JP7255896B2 - シクロホスファミド療法に対する応答者の予測 - Google Patents
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Description
本開示は、対象、特に低用量シクロホスファミドを用いた治療に応答する婦人科がんを有する対象を診断的又は予防的に予測するために、Tエフェクター細胞上のCCケモカイン受容体4(CCR4)発現を検出することに基づく。
(i)対象から得られた生物学的試料中のTeff細胞を、Teff細胞の表面上のCCR4に結合する薬剤と接触させること、及び
(ii)細胞上のCCR4の発現レベルを測定すること
を含み、Teff細胞上のCCR4発現の上方調節は、対象がシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いたさらなるインビボ治療に臨床的に応答することを示す。
(i)生物学的試料をインビトロでシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体に曝露すること、
(ii)対象からの生物学的試料中のTeff細胞を、Teff細胞の表面上のCCR4に結合する薬剤と接触させること、及び
(iii)細胞上のCCR4の発現レベルを測定すること
を含み、Teff細胞上のCCR4発現の上方調節は、対象がシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体による治療に臨床的に応答することを示す。
(i)対象からの生物学的試料であって、エフェクターT細胞を含む生物学的試料を得ること、及び
(ii)生物学的試料から細胞懸濁液を調製すること
をさらに含む。
(i)本明細書に記載される方法を実施して、低用量シクロホスファミドに応答する対象を同定又は予測すること、及び
(ii)対象が低用量シクロホスファミドを用いた治療に臨床的に応答する対象であるものと同定又は予測される場合、対象にさらなる低シクロホスファミドを投与すること
を含む。
(i)対象から得られた生物学的試料中のTeff細胞を、Teff細胞の表面上のCCR4に結合する薬剤と接触させること、及び
(ii)細胞上のCCR4の発現レベルを測定すること
をさらに含む。
(i)シクロホスファミド治療、又はその類似体若しくは誘導体の少なくとも1用量又はサイクルの投与後の対象からのTeff細胞上のCCR4の発現を検出すること、
(ii)Teff細胞のCCR4発現の上方調節のレベルを測定すること、及び
(iii)対象がTeff細胞上のCCR4発現の上方調節を有する場合、対象に低シクロホスファミドをさらに投与すること
を含む。
用語「対象」とは、本明細書で使用するとき、ヒト及び非ヒト動物を含む哺乳動物を指す。より詳細には、哺乳動物はヒトである。さらにより具体的には、対象は女性である。用語、例えば、「対象」、「患者」又は「個体」は、文脈では、本開示において互換的に使用することができる用語である。特定の例では、対象は、成人又は子供(小児)対象であり得る。用語「成人」とは、本明細書で使用するとき、18歳以上のヒト対象を意味することが理解される。対象は、60歳から85歳までの年齢の成人の対象であり得る。
本開示は、対象、特に、対象のTeff細胞上のCCR4発現の上方調節に基づいた、低用量シクロホスファミドを用いた治療のためのがん対象をスクリーニング又は層別化する方法を提供する。
本開示の方法は、エフェクターT細胞上のCCR4の発現を検出及び/又は測定することを含む。用語「エフェクターT細胞」とは、刺激に応答して活性化されたT細胞を指す。このクラスのT細胞には、Tヘルパー細胞及び細胞傷害性(キラー)T細胞が含まれる。
制御性T細胞は、以前には、サプレッサーT細胞として公知であり、免疫系をモジュレートし、自己抗原に対する耐性を維持し、自己免疫疾患を予防するT細胞の亜集団を指す。それらの機能は、エフェクターT細胞の誘導及び増殖を抑制し又は下方調節することである(Bettelli Eら(2006年) Nature 441巻(7090号):235-238頁)。
CCR4(CCケモカイン受容体4及びケモカイン(C-Cモチーフ)受容体4とも呼ばれる)は、Gタンパク質共役型受容体である。CCR4は、ケモカイン、胸腺及び活性化調節ケモカイン(CCL17とも呼ばれる)及びマクロファージ由来ケモカイン(CCL22とも呼ばれる)の受容体である。CCR4は、主にTヘルパー細胞型2(TH2)細胞及び制御性T(Treg)細胞上に発現する。CCR4の限られた発現は、他の健康な細胞及び組織、例えば1型(インターロイキン(IL)-2、インターフェロン(IFN)-γ及び腫瘍壊死因子(TNF)及び2型(IL-4)サイトカインの組み合わせを分泌する記憶CD8+T細胞上に生じる(Kondo, T. & Takiguchi, M. (2009年). International immunology 21巻, 523-532頁(2009年))。
本出願の方法及びキットを使用して、CCR4の発現を決定することによって、化学療法剤を用いた治療に応答する対象を同定することができる。一部の実施形態では、評価される対象はがんを有する。本明細書で使用するとき、「がん」は、新生物、すなわち、細胞の異常な増殖又は***によって特徴付けられる状態の総称である。したがって、がん細胞は「新生物」と呼ばれる場合がある。がん細胞の集まりは、しばしば「腫瘍」と呼ばれ、「腫瘍」及び「がん」という用語は、本明細書において互換的に使用される。腫瘍は、良性又は悪性であり得る。好ましくは、悪性である。
卵巣がんは、卵巣で始まる異常な悪性細胞の増殖である。多くの場合、漠然とした非特異的な症状、例えば、腹部膨満感、骨盤痛、腹痛、摂食困難、並びに/又は早期満腹感及び尿の症状と関連付けられる。卵巣がんが診断されると、がんのステージ決定が行われ、疾患がどの程度進行しているかが決定される。
第1ステージ-がんが、卵巣(又は複数の卵巣)内でのみ発見され、腹部若しくは骨盤の臓器及び組織、リンパ節、又は遠隔部位には拡がっていない。
第2ステージ-がんが、骨盤内の他の臓器、例えば、子宮、卵管、膀胱、S状結腸、又は直腸に拡がっている。リンパ節又は遠隔部位には拡がっていない。
