所示)。发现P42菌株与模式菌株Lactobacillus plantarum strain BCH-2、Lactobacillus plantarum L.P 205、Lactobacillus plantarum strain CSI9、Lactobacillus plantarum strain CSI3同源性达到了99％。结合生理生化特性，确定菌株P42为植物乳杆菌属，并命名为植物乳杆菌P42(Lactobacillus plantarum P42)。并于2019年5月17日于中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO.M2019369。
实施2植物乳杆菌P42降解亚硝酸盐能力及强产酸能力测定
1、植物乳杆菌P42菌悬液的制备
取保存在4℃冰箱中植物乳杆菌P42的斜面，用接种环划线接种于MRS琼脂培养基上，置于恒温培养箱中37℃培养24h。取单菌落接种于MRS液体培养基中，置于恒温培养箱中37℃培养16h。将变浑浊的MRS液体培养基在超净台中移入无菌离心管中离心，弃上清液，用0.85％无菌生理盐水洗菌两次，然后加0.85％无菌生理盐水，混匀，制成1×108CFU/mL的菌悬液备用。
2、接种植物乳杆菌P42菌悬液
将5mL灭菌的2000μg/mL NaNO2的溶液加入到45mL的MRS肉汤培养基中得到含200mg/L的NaNO2的肉汤培养基，再将植物乳杆菌P42的菌悬液接种到含200mg/L的NaNO2的肉汤培养基中。其中接种量为2％(v/v)，发酵温度为37℃。
同时将植物乳杆菌P42的菌悬液接种到含300mg/L的NaNO2的肉汤培养基中。其中接种量为2％(v/v)，发酵温度为37℃。
3、取样并测定亚硝酸盐含量及pH值变化情况
在发酵的0h，4h，8h，12h，24h，36h和48h时间点，取发酵液离心(4℃，5min，10000r/min)，将得到的上清液利用比色亚硝酸盐的方法测定亚硝酸盐的含量，计算降解率。接种到含200mg/L的NaNO2的肉汤培养基中的结果见表1，接种到含300mg/L的NaNO2的肉汤培养基中的结果见表2。
表1
Figure BDA0002099805370000071
由表1可以看出，在含200mg/L的NaNO2的MRS培养基情况下，24h后植物乳杆菌P42对亚硝酸盐的降解率达到97.28±0.64％，pH由5.83±0.01变为3.45±0.02，表明植物乳杆菌具有极强的产酸能力和耐酸能力的同时具有极强地降解亚硝酸盐的能力。
表2
Figure BDA0002099805370000081
由表2可以看出，在含300mg/L的NaNO2的MRS培养基情况下，24h后植物乳杆菌P42对亚硝酸盐的降解率达到96.01±0.93％，pH由5.83±0.01变为3.79±0.03，表明植物乳杆菌在含300mg/L的高浓度的NaNO2情况下依然具有极强的产酸能力和耐酸能力的同时具有极强地降解亚硝酸盐的能力。
实施例3接种植物乳杆菌P42进行泡菜发酵实验
1、泡菜的制作
泡菜配方如下：白菜400g，大蒜30g，生姜30g，花椒5g，干红辣椒5g，食盐40g，凉白开1L。将白菜清洗、切分、沥干备用，生姜切片，大蒜去皮备用后将原料和调味料都装入泡菜坛子，加入食盐水，实验组：接种本发明的植物乳杆菌P42菌悬液作为发酵剂进行发酵，接种量为40mL。泡菜发酵的温度为25℃，发酵时间为7d，对照组是自然发酵，不接种植物乳杆菌P42菌悬液。
2、泡菜中亚硝酸盐含量和卤水的pH测定
取泡菜和泡菜卤水测定泡菜中亚硝酸盐含量和卤水的pH如表3所示。
表3
Figure BDA0002099805370000091
由表3可知，自然发酵过程中第二天达到亚硝酸盐含量最大值33.14±19.63mg/kg，接种植物乳杆菌P42发酵也是第二天亚硝酸盐含量达到最大值1.85±0.03mg/kg。接种植物乳杆菌P42发酵的泡菜亚硝酸盐含量一直处于很低的水平，且一直低于自然发酵过程中产生的亚硝酸盐含量。说明接种植物乳杆菌P42的发酵泡菜可以大大降低泡菜中亚硝酸盐含量。接种植物乳杆菌P42的发酵泡菜的卤水第一天下降的很快pH由6.78±0.04变为4.06±0.28，到第三天基本稳定为3.51±0.25，而自然发酵的卤水变化比较慢由开始的6.72±0.07到第三天变为5.47±0.01。说明接种P42发酵泡菜可以大大缩短发酵时间。
3、泡菜进行质构分析和感官评定
泡菜发酵7d后对泡菜进行质构分析和感官评定见表4和表5。
表4-自然发酵泡菜和接种植物乳杆菌P42发酵泡菜的质构变化
Figure BDA0002099805370000092
由表4可知，在相同温度下自然发酵的泡菜质地(硬度、粘性、咀嚼性、弹性和回弹性)与植物乳杆菌P42发酵的泡菜相似(P>0.05)。这表明接种植物乳杆菌P42并未改变泡菜的质地。
表5-自然发酵泡菜和接种植物乳杆菌P42发酵泡菜的感官评价
Figure BDA0002099805370000101
由表5可知，接种植物乳杆菌P42发酵泡菜不论是从色泽、质地、口感、气味还是整体的可接受度都是更优于自然发酵泡菜的。说明接种植物乳杆菌P42的发酵泡菜可以提高泡菜的感官品质。一个优质的泡菜，其口感不能是新鲜白菜味也不能酸味太重，酸味要在消费者的接受程度内；接种本发明的植物乳杆菌P42的泡菜的卤水的pH为3.51±0.25，酸味口感好。
以上所述仅为本发明的一个实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一株具有高效降解亚硝酸盐及强产酸功能的植物乳杆菌，其特征在于，其命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P42，其保藏编号为：CCTCC NO.M2019369。
2.权利要求1所述的具有高效降解亚硝酸盐及强产酸功能的植物乳杆菌在发酵泡菜上的应用。
3.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂为：如权利要求1所述的植物乳杆菌P42经发酵获得的发酵液，或如权利要求1所述的植物乳杆菌P42经发酵获得发酵液后再经喷雾干燥获得的干粉菌剂。
4.一种发酵泡菜的制备方法，其特征在于，在泡菜发酵开始时，将权利要求1所述的植物乳杆菌P42制成的菌悬液或干粉菌剂与白菜、食盐水以及调味料一起加入泡菜坛中发酵。
5.如权利要求4所述的发酵泡菜的制备方法，其特征在于，所述菌悬液的浓度为1×108CFU/mL-1×1011CFU/mL，且在发酵刚开始时将菌悬液加入，植物乳杆菌P42的接种量为4％，所述接种量的单位是mL/L。
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