CN117778425A - 一种甲基转移酶在增强固氮微生物的固氮能力方面的用途和方法 - Google Patents
一种甲基转移酶在增强固氮微生物的固氮能力方面的用途和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开涉及一种甲基转移酶在增强固氮微生物的固氮能力方面的用途和方法，甲基转移酶在增强固氮微生物的固氮能力方面的用途，所述甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本公开还提供了一种增强固氮微生物的固氮能力的方法，该方法包括以下步骤：将编码甲基转移酶的基因导入固氮微生物中并使其过表达。编码甲基转移酶的基因能够提高固氮微生物中固氮酶的活性固氮基因的表达量，进而提高了固氮微生物的固氮能力，尤其是施氏假单胞菌的固氮能力。
Description
技术领域
本公开涉及微生物和基因工程技术领域，具体地，涉及一种甲基转移酶在增强固氮微生物的固氮能力方面的用途和方法。
背景技术
DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）作为甲基供体，通过共价键结合的方式获得一个甲基基团的化学修饰过程。植物等真核生物在面临氧气、干旱、高温等非生物胁迫时，通过DNA甲基化等表观遗传修饰方式激活自身防御反应，而微生物为了适应复杂多变的外界环境，主要通过DNA甲基化的方式进行基因表达的调控。
固氮菌中的生物固氮是一个复杂调控***，在固氮过程中对氧敏感且十分依赖能量。因此，通过合成生物学的手段，从表观遗传修饰的角度改造固氮调控元件与功能模块，构建作物根际人工高效固氮体系。目前研究中，没有将DNA甲基转移酶编码基因应用在固氮菌中进而调控固氮酶活性方面的应用。
发明内容
本公开的目的是提供一种甲基转移酶在增强固氮微生物的固氮能力方面的用途和方法，编码甲基转移酶的基因能够提高固氮微生物固氮基因的表达量，提高固氮微生物中固氮酶的活性，进而提高了固氮微生物固氮的能力。
为了实现上述目的，本公开提供第一方面提供甲基转移酶在增强固氮微生物的固氮能力方面的用途，所述甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可选地，编码所述甲基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
可选地，所述固氮微生物为施氏假单胞菌。
可选地，增强固氮微生物的固氮能力包括提高固氮微生物中固氮酶活性和固氮基因的表达量。
可选地，所述固氮基因为nifH、nifD和nifK。
本公开第二方面提供一种增强固氮微生物的固氮能力的方法，该方法包括以下步骤：将编码甲基转移酶的基因导入固氮微生物中并使其过表达；所述甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述甲基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
可选地，所述重组表达载体含有组成型启动子；所述组成型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3中的第1位-第176位所示。
可选地，所述固氮微生物为施氏假单胞菌。
可选地，增强固氮微生物菌的固氮能力包括提高固氮微生物中固氮酶活性和固氮基因的表达量。
可选地，所述固氮基因为nifH、nifD和nifK。
通过上述技术方案，本公开提供了一种甲基转移酶在增强固氮微生物的固氮能力方面的用途和方法。本公开将编码甲基转移酶的基因导入固氮微生物中并使其过表达，能够提高固氮微生物中固氮基因的表达，提高固氮微生物中固氮酶的活性，进而提高了固氮微生物固氮的能力，尤其是增强施氏假单胞菌的固氮能力。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是编码甲基转移酶的基因的同源性分析图。
图2是缺失突变株ΔPST2700、PST2700缺失突变株功能回补株、底盘菌株A1501和过表达工程菌株A1501（PST2700）的生长能力分析图。
图3是缺失突变株ΔPST2700、PST2700缺失突变株功能回补株、底盘菌株A1501和过表达工程菌株A1501（PST2700）的固氮酶活柱状图。
图4是为缺失突变株ΔPST2700、PST2700缺失突变株功能回补株、底盘菌株A1501和过表达工程菌株A1501（PST2700）的固氮基因相对表达量的柱状图。
序列表信息
SEQ ID NO.1：甲基转移酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO.2：编码甲基转移酶的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.3：本公开的一种实施方式的重组表达载体的核苷酸序列。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面提供甲基转移酶在增强固氮微生物的固氮能力方面的用途，所述甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本公开的一种优选实施方式中，所述固氮微生物为施氏假单胞菌。
本公开发明人经过大量研究发现，通过对DNA甲基转移酶结构域分析，其具有I类依赖SAM的甲基转移酶结构域，与该家族中其他蛋白进行同源性分析，相似度低于40%，可能为新型DNA甲基转移酶。该DNA甲基转移酶可以参与固氮微生物中固氮酶活的调控，提高固氮微生物的固氮能力。尤其是能够提高施氏假单胞菌中固氮基因的表达量，提高施氏假单胞菌中固氮酶的活力，进而提高了施氏假单胞菌固氮的能力。