第3ステージ-がんが、骨盤を超えて腹部の内側に拡がっていて、及び/又は腹部の後ろのリンパ節(後腹膜リンパ節)に拡がっている。
第4ステージ-がんが、脾臓、肝臓、肺、又は腹腔の外側にある他の臓器の内部に拡がっている。
本開示の方法及びキットは、対象、好ましくはがん対象から得られた生物学的試料中のCCR4の発現を決定することを含む。生物学的試料は、Teff細胞が存在する対象から得られる任意の試料である。本明細書で使用するとき、用語「得られる」とは、広く定義され、対象に直接由来する細胞、組織又は器官、並びに何らかの方法で培養又は継続された組織若しくは器官に由来するものを指す。
本発明者は、低用量のシクロホスファミド治療が、血液中のエフェクターCCR4+CD8+T細胞を増加させるが、CCR4+Tregsは増加させないことを見出した。本開示の方法及びキットは、Teff細胞上でのCCR4の発現の上方調節を検出することを含む。CCR4発現の検出のために当技術分野において利用可能な任意の方法を、本開示の方法において使用することができる。一例では、CCR4の発現は、タンパク質レベルで検出される。一部の例では、CCR4発現の上方調節の検出は、シクロホスファミド治療に応答する対象を予後的に同定する。他の例では、CCR4発現の上方調節の検出は、事前のシクロホスファミド治療後のシクロホスファミドのさらなるサイクルに応答する対象を診断する。
本開示の方法を使用して、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体に応答する対象を同定することができる。本開示の方法はまた、以前にシクロホスファミドを受けたことがない対象が、シクロホスファミドに応答するかどうかを予測するために使用することができる。
一部の実施形態では、本方法は、追加の化学療法剤を投与することをさらに含む。追加の化学療法剤は、化学療法剤を用いた治療の前、実質的に同時、又は治療後に対象に投与することができる。一部の実施形態では、化学療法剤は、追加の化学療法剤の前に投与される。一部の実施形態では、追加の化学療法剤は、化学療法剤の前に投与される。
対象が治療に臨床的に応答したかどうかを決定する方法は、当業者に公知である。この用語は広く定義されており、例えば、様々な基準、例えば国立がん研究所の一般的な毒性基準(NCI-CTC)又は固形腫瘍の応答評価基準(RECIST)によって、治療関連の毒性及び治療に対する応答を評価することにより決定され得る。無増悪(PFS)、及び全生存(OS)もまた評価され得る。RESIST基準は、コンピューター断層撮影(CT)又は磁気共鳴画像(MRI)を使用して、標的腫瘍の最大直径又は新しい病変のデノボ出現を測定する。
本開示はまた、予測される応答の可能性に関して、それを必要とする対象のがん(例えば、婦人科がん)を治療する方法に関する。例えば、本開示は、対象のTeff細胞上でのCCR4の発現に基づいて、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に肯定的に応答するものと同定された対象を治療する方法を提供する。したがって、別の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法に従って、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に肯定的に応答する対象を同定し、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いて対象を治療することを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法を提供する。
チェックポイント阻害剤
一部の実施形態では、本方法は、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む。チェックポイント阻害剤は、シクロホスファミドによる治療の前、実質的に同時、又は治療後に対象に投与することができる。一部の実施形態では、シクロホスファミドは、チェックポイント阻害剤の前に投与される。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、シクロホスファミドの前に投与される。
一部の実施形態では、本方法は、ワクチンを投与することをさらに含む。ワクチンは、シクロホスファミドによる治療前、実質的に同時、又は治療後に対象に投与することができる。一部の実施形態では、ワクチンの前にシクロホスファミドが投与される。一部の実施形態では、ワクチンはシクロホスファミドの前に投与される。
一部の実施形態では、本方法は、免疫モジュレート剤を投与することをさらに含む。免疫モジュレート剤は、シクロホスファミドを用いた治療の前、実質的に同時、又は治療後に対象に投与することができる。一部の実施形態では、シクロホスファミドは免疫モジュレート剤の前に投与される。一部の実施形態では、免疫モジュレート剤はシクロホスファミドの前に投与される。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する:
[実施形態1]シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に臨床的に応答するがん対象を同定する方法であって、少なくとも1用量又は1サイクルのシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体の投与後に、対象からのTeff細胞上のCCR4発現を検出することを含み、Teff細胞上のCCR4発現の上方調節は、対象が治療に臨床的に応答することを示す、方法。
[実施形態2]対象が婦人科がんを有する、実施形態1に記載の方法。
[実施形態3]Tsupp細胞ではなくTeff細胞上のCCR4発現の上方調節が、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に臨床的に応答する対象を同定する、実施形態1又は2に記載の方法。
[実施形態4]Teff細胞がTヘルパー細胞及び/又は細胞傷害性T細胞である、実施形態1から3のいずれかに記載の方法。
[実施形態5]Tsupp細胞が制御性T細胞(Treg)である、実施形態1から3のいずれかに記載の方法。
[実施形態6]検出することが、
