CN115872895A - 用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂及其制备方法、应用 - Google Patents
用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂及其制备方法、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂及其制备方法、应用，涉及短链脂肪酸检测的技术领域，本发明提供的重标试剂能够衍生短链脂肪酸标准品作为内标，不仅有效解决了质谱检测手段中出现的灵敏度较差的问题，而且也解决了作为内源性物质的短链脂肪酸没有同位素内标的技术问题，同时，本发明在衍生化反应后引入的衍生终止反应有效改善了甲酸和乙酸的回收率，解决了由于甲酸和乙酸容易在色谱***中残留而导致的回收率不达标的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及短链脂肪酸检测的技术领域，尤其是涉及一种用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂及其制备方法、应用。
背景技术
脂肪酸是碳链和羧基所组成的化合物，它为体内中性脂肪、磷脂以及糖脂的主要成分。脂肪酸根据碳链长度可以分为短链脂肪酸，其碳链上的碳原子数小于6；中链脂肪酸，其碳链上的碳原子数为6-12；长链脂肪酸，其碳链上的碳原子数大于12。其中，短链脂肪酸在人体中，多由肠道中的细菌产生，对身体健康起着很重要的作用。
目前，在短链脂肪酸检测中，常用的质谱检测手段的灵敏度较差。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂，能够提高短链脂肪酸在质谱检测中的灵敏度，能够解决短链脂肪酸没有同位素内标的技术问题。
本发明的目的之二在于提供一种重标试剂的制备方法，合成方法简单，成本低。
本发明的目的之三在于提供一种重标试剂的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，一种用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂，具有如下结构：
第二方面，一种重标试剂的制备方法，包括以下步骤：
3-硝基苯胺-D4经重氮化反应，得到重氮盐，之后经还原反应，得到所述重标试剂。
进一步的，所述重氮化反应的温度为0 ℃；
所述还原反应的温度为0 ℃。
第三方面，一种重标试剂在短链脂肪酸检测中的应用。
进一步的，所述短链脂肪酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、己酸、异己酸、2-甲基戊酸以及3-甲基戊酸中的至少一种。
进一步的，所述短链脂肪酸检测包括以下步骤：
（a）在质谱检测中，用所述重标试剂衍生短链脂肪酸标准品作为内标；
（b）取生物样本与3-硝基苯肼进行衍生化反应，得到待测样品，将所述待测样品进行质谱检测。
进一步的，所述质谱检测包括电喷雾离子源质谱检测。
进一步的，所述衍生化反应的催化剂包括吡啶；
所述衍生化反应的活化剂包括N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺。
进一步的，所述衍生化反应之后还包括终止衍生化反应的步骤。
进一步的，所述终止衍生化反应的试剂包括二硫苏糖醇和柠檬酸。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
本发明提供的用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂，能够与短链脂肪酸发生反应以生成短链脂肪酸衍生物，进而能够作为短链脂肪酸质谱检测中的内标，这不仅有效解决了质谱检测手段中出现的灵敏度较差的问题，而且也解决了作为内源性物质的短链脂肪酸没有同位素内标的技术问题。
本发明提供的重标试剂的制备方法，合成方法简单，成本低。
本发明提供的重标试剂的应用，能够有效解决短链脂肪酸在质谱检测中出现的灵敏度差的问题和短链脂肪酸没有同位素内标的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种实施方式提供的重标试剂的制备流程图；
图2为本发明实施例2提供的12种短链脂肪酸的区分色谱图；
图3为本发明试验例1得到的甲酸经3-NPH衍生后的进样结果图；
图4为本发明试验例1得到的甲酸经3-NPH-D4衍生后的进样结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的第一个方面，提供了一种用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂，具有如下结构：
本发明提供的用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂，能够与短链脂肪酸发生反应以生成短链脂肪酸衍生物，进而能够作为短链脂肪酸质谱检测中的内标，这不仅有效解决了质谱检测手段中出现的灵敏度较差的问题，而且也解决了作为内源性物质的短链脂肪酸没有同位素内标的技术问题。
根据本发明的第二个方面，提供了一种重标试剂的制备方法，包括以下步骤：
3-硝基苯胺-D4经重氮化反应，得到重氮盐，之后经还原反应，得到重标试剂。
在一种优选的实施方式中，本发明中重氮化反应的温度可以为0 ℃，还原反应的温度可以为0 ℃，更有利于提高重标试剂的合成效果。
一种重标试剂（3-硝基苯肼-氘4）的典型的制备方法，见图1，包括以下步骤：
步骤一：加入3-硝基苯胺-D4和6M HCl到烧瓶中混合，之后在0 ℃的温度下加入亚硝酸钠的水溶液，在0 ℃的温度下搅拌反应体系30分钟，得到重氮盐水溶液；
