CN115943312A

CN115943312A - 免疫抑制性成纤维细胞群体的生物标志物antxr1及其在预测对免疫疗法的反应中的用途

Info

Publication number: CN115943312A
Application number: CN202180043224.9A
Authority: CN
Inventors: 法蒂玛·梅齐塔-格里格里欧; 雅恩·基耶夫尔; 安娜·文森特-萨洛蒙; 拉希德·奥西纳·奥西纳
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Curie
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Curie
Priority date: 2020-05-07
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2023-04-07
Also published as: CA3176497A1; EP4147053A1; WO2021224438A1; US20230258645A1; JP2023525082A

Abstract

本发明提供了一种用于检测来自患癌对象的癌样本中的免疫抑制性成纤维细胞、特别是癌相关成纤维细胞(CAF)的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞。本发明还涉及一种用于预测患癌对象对免疫疗法治疗的反应的体外方法，一种用于治疗患者的癌症的免疫疗法治疗，ANTXR1作为生物标志物在鉴定免疫抑制性成纤维细胞、特别是免疫抑制性CAF中的用途，一种用于治疗患者癌症的靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂，以及一种产品或试剂盒，所述产品或试剂盒包含：a)靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂和b)免疫疗法治疗。

Description

免疫抑制性成纤维细胞群体的生物标志物ANTXR1及其在预测对免疫疗法的反应中的用途

技术领域

本发明涉及医学领域、特别是肿瘤学领域。它提供了免疫抑制性细胞群体的新标志物及其用途。

背景技术

随着2018年造成960万人死亡，癌症成为全球第二大死因。癌症的患病率也极高，每年新诊断的病例超过1500万，预计未来20年新病例的数量将上升约70％。

如今对癌症有许多治疗选择，包括例如手术、化疗、放疗、激素疗法、靶向疗法和姑息护理。对患者最适合的治疗的选择取决于癌症的类型、位置和分级以及患者的健康和偏好。

在过去的几十年间，免疫疗法已经成为癌症治疗策略的重要部分。癌症免疫疗法依赖于利用免疫***来治疗癌症。在一直以来开发的各种免疫疗法治疗当中，免疫检查点抑制剂疗法特别有希望。然而，尽管结果令人鼓舞，但许多晚期癌症患者对免疫检查点抑制剂没有反应，并且对原发性抵抗的机制知之甚少。特别是，一些癌症发展出免疫抑制性微环境，导致了对免疫疗法的抵抗的产生。

因此，需要鉴定可以在开始治疗之前可靠地区分有反应和无反应患者的生物标志物，以选择很可能从免疫肿瘤药物中受益的患者。

癌相关成纤维细胞(CAF)是癌症中丰富的组分，发挥着重要的促肿瘤发生功能。现在认识到CAF是异质性的，可以基于特异性标志物的表达来定义不同的CAF子集。目前，已在人类乳腺癌和卵巢癌中鉴定出4个CAF子集，称为CAF-S1至CAF-S4(Costa A等，Cancer Cell2018；33(3):463-79 e10)。虽然CAF-S2和CAF-S3成纤维细胞在健康组织中也能检测到并且可以使人想起正常的成纤维细胞，但CAF-S1和CAF-S4肌成纤维细胞局限于癌症和转移***中。CAF-S1和CAF-S4均通过互补机制促进转移。相比之下，虽然CAF-S1促进人类癌症中的免疫抑制，但CAF-S4却没有。CAF亚群仍然是异质性的，因此需要鉴定在癌症患者中对免疫疗法的原发性抵抗具有特定作用的CAF，特别是鉴定用于检测癌症中的免疫抑制性CAF的新标志物。

还一直需要开发新的策略来克服免疫抑制性环境，从而使免疫疗法、特别是免疫检查点抑制剂治疗更有效并且所有患者都可用。

本发明寻求满足这些需求和其它需求。

发明内容

癌症是一种全身性疾病，包括肿瘤细胞本身和宿主***二者的多种组分。现在清楚的是，肿瘤微环境中的***在癌症发展中起重要作用。癌间质包括成纤维细胞特别是癌相关成纤维细胞(CAF)、血管内皮细胞、免疫细胞和细胞外基质。CAF是肿瘤间质中最丰富的组分，它们构成癌间质的主体并影响肿瘤微环境，使它们促进癌症启动、血管生成、侵袭和转移。

本发明人发现了新的CAF亚群，它们在肿瘤部位建立免疫抑制性微环境中发挥关键作用。本发明人使用scRNA-seq来解决CAF-S1免疫抑制性亚群的异质性，并鉴定了8个不同的CAF-S1簇。其中，3个CAF-S1簇(1、2、5)属于炎性(“iCAF”)亚组，5个CAF-S1簇(0、3、4、6、7)属于肌成纤维细胞(“myCAF”)亚组，iCAF和myCAF亚组以前在胰腺癌中描述过(Ohlund D等，J Exp Med 2017；214(3):579-96)。

本发明人鉴定的8个CAF-S1簇的特征在于下列编码基因的高表达：细胞外基质(ECM)蛋白(簇0)、解毒途径(簇1)、白介素信号传导(簇2)、转化生长因子β(TGFβ)信号传导途径(簇3)、伤口愈合(簇4)、干扰素γ(簇5)、干扰素αβ(簇6)和肌动球蛋白途径(簇7)。因此，本发明人对它们作了如下注释：ecm-myCAF(簇0)，解毒-iCAF(簇1)，IL-iCAF(簇2)，TGFβ-myCAF(簇3)，创伤-myCAF(簇4)，IFNγ-iCAF(簇5)，IFNαβ-myCAF(簇6)和acto-myCAF(簇7)。

通过分析公开可用的scRNA-seq数据，在头颈鳞状细胞癌(HNSCC)和非小细胞肺癌(NSCLC)中证实了这些CAF-S1簇的存在，证明了这些CAF-S1簇跨不同癌症类型的关联性。

此外，本发明人发现，myCAF亚组的两个CAF-S1簇——即ecm-myCAF(簇0)和TGFβ-myCAF(簇3)的丰度与免疫抑制性环境显著相关，而解毒-iCAF和IL-iCAF的含量则不相关。

实际上，具有高水平的PD-1⁺、CTLA-4⁺和TIGIT⁺CD4⁺T淋巴细胞(它们自身富含Treg)和小分率的CD8⁺T淋巴细胞的肿瘤中富含ecm-myCAF(簇0)和TGFβ-myCAF(簇3)簇。有趣的是，ecm-myCAF(簇0)特异性签名(signature)含有LRRC15基因，该基因最近已被鉴定为对胰腺癌的免疫疗法有反应的患者的决定因素(Dominguez等，Cancer Discov 2020；10(2):232-53)。

与ecm-myCAF(簇0)和TGFβ-myCAF(簇3)相反，创伤-myCAF(簇4)与免疫抑制性环境无关，但与T淋巴细胞的高度全面浸润有关。因此，由于在对免疫疗法无反应的患者的肿瘤中富含创伤-myCAF簇(簇4)，创伤-myCAF簇可能在通常对免疫疗法敏感的高浸润性肿瘤中充当原发性抵抗这种类型的治疗的新的替代标志物。因而，在诊断时评估肿瘤内特定CAF-S1簇的含量为预测对免疫检查点抑制剂的原发性抵抗提供了附加价值。

本发明人特别表明，在诊断时，这些特定的CAF-S1簇与黑色素瘤患者和NSCLC患者两者对免疫疗法的原发性抵抗有关。特别是，ecm-myCAF(簇0)增加了FOXP3^高T细胞的分率并刺激CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞表面处PD-1和CTLA-4两者的蛋白水平，这转而增加了TGFβ-myCAF(簇3)的比例。这揭示了免疫抑制性ecm-myCAF(簇0)和TGFβ-myCAF(簇3)CAF-S1簇和Treg之间促进免疫抑制并参与对免疫疗法的抵抗的正反馈回路。因此，这些数据支持开发将PD-1和/或CTLA-4阻断与靶向特定CAF-S1簇组分的疗法相结合的策略，以克服对免疫检查点阻断的原发性抵抗。

相应地，本发明人的数据支持在肿瘤样本中鉴定新的具有ANTXR1⁺FAP⁺CAF的患者子集，这些患者表现出免疫抑制并且具有对免疫疗法的抵抗或低反应。因此，在该特定患者子集中，靶向ANTXR1⁺CAF从而抑制或减轻ANTXR1⁺FAP⁺CAF的免疫抑制性作用的药剂可以带来治疗效益。另外，该药剂与免疫治疗剂的组合可防止发生对免疫治疗剂的抵抗或恢复对其的反应。此外，即使所有CAF-S1细胞都表达FAP，用FAP抑制剂治疗ANTXR1⁺FAP⁺患者仍会具有更大的治疗效益，因为ANTXR1⁺FAP⁺CAF是免疫抑制性的并与免疫疗法抵抗有关，而ANTXR1⁺FAP^-CAF则不是。在这种情况下，利益/风险的权衡支持在这一特定的患者子集中进行这种治疗，特别是与免疫疗法相结合。

最后，本发明人将ANTXR1鉴定为CAF-S1簇0、3和4的特异性标志物，允许鉴定与免疫抑制效应相关的CAF。

在第一方面，本发明涉及一种用于检测来自患癌对象的癌样本中的免疫抑制性成纤维细胞的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的炭疽毒素受体1(ANTXR1)阳性成纤维细胞，ANTXR1⁺成纤维细胞的存在是免疫抑制性CAF的指示。

在第二方面，本发明涉及一种用于预测患癌对象对免疫治疗剂的反应的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞，其中所述癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞预测所述患者对免疫治疗剂的反应性。

在第三方面，本发明涉及一种用于治疗患者的癌症的免疫治疗剂，其中所述患者提供的癌样本具有(a)低数量或低百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞；或(b)没有ANTXR1⁺成纤维细胞。

特别地，所述用于预测对象对免疫治疗剂的反应的方法还包括确定ANTXR1⁺成纤维细胞的百分比，ANTXR1⁺成纤维细胞的百分比是ANTXR1⁺成纤维细胞的数量相对于癌样本中的成纤维细胞总数或相对于癌样本中的细胞总数。

特别地，ANTXR1⁺成纤维细胞是FAP⁺ANTXR1⁺成纤维细胞。优选地，ANTXR1⁺成纤维细胞是ANTXR1⁺癌相关成纤维细胞(CAF)，优选FAP⁺ANTXR1⁺CAF。

更加优选地，ANTXR1⁺成纤维细胞选自：FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺成纤维细胞、优选CAF；FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-成纤维细胞、优选CAF；和ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺成纤维细胞、优选CAF。

在第四方面，本发明涉及ANTXR1作为生物标志物在鉴定免疫抑制性成纤维细胞、优选免疫抑制性CAF中的用途。本发明还涉及成纤维细胞群体中、优选CAF群体中的ANTXR1作为患癌对象的肿瘤中的生物标志物在预测所述对象对免疫疗法的反应中的用途。

在第五方面，本发明涉及一种用于治疗患者癌症的靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂，其中所述患者在来自所述患者的肿瘤样本中具有ANTXR1⁺FAP⁺成纤维细胞、优选CAF并且所述药剂抑制或降低ANTXR1⁺成纤维细胞的免疫抑制性作用，优选所述药剂选自：(i)任选与细胞毒性药物缀合的抗ANTXR1抗体、包含抗ANTXR1部分的多特异性分子、抗ANTXR1 T细胞受体(TCR)和抗ANTXR1嵌合抗原受体(CAR)，以及(ii)表达抗ANTXR1 TCR或抗ANTXR1 CAR的免疫细胞、优选T细胞或自然杀伤细胞；或其任何组合。

特别地，所述靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂与免疫治疗剂联合使用。

在第六方面，本发明涉及一种用于治疗患者癌症的FAP抑制剂，其中所述患者在来自所述患者的肿瘤样本中具有ANTXR1⁺FAP⁺成纤维细胞、优选CAF。在一个特定方面，所述FAP抑制剂与免疫治疗剂联合使用。

优选地，FAP抑制剂选自：他拉布司他(talabostat)或PT-100(CAS编号149682-77-9，[(2R)-1-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰基]吡咯烷-2-基]硼酸)，利拉利汀(linagliptin)(Tradjenta)(CAS编号668270-12-0；8-[(3R)-3-氨基哌啶-1-基]-7-丁-2-炔基-3-甲基-1-[(4-甲基喹唑啉-2-基)甲基]嘌呤-2,6-二酮)，具有N-(4-喹啉基)-甘氨酰-(2-氰基吡咯烷)骨架的FAP抑制剂，FAPI-02(CAS编号2370952-98-8；(S)-2,2',2”-(10-(2-(4-(3-((4-((2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨甲酰基)喹啉-6-基)氧基)丙基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)，FAPI-04(CAS#2374782-02-0；(S)-2,2',2”-(10-(2-(4-(3-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨甲酰基)喹啉-6-基)氧基)丙基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)，和FAPI-46(CAS编号：2374782-04-2)，肽靶向放射性核素如FAP-2286，及其任何组合。

在第七方面，本发明涉及一种产品或试剂盒，其包含：a)靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂和b)免疫治疗剂，作为在治疗患者癌症中同时、分别或顺序使用的组合制剂。

特别地，所述免疫治疗剂选自刺激患者免疫***攻击恶性肿瘤细胞的治疗性治疗、用肿瘤抗原对患者进行免疫接种、刺激免疫***的分子如细胞因子、治疗性抗体、过继T细胞疗法、CAR细胞疗法、免疫检查点抑制剂、及其任何组合，优选免疫检查点抑制剂。

优选地，检查点抑制剂选自针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性细胞死亡配体(PD-L1)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白-3(TIM-3)、B和T淋巴细胞衰减因子(BLTA)、IDO1的抗体或其任何组合，优选选自针对CTLA-4、PD-1、PD-L1和TIGIT的抗体或其任何组合，更优选针对PD-1或CTLA-4的抗体及其组合。

特别地，所述免疫治疗剂选自伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、BGB-A317、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、或德瓦鲁单抗(duvalumab)、BMS-986016和艾卡哚司他(epacadostat)，或其任何组合。

特别地，所述癌症选自***癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、肝细胞癌、骨肉瘤、黑色素瘤、下咽癌、食道癌、子宫内膜癌、***、胰腺癌、肝癌、结肠或结直肠癌、腺癌、肉瘤、非鳞状细胞癌、鳞状细胞癌、神经内分泌肿瘤、肌肉癌、肾上腺癌、甲状腺癌、子宫癌、皮肤癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、膀胱癌、头颈癌，优选所述癌症选自头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、NSCLC、黑色素瘤和转移性黑色素瘤，更优选所述癌症选自头颈癌、NSCLC、黑色素瘤和转移性黑色素瘤。

附图说明

图1：CAF-S1成纤维细胞中不同细胞簇的鉴定。对7名BC患者的18 296个CAF-S1成纤维细胞的统一流形逼近与投影(UMAP)，使得8个CAF-S1簇(0至7)可视化。颜色显示了在由30个第一主成分界定的空间上应用基于图的聚类方法所界定的不同CAF-S1簇。

图2：对不同癌症类型中5个最丰富的CAF-S1簇的验证。CAF-S1成纤维细胞之中不同簇的百分比(％)基于FACS数据。每条代表一名患者(N＝44)。

图3：肺癌和头颈癌中CAF-S1细胞簇的检测。(A)结合了来自BC的18 296个CAF-S1成纤维细胞(红色，左上图)和来自HNSCC的FAP⁺成纤维细胞(数据来自(30)，n＝603个FAP⁺细胞，蓝色，左上图)的UMAP图。采用按构成每个CAF-S1簇的特异性签名的基因的平均z分数计算的分数。(B)与(A)相同，来自NSCLC(数据来自(31)，n＝959个FAP⁺细胞，蓝色，左上图)。

图4：乳腺癌中CAF-S1簇与免疫细胞之间的相关性。(A)两个变量之间的详细相关曲线，如图所示。每个点代表一个肿瘤(N＝37)。P值来自Pearson相关性检验。(B)TCGA群组中CAF-S1簇签名与FOXP3之间的相关曲线。每个点代表一个肿瘤(N＝1221)。P值来自Pearson相关性检验。(C)与(B)相同，为CAF-S1簇签名与如Rooney等，Cell 2015；160(1-2):48-61中所定义的细胞溶解指数之间的相关曲线。

图5：CAF-S1簇和Treg的交互效应。(A)FOXP3特异性平均荧光强度(speMFI)的代表性直方图(左)，单独(绿色)，或在iCAF(橙色)或ecm-myCAF(红色)存在下。在以10:1的比率(T:CAF-S1)共培养24小时(h)后，评估FOXP3⁺细胞百分比(中)和CD4⁺CD25⁺T细胞中的FOXP3蛋白水平(右)。P值来自Welch t检验(N＝每种条件7个CAF-S1原代细胞系；n＝3个独立实验)。(B-G)与(A)相同，针对FOXP3⁺CD4⁺CD25⁺Treg中的以下免疫检查点：PD-1(B)，CTLA-4(C)，TIGIT(D)，TIM3(E)和LAG3(F)。P值来自Welch t检验(N＝每种条件7个CAF-S1原代细胞系；n＝3个独立实验)。(G)CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞对CAF-S1簇身份的影响。点图显示了CAF-S1原代细胞系表面的CAF-S1簇标志物的蛋白水平。对于每个标志物，表面蛋白水平以特异性MFI表示，计算如下：在不存在(-)或存在(+)CD4⁺CD25⁺T细胞下，特异性MFI＝来自特异性抗体的MFI–来自同型对照的MFI(N＝每种条件7个CAF-S1细胞系；n＝3个独立实验)。P值来自Mann-Whitney检验。

图6：CAF-S1簇对免疫疗法抵抗的影响。(A)通过使用来自每个CAF-S1簇的特异性签名，对来自28个抗PD-1治疗前黑色素瘤的RNA-Seq数据应用基因集富集分析(GSEA)，显示与有反应(N＝15)的患者相比，无反应(N＝13)的患者中CAF-S1基因签名(前100个基因)显著富集。群组来自(33)。下，同(上)，针对正常成纤维细胞签名)。GSEA分析表明，簇0(ecm-myCAF)、3(TGFβ-myCAF)和4(创伤-myCAF)与无反应者显著相关(上)，而簇1(解毒-iCAF)、2(IL-iCAF)和5(IFN-iCAF)则不相关(下)。(B)通过有反应者和无反应者黑色素瘤患者中每个CAF-S1簇签名的平均z分数来评估的表达。(C，D)与(B)相同，使用正常成纤维细胞签名和细胞溶解指数。(E)有反应者和无反应者以CAF-S1簇低表达和高表达分层(基于CAF簇z分数的第三个四分位数)。(F，G)与(E)相同，使用正常成纤维细胞签名和细胞溶解指数。(H)与(A)相同，分析NSCLC患者群组。

图7.CAF-S1簇的鉴定。(A)显示用于分离CAF-S1的门控策略的代表性FACS图。首先以DAPI-EPCAM-CD45-CD31-CD235a-对细胞进行门控，以分别排除死细胞、上皮细胞、造血细胞、内皮细胞和红细胞。然后选择FAPHigh CD29Med细胞作为CAF-S1成纤维细胞。(B)18 296个CAF-S1成纤维细胞的UMAP图(如同图1)，显示了5个最丰富的CAF-S1簇的特异性基因签名的平均z分数。

图8.CAF-S1簇标志物的鉴定，用于FACS分析以及从HNSCC和NSCLC scRNA-seq数据中选择CAF-S1。小提琴图显示了编码5个最丰富的CAF-S1簇特异性的表面标志物的6个基因的表达分布(来自7名BC患者的18 296个CAF-S1成纤维细胞的scRNA-seq的RNA水平)。

图9.CAF-S1簇与免疫细胞之间的相关性。CAF簇和免疫细胞之间的详细相关性图，如所示(N＝37个BC)。P值来自Pearson相关性检验。

图10.通过在塑料培养皿中播散和培养从瘤旁分离的成纤维细胞获得CAF-S1性质(A)点图，显示了单独培养(左)或在ecm-myCAF存在下培养(右)的CD4+CD25+T细胞中的细胞内特异性平均荧光强度(speMFI)FOXP3、PD-1、CTLA-4和TIGIT。P值来自Mann-Whitney检验(N＝4个CAF-S1原代细胞系)。(B)箱线图，显示了单独培养(右)或在ecm-myCAF存在下培养(左)的CD4+CD25+T细胞中的FOXP3、CTLA-4和TIGIT mRNA水平。P值来自DESeq2分析(N＝8)。(C)与(B)相同，针对STAT和NFAT家族成员。

图11.(A)18 296个CAF-S1成纤维细胞的UMAP图(如同图1)，使得8个CAF-S1簇(0至7)可视化。三个对免疫疗法反应有预测性的簇，即簇0＝ECM-myCAF、簇3＝TGFβ-myCAF和簇4＝创伤-myCAF，用箭头指示。(B)小提琴图(左)和UMAP图(右)，显示了定义CAF-S1签名的最差异表达基因中的一些。每个CAF-S1簇中这些基因的表达采用小提琴图和UMAP表现来显示。在这些最具代表性的CAF-S1基因之中，无一在簇0、3和4中特异性表达，因此对免疫疗法反应有预测性。

具体实施方式

定义

如本文所用的术语“癌症”或“肿瘤”是指存在具有致癌细胞的典型特征的细胞，例如不受控制的增殖、和/或永生、和/或转移潜能、和/或快速生长、和/或增殖速率、和/或某些特征性的形态特征。该术语是指任何类型的对象中的任何类型的恶性肿瘤(原发或转移瘤)。它可以指实性肿瘤以及造血***肿瘤。

如本文所用的术语“癌样本”是指含有源自于对象的肿瘤细胞和癌***、特别是成纤维细胞如癌相关成纤维细胞(CAF)的任何样本。癌组织除了细胞外基质外，还特别由癌细胞以及周围的癌***包括癌相关成纤维细胞(CAF)、血管内皮细胞和免疫细胞构成。优选地，癌样本含有核酸和/或蛋白质。所述样本可在使用前进行处理。