(i)対象から得られた生物学的試料中のTeff細胞を、Teff細胞の表面上のCCR4に結合する薬剤とインビトロで接触させること、並びに
(ii)細胞上のCCR4の発現レベルを測定すること
を含み、Teff細胞上のCCR4発現の上方調節は、対象がシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いたさらなるインビボ治療に臨床的に応答することを示す、実施形態1から5のいずれかに記載の方法。
[実施形態7]生物学的試料からTeff細胞を単離又は精製することをさらに含む、実施形態6に記載の方法。
[実施形態8]ステップ(ii)に従って測定されたCCR4の発現レベルを、シクロホスファミドを用いて前治療された対象からのTeff細胞上のCCR4の発現レベルと比較することを含む、実施形態6又は7に記載の方法。
[実施形態9]Teff細胞を含む対象からの生物学的試料を得ることをさらに含む、実施形態1から8のいずれかに記載の方法。
[実施形態10]シクロホスファミドを以前に受けていないがん対象が、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に臨床的に応答するかどうかを予測する方法であって、対象から得られた生物学的試料中のTeff細胞をインビトロでシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体に曝露した後、Teff細胞上のCCR4発現を検出することを含み、曝露した後のTeff細胞上のCCR4発現の上方調節は、対象が治療に応答することを示す、方法。
[実施形態11]対象が婦人科がんを有する、実施形態10に記載の方法。
[実施形態12]Tsupp細胞ではなくTeff細胞上のCCR4発現の上方調節が、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に臨床的に応答する対象を同定する、実施形態10又は11に記載の方法。
[実施形態13]Teff細胞がTヘルパー細胞及び/又は細胞傷害性T細胞である、実施形態10から12のいずれかに記載の方法。
[実施形態14]Tsupp細胞が制御性T細胞(Treg)である、実施形態10から12のいずれかに記載の方法。
[実施形態15]発現を検出することが、
(i)生物学的試料をインビトロでシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体に曝露すること、
(ii)対象からの生物学的試料中のTeff細胞を、Teff細胞の表面上のCCR4に結合する薬剤と接触させること、並びに
(iii)細胞上のCCR4の発現レベルを測定すること
を含み、Teff細胞上のCCR4発現の上方調節は、対象がシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に臨床的に応答することを示す、実施形態10から14のいずれかに記載の方法。
[実施形態16]細胞がインビトロでマホスファミドに3日間曝露される、実施形態1から15のいずれかに記載の方法。
[実施形態17]ステップ(iii)に従って測定されたCCR4の発現レベルを、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体に予め曝露された対象からのTeff細胞上のCCR4の発現レベルと比較することを含む、実施形態10から16のいずれかに記載の方法。
[実施形態18]ステップ(iii)で決定されたCCR4の発現レベルを、対照の対象からのTeff細胞上のCCR4の発現レベルと比較することを含む、実施形態10から16のいずれかに記載の方法。
[実施形態19]低用量シクロホスファミドを用いて対象を治療することをさらに含むか、又はそれからなる、実施形態1から18のいずれかに記載の方法。
[実施形態20]対象が、シクロホスファミド又はその類似体、誘導体若しくは活性代謝物を用いて治療することができるがんを有する、実施形態1から19のいずれかに記載の方法。
[実施形態21]対象が、CCL22を分泌するがんを有する、実施形態1から20のいずれかに記載の方法。
[実施形態22]対象が、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ性白血病(ALL)、T細胞リンパ腫(菌状息肉腫)、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、乳がん、精巣がん、子宮内膜がん、卵巣がん;子宮がん、子宮頸がん、外陰がん又は膣がんを含む他の婦人科がん、及び肺がん、又はこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるがんを有する、実施形態1から21のいずれかに記載の方法。
[実施形態23]生物学的試料が末梢血単核細胞(PBMC)を含む、実施形態6から22のいずれかに記載の方法。
[実施形態24](i)対象からの、エフェクターT細胞を含む生物学的試料を得ること、及び
(ii)生物学的試料から細胞懸濁液を調製すること
をさらに含む、実施形態1から23のいずれかに記載の方法。
[実施形態25]がん対象の低用量シクロホスファミド治療の有効性を評価する方法であって、第1の時点でTeff細胞を含む第1の生物学的試料において、CCR4の発現レベルを検出すること、後の時点でTeff細胞を含む第2の生物学的試料を用いてこの分析を反復すること、及び2つの時点でのCCR4の発現レベルを比較することを含み、第1の試料と比較した第2の試料におけるTeff細胞上のCCR4発現の上方調節が、臨床的に有効な治療を示す、方法。
[実施形態26]第1の時点は、対象が少なくとも1用量のシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を投与される前又は後にある、実施形態25に記載の方法。
[実施形態27]対象における卵巣がんの退行又は進行を評価するモニタリング方法であって、第1の時点でTeff細胞を含む第1の生物学的試料において、CCR4の発現レベルを検出すること、後の時点でTeff細胞を含む第2の生物学的試料を用いてこの分析を反復すること、及び2つの時点でのCCR4の発現レベルを比較することを含み、第1の試料と比較した第2の試料におけるTeff細胞上のCCR4発現の上方調節が卵巣がんの退行を示す、方法。