根据本公开，编码所述甲基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本公开，增强固氮微生物的固氮能力包括提高固氮微生物中固氮酶活性和固氮基因的表达量。
根据本公开，所述固氮基因为nifH、nifD和nifK。
本公开第二方面提供一种增强固氮微生物的固氮能力的方法，该方法包括以下步骤：将编码甲基转移酶的基因导入固氮微生物中并使其过表达；
所述甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
编码所述甲基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本公开中，将编码甲基转移酶的基因导入固氮微生物中可以采用本领域人员所常规采用的方法，例如可以为三亲本接合的方法。
根据本公开，编码所述甲基转移酶的基因通过重组表达载体导入固氮微生物中；所述重组表达载体含有组成型启动子；所述组成型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3中的第1位-第176位所示。
根据本公开，增强固氮微生物的固氮能力包括提固氮微生物中固氮酶活性和固氮基因的表达量。优选地，所述固氮基因为nifH、nifD和nifK。
在本公开中，本公开构建的过表达工程菌株A1501（PST2700）的固氮酶活性与A1501相比提高了20%。本公开构建的过表达工程菌株A1501（PST2700）中固氮基因的表达量与A1501相比上调7-13倍。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
本公开实施例中涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。
本公开实施例中未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
本实施例用于说明构建PST2700缺失突变株。
（1）实验方法：
所构建的DNA甲基转移酶编码基因PST2700缺失突变株主要原理是DNA的同源重组。
具体的方法是：PCR扩增获得基因PST2700的上游及下游的同源片段（各500bp以上）与抗性盒（壮观霉素抗性盒，购自Thermo Fisher公司）连接，得到重组片段；用限制性内切酶EcoR I和BamH I对***载体pk18mobsacB进行双酶切，再通过无缝克隆试剂盒（购自Vazyme公司）将重组片段连接到***性载体pK18mobsacB上，构成重组载体，再通过三亲本接合的方法转化至施氏假单胞菌（A1501）中。此时同源片段会发生单交换，从而将载体整合到全基因组上，通过载体本身的抗性来筛选单交换突变株，第二次交换时***性载体sacB从基因组上被切割下来时会携带单交换时的部分基因，进而产生出两种产物，即缺失突变株和野生型菌株，比例约为1:1。
双交换的突变株可通过10%的蔗糖来筛选。
（2）实验结果：
经PCR测序验证PST2700基因成功敲除，命名为ΔPST2700。
实施例2
本实施例用于说明构建PST2700缺失突变株功能回补株和基因PST2700过表达重组工程菌株。
实验方法：
通过PCR扩增，获得完整PST2700基因，使用广宿主质粒pLAFR3，选择BamH I和HindIII酶切位点对其进行双酶切，使用无缝克隆试剂盒（购自Vazyme公司）将基因PST2700与酶切后的载体pLAFR3进行同源重组，最后通过转化大肠杆菌获得单菌落，挑取单菌落进行PCR验证成功获得DNA甲基转移酶重组质粒pLA-PST700。
分别将供体菌E.coli（PLAFR3-PST2700），助质粒PRK2013，受体菌：ΔPST2700或A1501在LB培养基中培养过夜，收集1mL过夜培养的菌液6000rpm离心10min，上清倒掉后用等体积生理盐水重悬，再次离心，将洗涤两次后的菌体沉淀用1mL生理盐水重悬混合后离心，用50µL生理盐水重悬菌体后滴到无抗性的固体平板，将平板放置30℃培养箱静置培养。24h后分别在1/2氯霉素、壮观霉素以及壮观霉素、卡那霉素的平板上划线，挑取单菌落验证，测序正确即获得PST2700缺失突变株功能回补株和过表达工程菌株A1501（PST2700）。
实施例3
本实施例用于说明DNA甲基转移酶序列同源性分析
（1）实验方法：
通过CDD结构域数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd），序列比对分析网站ClustalW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）和ESPript 3.0（https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php）对编码DNA甲基转移酶基因PST2700进行生物信息学分析。
（2）实验结果及结论：
编码DNA甲基转移酶的基因PST2700通过结构域预测分析鉴定为I类依赖SAM的甲基转移酶，与同基因家族的DNA甲基转移酶进行序列比对，相似度为36%。如图1所示，编码DNA甲基转移酶的基因PST2700鉴定为I类依赖SAM的甲基转移酶家族中新型DNA甲基转移酶。
实施例4
本实施例用于说明过表达工程菌株A1501（PST2700）生长能力分析。
（1）实验方法：
检测在LB培养基中缺失突变株ΔPST2700、PST2700缺失突变株功能回补株、底盘菌株A1501、过表达工程菌株A1501（PST2700）的生长情况，分析DNA甲基转移酶是否影响菌株生长，具体步骤如下：