如本文所用的术语“癌相关成纤维细胞”或“CAF”是指存在于癌间质中的成纤维细胞。它们是最丰富的间质组分之一，形态类似于肌成纤维细胞。CAF是CD45^-EpCAM^-CD31^-CD29⁺***。

如本文所用的术语“免疫抑制性成纤维细胞”是指在肿瘤中造成和/或有助于免疫抑制、即造成和/或有助于部分或完全抑制或遏制个体对癌细胞的免疫应答的成纤维细胞。任选地，所述成纤维细胞可以是恶性的，尤其是在肉瘤中，或正常的。

如本文所用的术语“免疫抑制性癌相关成纤维细胞”或免疫抑制性CAF”是指在肿瘤中造成和/或有助于免疫抑制或免疫抑制性微环境、即造成和/或有助于部分或完全抑制或遏制个体对癌细胞的免疫应答的CAF。“肿瘤微环境”或“TME”是肿瘤周围的环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、信号分子和细胞外基质(ECM)。

术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞、以及由这些细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，该作用导致选择性损害、破坏或消除人体中入侵的病原体、病原体感染的细胞或组织、癌细胞、或在自身免疫或病理性炎症情况下的正常人体细胞或组织。

如本文所用的术语“炭疽毒素受体1”、“ANTXR细胞黏附分子1”、“ANTXR”、“ANTXR1”、“肿瘤内皮标志物8”、“TEM8”、“ATR”或“GAPO”是等同的，并且是指人ANTXR1基因的产物，例如在Gene ID：84168和UniProt Q9H6X2参考号下描述的。ANTXR1蛋白在细胞附着和迁移中发挥作用。

如本文所用的术语“成纤维细胞激活蛋白”、“FAP”、“脯氨酰内肽酶FAP”、“二肽基肽酶FAP”、“表面表达蛋白酶”、“Sepras”、“丝氨酸整合膜蛋白酶”、“SIMP”、“整合膜丝氨酸蛋白酶”、“脯氨酸后裂解酶”可互换地使用，是指FAP人类基因的产物，例如在GeneID:2191和UniProt Q12884参考号下描述的。FAP是一种细胞表面糖蛋白丝氨酸蛋白酶，其参与细胞外基质降解并参与许多细胞过程，包括组织重塑、纤维化、伤口愈合、炎症和肿瘤生长。

如本文所用的术语“溶酶体相关膜糖蛋白5”、“溶酶体相关膜蛋白5”、“LAMP5”、“脑和树突状细胞相关LAMP”和“脑相关LAMP样蛋白”是等同的，是指人LAMP5基因的产物，例如在Gene ID 24141和UniProt Q9UJQ1参考号下描述的。

如本文所用的术语“共结合聚糖-1”、“SDC1”、“SYND1”、“CD138”在本文中可互换使用，是指人SDC1基因的产物，例如在GeneID:6382和UniProt P18827参考号下描述的。SDC1是一种细胞表面蛋白聚糖，它兼有硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素并将细胞骨架与间隙基质连接起来。

如本文所用的术语“CD9”、“5H9抗原”、“细胞生长抑制基因2蛋白”、“白细胞抗原MIC3”、“运动相关蛋白”、“MRP-1”、“四跨膜蛋白-29”、“Tspan-29”和“p24”本文中可互换使用，是指人CD9基因的产物，例如在GeneID:928和UniProt P21926参考号下描述的。CD9是一种与整联蛋白相关的整合膜蛋白，它调节不同的过程。

“+”是指表达标志物的细胞。例如，ANTXR1⁺是指表达ANTXR1的细胞。或者，“-”是指不表达该标志物的细胞。例如，ANTXR1^-是指不表达ANTXR1的细胞。

如本文所用的术语“对象”、“个体”或“患者”可以互换，是指动物、优选哺乳动物，更优选人类。然而，术语“对象”也可以指非人类动物，特别是哺乳动物，如狗、猫、马、牛、猪、羊和非人灵长类动物等。

如本文所用的术语“标志物”或“生物标志物”是指一种可测量的生物参数，它有助于预测癌症的发生、癌症治疗的有效性或免疫抑制性细胞的存在。

如本文所用的术语“诊断”是指确定对象是否有可能罹患癌症。技术人员经常基于一种或多种诊断标志物进行诊断，诊断标志物的存在与否或量指示癌症的存在与否。“诊断”也旨在指提供对诊断有用的信息。

如本文所用的术语“治疗”是指旨在改善患者健康状态的任何行为，如治疗、防止、预防和延缓疾病。在某些实施方式中，这样的术语是指改善或根除疾病或与疾病相关的症状。在其它实施方式中，该术语是指最小化因给患有此类疾病的对象施用一种或多种治疗剂而导致的疾病扩散或恶化。

如本文所用的术语“免疫疗法”、“免疫治疗剂”或“免疫疗法治疗”是指利用免疫***排斥癌症的癌症治疗性治疗。该治疗性治疗刺激患者的免疫***攻击恶性肿瘤细胞。它包括用肿瘤抗原对患者进行免疫接种(例如，施用癌症疫苗)，在这种情况下，患者自身的免疫***被训练成将肿瘤细胞识别为要破坏的靶标，或施用刺激免疫***的分子如细胞因子，或施用作为药物的治疗性抗体，在这种情况下，该治疗性抗体征募患者的免疫***来破坏肿瘤细胞。特别地，抗体针对的是特异性抗原，例如在肿瘤表面上呈递的不寻常抗原。

免疫***的一个重要部分是它能够区分体内的正常细胞和它认为是“外来”的那些细胞、特别是癌细胞。这令免疫***攻击癌细胞，同时不影响正常细胞。为此，免疫***使用“检查点”，这些检查点是某些免疫细胞上的分子，它们需要被激活(或失活)才能启动免疫应答。癌细胞有时会找到利用这些检查点来避免受到免疫***攻击的方法。如本文所用的术语“免疫检查点抑制剂治疗”是指针对这些检查点的免疫疗法，以允许或促进免疫***攻击癌细胞。

术语“百分比”、“量”、“数量”和“水平”在本文中可互换使用，并且可以指样本中分子或细胞的绝对定量，或样本中分子或细胞的相对定量，即相对于另一个值，例如相对于如本文中教示的参考值。

如本文所用的“药物组合物”是指一种或多种活性剂与任选的其它化学组分如生理上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是便于给生物体施用该活性剂。本发明的组合物可以是适合于任何常规施用或利用途径的形式。在一个实施方式中，“组合物”通常意指活性剂例如化合物或组合物与天然存在或非天然存在的惰性载体(例如可检测的试剂或标记)或活性载体如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、助剂等的组合，并且包括药学上可接受的载体。如本文所称的“可接受的介质”或“可接受的载体”是本领域技术人员已知可用于配制药物组合物的任何已知化合物或化合物的组合。

如本文所用的术语“活性要素”、“活性成分”、“活性药物成分”、“治疗剂”、“抗肿瘤化合物”和“抗肿瘤剂”是等同的，是指具有治疗效果的组分。

如本文所用的术语“治疗效果”是指由本发明的活性成分或药物组合物引起的能够预防或延迟癌症的出现或发展、或治愈或减弱癌症效应的效果。

如本文中所用的“有效量”或“治疗有效量”是指活性剂单独或与一种或多种其它活性剂组合为对象赋予治疗效果所需的量，例如治疗目标疾病或病症、或产生预期效果所需的活性剂的量。“有效量”取决于活性剂、疾病及其严重程度、待治疗的对象的特征包括年龄、身体状况、体型、性别和体重、治疗的持续时间、并行疗法(如果有的话)的性质、具体的施用途径以及在健康从业者的知识和专业知识范围内的类似因素而变化。这些因素是本领域普通技术人员公知的，并且仅以常规实验就可以解决。一般优选使用单个组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。

如本文所用的术语“试剂盒(kit)”、“产品”或“组合制剂”尤其是在如本申请中定义的组合伴侣(a)和(b)可以独立地或通过使用不同量的组合伴侣(a)和(b)的不同固定组合来给药、即同时或在不同时间点给药的意义上，定义了“套件(kit of parts)”。然后，套件中的部分可以同时施用或按时间交错地施用、即套件中的任何部分在不同的时间点施用。组合制剂中待施用的组合伴侣(a)与组合伴侣(b)的总量的比率可以变化。组合伴侣(a)和(b)可以通过相同的途径或通过不同的途径进行施用。

如本文所用的术语“同时”是指本发明的药物组合物、试剂盒、产品或组合制剂，其中活性成分同时、即在同一时间使用或施用。

如本文所用的术语“顺序”是指本发明的药物组合物、试剂盒、产品或组合制剂，其中活性成分顺序地、即一个接一个地使用或施用。优选地，当顺序施用时，所有活性成分在少于约1小时内、优选在少于约10分钟内、更优选在少于约1分钟内施用。

如本文所用的术语“分别”是指本发明的药物组合物、试剂盒、产品或组合制剂，其中活性成分在一天中的不同时间使用或施用。优选地，当分别施用时，以约1小时至约24小时的间隔、优选以约1小时至15小时的间隔、更优选以约1小时至8小时的间隔、更加优选以约1小时至4小时的间隔来施用活性成分。

如本文所用的术语“和/或”应被视为对两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个在一起的具体公开。例如，“A和/或B”应视为对(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，就如同每一个都被个别列出一样。

术语“一个”或“一种”可以指其修饰的元素中的一个或多个(例如，“一种试剂”可以指一种或多种试剂)，除非上下文中清楚地描述了所述元素中的一个或所述元素中的多于一个。

如本文所用的术语“约”与任何和所有的数值(包括数值范围的下端和上端)相结合，是指可接受的偏差范围至多为+/-10％(例如，+/-0.5％、+/-1％、+/-1.5％、+/-2％、+/-2.5％、+/-3％、+/-3.5％、+/-4％、+/-4.5％、+/-5％、+/-5.5％、+/-6％、+/-6.5％、+/-7％、+/-7.5％、+/-8％、+/-8.5％、+/-9％、+/-9.5％)的任何数值。在一串数值的开始时使用术语“约”则修饰了每个数值(即，“约1、2和3”是指约1、约2和约3)。此外，当本文中描述了数值清单(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)时，该清单包括其所有中间值和分数值(例如，54％、85.4％)。

如下面公开的本发明的方法可以是体内、离体或体外方法、优选体外或离体方法。

新的成纤维细胞亚群、特别是CAF亚群的检测

在第一方面，本发明涉及一种用于检测来自患癌对象的癌样本中的免疫抑制性成纤维细胞、尤其是癌相关成纤维细胞(CAF)的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF，ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF的存在是免疫抑制性成纤维细胞、尤其是免疫抑制性CAF的指示。然后，本发明设想了ANTXR1作为生物标志物在来自患癌对象的癌样本中鉴定免疫抑制性成纤维细胞、尤其是免疫抑制性CAF的用途。本发明还涉及ANTXR1和免疫抑制性ANTXR1⁺成纤维细胞群体、尤其是ANTXR1⁺CAF群体作为癌症治疗中的新生物标志物的用途。特别是，本发明设想了免疫抑制性ANTXR1⁺成纤维细胞群体、尤其是ANTXR1⁺CAF群体作为对免疫疗法的反应的新生物标志物的用途。本发明还涉及成纤维细胞群体中、优选CAF群体中的ANTXR1作为患癌对象的肿瘤中的生物标志物在预测所述对象对免疫疗法的反应、特别是对象是否易对免疫疗法产生反应中的用途。

在一个实施方式中，本发明涉及一种用于检测来自患癌对象的癌样本中的免疫抑制性成纤维细胞、尤其是癌相关成纤维细胞(CAF)的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF。

任选地，所述方法还可包括提供来自所述患者的癌样本的预先步骤。

优选地，本发明的CAF属于CAF-S1亚群，例如，如Costa等，2018，Cancer cell，第33卷，第3期，第463-479页.e10中或WO2019/020728中所述，所述文献的公开内容通过引用并入本文。CAF-S1群体特别表达选自CD29、FAP、αSMA、PDGFRβ和FSP1中的一种或多种生物标志物。特别地，本发明的CAF-S1是FAP⁺。

如本文所用的术语“FAP⁺成纤维细胞”是指表达FAP的成纤维细胞亚群。如本文所用的术语“FAP⁺CAF”或“FAP⁺癌相关成纤维细胞”是指表达FAP的CAF亚群。并不是所有的CAF都表达FAP。因此，在一个优选的实施方式中，FAP⁺CAF的检测依赖于对表达FAP的CAF的检测，优选对FAP mRNA和/或蛋白质的检测。然而，FAP⁺CAF的其它特异性标志物也可以用于检测它们。

如本文所用的术语“ANTXR1⁺成纤维细胞”是指表达ANTXR1的成纤维细胞亚群。如本文所用的术语“ANTXR1⁺CAF”或“ANTXR1⁺癌相关成纤维细胞”是指表达ANTXR1的CAF亚群。并不是所有的成纤维细胞或CAF都表达ANTXR1。因此，在一个优选的实施方式中，ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF的检测依赖于对表达ANTXR1的成纤维细胞、尤其是CAF的检测，优选对ANTXR1 mRNA和/或蛋白质的检测。在一个优选的方面，ANTXR1的检测是在蛋白质水平上进行的，特别是用抗ANTXR1抗体进行的。

在一个方面，本发明涉及一种用于检测来自患癌对象的癌样本中的免疫抑制性成纤维细胞、尤其是癌相关成纤维细胞(CAF)的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的FAP⁺ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF。

然而，ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF的其它特异性标志物也可以用于检测它们。

如本文所用的术语“ecm-myCAF”、“CAF-S1簇0”、“ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-CAF”和“FAP⁺ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-CAF”可互换使用并且是指CAF的一个亚群，尤其是CAF亚群CAF-S1的一个簇。这样的群体表达FAP、ANTXR1和SDC1，但不表达LAMP5。因此，在一个优选的实施方式中，ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-CAF的检测依赖于对表达ANTXR1和SDC1但不表达LAMP5的CAF的检测。ANTXR1、LAMP5和SCD1的检测可以在mRNA和/或蛋白质水平上进行，优选在蛋白质水平上进行，特别是通过抗体。

如本文所用的术语“TGFb-myCAF”、“CAF-S1簇3”、“ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-”和“FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-”可互换使用并且是指CAF的一个亚群，尤其是CAF亚群CAF-S1的一个簇。这样的群体表达FAP、ANTXR1和LAMP5并任选表达SDC1。因此，在一个优选的实施方式中，ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF的检测依赖于对表达ANTXR1、LAMP5并任选表达SDC1的CAF的检测。ANTXR1、LAMP5和SCD1的检测可以在mRNA和/或蛋白质水平上进行，优选在蛋白质水平上进行，特别是通过抗体。

如本文所用的术语“创伤-myCAF”、“CAF-S1簇4”、“ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺”和“FAP⁺ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺”可互换使用并且是指CAF的一个亚群，尤其是CAF亚群CAF-S1的一个簇。这样的群体表达FAP、ANTXR1和CD9但不表达LAMP5和SDC1。因此，在一个优选的实施方式中，ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺CAF的检测依赖于对表达ANTXR1和CD9但不表达SDC1和LAMP5的CAF的检测。ANTXR1、LAMP5、CD9和SCD1的检测可以在mRNA和/或蛋白质水平上进行，优选在蛋白质水平上进行，特别是通过抗体。

在一个方面，本发明涉及一种用于检测来自患癌对象的癌样本中的免疫抑制性成纤维细胞、尤其是癌相关成纤维细胞(CAF)的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)、TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和/或创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)、TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。

在一个实施方式中，成纤维细胞，尤其是CAF，当其mRNA水平和/或其蛋白质水平与相应背景噪声的水平、例如在相同条件但没有细胞的情况下测量的水平显著不同，和/或与对应于对照条件或参比的RNA或蛋白质的水平、例如在相同条件下但分别用已知不表达FAP、ANTXR1、LAMP5、SDC1和/或CD9的细胞测量的水平显著不同，则被认为其表达FAP、ANTXR1、LAMP5、SDC1和/或CD9。

FAP、ANTXR1、LAMP5、SDC1和/或CD9在成纤维细胞、尤其是CAF中的表达水平的测量可以通过本领域技术人员公知的各种技术来实现。特别地，FAP、ANTXR1、LAMP5、SDC1和/或CD9在CAF中的表达水平的测量可以依赖于对FAP、ANTXR1、LAMP5、SDC1和/或CD9 mRNA(信使RNA)、或蛋白质的检测。

在一个方面，FAP、ANTXR1、LAMP5、SDC1和/或CD9在成纤维细胞、尤其是CAF中的表达是通过测量它们的mRNA表达来确定的。用于确定细胞中的mRNA的量的方法是本领域技术人员公知的。可以通过杂交(例如，Northern印迹分析)、特别是通过Nanostring方法和/或通过扩增(例如，RT-PCR)、特别是通过定量或半定量RT-PCR来检测mRNA。其它扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、转录介导扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。

实时定量或半定量RT-PCR特别有利。可以使用对目的蛋白转录本特异性的Taqman探针。在一个优选的实施方式中，FAP、ANTXR1、LAMP5、SDC1和/或CD9和任何其它目的蛋白的表达水平通过测量它们的mRNA的量来确定，优选通过定量或半定量RT-PCR或通过实时定量或半定量RT-PCR来确定。

如本文所用的术语“定量RT-PCR”、“qRT-PCR”、“实时RT-PCR”和“定量实时RT-PCR”是等同的，可以互换使用。可以使用(并根据需要修改)各种已发表的定量RT-PCR方案中的任何一种以用于本方法。合适的定量RT-PCR程序包括但不限于美国专利No.5,618,703和美国专利申请No.2005/0048542中提出的那些，所述专利和专利申请特此通过引用并入。

任选地，可以对肿瘤样本或对包含成纤维细胞、尤其是CAF的肿瘤的子集确定ANTXR1、FAP、LAMP5、SDC1和/或CD9。因此，可以在检测ANTXR1、FAP、LAMP5、SDC1和/或CD9之前预先处理肿瘤，以便将成纤维细胞、尤其是CAF与肿瘤中的其它细胞、特别是肿瘤细胞进行分离。因此，本发明可涉及一种用于检测患癌对象的癌样本中的免疫抑制性成纤维细胞、尤其是CAF的方法，其中所述方法包括从对象的癌样本、尤其是从肿瘤细胞中分离成纤维细胞、尤其是CAF，并分别在分离的成纤维细胞、尤其是CAF中检测ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF。

在另一个方面，ANTXR1、FAP、LAMP5、SDC1和/或CD9在成纤维细胞、尤其是CAF中的表达水平是通过测量它们相应的蛋白质表达来确定的。

蛋白质的量可通过技术人员已知的任何方法来测量。通常，这些方法包括使样本与能够与该样本中存在的蛋白质选择性相互作用的结合配偶体接触。结合配偶体通常是多克隆或单克隆抗体，优选单克隆抗体。这样的抗体可以通过本领域技术人员已知的方法产生。该抗体特别包括由杂交瘤产生的那些抗体、以及利用以携带该抗体编码基因的重组表达载体转化的宿主细胞进行基因工程而产生的那些抗体。产生单克隆抗体的杂交瘤可以如下获得：根据常规免疫接种方法，将蛋白质或其免疫原性片段用作抗原进行免疫接种。由此产生的免疫细胞根据常规细胞融合方法与已知的亲本细胞融合，从而使用常规筛选方法从融合细胞中筛选产生该抗体的细胞。

本发明的抗体可以被标记和/或与检测实体融合。优选地，本发明的抗体被标记或与检测实体融合。

在一个优选的实施方式中，所述抗体被标记。可以用选自放射性标记物、酶标记物、荧光标记物、生物素-亲和素标记物、化学发光标记物等中的标记物来标记所述抗体。本发明的抗体可以通过本领域技术人员公知的标准标记技术进行标记，并且标记的抗体可以使用已知的方法可视化。特别地，标记物通常提供可通过荧光、化学发光、放射性、比色法、质谱学、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测到的信号。

优选地，可检测标记物可以是发光标记物。例如，在本发明的实践中可以使用荧光标记物、生物发光标记物、化学发光标记物和比色标记物，更优选荧光标记物。优选地，所述标记物连接在抗体的C末端。

在另一个优选的实施方式中，上述抗体可以与检测实体融合。检测实体可选自标签、酶或荧光蛋白。优选地，检测实***于抗体的C末端。

ANTXR1、FAP、LAMP5、SDC1和/或CD9的量可通过半定量Western印迹、酶标记和介导的免疫测定如ELISA、生物素/亲和素类型测定、放射免疫测定、免疫组织化学、免疫电泳或免疫沉淀、蛋白质或抗体阵列、或流式细胞术如荧光激活细胞分选(FACS)来测量。所述反应通常包括显示标记物如荧光标记物、化学发光标记物、放射性标记物、酶标记物或染料分子，或其它用于检测抗原和与其反应的抗体之间形成复合体的方法。优选地，通过FACS或通过免疫组织化学来评估蛋白表达水平。

荧光激活细胞分选(FACS)是一种特殊类型的流式细胞术。它提供了一种基于每个细胞的特定光散射和荧光特性将生物细胞的异质混合物以一次一个细胞分选到两个或更多个容器中的方法。细胞悬浮液被夹带在狭窄的、快速流动的液体流的中心。流的安排使得细胞之间相对于它们的直径有大的间隔。振动机制导致细胞流分解成单个的液滴。调节***，使每个液滴有多于一个细胞的几率低。在所述流临分解成液滴之前，使该流通过荧光测量站，在其中测量每个目的细胞的荧光特性。将充电环恰好放置在所述流分解成液滴的地方。在测量荧光强度之前，在环上布置电荷，当液滴从流中分解出来时，相反的电荷被捕获在液滴上。带电的液滴然后下落通过静电偏转***，该***基于液滴的电荷使它们转向到容器中。