[実施形態28]Teff細胞がCD4+T H1 T細胞及び/又はCD8+細胞傷害性T細胞を含む、実施形態1から27のいずれかに記載の方法。
[実施形態29]Teff細胞がFoxP3-CD25-CD4+細胞及びCD8+T細胞を含む、実施形態1から28のいずれかに記載の方法。
[実施形態30]チェックポイント阻害剤(1若しくは複数)、抗がんワクチン(1若しくは複数)、モノクローナル抗体、追加の化学療法剤(1若しくは複数)、サイトカイン、腫瘍溶解性ウイルス、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法、及び免疫モジュレート剤(1若しくは複数)又はこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される治療剤を対象に投与することをさらに含む、実施形態1から29のいずれかに記載の方法。
[実施形態31]それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、
(i)実施形態1から24のいずれかに記載の低用量シクロホスファミドに応答する対象を同定又は予測すること、及び
(ii)対象が低用量シクロホスファミドを用いた治療に臨床的に応答する対象であることが同定又は予測される場合、低用量シクロホスファミドを対象に投与すること
を含む、方法。
[実施形態32](i)対象から得られた生物学的試料中のTeff細胞を、Teff細胞の表面上のCCR4に結合する薬剤と接触させること、及び
(ii)細胞上のCCR4の発現レベルを測定すること
をさらに含む、実施形態31に記載の方法。
[実施形態33]対象が、実施形態1から24のいずれかに記載の低用量シクロホスファミドに応答することが以前に同定又は予測されている、低用量シクロホスファミドを用いて卵巣がんを治療する方法。
[実施形態34]実施形態1から24のいずれかに記載の低用量シクロホスファミドに応答する対象を同定又は予測する方法において使用するための、Teff細胞及びそれに結合するCCR4結合部分を含む複合体。
[実施形態35]実施形態1から24のいずれかに記載の方法において使用するための、Teff細胞上のCCR4発現を検出する試薬を含むキットであって、生物学的試料を回収する容器、並びにCD3、CD8、CD4、CD25、CCR4及びFoxP3からなる群から選択される表面抗原に結合する1つ以上の結合試薬を含む、キット。
[実施形態36]本出願の本明細書において個別に若しくは集合的に開示又は示されるステップ、特徴、構成要素(integer)、組成物及び/又は化合物、並びに前記ステップ又は特徴のうちの2つ以上の任意の及びすべての組み合わせ。
方法
1.1 試験設計及び患者の詳細
年齢が62~82歳の婦人科がんの10人のヒト患者が、二中心性(bicentric)の第II相試験で募集された。患者は、進行した治療抵抗性の婦人科腫瘍を有し、オーストラリアのRoyal Women’s Hospital(n=3)及びベルギーのUniversity Hospital Leuven(n=7)から募集された。表1を参照されたい。疾患の進行は、RECIST及びGCIG CA125基準を使用して決定された(Rustin GJら、(2011年) Official journal of the International Gynaecological Cancer Society Feb; 21巻(2号):419-23頁)。募集時から、患者から書面による同意が得られ、治療前の血液試料が回収された。患者は、3日間連続で1日2回(朝及び夕方)、50mgのシクロホスファミドを経口投与され、2週間後に全血用EDTAコーティングチューブ及び血清用血清分離チューブ(BD Vacutainer, BD, USA)に血液を採取した。治療サイクル及び採血は、2週間ごとに最大8サイクル繰り返された。健康な試料については、オーストラリア赤十字血液サービスで取得した定期的な献血からバフィーコートを入手した。
末梢血単核細胞(PBMC)は、Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)密度勾配遠心分離により血液採取から24時間以内に単離された。次に、細胞をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(dPBS、Sigma-Aldrich, USA)で洗浄した。単離したPBMCを、10%DMSO(Sigma- Aldrich, USA)及び90%熱不活化ウシ胎仔血清(GIBCO, Life Technologies, USA)又は90%ヒトAB血清(Sera Laboratories International, UK)を含む凍結培地中で-80℃にて1℃/分の速度で凍結し、その後、液体窒素に保存した。解凍後、凍結したPBMCの各バイアルを37℃の水浴ですばやく解凍し、5%正常ヒト血清(HS, Sigma-Aldrich, USA)を含むAIM-V培地(Life Technologies, USA)に再懸濁した(完全なAIM-V培地)。
細胞は、倒立顕微鏡(Leica Microsystems, Germany)でガラス血球計算盤(Hausser Scientific, USA)を使用してカウントされた。細胞をトリパンブルー染色(GIBCO, Life Technologies, USA)で希釈して、細胞の生存率を決定した。
総細胞=細胞数×希釈係数×チューブ内の細胞の体積×104。
製造元の指示に従って、Multiplex Bead Immunoassay Kit(ヒトケモカイン5プレックスパネル、Life Technologies, USA)を使用して、がん患者及び健康なドナーの血清中のCCL22の濃度を決定した。試料は、Bio-Plex 200システム(Bio-Rad, USA)で取得し、最低100事象を回収した。結果は、Bio-Plex Managerバージョン5ソフトウェア(Bio-Rad, USA)を使用して分析した。