（a）将缺失突变株ΔPST2700、PST2700缺失突变株功能回补株、底盘菌株A1501和过表达工程菌株A1501（PST2700）在LB液体培养基中培养，220rpm，30℃过夜培养；
（b）次日5000rpm条件下离心菌体10min；
（d）用生理盐水重悬菌体，清洗菌体两次；
（e）用LB培养基悬浮菌体，调OD600至1.0；
（f）将菌体接种在LB培养基中培养；
（g）利用全自动生长曲线仪器测量缺失突变株ΔPST2700、PST2700缺失突变株功能回补株、底盘菌株A1501和过表达工程菌株A1501（PST2700）在LB培养基中的生长曲线，参数设置，30℃，每隔4小时测定OD600。
（2）实验结果及结论：
如图2所示，在LB培养基中，过表达工程菌株A1501（PST2700）生长趋势与底盘菌株A1501相近。
因此，在LB培养基中，编码DNA甲基转移酶的基因PST2700并不影响菌株的生长。
实施例5
本实施例用于说明过表达工程菌株A1501（PST2700）的固氮酶活测定。
（1）实验方法：
通过乙炔还原法检测缺失突变株ΔPST2700、PST2700缺失突变株功能回补株、底盘菌株A1501和过表达工程菌株A1501（PST2700）的固氮能力，具体步骤如下：
（a）挑取新鲜活化的缺失突变株ΔPST2700、PST2700缺失突变株功能回补株、底盘菌株A1501和过表达工程菌株A1501（PST2700）的单菌落，接种于20mL新鲜LB液体培养基中，220rpm、30 °C过夜培养。
（b）次日将菌液在5000 rpm、4 °C条件下离心10min，去除上清后用20mL限制性K无氮培养基重悬洗涤菌体2次，在相同条件下离心10min。
（c）将洗涤后的菌液OD600调至1.0，在无菌的60mL盐水瓶中加入9mL限制性K无氮培养基和1mL OD600为1.0的菌液，初始OD600调为0.1，每个样品做3个平行重复。
（d）盖紧无菌黑橡胶塞，在瓶身做好标记，用压盖器给每个盐水瓶压紧铝盖，以确保瓶子的密封性。
（e）向每个盐水瓶内充氩气4min，以排净瓶中空气，向每个充好氩气的瓶中分别注入占瓶内空间0.5%的氧气和占瓶内空间10%的乙炔气。
（f）将注完气的盐水瓶置于220 rpm、30 °C条件下摇床培养，每隔2h测定一次酶活力。
（2）实验结果及结论：
如图3所示，与底盘菌株A1501相比，过表达工程菌株A1501（PST2700）的固氮酶活性提高20%。表明编码DNA甲基转移酶的基因PST2700能够显著提高底盘菌株A1501的固氮能力。
实施例6
本实施例用于说明过表达工程菌株A1501（PST2700）固氮酶基因表达量的分析。
（1）实验方法
通过qRT-PCR方法对缺失突变株ΔPST2700、PST2700缺失突变株功能回补株、底盘菌株A1501和过表达工程菌株A1501（PST2700）固氮基因（nifH、nifD、nifK）在固氮条件下的表达水平进行了分析。
（2）实验结果及结论：
如图4所示，与底盘固氮菌A1501相比，过表达工程菌株A1501（PST2700）固氮基因nifH、nifD、nifK在固氮条件下表达量分别提高7.5倍、13.5倍和10倍。表明在固氮条件下，编码DNA甲基转移酶的基因PST2700能够在转录后提高固氮基因的表达量。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (10)
1.甲基转移酶在增强固氮微生物的固氮能力方面的用途，其特征在于，所述甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，编码所述甲基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述用途，其中，所述固氮微生物为施氏假单胞菌。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中，增强固氮微生物的固氮能力包括提高固氮微生物中固氮酶活性和固氮基因的表达量。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述固氮基因为nifH、nifD和nifK。
6.一种增强固氮微生物的固氮能力的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将编码甲基转移酶的基因导入固氮微生物中并使其过表达；
所述甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
编码所述甲基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，编码所述甲基转移酶的基因通过重组表达载体导入固氮微生物中；
所述重组表达载体含有组成型启动子；所述组成型启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.3中的第1位-第176位所示。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述固氮微生物为施氏假单胞菌。
9.根据权利要求6-8中任意一项所述的方法，其中，增强固氮微生物菌的固氮能力包括提高固氮微生物中固氮酶活性和固氮基因的表达量。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述固氮基因为nifH、nifD和nifK。
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