免疫组织化学(IHC)是指利用抗体与生物组织中的抗原特异性结合的原理，对组织切片的细胞中的抗原(例如蛋白质)进行选择性成像的过程。使抗体-抗原相互作用可视化可以通过本领域技术人员公知的多种方式来实现。在最常见的情况下，抗体与可以催化生色反应的酶、如过氧化物酶缀合，或被荧光团如荧光素或罗丹明加标签。免疫组织化学可以分为两个阶段：样本制备和样本标记。

样本的制备对维持细胞形态、组织结构、和靶表位的抗原性至关重要。这需要适当的组织收集、固定和切片。多聚甲醛溶液经常用于固定组织，但也可使用其它方法。然后，取决于实验目的或组织本身，可以将组织切片或完整使用。在切片之前，可将组织样本包埋在介质如石蜡或冷冻介质中。切片可以在各种仪器上切，最常见的是显微切片机、低温恒温器或Compresstome组织切片机。通常以3μm-50μm的范围切标本。然后将切片安装在载玻片上，使用浓度递增(例如50％、75％、90％、95％、100％)的醇洗涤剂脱水，并且在显微镜下成像之前使用洗涤剂例如二甲苯进行清洁。取决于固定方法和组织保存的方法，样本可能需要额外的步骤才能使表位可用于抗体结合，包括脱石蜡和抗原修复。对于***固定的石蜡包埋组织，抗原修复往往是必要的，并涉及用热或蛋白酶对切片预处理。这些步骤可能造成染色或未染色的靶抗原之间的差异。取决于组织类型和抗原检测方法，在抗体染色之前，可能分别需要阻断或淬灭内源性的生物素或酶。虽然抗体对特异性表位显示出优先的亲合力，但它们也可以与靶抗原上的同源结合位点的相似非特异性蛋白上的位点(也称为反应性位点)部分结合或弱结合。为了减少IHC中的背景染色，将样本与封闭原本可能结合第一或第二抗体的反应性位点的缓冲液一起温育。常见的封闭缓冲液包括正常血清、脱脂奶粉、BSA或明胶。消除背景染色的方法包括稀释第一或第二抗体、改变温育的时间或温度、以及使用不同的检测***或不同的第一抗体。质量控制至少应该包括已知表达该抗原的组织作为阳性对照、和已知不表达该抗原的组织作为阴性对照，以及以相同方式但省略了第一抗体(或更好的是，吸收了第一抗体)进行检测的被测组织。

对于免疫组织化学检测策略，抗体在必要时被分类为第一试剂或第二试剂。第一抗体针对目的抗原而产生，通常是未缀合的(即未标记的)，而第二抗体针对第一抗体种类的免疫球蛋白而产生。第二抗体通常如上所述被标记和/或与检测实体融合。

直接法是一步染色法，涉及直接与组织切片中的抗原反应的标记抗体。虽然这项技术只利用一种抗体并因此简单而快速，但与间接方法相反，由于信号放大很少，敏感性较低。

间接法涉及与组织中的靶抗原结合的未标记的第一抗体(第一层)和与第一抗体反应的标记的第二抗体(第二层)。第二抗体必须针对产生第一抗体的动物物种的IgG而产生。这种方法比直接检测策略更灵敏，因为如果第二抗体与荧光或酶报告分子缀合，则由于几个第二抗体与每个第一抗体结合而导致信号放大。如果第二抗体与几个生物素分子缀合，而生物素分子可以募集亲和素-、链霉亲和素-或中性亲和素蛋白-结合酶的复合体，则可以实现进一步的扩增。

优选地，免疫抑制性CAF的存在是通过如实验部分所述的FACS或通过免疫组织化学来评估蛋白表达水平而进行的。

可以用于通过FACS或免疫组织化学来测量CAF中FAP表达水平的抗体是，例如：参考号MAB3715的抗人FAP抗体(R&D systems)、ab53066(abcam)、ABIN560844、Vitatex-MABS1001。

可以用于通过FACS或免疫组织化学来测量CAF中ANTXR1表达水平的抗体是，例如：参考号NB-100-56585的抗ANTXR1-AF405抗体(Novus Biological)、人TEM8/ANTXR1抗体MAB3886(R&Dsystem)、ABIN252539、ANTXR1抗体(15091-1-AP，Thermo Fischer)、NB-100-56585(Novus)、MA1-91702(Thermo Fischer)、ab21270(Abcam)、LS-B13896(Life spanbioscience)、rb158588(Biorbyt)、bs-5210R(Bioss)或具有替代标记物、特别是荧光标记物的这些抗体中的任何一种。

可以用于通过FACS或免疫组织化学来测量CAF中LAMP5表达水平的抗体是，例如：参考号130-109-156的抗LAMP5-PE抗体(Miltenyi Biotech)。

可以用于通过FACS或免疫组织化学来测量CAF中SDC1表达水平的抗体是，例如：参考号BD-564393的抗SDC1-BUV737抗体(BD Biosciences)、ABIN5680139。

可以用于通过FACS或免疫组织化学来测量CAF中CD9表达水平的抗体是，例如：参考号BD-743050的抗CD9-BV711抗体(BD Biosciences)、LS-B5962(LSBio)或AB_2075893(BioLegend)。

在一个优选的实施方式中，通过FACS检测患者癌样本中的ANTXR1⁺CAF可包括以下步骤：

-排除非CAF细胞，例如通过排除CD45⁺细胞、EpCAM⁺细胞和CD31⁺细胞，从而选择CD45^-EpCAM^-CD31^-细胞；和/或

-选择CAF细胞，例如通过选择CD29⁺细胞和/或PDGFRb⁺细胞，优选通过选择CD29⁺细胞；

-任选选择CAF-S1细胞，例如通过选择CD29⁺、FAP⁺、αSMA⁺、PDGFRβ⁺和/或FSP1⁺细胞、优选FAP⁺细胞，

-任选地，排除死细胞，例如通过使用细胞内染料如紫色LIVE/DEAD染料或DAPI并排除染色细胞；以及

-检测在前一步骤获得的细胞中的ANTXR1⁺CAF，

-任选检测LAMP5、SDC1和/或CD9阳性或阴性细胞。

在另一个优选的实施方式中，通过免疫组织化学检测患者癌样本中的ANTXR1⁺CAF可包括以下步骤：

-鉴定癌样本中的CAF，例如基于形态学标准；

-检测CAF之中的ANTXR1⁺CAF，优选基于ANTXR1抗体免疫染色；

-任选检测CAF中的FAP⁺CAF，优选基于FAP抗体免疫染色；

-任选检测LAMP5、SDC1和/或CD9阳性或阴性细胞。

在一个方面，免疫抑制性成纤维细胞、尤其是CAF的存在是指：免疫抑制性成纤维细胞、尤其是CAF在肿瘤样本或其任何级分中的量，ANTXR1⁺成纤维细胞、特别是ANTXR1⁺CAF的细胞数量占所述样本或其任何级分的细胞总数的比率或百分比，ANTXR1⁺成纤维细胞、特别是ANTXR1⁺CAF的细胞数量占所述样本或其任何级分的***总数的比率或百分比，ANTXR1⁺成纤维细胞的细胞数量占所述样本中成纤维细胞总数的比率或百分比，ANTXR1⁺成纤维细胞的细胞数量占所述样本中成纤维细胞总数的比率或百分比，ANTXR1⁺CAF细胞数量占所述样本或其任何级分的CAF细胞总数的比率或百分比，或ANTXR1⁺CAF细胞数量占所述样本或其任何级分的CAF-S1细胞总数的比率或百分比。

优选地，术语“肿瘤中ANTXR1+成纤维细胞的百分比”可以指以ANTXR1⁺成纤维细胞的数量作为分子(nominator)并以参比细胞的数量作为分母的任何比率。优选地，术语“肿瘤中ANTXR1⁺CAF的百分比”可以指以ANTXR1⁺CAF的数量作为分子并以参比细胞的数量作为分母的任何比率。在癌样本中，这样的参比细胞特别可以选自：癌样本的所有细胞、癌细胞、***、CAF细胞和CAF-S1细胞。

“ANTXR1⁺成纤维细胞的低百分比”或“低百分比的ANTXR1+成纤维细胞”相当于低于20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％。

“ANTXR1⁺成纤维细胞的高百分比”或“高百分比的ANTXR1+成纤维细胞”相当于大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

于是，在第一个方面，ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF在患者的癌样本中的存在表示癌样本的细胞总数中ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF细胞的数量。优选地，ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF的存在对应于至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、5％、10％、20％或30％的百分比。

在第二个方面，ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF在患者的癌样本中的存在表示癌样本的***总数中ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF细胞的数量。优选地，ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF的存在对应于至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、5％、10％、20％或30％的百分比。

在第三个方面，ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF在患者的癌样本中的存在表示癌样本的CAF细胞总数中ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF细胞的数量。优选地，ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF的存在对应于至少0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的百分比。

在第四个方面，ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF在患者的癌样本中的存在表示癌样本的CAF-S1细胞总数中ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF的数量。优选地，ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF的存在对应于至少0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的百分比。

在一个方面，癌样本中ANTXR1+成纤维细胞、尤其是CAF的存在，例如在癌样本中ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF的百分比，与所述患者对免疫疗法治疗的反应性成反比；并且任选所述方法还包括选择在癌样本中没有ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF或具有低百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF的患者为适合于免疫疗法治疗，和/或选择在癌样本中具有中或高百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF的患者进行替代治疗，例如免疫疗法以外的抗癌治疗、或与降低ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF引起的免疫抑制的治疗相结合的免疫疗法治疗。

“成反比”意味着癌样本中ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF越多，患癌对象对免疫疗法的反应越少。这些术语并不一定意味着直接和可度量的相关系数。

在一个方面，本发明涉及一种用于预测患癌对象对免疫疗法治疗的反应的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF，其中所述癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF指示或预测所述患者对免疫疗法治疗的不反应性。特别地，癌样本中ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF越多，患者就越不易于对免疫疗法治疗有反应。

任选地，ANTXR1⁺成纤维细胞是ANTXR1⁺CAF。任选地，ANTXR1⁺成纤维细胞是FAP⁺成纤维细胞。任选地，ANTXR1⁺CAF是FAP⁺ANTXR1⁺CAF。

事实上，本发明涉及成纤维细胞群体、尤其CAF群体中的ANTXR1作为患癌对象的肿瘤中的生物标志物在预测所述对象对免疫疗法的反应中的用途。

任选地，本发明涉及一种用于预测患癌对象对免疫疗法治疗的反应的体外方法，其中所述方法包括：(a)检测来自所述患者的癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF，其中所述癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是CAF指示或预测所述患者对免疫疗法治疗的不反应性；

(b)任选地，选择没有ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF的患者为适合于免疫疗法治疗，和/或选择具有ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF的患者进行替代治疗，例如免疫疗法以外的抗癌治疗、或与降低ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF引起的免疫抑制的治疗相结合的免疫疗法治疗。

任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的FAP⁺ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)、TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和/或创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)、TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。

在一个方面，通过特异性基因签名来检测所述CAF亚群。“基因签名”或“基因表达签名”是细胞、特别成纤维细胞中具有独特的特征性基因表达模式的单个基因或一组基因。特别地，基因签名对应于特定基因的失调，特别是基因的过表达。

在一个方面，ecm-myCAF基因签名包括以下基因：

ASPN、COL3A1、THY1、SFRP2、COL10A1、COL6A3、LRRC17、CILP、GRP、ITGBL1、COL8A1、COL14A1、ADAM12、OLFML2B、ELN、PLPP4、CREB3L1、FBN1、LOXL1、MATN3、LRRC15、COMP、ISLR、P3H1、COL11A1、SEPT11、NBL1、SPON1、SULF1、FNDC1、CNN1、MIAT、MMP23B、CPXM1、FIBIN、P4HA3、GXYLT2、CILP2、P3H4和CCDC80。在一个特定的方面，ecm-myCAF基因签名还包括以下基因：FAP和/或ANTXR1。

在一个方面，TGFβ-myCAF基因签名包括以下基因：

CST1、LAMP5、LOXL1、EDNRA、TGFB1、TGFB3、TNN、CST2、HES4、COL10A1、ELN、THBS4、NKD2、OLFM2、COL6A3、LRRC17、COL3A1、THY1、HTRA3、TMEM204、SEPT11、COMP、TNFAIP6、ID4、GGT5、INAFM1、CILP和OLFML2B。在一个特定的方面，TGFβ-myCAF基因签名还包括以下基因：FAP和/或ANTXR1。

在一个方面，创伤-myCAF基因签名包括以下基因：

SFRP4、CCDC80、OGN、DCN、PTGER3、SFRP2、PDGFRL、SMOC2、MMP23B、CPXM2、COL14A1、ITGBL1、WISP2、CILP2、COL8A1、GAS1、COL3A1、OMD、COL11A1、CILP、NEXN、ASPN、RARRES2、FIBIN、TMEM119、KERA、ID4、GRP、COMP、DPT、ELN、FBLN2、IGF1和IGF2。在一个特定的方面，创伤-myCAF基因签名还包括以下基因：FAP和/或ANTXR1。

因此，在本公开的方法中，通过确定包含对ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和/或创伤-myCAF特异性的基因签名的基因的表达来检测ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和/或创伤-myCAF，所述基因的过表达指示这些CAF亚群的存在。任选地，所述基因签名可包含另外的基因，但不多于50个基因，尤其不多于40个基因。

本发明还涉及这些基因签名在检测ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和/或创伤-myCAF亚群中的用途，特别是在检测免疫抑制性CAF的存在和/或预测对免疫疗法的治疗反应中的用途。

任选地，在确定基因签名的表达之前，可以处理样本以去除非CAF细胞。

“过表达”是指在核酸水平、尤其是在mRNA水平上测量的表达水平。它可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测量。与参考水平相比，当一个基因的表达至少增加了log2时，它就是过表达的。参考水平可以是该基因在对照细胞中的表达，所述对照例如是成纤维细胞群体、特别是CAF群体、优选FAP⁺CAF群体。在一个特定的方面，对照细胞是并非ecm-myCAF(簇0)、TGFβ-myCAF(簇3)和/或创伤-myCAF(4)的CAF簇，例如解毒-iCAF(簇1)、IL-iCAF(簇2)、IFNγ-iCAF(簇5)、IFNαβ-myCAF(簇6)和acto-myCAF(簇7)，或其任意组合。

ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和/或创伤-myCAF亚群特异性的这些基因签名可以与本领域技术人员已知的其它基因签名、特别是反应预测或癌症诊断的相关基因签名联合使用。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种用于预测患癌对象对免疫疗法治疗的反应的体外方法，其中所述方法包括：

(a)检测来自所述患者的癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF；

(b)确定所述癌样本中ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF的百分比，其中所述患者对免疫疗法治疗的反应性与所述癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF的百分比成反比；

(c)任选地，选择具有低百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF的患者、特别是没有任何ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF的患者为适合于免疫疗法治疗，并选择具有中或高百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF的患者进行替代治疗，例如免疫疗法以外的抗癌治疗、或与降低ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF引起的免疫抑制的治疗相结合的免疫疗法治疗。

任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的FAP⁺ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)、TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和/或创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)、TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述方法还可包括在步骤(a)之前提供来自所述患者的癌样本的步骤。

任选地，所述方法还可包括对具有低百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的患者施用免疫疗法治疗的步骤。或者，所述方法还可包括对具有高百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的患者施用替代抗癌治疗的步骤，所述替代治疗是免疫疗法以外的抗癌治疗、或与降低ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF引起的免疫抑制的治疗相结合的免疫疗法治疗。所施用的治疗可选自手术、化疗、放疗、激素疗法、靶向疗法和姑息护理或其任何组合。替代地或附加地，所述方法还可包括施用与降低ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF诱导的免疫抑制的治疗相结合的免疫疗法治疗的步骤。

在另一个特定方面，本发明还涉及一种选择患有肿瘤的患者进行免疫疗法治疗或确定患有肿瘤的患者是否易从免疫疗法治疗中受益的方法，其中所述方法包括确定来自所述患者的癌样本中ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的存在并且任选选择没有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF或具有低百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的患者进行免疫疗法治疗。

任选地，所述方法还包括提供来自所述患者的癌样本的预先步骤。

在又一个特定方面，本发明还涉及一种选择患有肿瘤的患者进行替代治疗例如免疫疗法以外的抗癌治疗或与降低ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF引起的免疫抑制的治疗相结合的免疫疗法治疗、或确定患有肿瘤的患者是否易从替代治疗例如免疫疗法以外的抗癌治疗或与降低ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF引起的免疫抑制的治疗相结合的免疫疗法治疗中受益的方法，其中所述方法包括确定来自所述患者的癌样本中ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的存在并且任选选择具有ANTXR1⁺CAF或具有高百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的患者进行这样的替代治疗。

任选地，所述ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF是FAP⁺ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF。优选地，ANTXR1⁺CAF选自FAP⁺ANTXR1⁺CAF、FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺CAF、FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF、和ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺，优选是FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺CAF和/或FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF。

任选地，所述ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)、TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。

在又一个实施方式中，本发明涉及一种选择患者进行免疫疗法的方法，其中所述方法包括：

(a)检测来自所述患者的癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF；

(b)确定所述癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的百分比，并且其中ANTXR1⁺CAF的百分比低于25％、优选低于20％、更优选低于10％、更加优选低于5％、愈加优选低于1％、更甚优选低于0.5％预测所述患者对免疫疗法治疗有反应性。

所述方法还可包括施用免疫疗法的步骤c)，优选地，所述免疫疗法是免疫检查点抑制剂。

在又一个实施方式中，本发明涉及一种选择患进者行替代抗癌治疗、特别是免疫疗法以外的或包括免疫疗法的抗癌治疗的方法，其中所述方法包括：

(a)检测来自所述患者的癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF；

(b)确定所述癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的百分比，并且其中ANTXR1⁺CAF的百分比高于1％、优选高于5％、更优选高于10％、更加优选高于20％、愈加优选高于30％、更甚优选高于40％指示或预测所述患者对免疫疗法治疗的不反应性。

所述方法还可包括施用替代治疗的步骤c)，所述替代治疗选自手术、化疗、放疗、激素疗法、靶向疗法和姑息护理或其任何组合。替代地或附加地，所述方法还可包括施用与降低ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF诱导的免疫抑制的治疗相结合的免疫疗法治疗的步骤。

本发明还涉及一种用于治疗患者癌症的免疫疗法治疗，其中所述患者的癌样本中呈现(a)低数量或低百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF；或(b)没有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF。它还涉及免疫疗法治疗在制造用于治疗患者癌症的药物中的用途，其中所述患者的癌样本中呈现(a)低数量或低百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF；或(b)没有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF。本发明还涉及一种用于治疗患者癌症的方法，其中所述方法包括选择患者，所述患者具有(a)低数量或低百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF；或(b)没有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF，以及施用治疗有效量的免疫疗法治疗。

任选地，所述ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF是FAP⁺ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。所述ANTXR1⁺CAF是创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，所述ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)、TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。

免疫疗法治疗

本发明的免疫抑制性成纤维细胞，特别是免疫抑制性CAF，可以用于预测或评估对免疫疗法的反应。

优选地，所述免疫疗法治疗选自：刺激患者免疫***攻击恶性肿瘤细胞的治疗性治疗，用肿瘤抗原对患者进行免疫接种、例如通过施用癌症疫苗，施用刺激免疫***的分子例如细胞因子，施用治疗性抗体、优选单克隆抗体作为药物，特别是针对在肿瘤细胞膜上特异性呈递或过表达的抗原或针对阻止肿瘤生长的细胞受体的抗体，过继T细胞疗法，免疫检查点抑制剂治疗，及其任何组合；优选免疫检查点抑制剂治疗。

在一个优选的实施方式中，所述免疫疗法治疗是免疫检查点抑制剂治疗，优选选自：针对抗CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)的抗体例如伊匹单抗，针对PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)的抗体例如纳武单抗、帕博利珠单抗或BGB-A317，针对PDL1(程序性细胞死亡配体)的抗体例如阿替利珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗，针对LAG-3(淋巴细胞激活基因3)的抗体例如BMS-986016，针对TIM-3(含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白-3)的抗体，针对TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)的抗体，针对BLTA(B和T淋巴细胞衰减因子)的抗体，IDO1抑制剂例如艾卡哚司他，或其组合。

在一个最优选的方面，所述免疫疗法是免疫检查点抑制剂，其中所述免疫检查点选自针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性细胞死亡配体(PD-L1)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白-3(TIM-3)、B和T淋巴细胞衰减因子(BLTA)的抗体、IDO1抑制剂或其任何组合，优选选自针对CTLA-4、PD-1和TIGIT的抗体或其任何组合，更优选针对PD-1或CTLA-4的抗体及其组合。

有几种抗PD-1抗体已经获得临床批准，其它仍在临床开发中。例如，抗PD1抗体可以选自：帕博利珠单抗(也称为Keytruda lambrolizumab，MK-3475)，纳武单抗(Opdivo，MDX-1106，BMS-936558，ONO-4538)，匹地利珠单抗(Pidilizumab)(CT-011)，西米普利单抗(Cemiplimab)(LIBTYO)，卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)，AUNP12，AMP-224，AGEN-2034，BGB-A317(替雷利珠单抗(Tisleizumab))，PDR001(斯巴达珠单抗(Spartalizumab))，MK-3477，SCH-900475，PF-06801591，JNJ-63723283，genolimzumab(CBT-501)，LZM-009，BCD-100，SHR-1201，BAT-1306，AK-103(HX-008)，MEDI-0680(也称为AMP-514)，MEDI0608，JS001(参见Si-Yang Liu等，J.Hematol.Oncol.10:136(2017))，BI-754091，CBT-501，INCSHR1210(也称为SHR-1210)，TSR-042(也称为ANB011)，GLS-010(也称为WBP3055)，AM-0001(Armo)，STI-1110(参见WO 2014/194302)，AGEN2034(参见WO 2017/040790)，MGA012(参见WO 2017/19846)，或IBI308(参见WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/132825和WO 2017/133540)，WO 2006/121168中描述的单克隆抗体5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4。靶向PD-1的双功能或双特异性分子也是已知的，例如RG7769(Roche)、XmAb20717(Xencor)、MEDI5752(AstraZeneca)、FS118(F-star)、SL-279252(Takeda)和XmAb23104(Xencor)。