PBMCのT細胞集団の頻度及び表現型を決定するために、以下の表面抗体を使用してマルチカラーフローサイトメトリーを実施した:抗CD3、抗CD8、抗CD4、抗CD25、及び抗CCR4。抗体は、5%HSを含むdPBS(染色緩衝液)で希釈した。細胞は、室温で15分間、107細胞/150μlの抗体カクテルの最終濃度で染色された。次に、細胞を染色緩衝液で2回洗浄した。固定可能な死細胞色素(生/死、固定可能なアクア死細胞染色キット、 Life Technologies, USA)を使用して、死細胞と生細胞を区別した。色素を染色緩衝液で1/500に希釈し、細胞を室温で15分間、最終濃度107細胞/150μlの希釈染料でインキュベートし、その後、染色緩衝液で2回洗浄した。FoxP3の細胞内レベルは、固定/透過緩衝液キット(eBioscience, USA)を使用して、細胞の固定及び透過処理後に決定された。固定/透過処理濃縮液を希釈剤で1:3に希釈した。次に、細胞を4℃で30分間、50μlの希釈固定/透過処理溶液に再懸濁した。細胞内の抗FoxP3及び抗Ki67は、固定/透過化洗浄緩衝液(eBioscience、USA)で希釈された。細胞を固定/透過化洗浄緩衝液で洗浄し、最終濃度107細胞/150μlの希釈細胞内抗体に再懸濁し、室温で15分間インキュベートした。次に、細胞を2回洗浄し、1%パラホルムアルデヒドを含むdPBS(PFA、Sigma-Aldrich, USA)に再懸濁した。FACSDivaソフトウェアを使用して、Becton Dickinson LSR IIフローサイトメーターでフローサイトメトリーデータを取得し、試料あたり最低100,000事象を取得した。正確なゲーティングを可能にするために、蛍光マイナス1(FMO)対照及びアイソタイプが一致した抗体もまた使用された。Flowjoソフトウェア(TreeStar, USA)を使用してデータを分析した。抗体のリストを表2に示す。
T細胞の細胞傷害能は、48ウェルプレートで106細胞/500μl/ウェルの完全AIM-V培地でPBMCを培養することにより決定された。次に、細胞は、タンパク質輸送阻害剤(ストックの1/1500希釈、BD GolgiStop, BD biosciences, USA)及び抗CD107a(ストックの1/20希釈、BD Pharmingen, USA)の存在下、37℃で、5%CO2の加湿インキュベーター内で、細胞を50ng/mlのホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA、Sigma-Aldrich, USA)及び1μg/mlのイオノマイシン(Sigma- Aldrich, USA)で6時間刺激した。ブレフェルジンA(eBioscience, USA)をインキュベーションの最後の4時間、3μg/mlで添加した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、上記のように表面マーカーについて標識した。フローサイトメトリーを用いて細胞を分析し、非刺激細胞、蛍光マイナス1(FMO)及びアイソタイプが一致した抗体も対照として使用した。上記のようにデータを回収して分析した。
シクロホスファミドのインビトロでのT細胞における効果を調べるために、患者、治療前及び健康なドナーからのPBMCを、シクロホスファミドの薬理学的に活性な肝臓代謝産物の類似体であるマホスファミド(Niomech, Germany)で処理した。マホスファミドは、使用時に滅菌ミリQ水に80mg/mlの濃度で再構成された。CD4+及びCD8+T細胞は、上記のようにそれぞれの抗体で細胞を標識し、次に、蛍光活性化細胞選別を使用することにより精製された。全PBMC又は精製CD4+及びCD8+T細胞を、96ウェルプレートに3×105細胞/150μl/ウェルで、完全AIM-V培地内で、1.5μg/mlのマホスファミド又は培地のいずれかとともに、37℃で72時間、5%CO2加湿インキュベーター内で培養した。精製された細胞培養物では、細胞生存率を維持するためにIL-2を20単位/mlの濃度で添加した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、上記のフローサイトメトリーを使用して、Treg及びエフェクターT細胞でのCCR4発現を決定した。インビトロ処理後のT細胞のサイトカイン分泌プロファイルを決定するために、24、48及び72時間の時間経過で、上記のように細胞をマホスファミドで処理した。各時点でのインキュベーションの最後の6時間で、上記のように細胞をPMA及びイオノマイシンで刺激した。次に、細胞を洗浄し、表面マーカー、続いて、抗IL-4(BD Pharmingen, USA)及び抗IL-2(BD Pharmingen, USA)を使用して上記の細胞内サイトカイン染色のために標識した。
リジン(H3K)9、H3K14及びH3K18でのヒストン3のアセチル化は、フローサイトメトリーを使用して評価された。最初に、1.5μg/mlのマホスファミド又は10ng/mlのIL-4(R&D systems, USA)又は20単位/mlのIL-2(R&D systems, USA)で上記のように細胞を72時間培養した。培養の最後の4時間で、50nMパノビノスタット(LBH589、汎ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤)をIL-2培養液に添加した。上記のように細胞を回収し、フローサイトメトリー分析用に準備した。表面標識、固定、及び透過処理後、細胞を非結合抗H3K9、抗H3K14及び抗H3K18(Cell Signalling Technology, USA)で標識した。二次標識は、Alexa Fluor 488結合ロバ抗ウサギIg抗体(Biolegend, USA)を使用して実施した。上記のようにデータを回収して分析した。
健康なドナーからのPBMCを上記のようにマホスファミドで処理した。72時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、生細胞を24ウェルトランスウェルインサート(Corning, USA)に、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA、Sigma-Aldrich, USA)を含むAIM-V培地中の2.5×105細胞/100μl/インサートで播種した。AIM-V培地中の100ng/mlのCCL22(R&D Systems, USA)又はAIM-V培地のみの600μlを、トランスウェルインサート下の各ウェルに添加した。細胞を5%CO2加湿インキュベーター内で37℃にて2時間インキュベートし、その後、細胞をカウントし、フローサイトメトリーを使用してT細胞サブセットを決定した。CCL22に向かって遊走した細胞の割合を、培地のみに向かって遊走した細胞の割合で割ることにより、遊走指数を計算した。
統計的有意性を決定するために、ノンパラメトリック検定が使用された。インビトロ及びインビボの治療後及び治療前の試料間の患者における違いを比較するために、Wilcoxonの対応した符号付順位検定を行い、Mann-Whitney検定を使用して患者群間又は患者と健康なドナー間を比較した。治療後の倍数変化の有意性を決定するために、Wilcoxonの符号付順位検定を行い、平均が1であるという帰無仮説を検定した。スピアマン相関検定を使用して、パラメーター間の相関を決定した。GraphPad Prism(v.6、GraphPad Software, Inc, USA)を使用して統計分析を実施した。p<0.05は有意とみなされた。平均値は平均の±標準誤差(SEM)を示した。
治療後のCCR4+T細胞の増加は、婦人科悪性腫瘍を有する患者の生存率の増加と関連付けられる
T細胞内のCCR4発現に対するシクロホスファミドの効果を調べるために、CCR4+細胞の治療前の頻度(n=7~8時点の平均)は、各個々の患者について、各治療サイクル後の頻度(n=3~6時点の平均)と比較した。10人の患者のうち、4人は少なくとも1サイクルの治療後、CD3+T細胞内のCCR4+細胞の頻度が有意に増加した(CCR4%又はCCR4スパイクの増加、図2A)。これは、初回の3サイクルの治療内で生じた。一方、他の6人の患者では、CD3+T細胞内のCCR4+細胞の頻度は、比較的一定のままであった(一定のCCR4+%又はCCR4定常、図2及び表3)。
CD8+T細胞及びエフェクターT細胞ではCCR4発現が増加するが、Tregでは増加しない
低用量シクロホスファミド治療は、患者の亜群のCD3+T細胞内のCCR4+細胞の頻度を一時的に増加させた。CCR4を発現している特定のT細胞サブセットをさらに決定するために、本発明者らは、CD3+T細胞内のCCR4+細胞の頻度の増加が観察された時点でこれらの患者に分析を集中した。次に、T細胞を制御性T細胞、FoxP3+CD25+CD4+(Treg)、及びFoxP3-CD25-CD4+(Tconv)、又はCD8+T細胞であるエフェクターT細胞サブセットに分割した(図3A)。それぞれのサブセット内のCCR4+細胞の頻度を決定し、治療後の値を治療前の値に対して標準化した。CD3+T細胞内のCCR4+細胞の頻度の増加は、治療前レベルと比較して、TconvとCD8+T細胞の両方がCCR4+細胞の頻度において有意に5倍の増加を示したため(両方のケースにおいてp<0.05)、エフェクターT細胞集団でのCCR4発現の増加によって促進された(図3A)。Treg内のCCR4+細胞の頻度は有意に増加しなかった(図3A)。Treg、Tconv、及びCD8+T細胞内のCCR4平均蛍光強度(MFI)の倍数変化はまた、治療前のレベルと比較して評価され、3つの集団すべてでCCR4 MFIは変化しないままであった(図3A)。
マホスファミド前処理によりインビトロでCCR4+エフェクターCD4 T細胞を生成する能力が増加した患者は、インビボでシクロホスファミドに「CCR4スパイク」で応答する
CCR4+T細胞の頻度の増加が直接シクロホスファミドによるものかどうかを決定するために、患者の治療前及び健康なドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)を、シクロホスファミドの生理活性アイソフォームであるマホスファミドとともに培養した。滴定により、最適な非毒性マホスファミドの用量は1.5μg/mlであることが決定された(図5)。健康なドナーと患者の治療前のPBMCを、1.5μg/mlのマホスファミド又は培地のみで3日間培養した。健康なドナーと患者の両方からのマホスファミド処理されたPBMCは、培地と比較してCD3+T細胞内のCCR4+細胞の頻度が有意に高かった(健康:15.4%±1.47%と比較して22.9%±1.79%、p<0.001、及びがん:19.6%±2.82%と比較して24.4%±3.14%、p<0.01、図6A)。
パクリタキセルは、健康なPMBCにおけるCCR4+T細胞の頻度を有意に増加させない
CCR4+T細胞の頻度の増加がパクリタキセル(別の抗腫瘍薬)を用いた治療時に発生するかどうかを決定するために、健康な患者からの末梢血単核細胞(PBMC)をマホスファミドとパクリタキセルとともに培養した。健康なドナーPBMCは、5%CO2加湿インキュベーター内で、培地のみ、シクロホスファミドの活性代謝物マホスファミド1.5μg/ml、又はパクリタキセル30ng/mlで37℃にて72時間インキュベートされた。細胞を回収し、フローサイトメトリー分析を使用して、CD8+及びCD4+CD25-T細胞上のCCR4発現を決定した。健康なドナーからのマホスファミド処理されたCD8+及びCD4+CD25-T細胞は、パクリタキセル処理された細胞と比較して、未処理細胞に対してCCR4+細胞の倍数増加が有意に高かった(CD8+:1.00と比較して1.39、p<0.05、及びCD4+CD25-:1.04と比較して1.14、p<0.01、図7)。
T細胞上のCCR4発現の誘導のメカニズム
CCR4の発現は、TH2分極条件下で誘導される。したがって、本発明者らは、CCR4の上方調節がマホスファミドによるTh2分極によるものかどうかを調べた。PBMC上のIL-4の発現は、1日間隔で3日間の時間経過にわたってCCR4発現と相関した。CD4+とCD8+T細胞集団の両方で、CCR4発現とIL-4発現の間に相関はなかった(図9A)。代わりに、CCR4発現は、CD4+とCD8+T細胞の両方でIL-2+細胞の頻度と正に相関した(図10)。
マホスファミド誘導によるCCR4発現はCCL22への細胞遊走を促進する