针对CTLA-4的抗体和靶向CTLA-4的双功能或双特异性分子也是已知的，例如伊匹单抗、曲美木单抗(tremelimumab)、MK-1308、AGEN-1884、XmAb20717(Xencor)、MEDI5752(AstraZeneca)。

针对TIGIT的抗体也是在本领域中已知的，例如如WO19232484中所公开的BMS-986207或AB154、BMS-986207CPA.9.086、CHA.9.547.18、CPA.9.018、CPA.9.027、CPA.9.049、CPA.9.057、CPA.9.059、CPA.9.083、CPA.9.089、CPA.9.093、CPA.9.101、CPA.9.103、CHA.9.536.1、CHA.9.536.3、CHA.9.536.4、CHA.9.536.5、CHA.9.536.6、CHA.9.536.7、CHA.9.536.8、CHA.9.560.1、CHA.9.560.3、CHA.9.560.4、CHA.9.560.5、CHA.9.560.6、CHA.9.560.7、CHA.9.560.8、CHA.9.546.1、CHA.9.547.1、CHA.9.547.2、CHA.9.547.3、CHA.9.547.4、CHA.9.547.6、CHA.9.547.7、CHA.9.547.8、CHA.9.547.9、CHA.9.547.13、CHA.9.541.1、CHA.9.541.3、CHA.9.541.4、CHA.9.541.5、CHA.9.541.6、CHA.9.541.7和CHA.9.541.8。WO16028656、WO16106302、WO16191643、WO17030823、WO17037707、WO17053748、WO17152088、WO18033798、WO18102536、WO18102746、WO18160704、WO18200430、WO18204363、WO19023504、WO19062832、WO19129221、WO19129261、WO19137548、WO19152574、WO19154415、WO19168382和WO19215728中也公开了抗TIGIT抗体。

优选地，所述免疫疗法选自伊匹单抗、纳武单抗、BGB-A317、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、阿维单抗、或德瓦鲁单抗、BMS-986016和艾卡哚司他，或其任何组合。

ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF靶向剂

在另一个方面，本发明还涉及靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂或靶向FAP⁺成纤维细胞的药剂或包含所述药剂的药物组合物，用于与免疫疗法治疗相结合以治疗患癌对象或用于患癌对象，所述对象具有ANTXR1⁺成纤维细胞，尤其是在来自所述对象的肿瘤样本中具有ANTXR1⁺成纤维细胞。

实际上，降低ANTXR1⁺成纤维细胞、尤其是ANTXR1⁺CAF诱导的免疫抑制的治疗可以是例如靶向ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的药剂、或FAP抑制剂。

本发明还涉及靶向ANTXR1⁺CAF或FAP⁺CAF的药剂或包含所述药剂的药物组合物，用于与免疫疗法治疗相结合以治疗患癌对象或用于患癌对象，所述对象具有ANTXR1⁺CAF，尤其是在来自所述对象的肿瘤样本中具有ANTXR1⁺CAF。更特别地，当使用FAP抑制剂时，所述对象有ANTXR1⁺FAP⁺成纤维细胞，尤其是ANTXR1⁺FAP⁺CAF。

本发明还涉及靶向ANTXR1⁺CAF或FAP⁺CAF的药剂在制造用于治疗患癌对象、特别是具有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的对象、尤其在来自对象的肿瘤样本中具有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的对象的药物中的用途，所述药物任选与免疫疗法治疗相结合。在一个进一步的方面，本发明涉及靶向ANTXR1⁺CAF或FAP⁺CAF的药剂的组合在治疗患癌对象、特别是具有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的对象、尤其在来自对象的肿瘤样本中具有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的对象中的用途。它涉及一种治疗患癌对象的方法，包括选择具有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的患者并施用治疗有效量的靶向ANTXR1⁺CAF或FAP⁺CAF的药剂。任选地，所述方法还包括施用治疗有效量的免疫疗法治疗。本发明还涉及一种产品或试剂盒，所述产品或试剂盒包含a)靶向ANTXR1⁺CAF或FAP⁺CAF的药剂和b)免疫疗法治疗，作为联合制剂供同时、分别或顺序用于治疗患者、尤其是有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的患者的癌症。特别地，所述对象的肿瘤样本具有中或高百分比的癌样本中ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF。

本发明还涉及一种选择癌症患者进行用靶向ANTXR1⁺CAF或FAP⁺CAF的药剂治疗的方法，所述方法包括检测如上所公开的免疫抑制性成纤维细胞或CAF并且选择在来自患者的癌样本中具有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的患者。

特别地，所述药剂抑制或降低ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的免疫抑制性作用。

优选地，所述药剂选自：ANTXR1抑制剂，任选与细胞毒性药物缀合的抗ANTXR1抗体，包含抗ANTXR1部分的多特异性分子，抗ANTXR1 T细胞受体(TCR)，抗ANTXR1嵌合抗原受体(CAR)，以及表达抗ANTXR1 TCR或抗ANTXR1 CAR的免疫细胞、优选T细胞，或其任何组合。

附加地或替代地，所述药剂选自：FAP抑制剂，任选与细胞毒性药物缀合的抗FAP抗体，包含抗FAP部分的多特异性分子，抗FAP T细胞受体(TCR)，抗FAP嵌合抗原受体(CAR)，以及表达抗FAP TCR或抗FAP CAR的免疫细胞、优选T细胞，或其任何组合。

特别地，ANTXR1抑制剂可以是例如依布硒(ebselen)或乙酸苯汞。

FAP抑制剂(FAPI)可选自：他拉布司他，PT-100，利拉利汀(Tradjenta)，如Jansen等，ACS Med Chem Lett.2013年5月9日；4(5):491–496公开的具有N-(4-喹啉基)-甘氨酰-(2-氰基吡咯烷)骨架的FAP抑制剂，例如Mueller等，J Biol Chem 1999；274:24947-52中所述的MIP-1232，以及诸如FAPI-02和FAPI-04的FAP抑制剂，例如Lindner等，EJNMMIRadiopharmacy and Chemistry(2019)4:16和Lidner等，Journal of Nuclear Medicine，2018年4月6日发表中所述。例如，FAP抑制剂在WO20081522、WO20132661、WO20245173、WO21005125、WO21005131、US2020246383、WO19154859、WO19083990、WO19118932、WO18111989、WO17189569、WO13107820、WO08116054或WO07085895中描述，所述文献的公开内容通过引用并入本文。FAP抑制剂也可以是与放射性核素(例如，镥-177)连接的FAP结合肽，例如由Clovis Oncology开发的FAP抑制剂FAP-2286。

在一个特定实施方式中，本发明涉及FAP抑制剂在治疗患癌对象或在用于治疗患癌对象中的用途，所述对象有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF，尤其是在来自所述对象的肿瘤样本中或在肿瘤的微环境中具有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF。

在一个实施方式中，所述药剂是抗ANTXR1或抗FAP抗体。本发明的抗体可以是任何种类的抗体。特别地，所述抗体可以包含具有两个重链和轻链或其片段的经典Y形抗体、由这样的抗体组成或基本上由这样的抗体组成。优选所述片段包含该抗体的抗原结合或可变区。所述片段可选自但不限于Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv、单链Fv(scFv)、di-scFv或sc(Fv)2、dsFv、Fd、dAb、CDR、VH、VL、VHH、V-NAR、纳米抗体、微型抗体、双特异抗体、和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本发明的抗体可以是单体抗体或多体抗体。特别地，本发明的抗体是单体抗体。

本发明的抗体可以是单克隆或多克隆的。优选地，本发明的抗体是单克隆的。

在另一个优选的实施方式中，所述靶向剂是抗ANTXR1或抗FAP抗体、或结合ANTXR1或FAP的肽，其与药物、优选细胞毒性药物缀合。任选地，所述抗ANTXR1或抗FAP抗体可具有抑制或拮抗活性。

本发明的药物优选是细胞毒性药物。如本文所用的术语“细胞毒性药物”是指一种分子，其当与细胞发生接触时，最终内化到细胞中，以有害的方式改变细胞功能(例如细胞生长和/或增殖和/或分化和/或代谢例如蛋白质和/或DNA合成)或导致细胞死亡。如本文所用的术语“细胞毒性药物”包括毒素，特别是细胞毒素。

本发明的细胞毒性药物可选自：多拉司他汀类(dolastatins)如多拉司他汀(dolastin)10、多拉司他汀15，澳瑞他汀(auristatin)E，澳瑞他汀EB(AEB)，澳瑞他汀EFP(AEFP)，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，单甲基澳瑞他汀-D(MMAD)，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)，美登素类(maytansines)如安丝菌素(ansamitocin)、mertansine(又称emtansine或DM1)和ravtansine(又称soravtansine或DM4)，蒽环类如柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、伊达比星(idarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、正定霉素(cerubidin)、阿柔比星(aclarubicin)、阿霉素(adriblastin)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、柔红霉素脂质体(daunoxome)、奈莫柔比星(nemorubicin)和PNU-159682，卡利奇霉素类(calicheamicins)如卡利奇霉素β1Br、卡利奇霉素γ1Br、卡利奇霉素α2I、卡利奇霉素α3I、卡利奇霉素β1I、卡利奇霉素γ1L、卡利奇霉素δ1I和奧佐米星(Ozogamicin)，埃斯培拉霉素类(esperamicins)如埃斯培拉霉素A1，新制癌菌素类(neocarzinostatins)，博来霉素(bleomycin)，多卡霉素类如CC-1065和多卡霉素A，吡咯并苯并二氮杂

类如安曲霉素(anthramycin)、abbeymycin、chicamycin、DC-81、甲基氨茴霉素(mazethramycin)、新茴霉素(neothramycin)A和B、porothramycin prothracarcin、西班米星(sibanomicin)(DC-102)、西伯利亚霉素(sibiromycin)和托马霉素(tomamycin)，吡咯并苯并二氮杂

二聚体类(或PBD)，吲哚并-苯并二氮杂

类，吲哚并-苯并二氮杂

二聚体类，α-鹅膏菌素类，abraxane，放线菌素，阿地白介素(aldesleukin)，六甲密胺(altretamine)，阿利维甲酸(alitretinoin)，安吖啶(amsacrine)，阿那曲唑(anastrozole)，砷，天冬酰胺酶，阿扎胞苷(azacitidine)，硫唑嘌呤(azathioprine)，蓓萨罗丁(bexarotene)，苯达莫司汀(bendamustine)，比卡鲁胺(bicalutamide)，硼替佐米(bortezomib)，白消安(busulfan)，卡培他滨(capecitabine)，卡铂(carboplatin)，卡莫司汀(carmustine)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，顺铂(cisplatin)，克拉屈滨(cladribine)，氯法拉滨(clofarabine)，环磷酰胺，阿糖胞苷(cytarabine)，氯霉素(chloramphenicol)，环孢素(ciclosporin)，西多福韦(cidofovir)，含煤焦油产品，秋水仙碱，达卡巴嗪(dacarbazine)，放线菌素D，达那唑(danazol)，达沙替尼(dasatinib)，己烯雌酚，地诺前列酮，地蒽酚(dithranol)，度他雄胺(dutasteride)，右雷佐生(dexrazoxane)，多西他赛(docetaxel)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，厄洛替尼(erlotinib)，雌氮芥(estramustine)，依托泊苷(etoposide)，依西美坦(exemestane)，非那雄胺(finasteride)，氟他胺(flutamide)，氟尿苷，氟胞嘧啶，氟达拉滨，氟尿嘧啶，更昔洛韦(ganciclovir)，吉非替尼(gefitinib)，吉西他滨(gemcitabine)，戈舍瑞林(goserelin)，羟基脲(hydroxyurea)，羟基脲(hydroxycarbamide)，异环磷酰胺(ifosfamide)，伊立替康(irinotecan)，伊马替尼(imatinib)，来那度胺(lenalidomide)，来氟米特(leflunomide)，来曲唑(letrozole)，醋酸亮丙瑞林(leuprorelin acetate)，洛莫司汀(lomustine)，二氯甲二乙胺，美法仑(melphalan)，硫代嘌呤，甲氨蝶呤，丝裂霉素，米托坦(mitotane)，尿促性素类，米非司酮(mifepristone)，那法瑞林(nafarelin)，奈拉滨(nelarabin)，氮芥，亚硝基脲，奥沙利铂(oxaliplatin)，奧佐米星(ozogamicin)，紫杉醇，鬼臼树脂(podophyllyn)，聚乙二醇天冬酰胺酶，培美曲塞(pemetrexed)，喷他脒(pentamidine)，喷司他丁(pentostatin)，丙卡巴肼(procarbazin)，雷洛昔芬(raloxifene)，利巴韦林(ribavarin)，雷替曲塞(raltitrexed)，利妥昔单抗(rituximab)，罗米地辛(romidepsin)，索拉非尼(sorafenib)，链佐星(streptozocin)，舒尼替尼(sunitinib)，西罗莫司(sirolimus)，链佐星，替莫唑胺(temozolomide)，替西罗莫司(temsirolimus)，替尼泊苷(teniposide)，沙利度胺(thalidomide)，硫鸟嘌呤，噻替派(thiotepa)，托泊替康(topotecan)，他克莫司(tacrolimus)，泰索帝(taxotere)，他氟泊苷(tafluposide)，托瑞米芬(toremifene)，维甲酸(tretinoin)，曲氟尿苷(trifluridine)，曲普瑞林(triptorelin)，缬更昔洛韦(valganciclovir)，戊柔比星(valrubicin)，长春花碱(vinblastine)，阿糖腺苷(vidaradine)，长春新碱(vincristine)，长春地新(vindesine)，长春瑞滨(vinorelbine)，威罗非尼(vemurafenib)，维莫德吉(vismodegib)，伏立诺他(vorinostat)，齐多夫定(zidovudine)，vedotine，其衍生物和组合。所述细胞毒性药物还可以是放射性核素，例如镥-177、碘-131、钐-153和钇-90或砹-211、铋-212、铅-212、铋-213、锕-225、镭-223和钍-227。

在一个优选的实施方式中，本发明的抗体-药物缀合物包含抗体和药物之间的接头。本发明的接头可以是可切割的或不可切割的，优选地，所述接头是可切割的。本发明的可切割接头的实例包括但不限于二硫化物、腙和肽。本发明的不可切割接头的实例包括但不限于硫醚。

在一个特定实施方式中，所述药物与抗体的半胱氨酸或赖氨酸残基连接。优选地，所述药物或抗原与已并入抗体中的非天然氨基酸连接。

制备抗体-药物缀合物的方法是本领域技术人员公知的。

在一个实施方式中，所述药剂是抗ANTXR1或抗FAP CAR细胞。如本文所用的术语“嵌合抗原受体”(CAR)、“工程改造的细胞受体”、“嵌合细胞受体”或“嵌合免疫受体”(ICR)是指工程改造的受体，其将抗原结合特异性(例如抗体)移植到免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)上，从而将抗原结合结构域的抗原结合性质与免疫细胞的免疫原活性、例如免疫细胞的溶解能力和自我更新相结合。针对ANTXR1的CAR细胞是本领域技术人员可得到的。例如，在专利申请KR1020190013612、US2016264662A、US2017114133A和CN108707199A中、以及在出版物例如Byrd等，(Cancer Res.2018；78(2):489–500.10.1158/0008-5472.CAN-16-1911)中，描述了抗ANTXR1 CAR T细胞。

本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含ANTXR1和/或FAP CAF靶向剂，优选FAP抑制剂、ANTXR1抑制剂、抗FAP抗体、抗ANTXR1抗体或其任何组合，所述抗体任选与药物、优选如上所述的细胞毒性药物或其组合缀合。特别地，这样的药物组合物包含至少一种药学上可接受的赋形剂。对于该制剂，可以根据本领域技术人员公知的技术使用常规赋形剂。

所述制剂可以被灭菌，并且如果需要，可以与助剂混合，所述助剂例如药学上可接受的载体、赋形剂、盐、抗氧化剂和/或稳定剂，它们不会与所述ANTXR1和/或FAP CAF靶向剂不利地相互作用。

任选地，所述药物组合物还可以包含附加的治疗剂，特别是例如上述的免疫治疗剂。

本领域技术人员理解，本发明的制剂可以与人的血液等渗，即本发明的制剂具有与人血基本上相同的渗透压。这样的等渗制剂通常具有约250mOSm至约350mOSm的渗透压。等渗性可以通过例如蒸汽压或冰冻型渗压计来测量。

本发明的ANTXR1⁺CAF和/或FAP⁺CAF靶向剂或本发明的药物组合物的施用量可以通过本领域普通技术人员公知的标准程序来确定。患者的生理数据(例如年龄、体型和体重)和施用途径必须加以考虑，以确定适当的剂量，以便给患者施用的是治疗有效量。

当分别或顺序地施用本发明的供使用的组合制剂、试剂盒或产品时，尤其是当分别施用时，优选在免疫疗法治疗之前用本发明的ANTXR1⁺CAF和/或FAP⁺CAF靶向剂进行治疗。所述治疗方法还可包括下述的步骤：在施用用本发明的ANTXR1⁺CAF和/或FAP⁺CAF靶向剂的治疗之后并优选在施用免疫疗法治疗之前，确定ANTXR1⁺CAF和/或FAP⁺CAF的百分比，只有在ANTXR1⁺CAF的百分比低或在没有ANTXR1⁺CAF的情况下才施用免疫疗法治疗。

免疫疗法治疗和治疗方法的用途

在一个特定的方面，本发明还涉及一种用于治疗患者癌症的免疫疗法治疗、优选免疫检查点抑制剂治疗，其中所述患者的癌样本中呈现：

(a)低水平或低百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞、特别是ANTXR1⁺CAF；或

(b)没有ANTXR1⁺成纤维细胞，特别是没有ANTXR1⁺CAF。

本发明还涉及免疫疗法治疗、优选免疫检查点抑制剂治疗在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述患者的癌样本中呈现：

(a)低水平或低百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF；或

(b)没有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF。

本发明还涉及一种用于治疗患有癌症的患者的方法，其中如果在来自患者的癌样本中有下列情况，则选择该患者：

(a)肿瘤中ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的百分比低。

(b)肿瘤中没有ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF，并且其中所述方法包括对所述患者施用免疫治疗治疗、优选免疫检查点抑制剂治疗的步骤。

ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF的百分比如上文所述。ANTXR1⁺成纤维细胞或CAF如上文所述，癌症如下文定义，免疫疗法治疗如上文定义。

优选地，ANTXR1⁺CAF选自FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺CAF、FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF、和ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺，优选FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺CAF和/或FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF。

任选地，ANTXR1⁺CAF是FAP⁺ANTXR1⁺CAF。任选地，ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)CAF。任选地，ANTXR1⁺CAF是TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。任选地，ANTXR1⁺CAF是创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)CAF。任选地，ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，ANTXR1⁺CAF是TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。任选地，ANTXR1⁺CAF是ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-)、TGFb-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-)和创伤-myCAF(ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺)CAF。

优选地，所述免疫疗法是免疫检查点抑制剂免疫疗法，优选选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体和抗TIGIT抗体或其任何组合，更优选抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体。

本发明还涉及一种用于治疗对象的癌症的方法，其中将治疗有效剂量的本发明的ANTXR1+CAF和/或FAP+CAF靶向剂或包含这样的靶向剂的药物组合物施用于所述患有癌症的对象，其中所述患者的癌症或来自所述患者的癌样本存在ANTXR1⁺CAF，优选FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺CAF、FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF、和/或ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺，优选FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺CAF和/或FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF。特别地，本发明的ANTXR1⁺CAF和/或FAP⁺CAF靶向剂或本发明的药物组合物的施用量可以通过本领域普通技术人员公知的标准程序来确定。患者的生理数据(例如年龄、体型和体重)和施用途径必须加以考虑，以确定适当的剂量，以便给患者施用的是治疗有效量。

在一些实施方式中，本发明的免疫疗法治疗、靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂、靶向FAP⁺成纤维细胞的药剂和/或药物组合物与附加的癌症疗法联合施用。特别地，本发明的免疫疗法治疗、靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂、靶向FAP⁺成纤维细胞的药剂和/或药物组合物与其它靶向疗法、其它免疫疗法、化疗和/或放疗联合施用。