シクロホスファミド誘導によるCCR4発現は機能的であり、CCL22に応答して細胞遊走を開始できるかどうかを決定するために、1.5μg/mlマホスファミドで処理された健康なドナーPBMCを使用してインビトロ遊走アッセイを実施した。遊走指数は、以前に説明されているように計算された(Govindaraj Cら、(2013年) Clinical Immunology 149巻(1号):97-110頁)。患者のCCL22の血清濃度を図12に示す。
卵巣がんの免疫適格性マウスモデルにおいて、LDCyは末梢血のCCR4+CD8+T細胞及びTILにおける活性化CD8T細胞を増加させる
生体活性エフェクターCD8 T細胞は、インビボで低用量シクロホスファミド(LDCy)により腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のTregに比例して増加するという、実施例1のパイロットヒト試験からの予測を試験するために、本発明者は同系上皮癌細胞株ID8に基づく免疫適格性マウスの卵巣がん(OC)モデルを採用した。これは、腹腔内(i.p.)又は嚢内(i.b.)に投与され、血管の変化、緩慢な成長、腫瘍腹水の形成、播種のパターンなどの卵巣がんの病理の重要な側面を再現している(Chiriva-Internati Mら、(2010年) PloS one 5, e10471)。
シクロホスファミド治療に対する応答者の予測
末梢血単核細胞(PBMC)をがん対象から得、採血の24時間以内にフィコール密度勾配遠心分離によって単離する。次に、細胞を5%ヒト血清を含むAMI-V培地に懸濁させる。次に、適切な条件下で、PBMCを1.5μg/mlのマホスファミド又は培地のみで3日間培養する。次に、細胞を回収し、CCR4、CD3、CD8、CD4、及びCD25などの適切な細胞表面マーカーと固定可能な死細胞色素(例えば、PE)で染色して、死細胞を区別する。FoxP3の細胞内レベルは、細胞の固定と透過処理に続いて、抗FoxP3で標識した後に決定される。次に、細胞を適切にゲーティングし、アイソタイプが一致する対照を参照してフローサイトメトリーで分析する。FoxP3-、CD25-、CD4+及びCD8+を発現するTeff細胞をCCR4の発現について分析する。場合によっては、FoxP3+、CD25+、CD4+を発現するTregもまたCCR4の発現について分析される。
がんに対する免疫療法の重点は、免疫抑制の改善及びエフェクターT細胞機能の活性化にある(Dougan M及びDranoff G (2009年) Ann Rev Immunol. 27:83-117)。しかしながら、有益な免疫細胞が必要とされる場所に到達できない場合、これらの努力は無駄になる。本明細書に提示されたデータは、免疫学的に応答し、インビトロでのスクリーニングプロトコルを使用した免疫療法の低用量シクロホスファミド(LDCy)治療から恩恵を受ける患者を事前に同定することが可能であることを示す。スクリーニング試験を遺伝子検査と組み合わせて、付加的な力を提供することができる。
Claims (25)
- シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に臨床的に応答するがん対象の同定を補助する方法であって、少なくとも1用量又は1サイクルのシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体の投与後に該対象から得られた生物学的試料中のTeff細胞上のCCR4発現を検出することを含み、Teff細胞上のCCR4発現の上方調節は、該対象が治療に臨床的に応答することを示す、方法。
- Tsupp細胞ではなくTeff細胞上のCCR4発現の上方調節が、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に臨床的に応答する対象を同定する、請求項1に記載の方法。
- 前記Teff細胞がTヘルパー細胞及び/又は細胞傷害性T細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記Tsupp細胞が制御性T細胞(Treg)である、請求項2に記載の方法。
- 検出することが、
(i)前記対象から得られた生物学的試料中のTeff細胞を、Teff細胞の表面上のCCR4に結合する薬剤とインビトロで接触させること、並びに
(ii)前記細胞上のCCR4の発現レベルを測定すること
を含み、前記Teff細胞上のCCR4発現の上方調節は、前記対象がシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いたさらなるインビボ治療に臨床的に応答することを示す、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(ii)に従って測定されたCCR4の発現レベルを、シクロホスファミドを用いて前治療された対象からのTeff細胞上のCCR4の発現レベルと比較することを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記対象が婦人科がんを有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- シクロホスファミドを以前に受けていないがん対象が、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に臨床的に応答するかどうかを予測する方法であって、該対象から得られた生物学的試料中のTeff細胞をインビトロでシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体に曝露した後、Teff細胞上のCCR4発現を検出することを含み、曝露した後のTeff細胞上のCCR4発現の上方調節は、該対象が治療に応答することを示す、方法。
- 前記対象が婦人科がんを有する、請求項8に記載の方法。
- Tsupp細胞ではなくTeff細胞上のCCR4発現の上方調節が、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に臨床的に応答する対象を同定する、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記Teff細胞がTヘルパー細胞及び/又は細胞傷害性T細胞である、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Tsupp細胞が制御性T細胞(Treg)である、請求項10に記載の方法。