在一些实施方式中，本发明的免疫疗法治疗、靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂、靶向FAP⁺成纤维细胞的药剂和/或药物组合物与化疗联合施用于所述患者。如本文所用的术语“化疗”具有其在本领域的一般含义，是指对患者施用化疗剂的治疗。化疗剂包括但不限于：烷化剂类，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐类，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，如benzodopa、卡巴醌(carboquone)、meturedopa和uredopa；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；acetogenins(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；Cryptophycins(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；多卡霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺、氧化二氯甲二乙胺盐酸盐、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如，卡利奇霉素，尤其是卡利奇霉素γ和卡利奇霉素ω；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，如氯屈膦酸二钠(clodronate)；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素发色团，阿克拉霉素类(aclacinomysins)，放线菌素，authrarnycin，氮杂丝氨酸，博来霉素，放线菌素C，carabicin，洋红霉素(caminomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放线菌素D，柔红霉素，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星(包括吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基-多柔比星、2-吡咯烷基-多柔比星和脱氧多柔比星)，表柔比星，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，marcellomycin，丝裂霉素如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycins)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫代鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、硫雄甾醇(epitiostanol)、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺激素，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；脱羰秋水仙碱(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登素类化合物，如美坦生和安丝菌素；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼；PSK多糖复合体；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；裂裥菌素(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯族化合物(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和anguidine；乌拉坦(urethan)；长春地新；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；***糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西紫杉醇；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂配位络合物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班磷酸盐(ibandronate)；伊立替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；卡培他滨；蒽环素类，亚硝脲，抗代谢物，表鬼臼毒素类，酶如L-天冬酰胺酶；蒽二酮；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，如***及其等效物、***和氨鲁米特；孕激素，如己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮和乙酸甲地孕酮；***，如己烯雌酚和乙炔***等效物；抗***，如他莫昔芬；雄激素类，包括丙酸睾酮和氟***(fluoxymesterone)/等效物；抗雄激素物质，如氟他胺(flutamide)、***释放激素类似物和亮丙瑞林(leuprolide)；以及非类固醇抗雄激素物质，如氟他胺；以及上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在一些实施方式中，本发明的免疫疗法治疗、靶向ANTXR1+成纤维细胞的药剂、靶向FAP⁺成纤维细胞的药剂和/或药物组合物与放疗联合施用于所述患者。放射疗法的适当的实例包括但不限于外束放疗(如浅表X射线疗法、正电压X射线疗法、超高电压X射线疗法、放射外科、立体定向放射疗法、分次立体定向放射疗法、钴疗法、电子疗法、快中子疗法、中子俘获疗法、质子疗法、调强放射疗法(IMRT)、三维适形放射疗法(3D-CRT)等)；近距放射疗法；非密封源放疗；螺旋断层放疗；等等。伽马射线是放疗中使用的另一种形式的光子。当某些元素(如镭、铀和钴60)在其分解或衰变时释放辐射，自发地产生伽马射线。在一些实施方式中，放疗可以是质子放疗或质子微束放射疗法。质子放疗是一种使用质子束的超精密放疗形式(Prezado Y，Jouvion G，Guardiola C，Gonzalez W，Juchaux M，Bergs J，NaurayeC，Labiod D，De Marzi L，Pouzoulet F，Patriarca A，Dendale R.带有RG2胶质瘤的大鼠中的肿瘤控制：质子微束疗法与标准质子疗法之间的比较(Tumor Control in RG2 Glioma-Bearing Rats:A Comparison Between Proton Minibeam Therapy and Standard ProtonTherapy).Int J Radiat Oncol Biol Phys.2019年6月1日；104(2):266-271.doi:10.1016/j.ijrobp.2019.01.080；Prezado Y，Jouvion G，Patriarca A，Nauraye C，Guardiola C，Juchaux M，Lamirault C，Labiod D，Jourdain L，Sebrie C，Dendale R，Gonzalez W，Pouzoulet F.质子微束放射疗法扩大了高级别胶质瘤的治疗指数(Protonminibeam radiation therapy widens the therapeutic index for high-gradegliomas.)Sci Rep.2018年11月7日；8(1):16479.doi:10.1038/s41598-018-34796-8)。放疗也可以是FLASH放疗(FLASH-RT)或FLASH质子照射。FLASH放疗涉及以比目前常规临床实践高几个数量级的剂量率(超高剂量率)超快地递送放射治疗。(Favaudon V，Fouillade C，Vozenin MC.FLASH放疗拯救健康组织(The radiotherapy FLASH to save healthytissues.)Med Sci(巴黎)2015；31:121-123.DOI:10.1051/medsci/20153102002)；Patriarca A.，Fouillade C.M.，Martin F.，Pouzoulet F.，Nauraye C.等，使用临床***对小型动物进行FLASH质子放射的实验设置(Experimental set-up for FLASH protonirradiation of small animals using a clinical system.)Int J Radiat Oncol BiolPhys，102(2018)，619-626页.doi:10.1016/j.ijrobp.2018.06.403.电子版2018年7月11日)。

患者、方案和施用

患者是动物、优选哺乳动物、更加优选人类。然而，患者也可以是需要治疗的非人类动物，特别是哺乳动物，如狗、猫、马、牛、猪、羊、驴、兔子、雪貂、沙鼠、仓鼠、灰鼠、大鼠、小鼠、豚鼠和非人灵长类动物等。

本发明的人类患者可以是出生前阶段的人类、新生儿、儿童、婴儿、青少年或成人，特别是至少30岁或至少40岁的成人、优选至少50岁的成人、更加优选至少60岁的成人、愈加优选至少70岁的成人。

在一个实施方式中，患者是主动吸烟者或曾经吸烟者。

优选地，患者被诊断出患有癌症。在另一特定实施方式中，患者患有转移癌或晚期癌症。在一个实施方式中，患者已被诊断出患有III或IV期癌症。

在一个实施方式中，患有癌症的患者有转移，特别是脑、肝、骨和/或肾上腺转移。

在一个特定实施方式中，患者已经接受了至少一条治疗路线、特别是一条治疗路线、两条治疗路线或三条或更多的治疗路线，优选是几条治疗路线。或者，患者尚未接受任何治疗。特别是，患者已经接受了纳武单抗、帕博利珠单抗、伊匹单抗(ipilumumab)或其任何组合。

癌症治疗，特别是免疫疗法治疗或包含抗ANTXR1或抗FAP药剂的治疗，可以通过任何常规施用途径如局部、肠内、口服、胃肠外、鼻内、静脉内、肌内、皮下或眼内施用途径等进行施用。

特别地，癌症治疗可以是免疫疗法、手术、化疗、放疗、激素疗法、靶向疗法、姑息护理、包含抗ANTXR1或抗FAP药剂的治疗及其任何组合。

优选地，在确定ANTXR1⁺成纤维细胞、特别是ANTXR1⁺CAF的存在后不超过一个月、优选不超过一周，开始癌症治疗。

癌症治疗可以作为单次剂量或以多次剂量施用。

优选地，癌症治疗是定期施用的，优选在每天和每个月之间、更优选在每天和每两周之间、更加优选在每天和每周之间施用。

治疗的持续时间优选在1天和24周之间、更优选在1天和10周之间、更加优选在1天和4周之间。在一个特定实施方式中，只要癌症存续，治疗就会持续。

癌症治疗的施用量、特别是免疫疗法治疗或包含抗ANTXR1或抗FAP药剂的治疗的施用量，由本领域普通技术人员公知的标准程序确定。患者的生理数据(例如年龄、体型、体重和身体一般条件)和施用途径必须加以考虑，以确定适当的剂量，以便给患者施用的是治疗有效量。

在活性成分的组合的情况下，活性成分可以通过相同或不同的施用途径施用于所述对象。施用途径通常取决于所用的药物组合物。

癌症

本发明的方法旨在选择和/或治疗患有肿瘤的患者。

在一个实施方式中，肿瘤来自于选自下列的癌症：白血病，***瘤，黑色素瘤，畸胎瘤，淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，神经母细胞瘤，胶质瘤，腺癌，间皮瘤(包括胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、心包间皮瘤和终末期间皮瘤)，直肠癌，子宫内膜癌，甲状腺癌(包括***状甲状腺癌、滤泡性甲状腺癌、甲状腺髓样癌、未分化甲状腺癌、2A型多发性内分泌瘤、2B型多发性内分泌瘤、家族性甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤)，皮肤癌(包括恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、角化棘皮瘤、痣、发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤和皮肤纤维瘤)、神经***癌，脑癌(包括星形细胞瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤、低级别胶质瘤、室管膜瘤、胚组织瘤(松果体瘤)、多形性胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤、脊髓神经纤维瘤、胶质瘤或肉瘤)，颅骨癌(包括骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤或畸形性骨炎)，脑膜癌(包括脑膜瘤、脑膜肉瘤或胶质瘤病)，头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌和口腔癌(如颊腔癌、唇癌、舌癌、口腔癌或咽癌))，***癌，胃肠道癌，肝癌(包括肝肿瘤、肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤和血管瘤)，结肠癌，胃癌，食道癌(包括鳞状细胞癌、喉癌、腺癌、平滑肌肉瘤或淋巴瘤)，结直肠癌，肠癌，小肠癌(例如腺癌淋巴瘤、类癌、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤或纤维瘤)，大肠癌(例如，腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤或平滑肌瘤)，胰腺癌(包括导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤或血管活性肠肽瘤)，耳、鼻和喉(ENT)癌，乳腺癌(包括HER2富集型乳腺癌、luminal A型乳腺癌、luminal B型乳腺癌和三阴性乳腺癌)，子宫癌(包括子宫内膜癌，如子宫内膜上皮癌、子宫内膜间质肉瘤和恶性苗勒氏混合瘤、子宫肉瘤、平滑肌肉瘤和妊娠滋养细胞病)，卵巢癌(包括无性细胞瘤、颗粒细胞-卵泡膜细胞瘤和Sertoli-Leydig细胞瘤)，***，***癌(包括鳞状细胞***癌、***腺癌、透明细胞***腺癌、***生殖细胞肿瘤、***葡萄状肉瘤和***黑色素瘤)，外阴癌(包括鳞状细胞外阴癌、疣状外阴癌、外阴黑色素瘤、基底细胞外阴癌、***癌、外阴腺癌和增殖性红斑)，泌尿生殖道癌，肾癌(包括透明肾细胞癌、嫌色肾细胞癌、***状肾细胞癌、腺癌、Wilms肿瘤、肾母细胞瘤、淋巴瘤或白血病)，肾上腺癌，膀胱癌，尿道癌(例如鳞状细胞癌、移行细胞癌或腺癌)，***癌(例如腺癌或肉瘤)和睾丸癌(例如***瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、***癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤或脂肪瘤)，肺癌(包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)包括鳞状细胞肺癌、肺腺癌(LUAD)和大细胞肺癌、支气管癌、肺泡癌、细支气管癌、支气管腺瘤、肺肉瘤、软骨瘤错构瘤和胸膜间皮瘤)，肉瘤(包括Askin瘤、葡萄状肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤和软组织肉瘤)，软组织肉瘤(包括腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、***增生性小圆细胞瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、***肉瘤、淋巴肉瘤、恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、神经纤维肉瘤、丛状纤维组织细胞瘤、横纹肉瘤、滑膜肉瘤和未分化多形性肉瘤，贲门癌(包括肉瘤如血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤或脂肉瘤、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)，骨癌(包括骨原性肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性淋巴瘤和网状细胞肉瘤、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(osteochronfroma)、骨软骨外生性骨疣(osteocartilaginousexostoses)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤)，血液***和淋巴***癌，血液癌(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤和骨髓发育不良综合征)，霍奇金氏病，非霍奇金氏淋巴瘤，以及毛细胞和淋巴***疾病，及其转移癌。

优选地，肿瘤来自于选自下列的癌症：***癌，肺癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，乳腺癌，胃癌，肾癌，卵巢癌，肝细胞癌，骨肉瘤，黑色素瘤，下咽癌，食道癌，子宫内膜癌，***，胰腺癌，肝癌，结肠或结直肠癌，神经内分泌肿瘤，肌肉癌，肾上腺癌，腺癌，肉瘤，非鳞状细胞癌，鳞状细胞癌，甲状腺癌，子宫癌，皮肤癌，黑色素瘤，转移性黑色素瘤，膀胱癌，头颈癌。更优选地，癌症选自卵巢癌、乳腺癌、腺癌、肉瘤、非鳞状细胞癌、鳞状细胞癌、肺癌、NSCLC、结直肠癌、胰腺癌、头颈癌、黑色素瘤和转移性黑色素瘤。在一个非常特定的方面，癌症选自头颈癌、NSCLC、黑色素瘤和转移性黑色素瘤。

在一个实施方式中，癌症是卵巢癌、优选间叶性卵巢癌、特别是浆液型的高级别卵巢癌，或乳腺癌、优选浸润性乳腺癌和/或其转移癌，特别是腋窝转移癌。

在另一个实施方式中，癌症是NSCLC或头颈癌。

在一个实施方式中，癌症是肉瘤，特别是成纤维细胞肉瘤。

在另一个实施方式中，癌症选自腺癌、非鳞状细胞癌和鳞状细胞癌。

特别地，患者的癌症、或来自所述患者的癌样本、或肿瘤的微环境存在免疫抑制性成纤维细胞、特别是免疫抑制性CAF、特别是ANTXR1⁺CAF或ANTXR1⁺FAP⁺CAF。

优选地，患者的癌症、或来自所述患者的癌样本存在ANTXR1⁺CAF，优选FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺CAF、FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF和/或ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺，优选FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺CAF和/或FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF。

试剂盒

此外，本发明提供了一中可用于执行本文中公开的方法的试剂盒，所述试剂盒包含能够检测ANTXR1⁺成纤维细胞的工具，所述ANTXR1⁺成纤维细胞特别是ANTXR1⁺CAF、优选FAP⁺ANTXR1⁺CAF、更加优选FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺CAF、FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF和/或ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺CAF。

例如，所述试剂盒包含检测ANTXR1⁺CAF、优选FAP⁺ANTXR1⁺CAF、更加优选FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺CAF、FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF和/或ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺CAF所需的工具。本领域技术人员知道专门确定ANTXR1的存在、优选FAP和ANTXR1的存在、更加优选FAP、ANTXR1、LAMP5和SDC1；FAP、ANTXR1、LAMP5和SDC1；和/或ANTXR1、SDC1、LAMP5和CD9的存在需要哪种(哪些)工具。所述存在可以在核酸水平、特别是mRNA水平上或在蛋白质水平上检测。例如，这样的工具可以是对于检测ANTXR1⁺CAF、优选FAP⁺ANTXR1⁺CAF、更加优选FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺CAF、FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CAF和/或ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺CAF特异性的探针、引物、抗体和/或适配体。特别地，这样的工具是针对ANTXR1、FAP、LAMP5和SDC1、和/或CD9的抗体，例如本文中公开的。或者，这样的工具可以是对ANTXR1、FAP、LAMP5和SDC1、和/或CD9特异性的探针和/或引物。

附加地或替代地，所述试剂盒包含靶向基因签名ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和/或创伤-myCAF中的至少一个基因的工具，特别是核酸、探针或引物，例如上文公开的。更特别地，它包含用于检测基因签名ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和/或创伤-myCAF中的所有基因的工具。特别地，所述工具是引物和/或探针。

所述试剂盒可以是诊断试剂盒。所述试剂盒的组件可以在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器工具通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器工具，组分可以放置在其中、并且优选适当地等分。在试剂盒中有多于一个组分的情况下，所述试剂盒通常通常还包含第二个、第三个或其它附加的容器，附加的组件可以单独放置在其中。然而，小瓶中可以包含组分的各种组合。

在一些实施方式中，可以提供从个体采样和/或测定样本的工具。所述试剂盒还可以包含用于容纳无菌的、药学上可接受的缓冲剂和/或其它稀释剂的工具。任选地，提供介绍这样的试剂盒的使用指导的说明书。

在另一个方面，本发明还涉及如上所述的试剂盒在以下各项中的用途：

-检测来自患有癌症的对象的癌样本中的免疫抑制性癌相关成纤维细胞(CAF)；

-预测患有癌症的对象对免疫疗法治疗的反应；

-选择或不选择癌症患者进行免疫疗法治疗；

-选择或不选择癌症患者进行用靶向ANTXR1⁺CAF的药剂治疗；

-选择或不选择癌症患者进行用靶向ANTXR1⁺CAF的药剂治疗和免疫疗法治疗。

本发明的其它方面和优点将在以下实施例中进行描述，这些实施例应被视为说明性的而非限制性的。

实施例

通过单细胞方法，鉴别免疫抑制性CAF-S1子集内不同的细胞簇。本发明人使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)来研究CAF-S1免疫抑制性子集内的细胞异质性。如前所述，通过FACS从人BC(参见表1中对前瞻性群组1的描述)中分离出CAF-S1成纤维细胞(Costa A等，Cancer Cell 2018；33(3):463-79e10)。简而言之，发明人首先从新切出的肿瘤中排除了碎片、死细胞、二倍体、上皮细胞(EPCAM⁺)、造血细胞(CD45⁺)、内皮细胞(CD31⁺)和红细胞(CD235a⁺)(图7A)。发明人将EPCAM^-CD45^-CD31^-CD235a^-视为富集了成纤维细胞的细胞级分，接下来进行如之前Costa A等，Cancer Cell 2018；33(3):463-79e10)建立的FAP和CD29染色(图7A)，其能够区分CAF-S1(FAP^高CD29^中-高)与其它CAF亚群(CAF-S2：FAP^阴性CD29^低；CAF-S3：FAP^阴性CD29^中；CAF-S4：FAP^阴性CD29^高)。发明人然后对来自7名BC患者在任何治疗之前的18 805个CAF-S1成纤维细胞进行scRNA-seq。质量控制后，保存了18 296个CAF-S1成纤维细胞，平均每个细胞检测到中位数为2428个基因，用于进一步分析。非监督的基于图形的聚类鉴定了8个CAF-S1簇，用统一流形近似和投影(UMAP)算法进行可视化(图1)。在大多数患者中都发现了所有的簇，尽管水平不同。如使用G1/S和G2/M基因签名所示，没有单个的簇与细胞周期的特定阶段或与高增殖有关(Tirosh I等，Science 2016；352(6282)。发明人确认，使用Stuart T等，Cell 2019；177(7):1888-902e21中所述的标记物转移(Label Transfer)算法，检测到了这些不同的CAF-S1细胞簇。事实上，这种算法成功地以高预测分数转移了一个独立的CAF-S1 scRNA-seq数据集中的所有8个簇标记物，该数据集是从第8个BC患者新生成的。

差异基因表达分析表明，每个簇都以特定的转录谱为特征。重要的是，在Costa A等，Cancer Cell 2018；33(3):463-79e10、Givel等，Nat Commun 2018；9(1):1056和Kieffer等，Cancer Discov.2020；10(9):1330-1351中发布的CAF-S1签名包含不限于特定CAF-S1簇的基因(图11)。簇0与ECM重塑、细胞-基质黏附和胶原形成相关；簇1与解毒和炎症反应相关；簇2与对生长因子、TNF信号传导和白介素途径的反应相关；簇3与TGFβ信号传导通路和基质组相关；簇4与胶原原纤维组装和伤口愈合相关；簇5与干扰素γ(IFNγ和细胞因子介导的信号传导通路)相关；簇6与IFNβα信号传导相关；簇7与肌动球蛋白复合体相关。例如，发明人发现：LRRC15(富含亮氨酸重复蛋白15)——一种最近从胰腺癌的CAF中鉴定的标志物——和GBJ2(缝隙连接蛋白β2)在簇0中高表达，ADH1B(乙醇脱氢酶1)和GPX3(谷胱甘肽过氧化物酶3)在簇1中高表达，RGMA(反义导向分子BMP共受体)和SCARA5(A类清道夫受体成员5)在簇2中高表达，CST1(胱抑素)和TGFβ1在簇3中高表达，SEMA3C(Semaphorin 3C)和SFRP4(分泌型卷曲相关蛋白4)在簇4中高表达，CCL19和CCL5(CC基序趋化因子配体19和5)在簇5中高表达，IFIT3(干扰素诱导的具有三角形四肽重复的蛋白3)和IRF7(干扰素调节因子7)在簇6中高表达，GGH(γ-谷氨酰水解酶)和PLP2(蛋白脂质蛋白2)在簇7中高表达。有趣的是，在人类BC中，发明人能够辨别肌成纤维细胞(“myCAF”)和炎性成纤维细胞(“iCAF”)亚群，这以前是在胰腺癌的FAP⁺成纤维细胞中鉴定的(Elyada等，Cancer Discov 2019；9(8):1102-23，Ohlund D等，J Exp Med 2017；214(3):579-96)。CAF-S1簇1、2和5被鉴定为iCAF，簇0、3、4、6和7被鉴定为myCAF。与胰腺癌的数据一致，iCAF显示出趋化因子和促炎分子如CXCL12(CXC基序趋化因子配体12)和SOD2(超氧化物歧化酶2)的高表达，而myCAF表达肌成纤维细胞标志物，包括COL1A2(1型胶原蛋白α2链)和TAGLN(Transgelin)。另外，发明人观察到，iCAF簇5表达高水平的CD74，编码II类主要组织相容性复合物(MHC)恒定链。CD74最近被证明在胰腺癌的抗原呈递CAF(“apCAF”)中特异性表达，提示CAF-S1簇5可能与此类apCAF相似。综上所述，发明人在BC中鉴定了8个不同的CAF-S1簇。簇1、2和5属于iCAF亚组，其中簇5可能对应于apCAF簇，而簇0、3、4、6和7属于myCAF亚组。此外，iCAF簇以解毒(簇1)、对刺激物的反应(簇2)、IFNγ和细胞因子(簇5)为特征；而myCAF簇以ECM(簇0)、TGFβ(簇3)、创伤愈合(簇4)、IFNαβ(簇6)和肌动球蛋白(簇7)为特征。因此，发明人为这些不同的FAP^高CAF-S1簇提出了以下命名：簇0＝ecm-myCAF，簇1＝解毒-iCAF,簇2＝IL-iCAF，簇3＝TGFβ-myCAF，簇4＝创伤-myCAF，簇5＝IFNγ-iCAF，簇6＝IFNαβ-myCAF和簇7＝acto-myCAF。

最后，发明人想知道这些CAF-S1簇在不同的BC亚型中是否有差异性积累。由于发明人对在任何治疗之前的患者进行分析，因此为scRNA-seq收集的新鲜样本大多从Luminal(Lum)患者收集，HER2和TN BC患者优先在新辅助环境下治疗。因此，在前瞻性群组1中没有HER2患者，只有2名TN BC患者(表1)。尽管如此，在这个数据集中，仍然可以检测出TN BC患者表现出比LumA BC患者更高的iCAF簇比例，而LumA BC患者积累了更多的myCAF簇(在LumA中：iCAF＝43.4％，myCAF＝56.6％；在TN中：iCAF＝57.1％，myCAF＝42.9％；根据Fisher精确试验，P值＝1.29e-64)。由于该数据集中TN BC的数量少，这个问题利用TCGA数据库解决，该数据库容纳了来自大量LumA和TN BC患者的RNA-Seq数据。为此，通过鉴定每个簇中与其它簇相比差异表达的基因，定义了5个最丰富的CAF-S1簇(占测序的CAF-S1细胞的高达91％)的特异性签名(图7B)。因为这些签名也被用于检测黑色素瘤、NSCLC和HNSCC数据中的这些簇(见后面图3和图6)，发明人接下来丢弃了这些签名中黑色素瘤、NSCLC和HNSCC癌细胞也会表达的任何基因，以避免来自癌细胞的任何信号并确保对CAF-S1簇严格特异性的信号(图7B针对CAF-S1簇签名的特异性)。从TCGA RNA-seq数据库(https:// portal.gdc.cancer.gov/)评估CAF-S1簇特异性签名在LumA和TN BC亚型之间的差异表达。这确认了iCAF簇在TN中和myCAF簇在LumA BC中的积累。具体而言，解毒-iCAF和IL-iCAF在TN中的表达比在Lum BC中高，而ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和创伤-myCAF在LumA BC中的表达更高，TN BC中iCAF含量的这种增加与一些TN BC中存在许多TIL的报道相符。总之，对从BC分离的大量FAP⁺CAF-S1成纤维细胞进行scRNA-seq，检测到8个簇表现出不同的签名和在BC亚型中的差异性积累。

通过多色流式细胞术验证BC中的CAF-S1细胞簇

发明人接下来的目标是通过在新鲜的BC样本上使用多色流式细胞术(FACS)来验证CAF-S1簇。通过分析由scRNA-seq定义的CAF-S1之中每个簇的百分比，首先观察到前5个簇占总测序细胞的高达91％。因此，发明人决定将FACS分析集中在这5个最丰富的簇上，并试图鉴定每个簇的表面标志物。利用对CAF-S1簇表达谱的成对比较，用可商购的抗体鉴定了6个表面标志物，并设计了门控策略来鉴定5个最丰富的簇(图8)。发明人试图在一个独立的CAF-S1数据集中验证这6个标志物的特异性。为此，发明人研究了对应于第8名患者的CAF-S1scRNA-seq数据，该数据中通过标记物转移算法成功地转移了簇标记物。事实上，依赖于这6个标志物并基于7名BC患者的门控策略有效地描绘了该独立数据集中5个最丰富的CAF-S1簇。通过这种方式，确认了这些标志物是每个CAF-S1簇特异性的。因此，通过应用以下门控策略的FACS来分析新鲜的BC样品：首先基于区分BC中的myCAF(ANTXR1⁺)成纤维细胞与iCAF(ANTXR1^-)成纤维细胞的ANTXR1蛋白质水平来分离CAF-S1成纤维细胞(分离为CD45^-、EPCAM^-、CD31^-、CD235a^-、FAP^高CD29^中)。接下来，根据SDC1、LAMP5和CD9蛋白质水平来区分ANTXR1⁺(myCAF)CAF-S1簇0(ecm-myCAF)、3(TGFβ-myCAF)和4(创伤-myCAF)。将ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-定义为簇0(ecm-myCAF)、ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-为簇3(TGFβ-myCAF)、和ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺为簇4(创伤-myCAF)。利用GPC3和DLK1标志物分离ANTXR1^-(iCAF)CAF-S1簇1(解毒-iCAF)和2(IL-iCAF)。将ANTXR1^-GPC3⁺DLK1^+/-定义为簇1(解毒-iCAF)；ANTXR1^-GPC3^-DLK1⁺为簇2(IL-iCAF)。将LAMP5、SDC1和CD9阴性的ANTXR1⁺CAF-S1细胞与ANTXR1^-GPC3^-DLK1^-细胞合并，并称为“其它簇”。通过对44个新鲜样本(前瞻性群组2，表S1)应用该门控策略，在BC中验证了这5个最丰富的簇的存在(图2)。由FACS确定的CAF-S1细胞之中每个簇的百分比确认了单细胞结果，包括CAF-S1成纤维细胞之中明显的异质性、和ecm-myCAF为大多数患者中最丰富的群体(图2)。发明者接下来分析了这5个CAF-S1簇在患者间的各自比例之间是否存在任何相关性。ecm-myCAF和TGFβ-myCAF(均为myCAF)的相对丰度关联在一起，解毒-iCAF和IL-iCAF(均为iCAF)也同样。相反，ecm-myCAF和TGFβ-myCAF的比例与解毒-iCAF和IL-iCAF的比例成反相关。另外，创伤-myCAF与解毒-iCAF、IL-iCAF而且与ecm-myCAF负相关，提示这些不同的CAF-S1簇可能在BC中差异性积累，但以一种协调的方式。

跨癌症类型鉴定CAF-S1细胞簇

发明者接下来试图在其它癌症类型中检验CAF-S1细胞簇的存在。为此，分析来自头颈鳞状细胞癌(HNSCC)(Puram SV等，Cell 2017；171(7):1611-24e24)和非小细胞肺癌(NSCLC)(Lambrechts D等，Nat Med 2018；24(8):1277-89)的公开的scRNA-seq数据，因为这两项研究已经分离出足够的CAF来研究簇。这些已发表的研究包括18名HNSCC患者，其中5对配对的原发肿瘤和***转移，总共分析了5902个全细胞(Puram SV等，Cell 2017；171(7):1611-24e24)。此外，在NSCLC群组中，从5个不同的患者收集了超过52 000个全细胞(Lambrechts D等，Nat Med 2018；24(8):1277-89)。在这两项研究中，1422个细胞和1465个细胞在HNSCC和NSCLC群组中分别被注释为CAF。为了严格地对CAF-S1成纤维细胞进行分析，基于分别在CAF-S1(FAP^高MCAM^低)和CAF-S4(FAP^低MCAM^高)中在RNA水平调节的两个标志物FAP和MCAM的表达，将CAF-S1与CAF-S4区分开来。于是，进一步分析了HNSCC中的603个CAF-S1细胞和NSCLC中的959个CAF-S1细胞。通过将参照物(BC)和靶标(HNSCC或NSCLC)数据集混合，比较来自不同癌症类型的CAF-S1细胞之间的相似性。使用来自不同数据集的单个细胞之间的“锚”对应物(“anchor”correspondences)，基于其表达谱的相似性，进行数据集成，如Stuart T等，Cell 2019；177(7):1888-902 e21所述(图3)。发明人使用由每个簇中与其它簇相比差异表达的基因来定义的CAF-S1簇特异性签名(图7B)。值得注意的是，发现了来自BC的CAF-S1簇与来自HNSCC(图3A)或NSCLC(图3B)的CAF-S1簇之间的***性对应。使用特异性签名对簇的可视化确认了能够检测到HNSCC和NSCLC中最丰富的5个簇(图3A、B)。因此，发明人确认了在HNSCC和NSCLC中存在5个最丰富的CAF-S1簇，强调了它们在其它癌症中的关联性。

免疫抑制性环境与特定的CAF-S1簇相关

由于发明人表明CAF-S1成纤维细胞在乳腺癌和卵巢癌中发挥免疫抑制，他们接下来研究了这一功能是否可以由所有CAF-S1簇发挥还是仅限于特定的簇(图4)。发明人首先测试了他们是否能够检测到CAF-S1簇的含量与免疫细胞之间的相关性。为此，对新鲜的BC样本(前瞻性群组2，表1)在CAF-S1簇含量和免疫细胞浸润方面进行了表征，免疫细胞包括CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞。发明人测试了基质细胞和免疫细胞之间的关联，并对表现出至少一种与另一个变量之间的显著相关性的变量进行了分析。通过非监督层次聚类(unsupervised hierarchical clustering)得到的相关矩阵表明，一方面ecm-myCAF和TGFβ-myCAF聚类在一起，另一方面解毒-iCAF和IL-iCAF簇聚类在一起，而创伤-myCAF完全分离，提示这些不同的簇与T细胞差异性相互作用。有趣的是发现ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和创伤-myCAF显示出与T淋巴细胞的特异性关联。事实上，首次观察到在CAF-S1成纤维细胞中ecm-myCAF的比例与CD45⁺造血细胞浸润显著相关(图9)。更具体地，ecm-myCAF的丰度与PD-1⁺、CTLA-4⁺和TIGIT⁺CD4⁺T淋巴细胞的浸润相关，但与CD8⁺T淋巴细胞反相关。同样，虽然没有显示出TGFβ-myCAF含量与CD45⁺造血细胞的任何整体关联，但其丰度与CTLA-4⁺CD4⁺T淋巴细胞的浸润正相关并且与CD8⁺T淋巴细胞负相关。因此，这些数据表明，ecm-myCAF和TGFβ-myCAF的丰度与富含Treg的免疫抑制性环境有关。与ecm-myCAF和TGFβ-myCAF簇相反，解毒-iCAF和IL-iCAF的丰度与CD8⁺T细胞浸润相关。创伤-myCAF簇与CD45⁺细胞之中的T淋巴细胞整体相关(图9)并与CTLA-4⁺、TIGIT⁺、PD-1⁺和NKG2A⁺CD4⁺T淋巴细胞反相关。创伤-myCAF的富集也与CTLA-4⁺CD8⁺、TIGIT CD8⁺、CD244⁺CD8⁺、CD244⁺NK、衰竭标志物反相关，提示该簇与高T淋巴细胞浸润和免疫保护性环境的整体关联。重要的是，在Costa A等，Cancer Cell2018；33(3):463-79e10、Givel等，Nat Commun 2018；9(1):1056和Kieffer等，CancerDiscov.2020；10(9):1330-1351中发表的CAF-S1签名无法特异性鉴定与免疫疗法反应有关的CAF-S1免疫抑制性簇(即ECM-myCAF、TGFβ-myCAF和创伤-myCAF)。这些簇是ANTXR1+。相反，我们证明最具差异性的CAF-S1基因并未在这些簇中特异表达(图11)，提示在Top CAF-S1基因中将ANTXR1鉴定为这些簇的标志物不可能是碰巧的。

为了在独立和大的BC患者群组中验证这些数据，接下来测试了CAF-S1簇和公开可用的TCGA数据库中T细胞签名之间的关联。来自TCGA数据库的RNAseq数据能够确认，ecm-myCAF和TGFβ-myCAF簇的表达与作为主要Treg标志物之一的一种FOXP3(图4B)的表达正相关。另外，虽然创伤-myCAF没有显示出与FOXP3的真正关联，但解毒-iCAF和IL-iCAF簇与FOXP3负相关(图4B)。与这些数据一致，观察到T细胞细胞溶解指数与解毒-iCAF和IL-iCAF簇之间的正相关，但与ecm-myCAF、TGFβ-myCAF或创伤-myCAF则没有(图4C)。综上所述，虽然解毒-iCAF和IL-iCAF与免疫活性环境相关，但ecm-myCA和TGFβ-myCAF都与免疫抑制性环境有关，免疫抑制性环境缺乏CD8⁺T淋巴细胞且富含表达高水平免疫检查点、包括PD-1和CTLA-4的CD4⁺T淋巴细胞。

ecm-myCAF和TGFβ-myCAF与PD-1⁺和CTLA-4⁺Treg之间的正反馈回路

如上所述，发明人观察到ecm-myCAF和TGFβ-myCAF的丰度、而不是解毒-iCAF和IL-iCAF的丰度与BC中PD-1⁺和/或CTLA-4⁺CD4⁺T淋巴细胞的丰度相关。发明人研究了CAF-S1簇在产生富含CD4⁺CD25⁺的免疫抑制性环境中的作用。因此，他们建立了CAF-S1簇的原代培养，以便进行体外功能测定。尽管他们没有实现在培养中建立每一个CAF-S1簇，但他们通过应用两种不同的方法成功地分离了ecm-myCAF和iCAF簇，这两种方法即：(1)让CAF-S1成纤维细胞直接从接种在塑料培养皿中的BC样本中逸出和播散，和(2)通过FACS分选FAP^高CD29^中细胞并以在塑料培养皿中的培养来扩增它们。在几周期间扩增后，比较这些不同的细胞在相同培养条件下、即与CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞共培养以进行功能测定(见下文)相容的条件下的身份。观察到通过播散获得的CAF-S1表达高水平的myCAF基因，而通过分选分离的CAF-S1表达高水平的iCAF基因。发明人因此应用了从scRNA-seq数据建立的簇特异性签名(图7B)，并发现播散的CAF-S1成纤维细胞富含ecm-myCAF，而分选的CAF-S1富含解毒-iCAF、IL-iCAF和IFN-iCAF簇(见方法部分#从BC分离的CAF-S1原代细胞系的RNA测序)。发明人以前证明，总CAF-S1亚群对CD4⁺CD25^-T细胞没有直接效应，但增加CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞之中FOXP3⁺Treg的比例。因为BC中ecm-myCAF和TGFβ-myCAF的含量与富含CD4⁺的免疫抑制性微环境有关，而iCAF簇则无关，因此，发明人使用如Costa A等，Cancer Cell 2018；33(3):463-79 e10和Givel等，Nat Commun 2018；9(1):1056doi 10.1038/s41467-018-03348-z.)以前进行的功能测定，比较了这些myCAF和iCAF簇对CD4⁺CD25⁺T细胞的功能。

首先，体外测试了myCAF和iCAF簇对CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T淋巴细胞含量的影响(图5A)。ecm-myCAF增加CD4⁺CD25⁺群体之中FOXP3⁺T细胞的百分比并提高这些T细胞中的FOXP3蛋白水平(图5A)。相反，iCAF簇对CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T淋巴细胞百分比或对FOXP3蛋白水平均无影响(图5A)。发明人还测试了培养对正常成纤维细胞的身份和免疫抑制活性的影响。播散时从健康组织分离的成纤维细胞是FAP^阴性-低的并且在早期时间点没有免疫抑制性活性，但在以后传代时变成FAP^阳性-高和免疫抑制性的，提示将CAF长期维持在塑料培养皿上可以激活它们。基于ecm-myCAF能够增加CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T淋巴细胞，发明人接下来比较了CAF-S1簇调节CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T淋巴细胞上PD-1⁺、CTLA-4⁺、TIGIT⁺、TIM3⁺和LAG3⁺的比例的能力，考虑的是阳性细胞的百分比和这些免疫检查点的表面蛋白水平(图5B-F)。ecm-myCAF显著增加PD-1⁺和CTLA-4⁺CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T淋巴细胞的百分比以及它们表面上的免疫检查点水平(图5B、C)。与ecm-myCAF相反，iCAF簇既不影响PD-1⁺和CTLA-4⁺T细胞的百分比，也不影响CTLA-4蛋白水平(图5B,C)。此外，虽然iCAF簇增加了PD-1蛋白水平，但该效应的效率比ecm-myCAF低。myCAF和iCAF簇二者均增加CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺TIGIT⁺细胞的比例(图5D)，而它们对TIM3⁺和LAG3⁺T细胞没有效应(图5E、F)。因此，与在BC中观察到的ecm-myCAF与PD-1⁺和CTLA-4⁺CD4⁺T淋巴细胞之间的相关性一致，在此表明，来自ecm-myCAF的CAF-S1通过增强CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T淋巴细胞表面上的PD-1和CTLA-4免疫检查点水平而具有对Treg的直接作用，而iCAF簇对这些细胞没有效应或效应甚微。最后，观察到与ecm-myCAF共培养时CD4⁺CD25⁺T细胞表面上免疫检查点的上调在细胞内也检测到(图10A)，提示ecm-myCAF增加T细胞中的总蛋白水平。此外，发明人发现，在与ecm-myCAF共培养后，CD4⁺CD25⁺T细胞中FOXP3、CTLA-4和TIGIT的表达也在mRNA水平上调(图10B)，PD-1RNA在体外T细胞中几乎检测不到。此外，发明人还观察到，在与ecm-myCAF共同培养时，CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞中NFAT和STAT家族成员的mRNA水平也升高(图10C)。由于NFAT和STAT是公知的T细胞中免疫检查点的转录调节因子，这些数据表明ecm-myCAF可能通过激活NFAT/STAT信号传导通路来促进CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞中免疫检查点在RNA水平的上调。

考虑到CAF-S1簇对Treg的影响，发明人接下来想知道T淋巴细胞是否继而可以调节CAF-S1簇身份。发明人因此评估了CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞共培养是否对CAF-S1成纤维细胞表面上的标志物簇水平有任何影响。共培养时，为了避免由T细胞产生的任何污染，通过FACS分离CAF-S1并对在其表面表达的簇标志物进行分析。观察到CD4⁺CD25⁺T细胞的共培养显著增加了ecm-myCAF成纤维细胞表面上TGFβ-myCAF特异性标志物LAMP5的表达(图5G)，从而提示在与CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞共培养时TGFβ-myCAF含量增加。该效应仅在myCAF中检测到，在iCAF成纤维细胞中则没有(图5G)，如考虑到TGFβ-myCAF和ecm-myCAF CAF-S1成纤维细胞属于myCAF亚组所预期的。与该观察结果一致，在与CD4⁺CD25⁺T细胞共培养时，ecm-myCAF成纤维细胞中的ANTXR1蛋白水平也显示出增加的趋势(尽管没有达到显著性)，而该蛋白水平在iCAF细胞中严格保持不变和低下(图5G)。相当意外的是，IL-iCAF的标志物DLK1在共培养时也增加，提示ecm-myCAF与IL-iCAF之间潜在的可塑性。相反，其它标志物在共培养时没有显示出任何显著变化，并且保持高(SDC1)或低(GPC3和CD9)，正如基于各自的簇身份所预期的那样(图5G)，这些观察结果提示，CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞可能促进ecm-myCAF(ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-CD9^+/-)转化为TGFβ-myCAF(ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-CD9^+/-)，这两个簇都是myCAF。总的来说，发明人发现ecm-myCAF可以直接影响FOXP3⁺T淋巴细胞表面上的PD-1和CTLA-4的蛋白水平。反过来，Treg可以促进ecm-myCAF转化为TGFβ-myCAF，从而在这两个簇与CD4⁺CD25⁺PD-1⁺或CTLA-4⁺T细胞之间建立正反馈回路，这可以解释在BC中观察到的正相关性。

ecm-myCAF和TGFβ-myCAF与对免疫疗法的原发性抵抗有关

鉴于特定的CAF-S1簇对Treg上的PD-1和CTLA-4蛋白水平的直接效应，发明人接下来想知道一些CAF-S1簇是否可能与免疫疗法抵抗有关。由于他们得不到来自免疫疗法治疗的BC的数据，他们利用了来自用抗PD-1(帕博利珠单抗)疗法治疗的转移性黑色素瘤患者的公开可得的数据(Hugo W等，Cell 2016；165(1):35-44)，抗PD-1疗法彻底变革了黑色素瘤治疗。如前述研究中的定义，如果患者表现出进展性疾病，发明人就将他们视为对抗PD-1“无反应者”，而在完全或部分反应的情况下，视为“反应者”。通过进行基因集富集分析，首先观察到，在诊断时，在无反应患者的肿瘤中显著富含CAF-S1特异性基因的表达，而不是正常成纤维细胞含量。使用CAF-S1簇特异性签名，发明人观察到，与反应者相比，无反应者中富含ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和创伤-myCAF基因表达，而不富含解毒-iCAF、IL-iCAF和IFN-iCAF簇(图6A)。接下来，他们比较了反应者对比无反应者每个CAF-S1簇的含量。他们确认，ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和创伤-myCAF表达在无反应者中显著高于反应者，而解毒-iCAF和IFN-iCAF表达在这两个患者亚组之间相似(图6B)。此外，正常的成纤维细胞含量、或是在Rooney等，Cell 2015；160(1-2):48-61中定义细胞溶解指数，在反应者和无反应者之间均不同(图6C、D)。与这些观察结果一致的是，相互分析(reciprocal analysis)(即根据CAF-S1簇的低或高表达来确定反应者和无反应者的数量)确认，在诊断时，无反应者的数量与显示ecm-myCAF、TGFβ-myCAF或创伤-myCAF高表达的肿瘤显著相关，而其它CAF-S1簇、总体CAF含量或细胞溶解指数并不能提供患者对免疫治疗的反应的信息(图6E-G)。总之，这些数据表明，3个特定的CAF-S1簇(ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和创伤-myCAF)在诊断时指示了转移性黑色素瘤患者的抗PD-1反应，而其它CAF-S1簇(解毒-iCAF、IL-iCAF和IFN-iCAF)、总CAF含量或细胞溶解指数则不能。最后，发明人试图验证CAF-S1簇、特别是ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和创伤-myCAF对一系列转移性NSCLC患者的原发免疫疗法抵抗的影响，转移性NSCLC是另一个最近确定的免疫疗法临床指征(在此在二线或三线环境中用纳武单抗进行治疗，NSCLC群组4的详细说明见表2)。与黑色素瘤相似，发明人验证了在诊断时取样的肿瘤样本中评估的CAF-S1签名在无反应患者中显著富集。相反，反应者中的正常成纤维细胞含量高于无反应者，提示无反应者中显著富含CAF-S1。重要的是，发明者确认，ecm-myCAF、TGFβ-myCAF和创伤-myCAF与无反应的NSCLC患者有关，而解毒-iCAF、IL-iCAF和IFNγ-iCAF簇则没有(图6I)。总而言之，与解毒-iCAF、IL-iCAF和IFNγ-iCAF簇相反，诊断时ecm-myCAF和TGFβ-myCAF的丰度在黑色素瘤和NSCLC中都与对免疫疗法的抵抗有关，这与它们增加Treg中PD-1⁺和CTLA-4⁺蛋白水平的能力一致。