- 発現を検出することが、
(i)前記生物学的試料をインビトロでシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体に曝露すること、
(ii)前記対象からの生物学的試料中のTeff細胞を、Teff細胞の表面上のCCR4に結合する薬剤と接触させること、並びに
(iii)前記細胞上のCCR4の発現レベルを測定すること
を含み、前記Teff細胞上のCCR4発現の上方調節は、前記対象がシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を用いた治療に臨床的に応答することを示す、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(iii)に従って測定されたCCR4の発現レベルを、シクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体に予め曝露された対象からのTeff細胞上のCCR4の発現レベルと比較することを含む、請求項13に記載の方法。
- ステップ(iii)で決定されたCCR4の発現レベルを、対照の対象からのTeff細胞上のCCR4の発現レベルと比較することを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記Teff細胞がインビトロでマホスファミドに3日間曝露される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、
(i)シクロホスファミド又はその類似体、誘導体若しくは活性代謝物を用いて治療することができるがん;並びに/あるいは
(ii)CCL22を分泌するがん;並びに/あるいは
(iii)ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ性白血病(ALL)、T細胞リンパ腫(菌状息肉腫)、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、乳がん、精巣がん、子宮内膜がん、卵巣がん;子宮がん、子宮頸がん、外陰がん又は膣がんを含む他の婦人科がん、及び肺がん、又はこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるがん
を有する、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。 - 前記生物学的試料が末梢血単核細胞(PBMC)を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- がん対象の低用量シクロホスファミド治療の有効性の評価を補助する方法であって、第1の時点で該対象から得られたTeff細胞を含む第1の生物学的試料において、CCR4の発現レベルを検出すること、後の時点で該対象から得られたTeff細胞を含む第2の生物学的試料を用いてこの分析を反復すること、及び2つの時点でのCCR4の発現レベルを比較することを含み、
第1の生物学的試料が、少なくとも1用量のシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を投与される前又は後に前記対象から得られたTeff細胞を含み、第2の生物学的試料が、少なくとも1用量のシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を投与された後に前記対象から得られたTeff細胞を含み、
第1の試料と比較した第2の試料におけるTeff細胞上のCCR4発現の上方調節が、臨床的に有効な治療を示す、方法。 - 対象における卵巣がんの退行又は進行の評価を補助するモニタリング方法であって、第1の時点で該対象から得られたTeff細胞を含む第1の生物学的試料において、CCR4の発現レベルを検出すること、後の時点で該対象から得られたTeff細胞を含む第2の生物学的試料を用いてこの分析を反復すること、及び2つの時点でのCCR4の発現レベルを比較することを含み、
第1の生物学的試料が、少なくとも1用量のシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を投与される前又は後に前記対象から得られたTeff細胞を含み、第2の生物学的試料が、少なくとも1用量のシクロホスファミド又はその類似体若しくは誘導体を投与された後に前記対象から得られたTeff細胞を含み、
第1の試料と比較した第2の試料におけるTeff細胞上のCCR4発現の上方調節が卵巣がんの退行を示す、方法。 - 前記Teff細胞がCD4+TH1 T細胞及び/又はCD8+細胞傷害性T細胞を含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Teff細胞がFoxP3-CD25-CD4+細胞及びCD8+T細胞を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- 低用量シクロホスファミドを含む、卵巣がん対象を治療するための医薬であって、前記対象が、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法により低用量シクロホスファミドに応答することが以前に同定又は予測されている、医薬。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の低用量シクロホスファミドに応答する対象を同定又は予測する方法において使用するための、Teff細胞及びそれに結合するCCR4結合部分を含む複合体を含むキット。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の方法において使用するための、Teff細胞上のCCR4発現を検出する試薬を含むキットであって、生物学的試料を回収する容器、並びにCD3、CD8、CD4、CD25、CCR4及びFoxP3からなる群から選択される表面抗原に結合する1つ以上の結合試薬を含む、キット。
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