材料和方法

患者群组

BC患者：在此开展的研究是基于从组织病理学分析后可利用的而不是诊断所需的手术剩余物提取的样本。对临床实践没有干扰。原发肿瘤样本的分析是根据对参与生物医学研究人员的保护的相关国家法律进行的。所有在居里研究所(Institut Curie)住院的患者(BC患者)都收到了一本欢迎小册子，解释了他们的样本可能被用于研究目的。因此，所有纳入研究的患者都得到他们的咨询肿瘤医生的通知，即通过标准临床实践收集的生物样本可能用于研究目的，而且如果他们愿意的话，他们可以表示反对用于这样的用途。在患者可以口头或书面表达拒绝的情况下，剩余的肿瘤样本不纳入研究。由F.Mechta-Grigoriou实验室分析肿瘤微环境的人体实验程序得到了居里医院研究所集团(2014年2月12日批准)和CNIL的机构审查委员会和伦理委员会的批准(法国国家信息和自由委员会(CommissionNationale de l’informatique et des Libertés))(批准号：1674356，2013年3月30日交付)。“生物资源中心(Biological Resource Centre)”(BRC)是由A.Vincent-Salomon博士领导的诊断和诊疗医学部(Diagnostic and Theragnostic Medicine Department)的病理部门的一部分。根据法国法律，BRC有权储存和管理人类生物样本。BRC已经声明了定义的样本收集，在获得患者同意书时持续增长(声明编号#DC-2008-57)。BRC遵循所有目前要求的国家和国际伦理规则，包括赫尔辛基宣言。BRC还获得了AFNOR NFS-96-900质量标签的认证(已续期，目前有效期至2021年)。Luminal(Lum)肿瘤通过ER(***受体)和/或PR(孕激素受体)免疫染色阳性来定义。用于定义激素受体阳性的界限是染色细胞的10％。Ki67(增殖)评分进一步区分Lum A与Lum B(低于15％：Lum A，高于：Lum B)。使用ASCO指南，根据ERBB2免疫染色来定义HER2扩增的癌。TN免疫表型定义如下：表达至少一种以下标志物的ER^-PR^-ERBB2^-：KRT5/6⁺或EGF-R⁺。

NSCLC患者：NSCLC样本来自Bichat医院病理部门储存的例行诊断样本，所述样本来自医学博士Pr.G.Zalcman领导的Bichat医院胸部肿瘤学部门中通过免疫肿瘤药物治疗的患者。按照法国观察性临床研究的监管规则，去标识化的临床数据来自Bichat医院(地区卫生机构授权编号17-1381)的临床研究中心(由Pr.G.Zalcman领导)CIC-1425/CLIP₂的肺癌患者胸部肿瘤学数据库的一部分。根据注册的免疫肿瘤药物，患者在进展后基于化疗的一线或二线接受检查点抑制剂。在本研究阶段期间，抗PD-1纳武单抗单克隆抗体是在这样的环境中使用最频繁的药物。由每周多学科肿瘤委员会，包括胸科专业放射医生、胸科肿瘤医生和肺科医生通过全身CT扫描，每8到12周一次评估免疫-肿瘤学治疗的疗效，根据RECIST v.1.1标准，定义目标反应者(OR)、病情稳定的患者(SD)和肿瘤体积增加20％以上且无任何临床效益的显示肿瘤进展的患者(Progr)。本研究使用在4个月时观察到的最佳反应状态。因在4个月评价时的临床效益而给予超过6个月免疫-肿瘤学药物且没有任何进展性疾病(则为长期SD)的标准，这样的SD患者归入本研究的反应患者组中。记录CT扫描评估的进展的日期。一些患者表现出早期临床进展，需要早期(在8周前)进行CT扫描评估。在这些系列中，根据上述标准。有22例反应患者，48例进展患者，接受的治疗均少于4个月。进展的日期保留为CT扫描显示RECIST进展的日期。***性记录死亡的日期和原因，或有生命状态的最后消息的日期。登记进展后的二线或三线治疗。根据进展后治疗，没有失去平衡。在Leica Bond平台上，使用Cell Signaling Technology E1L3N可商购的克隆，由A.G.在4μm石蜡包埋的切片上进行PD-L1染色和解释，所述切片来自诊断、治疗前活检样本，包含至少200个肿瘤细胞。除5个患者(残留的病理块中的肿瘤细胞少于200个)外，所有患者均进行PD-L1免疫组织化学分析。

单细胞水平的CAF-S1 RNA测序

从BC中分离CAF-S1：CAF-S1成纤维细胞是从总共8例原发BC(任何治疗前的手术剩余物)中分离出来的(前瞻性群组的详细信息见表S1)。对7个BC进行了初步研究。另外，还添加了另一个BC样本，用于使用Seurat R程序包中的标记物转移算法来验证CAF-S1簇。使用BDFACS ARIA III^TM分选机(BD Biosciences)从BC分离CAF-S1成纤维细胞。新鲜的人BC原发肿瘤在病理学家对手术标本的宏观检查并选择感兴趣的区域后，直接从手术室收集。将样本切成小块(约1mm³)并在37℃下伴随振荡(180rpm)在补充有150μg/ml释放酶(Roche#05401020001)和DNase I(Roche#11284932001)的CO₂-非依赖性培养基(Gibco#18045-054)中消化40分钟(min)时间。然后细胞通过40μm细胞滤网(Fisher Scientific#223635447)过滤并以在50μl中5×10⁵和10⁶个细胞之间的最终浓度在PBS+溶液(PBS，Gibco#14190；EDTA2mM，Gibco#15575；人血清1％，BioWest#S4190-100)中重悬。为了分离CAF-S1成纤维细胞，发明人首先应用选择来排除上皮细胞(EPCAM⁺)、造血细胞(CD45⁺)、内皮细胞(CD31⁺)和CD235a⁺(血红)细胞，并接下来使用CAF-S1标志物(FAP和CD29)。为此，然后将悬浮液中的细胞用用于流式细胞仪细胞分选的抗体混合物染色，所述抗体混合物含有抗EpCAM-BV605(BioLegend，#324224)、抗CD31-PECy7(BioLegend，#303118)、抗CD45-APC-Cy7(BDBiosciences，#BD-557833)、抗CD235a-PerCP/Cy5.5(Biolegend，#349109)、抗CD29-AlexaFluor 700(BioLegend，#303020)、抗FAP-APC(第一抗体，R&D Systems，#MAB3715)，以便进行单细胞RNA测序。除FAP外的所有抗体购买时均已与荧光染料缀合。抗FAP抗体用荧光染料Zenon APC小鼠IgG1标记试剂盒(ThermoFisher Scientific，#Z25051)缀合。所使用的各CAF标志物的同型对照抗体为：同型抗CD29(BioLegend,#400144)和同型抗FAP(第一抗体，R&D Systems，#MAB002)。

在PBS+溶液中在室温下15分钟期间解离BC肿瘤样本后，立即用所述抗体混合物进行细胞悬液染色。在临流式细胞术分选之前，添加2.5μg/ml DAPI(ThermoFisherscientific，#D1306)。在用于细胞分选的BDFACS ARIA III^TM分选器(BD biosciences)上采集信号。记录了至少5×10⁵个事件。使用单染对用于每种抗体的抗小鼠IgG和阴性对照珠子(BD biosciences，#552843)进行补偿。数据分析使用X10.0.7r2版FlowJo进行。细胞首先基于前向(FSC-A)和侧向(SSC-A)散射体(分别测量细胞大小和粒度)进行门控，以排除碎片。基于死细胞对DAPI的阳性染色来排除死细胞。接下来基于SSC-A对比SSC-W参数来选择单细胞。门控包括EPCAM^-、CD45^-、CD31^-、CD235a^-细胞，以排除上皮细胞(EPCAM⁺)、造血细胞(CD45⁺)、内皮细胞(CD31⁺)和血红细胞(CD235a⁺)。

单细胞CAF-S1 RNA测序：分离后，将CAF-S1细胞直接收集到预先涂有补充了10％FBS(Biosera，#1003/500)的DMEM(GE Life Sciences，#SH30243.01)的无核糖核酸酶的试管(ThermoFisher Scientific，#AM12450)中。每个样本收集至少6 000个细胞。在这些条件下，检查对照样品中的细胞浓度，为200 000个细胞/毫升。使用来自10X Genomics的Chromium^TM***用以下试剂盒进行单细胞捕获、裂解和cDNA文库构建：Chromium^TM SingleCell 3’Library&Gel Bead Kit v2试剂盒(10X Genomics，#120237)和Chromium^TM SingleCell A Chip试剂盒(10X Genomics，#1000009)。根据制造商的说明书进行在乳剂中生成凝胶珠(GEM)、编码、GEM-RT(逆转录)后清理和cDNA扩增。靶细胞回收为每个样本3 000个细胞，以获取足够的细胞，同时保持低的多细胞体率。将细胞相应地加载到Chromium Singlecell A芯片上，进行12个循环以扩增cDNA。在Agilent 2100生物分析仪上用Agilent高灵敏度DNA试剂盒(Agilent，#5067-4626)检查cDNA的质量和量，并按照10X Genomics方案构建文库。接下来在Illumina HiSeq(对患者P5-7)和NovaSeq(对患者P1-4)上运行文库，每个细胞的测序深度为50 000个读数。使用2.1.1版10X Cell Ranger流水线进行原始数据处理，包括原始碱基识别(BCL)文件去多重化为FASTQ文件、比对、过滤、编码和唯一分子识别符(UMI)计数。将读数与智人(人类)基因组组装GRCh38(hg38)进行比对。

scRNA-seq数据处理

scRNAseq：原始数据的预处理最初使用Cell Ranger软件流水线(2.1.1版)进行。这一步骤包括将原始碱基识别(BCL)文件去多重化为FASTQ文件、使用STAR对人类基因组组装GRCh38进行读数比对、以及唯一分子识别符(UMI)的计数。使用Seurat R程序包(3.0.0版)(Butler等，Nat Biotechnol 2018；36(5):411-2)，分析来自7名BC患者(对应于7次测序运行，患者1至7)的第一组18 805个CAF-S1细胞。来自一名BC患者(患者8)的第二组1646个CAF-S1细胞用于验证(参见#标记物转移)，并使用相同的方法进行分析。

质量控制：作为质量控制步骤，基于在每个患者的每个细胞中检测到的独特基因的分布(非零计数)，首先过滤出低质量细胞、空滴和多细胞体俘获物。检测到少于200个基因和多于6000个基因的细胞(对于患者1)、检测到多于5000个基因的细胞(对于患者3、5和6)、检测到多于4500个基因的细胞(对于患者2、7和8)或检测到多于4000个基因的细胞(对于患者4)被排除在外。还基于表达的线粒体基因的分数来绘制细胞的分布。线粒体基因的分数高于5％的细胞被丢弃，以消除濒死细胞或广泛线粒体污染的低质量细胞。对于每个患者，使用Seurat的PercentageFeatureSet函数以论证模式＝“^MT-”来计算线粒体分数。遵循这些QC标准，18 296个CAF-S1细胞(患者1＝1825个细胞；患者2＝3300个细胞；患者3＝2810个细胞；患者4＝3153个细胞；患者5＝2486个细胞；患者6＝3179个细胞和患者7＝1543个细胞)以及1582个CAF-S1细胞(患者8)最终分别保存在第一和第二数据集中用于下游分析。

归一化和数据集成：在使用带有默认参数的NormarizeData函数对每个细胞进行文库大小归一化之后，使用Seurat函数FindIntegrationAnchors和IntegrateData完成来自第一数据集的7个BC scRNA-Seq的集成。使用30个维度进行典型相关分析(CCA)，30个主成分(PC)用于IntegrateData函数的加权过程。使用ScaleData函数对数据进行缩放，并使用变量‘nUMI’和‘percent.mt’进行回归。相同的参数用于第二个数据集的归一化。

聚类和数据可视化：使用默认参数运行PCA降维。使用以函数JackStraw和ScoreJackStraw实现的JackStraw程序来评估所包含的成分(PC)的数量。保存了30个PC。使用FindNeighbours(k＝20)和FindClusters函数(res＝0.35)，用基于图的聚类方法对来自第一个数据集的细胞进行聚类。在该分辨率下获得了10个CAF-S1簇。为了数据的可视化，使用Seurat的RunUMAP函数应用了非线性降维技术UMAP。

差异基因表达和信号传导通路的分析：使用成对差异分析，鉴定了第一个数据集的10个簇的每个簇中特异性上调的基因。虽然每个成对组合中差异表达的基因的中位数为126个基因，但2个组合提供的差异表达基因数量非常有限，簇0和簇5之间只有9个基因，簇3和簇6之间只有22个基因。还使用在10个初始簇中的每个簇中显著上调的所有基因，用Metascape工具(http://metascape.org)确定了每个簇的生物学含义(一个簇对比所有其它簇；函数FindAllMarkers有以下参数：logfc.threshold＝0.25，检验＝用于Wilcoxon秩和检验的Wilcox检验)。与成对分析一致，一方面为簇0/5和另一方面为簇3/6鉴定的生物路径是冗余的，因此合并。于是将簇0和5定义为簇0/ecm-myCAF，并将簇3和6定义为簇3/TGFβ-myCAF，从而最终鉴定8个生物学上不同的CAF-S1簇。

CAF-S1、CAF-S1簇和正常成纤维细胞的基因签名：通过在簇0至5之间执行差异分析(Wilcoxon秩和检验)来定义CAF-S1簇0至5的特异性基因签名。选择经调整的P值<0.05的簇之间差异表达基因(一个簇相对于所有其它簇)。由于这些签名被用来检测来自不同癌症类型包括黑色素瘤、NSCLC和HNSCC的单细胞和整体的RNA-seq数据中的CAF-S1簇，发明人通过使用来自黑色素瘤(27)、NSCLC(31)和HNSCC(30)的肿瘤细胞的scRNA-seq数据排除了在肿瘤细胞中表达的基因。发明人定义，如果在任何前述scRNA-seq数据中超过10％的肿瘤细胞表现出高于1的表达水平，则为在肿瘤细胞中表达的基因(并因此从CAF-S1簇签名中排除)。CAF-S1整体签名(global signature)首先发表在Costa A等，Cancer Cell 2018；33(3):463-79e10中，并提交给相同类型的分析，排除在肿瘤细胞中检测到的基因，从而适合于整体分析。前100个最显著的基因被认为是CAF-S1特异性签名。与从BC分离的CAF-S1成纤维细胞相比，从健康的瘤旁组织分离的正常成纤维细胞(FAP^阴性CD29^中SMA^阴性)中显著上调的基因定义了正常成纤维细胞签名。遵循与上面描述的相同的策略，在肿瘤细胞中表达的基因被排除在签名之外。细胞溶解指数被定义为颗粒酶A(GZMA)和穿孔素(PRF1)基因表达的几何平均值，如Rooney等，Cell2015；160(1-2):48-61所述。

标记物转移

为了验证在第一数据集中确定的CAF-S1簇，使用Seurat流水线分析了对应于在质量控制后从附加的BC样本收集的1582个CAF-S1成纤维细胞的另一数据集。使用函数FindTransferAnchors和TransferData来施行在Stuart T等，Cell 2019；177(7):1888-902e21中描述并在Seurat V3.0 R程序包中实现的标记物转移(Label Transfer)算法。18296个CAF-S1细胞的第一数据集作为参比，以1582个CAF-S1细胞的第二数据集用作查询。在寻找锚时，通过将PCA从参比投射到查询上来进行降维。使用了30个维度。

来自BC、HNSCC和NSCLC的单细胞数据集成

BC与HNSCC或BC与NSCLC单细胞数据之间的集成使用Stuart T等，Cell 2019；177(7):1888-902 e21中所述并在Seurat V3.0 R程序包中实现的方法完成。简而言之，鉴定跨数据集的单细胞之间的细胞成对对应物(称为“锚”)允许将数据集转换到共享空间中。使用对角化典型对应分析(diagonalized Canonical Correspondence Analysis)(CCA)对这两个数据集进行降维，并在鉴定锚之前对典型相关向量施行L2归一化。Seurat V3.0程序包中的FindIntegrationAnchors和IntegrateData函数使用缺省参数。

5个最丰富的CAF-S1簇和免疫细胞的流式细胞术分析

将44个BC切成小碎片并在补充有5％胎牛血清(FBS，PAA，#A11-151)、2mg/ml胶原酶I(Sigma-Aldrich，#C0130)、2mg/ml透明质酸酶(Sigma-Aldrich，#H3506)和25mg/mlDNase I(Roche，#11284932001)的CO₂-非依赖性培养基(Gibco，#18045-054)中在37℃下伴随振荡(180rpm)消化45分钟。在组织消化后，使用细胞滤网(40mm，Fischer Scientific，#223635447)过滤细胞并使用补充有2mM EDTA(Gibco，#15575)和1％人血清(BioWest，#S4190-100)的PBS溶液(Gibco，#14190)洗涤。然后将细胞分离到两个组，分别用于分析CAF-S1簇面板(panel)和免疫细胞面板。

CAF-S1簇面板：细胞在PBS中用Live Dead NIR(1:1000，BD Bioscience#565388)染色20分钟。然后洗涤细胞并用抗体鸡尾酒染色45分钟，所述抗体鸡尾酒含有抗CD235a-APC-Cy7(1:20，BioLegend，#349115)、抗EpCAM-BV605(1:25，Biolegend，#324224)、抗CD31-PECy7(1:50，BioLegend，#303118)、抗CD45-BUV395(1:25，BD Biosciences，#BD-563792)、抗CD29-Alexa Fluor 700(1:50，BioLegend，#303020)使用荧光染料Zenon APC MouseIgG1标记试剂盒(Thermo Fisher Scientific，#Z-25051)偶联的抗FAP(1:100，R&DSystems，#MAB3715)、抗ANTXR1-AF405(1:33，Novus Biological，#NB-100-56585)、抗LAMP5-PE(1:10，Miltenyi Biotech，#130-109-156)、抗SDC1-BUV737(1:25，BDBiosciences，#BD-564393)、抗GPC3-AF594(1:20，RnD，#FAB2119T,100UG)、抗DLK1-AF488(1:25，RnD，#FAB1144G-100)和抗CD9-BV711(1:200，BD Biosciences，#BD-743050)。所使用的针对每个CAF簇标志物的同型对照抗体是：小鼠IgG1同型对照-BV711(1:200，BDBioscience，#563044)、小鼠IgG1同型对照-AF405(1:3，Novus Biological，#IC002V)、小鼠IgG1同型对照-BUV737(1:25，BD Bioscience，#564299)、小鼠IgG2B同型对照-AF488(1:12.5，RnD，#IC0041G)、小鼠IgG2A同型对照-AF594(1:5，RnD，#IC003T)、REA对照-PE(1:10，Miltenyi Biotech，#130-113-462)。然后将细胞洗涤并在同一天使用LSR FORTESSA分析仪(BD Bioscience)获取，或在4％多聚甲醛(PFA，Electron Microscopy Sciences，#15710)中固定20分钟、然后洗涤并在PBS+溶液中保存过夜并在第二天获取。记录至少5×10⁵个事件。使用单染对用于每种抗体的抗小鼠IgG和阴性对照珠子(BD bioscience#552843)和用于Live/Dead染色的细胞进行补偿。使用10.4.2版FlowJo(LLC，美国)进行数据分析。细胞首先基于前向(FSC-A)和侧向(SSC-A)散射体(分别测量细胞大小和粒度)进行门控，以排除碎片。基于对Live/Dead NIR和CD235a的阳性染色来分别排除死细胞和血红细胞。接下来基于SSC-H对比SSC-A参数来选择单细胞。然后将细胞针对EPCAM^-、CD45^-、CD31^-细胞进行门控，以排除上皮细胞(EPCAM⁺)、造血细胞(CD45⁺)和内皮细胞(CD31⁺)。根据FAP和CD29，将DAPI^-、EPCAM^-、CD45^-、CD31^-细胞分离在4个子集(CAF-S1至CAF-S4)。CAF-S1子集首先根据ANTXR1进行门控。ANTXR1⁺细胞接下来根据SDC1和LAMP5进行门控。将ANTXR1⁺SDC1⁺LAMP5^-定义为簇0/ecm-myCAF，ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5⁺为簇3/TGFβ-myCAF。ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-根据CD9进行门控，并将ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺定义为簇4/创伤-myCAF。ANTXR1^-/低细胞根据DLK1和GPC3进行门控。将簇1/解毒-iCAF定义为ANTXR1^-GPC3⁺DLK1^-/+和簇2为ANTXR1^-GPC3^-DLK1⁺。将ANTXR1^-GPC3^-DLK1^-和ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9^-指定为其它簇。

免疫面板：在44份BC样本中分析了CAF-S1簇，其中37份同时对免疫内容物进行了表征。对live dead阴性级分进行细胞类型分析，定义为造血细胞(CD45⁺)、CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞；B淋巴细胞(CD45⁺CD14^-CD3^-CD19⁺)；NK(CD45⁺CD14^-CD3^-CD56⁺)，细胞毒性NK(CD56⁺CD16⁺)和非细胞毒性NK(CD56⁺CD16^-)；(CD45⁺CD14^-CD3⁺CD4⁺/CD8⁺)和骨髓性细胞(CD45⁺CD14⁺)。对每个已鉴定的群体，还评估了下列检查点的阳性细胞百分比：PD-1，CTLA-4，NKG2A，TIGIT，CD244，CD158K，CD69，CD161。将细胞在PBS中用Live dead(1:1000，Thermo FisherScientific，#L34955)染色20分钟。然后洗涤细胞并用抗体鸡尾酒染色45分钟，所述抗体鸡尾酒含有抗CD45-APC-cy7(1:20，BD Biosciences，#BD-557833)、抗CD14-BV510(1:50，BDBioscience，#563079)、抗CD56-BUV395(1:25，BD Bioscience，#563554)、抗CD16-BV650(1:25，BD Bioscience，#563692)、抗PD-1-BUV 737(1:20，BD Bioscience，#565299)、抗CD3-AF700(1:25，BD Bioscience，#557943)、抗NKG2A-BV786(1:20，BD Bioscience，#747917)、抗TIGIT-BV605(1:20，BD Bioscience，#747841)、抗CD158K-PE(1:10，Miltenyi Biotech，#130-095-205)、抗CD244-FITC(1:10，BD Bioscience，#550815)、抗CTLA-4-Pe-cy5(1:10，BDBioscience，#555854)、抗CD19-Percp-cy5.5(1:20，BD Bioscience，#561295)、抗CD4 APC(1:25，MiltenyiBiotec，#130-092-374)、抗CD8-PE-TexasRred(1:100，LifeTechnologies，#MHCD0817)、抗CD69-BV710(1:25，BD Bioscience，#563836)、抗CD161-PE-VIO770(1:100，Miltenyi，#130-113-597)。然后将细胞洗涤并在同一天使用LSR FORTESSA分析仪(BD Bioscience)获取，或在4％多聚甲醛(PFA，Electron Microscopy Sciences，#15710)中固定20分钟、然后洗涤并在PBS+溶液中保存过夜并在第二天获取。记录至少5×10⁵个事件。使用单染对用于每种抗体的抗小鼠IgG和阴性对照珠子(BD bioscience，#552843)和用于Live/Dead染色的细胞进行补偿。使用10.4.2版FlowJo(LLC，美国)进行数据分析。

从BC分离的CAF-S1原代细胞系的RNA测序

用Qiagen miRNeasy试剂盒(QIGEN，#217004)，根据制造商的说明书从CAF-S1成纤维细胞中提取RNA。在此研究的7个CAF-S1原代细胞系中，有3个是通过分选分离的，4个是通过播散分离的。这7个CAF-S1原代细胞系从7个不同的BC患者中产生。使用Agilent RNA6000Pico试剂盒(Agilent Technologies，#5067-1513)分析RNA完整性和质量。使用TruSeqStranded mRNA试剂盒(Illumina，#20020594)制备cDNA文库，然后在NovaSeq(Illumina)上测序。读数在人类参考基因组(hg38；Gencode Release 26)上作图，并使用STAR(2.5.3a版)用下列参数进行定量：“outFilterMultimapNmax＝20；alignSJoverhangMin＝8；alignSJDBoverhangMin＝1；outFilterMismatchNmax＝999；outFilterMismatchNoverLmax＝0.04；alignIntronMin＝20；alignIntronMax＝1000000；alignMatesGapMax＝1000000；outMultimapperOrder＝Random”。只有在所有样本的至少5％中有一个读数的基因被保留下来供进一步分析。用DESeq2 R程序包进行归一化并对原始读数矩阵进行log2变换。为了鉴定CAF-S1原代细胞系的身份，通过组成iCAF/myCAF签名(如Ohlund等，J Exp Med2017；214(3):579-96中定义)基因的表达平均值来计算每个CAF-S1簇签名的分数。P值来自DESeq2分析。

功能测定

CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞的分离：通过与居里研究所(法国巴黎)的协定，从巴黎“国家血液服务机构(

du Sang)”的Saint-Antoine血库获得的健康供体的外周血中分离CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞。简而言之，外周血单核细胞(PBMC)是使用Lymphoprep(Stemcell，#07861)分离的，如以前Costa A等，Cancer Cell2018；33(3):463-79e10中所述。通过使用磁性细胞分离(MACS)，用CD4⁺CD25⁺Treg分离试剂盒(MiltenyiBiotec，#130-091-301)根据制造商的说明书从5×10⁸个PBMC纯化CD4⁺CD25⁺。通过流式细胞术确定CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞的纯度，如Costa A等，Cancer Cell 2018；33(3):463-79e10中所述。

培养物中CAF-S1簇的分离：为了分离不同的CAF-S1簇，发明人首先根据细胞的特异性标志物开始分选细胞，但他们未能使细胞以不同的身份存活。然后，他们测试了通过播散和分选的两种不同分离方法。对于“播散”方法，肿瘤被切成小块，并在加湿的1.5％O₂和5％CO₂培养箱中在塑料培养皿(Falcon，#353003)内在DMEM(HyClone，#SH30243.01)中温育，所述DMEM补充有10％FBS(Biosera，#FB-1003/500)、链霉素(100μg/ml)和青霉素(100U/ml)(Gibco#15140-122)，以使成纤维细胞在37℃下在至少2-3周期间播散和扩增。为了通过“分选”方法分离成纤维细胞，将肿瘤用(#从BC中分离CAF-S1)中所述的酶鸡尾酒消化，并使用在(#单细胞的CAF-S1 RNA测序)中所述的门控策略，在预先涂有FBS的48孔塑料培养皿(TPP板，#192048)中通过BDFACS ARIA III^TM进行2小时的分选。接下来将CAF-S1分选细胞在加湿的1.5％O₂和5％CO₂培养箱中在塑料培养皿(TPP板，#192048)内的周细胞培养基(ScienCell，#1201)中温育，所述培养基补充有2％FBS(ScienCell，#0010)。为了比较分选的和播散的CAF-S1成纤维细胞在用于功能测定的完全相同的条件下的细胞身份，将这两种类型的成纤维细胞(播散的和分选的)在DMEM(HyClone，#SH30243.01)中转移到20％O₂下的塑料培养皿(Falcon，#353047)内，因为这些培养条件与用于体外功能测定的CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞共培养相容。使用这些方案，从7个不同的患者分离出7个不同的CAF-S1细胞系，3个通过分选，4个通过播散。为了避免任何体外激活，这些通过分选和播散分离的CAF-S1原代细胞系不晚于第5代使用。此外，在每个实验中，比较了相同的代中播散细胞和分选细胞的性质。

Treg-CAF-S1簇功能测定：将5×10⁴CAF-S1细胞(播散的和分选的)在具有10％FBS(Biosera，#FB-1003/500)的DMEM(HyClone，#SH30243.01)中铺在1.5％O₂下的24孔板(Falcon，#353047)内过夜以完全贴壁。然后添加在500μl的DMEM 1％FBS(比率1-10)内的5×10⁵个CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞并在37℃、20％O₂下温育过夜(用于RNA分析)或24小时(用于FACS)。对于FACS分析，则收获未贴壁细胞(CD4⁺CD25⁺)，洗涤，并在室温下使用以下标志物染色30分钟：Live Dead(1:1000，BD Bioscience，#562247)，抗CD45-BUV395(1:50，BDBiosciences，#BD-563792)，抗CD4-APC(1:50，MiltenyiBiotec，#130-092-374)，抗CD25PE-cy7(1:33，BD Bioscience，#557741)，抗FOXP3-FITC(1:33，ebioscience，#53-4776-42)，抗CTLA-4-Pe-cy5(1:20，BD Bioscience,#555854)，抗PD-1-BUV737(BD Bioscience，#565299)，抗TIGIT-BV605(1:50，BD Bioscience，#747841)，抗LAG3-BV510(1:50，BDBioscience，#744985)，抗TIM3-BV711(1:50，BD Bioscience，#565566)。将贴壁细胞胰蛋白酶化、洗涤和针对CAF-S1簇标志物(ANTXR1、CD9、SDC1、LAMP5、GPC3、DLK1)染色，还用LiveDead NIR染色以去除死细胞以及CD45染色以除去残留的Treg。使用ZE5细胞分析仪(Bio-Rad)获取细胞(Treg面板和CAF-S1面板)，通过10.4.2版Flowjo进行分析。对于RNA分析，通过移液收获非贴壁细胞(CD4⁺CD25⁺)，并旋转沉降。然后使用单细胞RNA纯化试剂盒(NorgenBiotek Corp.，#51800)根据制造商的建议提取RNA。使用Agilent RNA6000 Pico试剂盒(Agilent Technologies，#5067-1513)分析RNA完整性和质量。使用TruSeq RNA Exome试剂盒(Illumina，#20020189)制备cDNA文库，随后在NovaSeq(Illumina)上测序。读数在人类参考基因组(hg38；Gencode Release 29)上作图，并使用STAR(2.6.1a版)用下列参数进行定量：“outFilterMultimapNmax＝20；alignSJoverhangMin＝8；alignSJDBoverhangMin＝1；outFilterMismatchNmax＝999；outFilterMismatchNoverLmax＝0.04；alignIntronMin＝20；alignIntronMax＝1000000；alignMatesGapMax＝1000000；outMultimapperOrder＝Random”。只有在所有样本的至少5％中有一个读数的基因被保留下来供进一步分析。用DESeq2 R程序包进行归一化。

Treg-CAF-S1簇细胞内染色：将5×10⁴个CAF-S1细胞(播散的)在具有10％FBS(Biosera，#FB-1003/500)的DMEM(HyClone，#SH30243.01)中在1.5％O₂下铺在24孔板(Falcon，#353047)内过夜以完全贴壁。然后除去培养基，添加在500μl的DMEM 1％FBS(比率1-10)内的5×10⁵个CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞并在37℃、20％O₂下温育过夜。然后收获未贴壁细胞(CD4⁺CD25⁺)，洗涤，并在室温下用Live Dead(1:1000,BD Bioscience，#562247)染色30分钟，洗涤后，将细胞分成两组(一组固定并透化，第二组不固定/透化，只有FOXP3染色)，并使用下列标志物进行染色：抗CD45-BUV395(1:50,BD Biosciences，#BD-563792)，抗CD4-APC(1:50，MiltenyiBiotec，#130-092-374)，抗CD25 PE-cy7(1:33，BD Bioscience，#557741)，抗CTLA-4-Pe-cy5(1:20，BD Bioscience,#555854)，抗PD-1-BUV737(BD Bioscience,#565299)，抗TIGIT-BV605(1:50，BD Bioscience，#747841)，抗LAG3-BV510(1:50，BDBioscience，#744985)，抗TIM3-BV711(1:50，BD Bioscience，#565566)，抗FOXP3-FITC(1:33，ebioscience，#53-4776-42)。

来自正常健康组织的成纤维细胞与来自BC的CAF-S1的比较

原代成纤维细胞是通过使用播散方法(见上文)从瘤旁组织、即咨询病理医师定义为健康的组织收集的。将瘤旁组织切成小块，放在塑料培养皿(Falcon，#353003)中并在补充有10％FBS(Biosera，#FB-1003/500)、链霉素(100μg/ml)和青霉素(100U/ml)(Gibco#15140122)的DMEM(HyClone，#SH30243.01)中37℃下培养2-3周。接下来在早期和晚期传代(分别为第2代和第5代)分析播散的成纤维细胞，以验证CAF-S1标志物的表达。将原代细胞胰蛋白酶化，重悬于PBS中，并在室温下用在PBS中稀释的LIVE/DEAD^TM Fixable Aqua死细胞染色染料(ThermoFisher Scientific，#L34957)染色20分钟并在室温下在PFA 4％中固定20分钟。在PBS+中快速洗涤后，将细胞用抗FAP抗体(1:100,R&D Systems，#MAB3715)或同型对照(1:100,R&D Systems，#MAB002)在室温下在PBS+中染色40分钟。这两种抗体和同型对照都使用荧光染料Zenon APC小鼠IgG1标记试剂盒(Thermo Fisher Scientific，#Z-25051)偶联。使用LSR FORTESSA分析仪(BD Bioscience)获取细胞。每个样本记录50 000个事件。

NSCLC样本的RNA测序

使用高FFPET RNA分离试剂盒(Roche，#06650775001)，按照制造商的说明书处理来自任何治疗的NSCLC幼稚组织的***固定石蜡包埋(FFPE)活检组织(N＝120)，用于RNA提取。使用Agilent RNA6000 Pico试剂盒(Agilent Technologies，#5067-1513)分析RNA完整性和质量。选择DV200高于40％的样本进行RNA测序(N＝70)。使用Nextera XT样本制备试剂盒(Illumina，#FC-131-10)制备cDNA文库，随后在NovaSeq(Illumina)上测序。读数在人类参考基因组(release hg19/GRCh37)上作图，并使用STAR(2.5.3a版)用下列参数进行定量：“outFilterMultimapNmax＝20；alignSJoverhangMin＝8；alignSJDBoverhangMin＝1；outFilterMismatchNmax＝999；outFilterMismatchNoverLmax＝0.04；alignIntronMin＝20；alignIntronMax＝1000000；alignMatesGapMax＝1000000；outMultimapperOrder＝Random”。只有在所有样本的至少5％中有一个读数的基因被保留下来供进一步分析。用DESeq2 R程序包进行有反应患者和无反应患者之间的归一化、无监督分析(PCA)和差异分析。

统计分析

所有统计分析和数据的图形表示都是在R环境(https://cran.r-project.org，3.5.3版)中或使用GraphPad Prism软件(8.1.1版)进行的。使用的统计检验与数据分布一致：首先使用Shapiro-Wilk检验来检查正态性，并根据正态性施行参数或非参数双尾检验，如每个图例所示。图1、2、3、图7和图8中呈现的scRNA-seq数据使用Seurat R程序包(3.0版)进行分析。图2和4中所示的相关矩阵是使用来自stats R程序包的cor函数以方法＝“pearson”和使用＝“pairwise.complete.obs”计算的。Corrplot R函数用于相关矩阵的聚类和可视化，参数如下：order＝“hclust”和hclust.method＝“ward.D2”。图5中所示的FACS分析的定量结果使用平均值±s.e.m来显示。图10中单独地或在ecm-myCAF存在下聚类的CD4⁺CD25⁺T细胞之间的差异分析使用DESeq2 R程序包进行。图6使用了基因集富集分析(GSEA)软件3.0版(Broad Institute)。对于黑色素瘤RNA-seq数据，应用了以下参数：Enrichment statistic＝‘weighted’，Metric for ranking genes＝‘Signal2Noise’。对于NSCLC RNA-seq数据，使用GSEAPreranked和根据DESeq2差异分析的log2倍变化作为排序基因的量度，并使用‘经典’模式进行富集评分。

表1.BC前瞻性群组的描述

NSCLC样本来自Bichat医院病理部门储存的例行诊断样本，来自免疫肿瘤药物治疗的患者。所有患者均根据当时的药物注册和要进行的临床试验，从2015年7月28日至2018年2月20日接受了第二或第三线免疫疗法第一周期。根据RECIST v.1.1标准，每8-12周通过全身CT扫描来评估免疫-肿瘤治疗的疗效。所有临床数据均从患者电子文件中检索。根据世界卫生组织2015年的现行分类，非小细胞肺癌样本的组织学亚型是在***固定的石蜡包埋组织切片上确定的，该组织切片用苏木精染色，来自支气管内窥镜检或CT引导下的经胸活检样本。鳞状细胞癌的诊断由P40阳性和TTF-1(甲状腺转录因子1)免疫染色阴性支持。非鳞鳞状细胞肺癌包括显示Alcian蓝染色阳性(用于粘液瘤细胞含量)和/或核TTF-1免疫染色阳性的腺癌、和p40和TTF-1免疫染色阴性的没有粘蛋白分泌的大细胞癌。两个样本表现出鳞癌和腺癌分化的混合特征。根据第8版TNM分期***，两个IIIB期患者均有不能切除的肺肿瘤，并有放射疗法禁忌症。*在Leica Bond平台上，使用Cell Signaling TechnologyE1L3N可商购的克隆，由AG在4μm石蜡包埋的切片上进行PD-L1染色和解释，所述切片来自诊断、治疗前活检样本，包含至少200个肿瘤细胞。**根据Oken等，Am J Clin Oncol 1982；5(6):649-55，在第一个免疫治疗周期时评估EOCG(东部肿瘤协作组(Eastern CooperativeOncology Group))的表现状况。

表2.免疫疗法治疗的回顾性NSCLC患者群组的描述(群组4)

Claims

1.一种用于检测来自患癌对象的癌样本中的免疫抑制性成纤维细胞的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的炭疽毒素受体1(ANTXR1)阳性成纤维细胞，ANTXR1⁺成纤维细胞的存在是免疫抑制性CAF的指示。

2.一种用于预测患癌对象对免疫疗法治疗的反应的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞，其中所述癌样本中的ANTXR1⁺成纤维细胞预测所述患者对免疫治疗剂的反应性。

3.一种用于治疗患者的癌症的免疫治疗剂，其中所述患者提供的癌样本具有(a)低数量或低百分比的ANTXR1⁺成纤维细胞；或(b)没有ANTXR1⁺成纤维细胞。

4.根据权利要求2所述的用于预测对象的反应的方法或根据权利要求3所述的用途的免疫治疗剂，其中包括确定ANTXR1⁺成纤维细胞的百分比，并且所述ANTXR1⁺成纤维细胞的百分比是ANTXR1⁺成纤维细胞的数量相对于所述癌样本中的成纤维细胞总数或相对于所述癌样本中的细胞总数。

5.根据权利要求2或4所述的方法或根据权利要求3或4所述的用途的免疫治疗剂，其中所述ANTXR1⁺成纤维细胞是FAP⁺ANTXR1⁺成纤维细胞。

6.根据权利要求2和4-5中任一项所述的方法或根据权利要求3和4-5中任一项所述的用途的免疫治疗剂，其中所述ANTXR1⁺成纤维细胞是ANTXR1⁺CAF，优选FAP⁺ANTXR1⁺CAF。

7.根据权利要求2和4-6中任一项所述的方法或根据权利要求3和4-6中任一项所述的用途的免疫治疗剂，其中所述ANTXR1⁺成纤维细胞选自：FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5^-SDC1⁺成纤维细胞、优选CAF；FAP⁺ANTXR1⁺LAMP5⁺SDC1^+/-成纤维细胞、优选CAF；和ANTXR1⁺SDC1^-LAMP5^-CD9⁺成纤维细胞、优选CAF。

8.ANTXR1作为生物标志物在鉴定免疫抑制性成纤维细胞、优选免疫抑制性CAF中的用途。

9.成纤维细胞群体中、优选CAF群体中的ANTXR1作为患癌对象的肿瘤中的生物标志物在预测所述对象对免疫治疗剂的反应中的用途。

10.一种用于治疗患者癌症的靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂，其中所述患者在来自所述患者的肿瘤样本中具有ANTXR1⁺FAP⁺成纤维细胞、优选CAF并且所述药剂抑制或降低ANTXR1⁺成纤维细胞的免疫抑制性作用，优选所述药剂选自：(i)任选与细胞毒性药物缀合的抗ANTXR1抗体、包含抗ANTXR1部分的多特异性分子、抗ANTXR1T细胞受体(TCR)和抗ANTXR1嵌合抗原受体(CAR)，以及(ii)表达抗ANTXR1 TCR或抗ANTXR1 CAR的免疫细胞、优选T细胞或自然杀伤细胞；或其任何组合。

11.根据权利要求10所述的用途的靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂，用于与免疫治疗剂联合使用。

12.一种用于治疗患者癌症的FAP抑制剂，其中所述患者在来自所述患者的肿瘤样本中具有ANTXR1⁺FAP⁺成纤维细胞、优选CAF。

13.根据权利要求12所述的用途的FAP抑制剂，用于与免疫治疗剂联合使用。

14.根据权利要求12或13所述的用途的FAP抑制剂，其中所述FAP抑制剂选自：他拉布司他，PT-100，利拉利汀(Tradjenta)，具有N-(4-喹啉基)-甘氨酰-(2-氰基吡咯烷)骨架的FAP抑制剂如FAPI-02、FAPI-04和FAPI-46，肽靶向放射性核素如FAP-2286，及其任何组合。

15.一种产品或试剂盒，其包含：a)根据权利要求10所述的靶向ANTXR1⁺成纤维细胞的药剂和b)免疫治疗剂，作为在治疗患者癌症中同时、分别或顺序使用的组合制剂，其中所述患者在来自所述患者的肿瘤样本中具有ANTXR1⁺FAP⁺成纤维细胞、优选CAF。

16.根据权利要求2和4-7中任一项所述的方法、根据权利要求3-7中任一项所述的用途的免疫治疗剂、根据权利要求9所述的用途、根据权利要求11所述的用途的药剂、根据权利要求13或14所述的用途的FAP抑制剂或根据权利要求15所述的产品或试剂盒，其中所述免疫治疗剂选自刺激患者免疫***攻击恶性肿瘤细胞的治疗剂、用肿瘤抗原对患者进行免疫接种、刺激免疫***的分子如细胞因子、治疗性抗体、过继T细胞疗法、CAR细胞疗法、免疫检查点抑制剂、及其任何组合，优选免疫检查点抑制剂。

17.根据权利要求16所述的方法、根据权利要求16所述的用途的免疫治疗剂、根据权利要求16所述的用途、根据权利要求16所述的用途的药剂、根据权利要求16所述的用途的FAP抑制剂或根据权利要求16所述的产品或试剂盒，其中所述检查点抑制剂选自针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性细胞死亡配体(PD-L1)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白-3(TIM-3)、B和T淋巴细胞衰减因子(BLTA)、IDO1的抗体或其任何组合，优选选自针对CTLA-4、PD-1、PD-L1和TIGIT的抗体或其任何组合，更优选针对PD-1或CTLA-4的抗体及其组合。

18.根据权利要求16所述的方法、根据权利要求16所述的用途的免疫治疗剂、根据权利要求16所述的用途、根据权利要求16所述的用途的药剂、根据权利要求16所述的用途的FAP抑制剂或根据权利要求16所述的产品或试剂盒，其中所述免疫治疗剂选自伊匹单抗、纳武单抗、BGB-A317、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、阿维单抗、或德瓦鲁单抗、BMS-986016和艾卡哚司他，或其任何组合。

19.根据权利要求2、4-7和16-18中任一项所述的方法、根据权利要求3-7和16-18中任一项所述的用途的免疫治疗剂、根据权利要求9和16-18中任一项所述的用途、根据权利要求10-11和16-18中任一项所述的用途的药剂、根据权利要求12-14和16-18中任一项所述的用途的FAP抑制剂、或根据权利要求15-18中任一项所述的产品或试剂盒，其中所述癌症选自***癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、肝细胞癌、骨肉瘤、黑色素瘤、下咽癌、食道癌、子宫内膜癌、***、胰腺癌、肝癌、结肠或结直肠癌、腺癌、肉瘤、非鳞状细胞癌、鳞状细胞癌、神经内分泌肿瘤、肌肉癌、肾上腺癌、甲状腺癌、子宫癌、皮肤癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、膀胱癌、头颈癌，优选所述癌症选自头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、NSCLC、黑色素瘤和转移性黑色素瘤，更优选所述癌症选自头颈癌、NSCLC、黑色素瘤和转移性黑色素瘤。