步骤二：氯化亚锡二水合物溶于盐酸后于0 ℃的温度下加入到已制备好的重氮盐水溶液中，在0 ℃的温度下搅拌反应体系1小时，之后过滤，弃去滤液，滤饼重结晶，得到3-硝基苯肼-氘4。
本发明提供的重标试剂的制备方法，合成方法简单，成本低。
根据本发明的第三个方面，提供了一种重标试剂在短链脂肪酸检测中的应用。
本发明提供的重标试剂的应用，能够有效解决短链脂肪酸在质谱检测中出现的灵敏度差的问题和短链脂肪酸没有同位素内标的问题。
在一种优选的实施方式中，本发明中的短链脂肪酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、己酸、异己酸、2-甲基戊酸以及3-甲基戊酸中的至少一种。
在一种优选的实施方式中，本发明中的短链脂肪酸检测包括以下步骤：
（a）在质谱检测中，用重标试剂衍生短链脂肪酸标准品作为内标，通过衍生实现每种短链脂肪酸都有对应的同位素内标；
（b）取生物样本与3-硝基苯肼进行衍生化反应，得到待测样品，将该待测样品进行质谱检测，能够同时检测12种上述的短链脂肪酸。
在一种优选的实施方式中，本发明中的谱检测包括但不限于电喷雾离子源质谱检测，更有利于提高检测的灵敏度，有利于同时检测12种短链脂肪酸。
在一种优选的实施方式中，本发明中衍生化反应的催化剂包括但不限于吡啶；衍生化反应的活化剂包括但不限于N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺。
本发明中选择的衍生化反应的催化剂和活化剂更有利于短链脂肪酸的衍生，提高衍生化反应的效果。
在一种优选的实施方式中，在衍生化反应之后还包括终止衍生化反应的步骤。
由于甲酸和乙酸很容易残留在色谱仪器中，所以过量的衍生化试剂会将残留的甲酸和乙酸衍生化，从而引起检测过程中甲酸和乙酸两种物质在空白样本中的残留，导致影响该物质的回收率，为了解决该问题，本发明在衍生化反应后引入了终止反应，向衍生后的体系中加入终止试剂以消耗过量的EDC（N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺）而终止反应，从而使空白样本中衍生化的甲酸和乙酸信号，以及EDC含量得以显著降低。
在本发明中，用于终止衍生化反应的终止试剂包括但不限于二硫苏糖醇和柠檬酸中的至少一种，更有利于消耗过量的EDC而终止衍生化反应，解决甲酸和乙酸的残留问题。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1
一种用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂，可记为3-NPH-D4（3-硝基苯肼-氘4），结构如下：
本实施例的重标试剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：加入3-硝基苯胺-D4和6M HCl到烧瓶中混合，之后在0 ℃的温度下加入亚硝酸钠的水溶液，在0 ℃的温度下搅拌反应体系30分钟，得到重氮盐水溶液；
步骤二：氯化亚锡二水合物溶于盐酸后于0 ℃的温度下加入到已制备好的重氮盐水溶液中，在0 ℃的温度下搅拌反应体系1小时，之后过滤，弃去滤液，滤饼重结晶，得到3-硝基苯肼-氘4。
实施例2
一种短链脂肪酸的电喷雾离子源质谱（ESI-MS）检测方法，包括以下步骤：
（a）混标配制：用移液器分别移取12种短链脂肪酸母液，混匀，制得12种标准品（甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、己酸、异己酸、2-甲基戊酸、3-甲基戊酸）的混标母液（10ug/ml）；
（b）内标配制：用移液器移取100μl混标母液，加入400μl 80%甲醇水溶液，得到500μl混合液，混匀离心，取上清液50μl，加入50ul 160mM实施例1提供的3-NPH-D4（3-硝基苯肼-氘4）（80%甲醇水）、50ul 120mM EDC（N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺）（甲醇）以及50ul 8%吡啶（甲醇），之后在40℃的温度下衍生40min，取50ul衍生后的样本，加入125ul 1M 二硫苏糖醇和12.5ul 1M柠檬酸，混匀后室温反应2小时，得到内标母液（10ug/ml）；
（c）线性配制：用移液器移取100μl混标母液，加入400μl 80%甲醇水溶液，得到500μl混合液，混匀离心，取上清液50μl，加入50ul 160mM 3-NPH（3-硝基苯肼）（80%甲醇水）、50ul 120mM EDC（甲醇）以及50ul 8%吡啶（甲醇），之后在40℃的温度下衍生40min，取50ul衍生后的样本，加入125ul 1M二硫苏糖醇和12.5ul 1M柠檬酸，混匀后室温反应2小时，得到线性母液，稀释成线性后，取各点99ul分别加入1ul混合内标溶液（10ug/ml）；
（d）生物样本提取方法：将生物样本100mg或100ul用400ul 80%甲醇提取，离心，取上清液，得到提取的生物样本；
（e）衍生方法：取50ul提取的生物样本，加50ul 160mM 3-NPH（80%甲醇溶解，衍生试剂）、50ul 8%吡啶（甲醇溶剂，催化剂）以及50ul 160mM EDC（甲醇溶解，活化剂）混匀，之后在40℃的温度下反应40min，取50ul衍生后的样本，加入125ul 1M二硫苏糖醇和12.5ul1M柠檬酸，混匀后室温反应2小时，取上清夜99ul和1ul混合内标溶液（10ug/ml）混匀，得到待测样品，上机测试：
（f）空白样本配制：用移液器移取100μl水，加入400μl 80%甲醇水溶液，得到500μl混合液，混匀离心，取上清液50μl，加入50ul 160mM 3-NPH-D4（3-硝基苯肼-氘4）（80%甲醇水）、50ul 120mM EDC（甲醇）以及50ul 8%吡啶（甲醇）混匀，之后在40℃的温度下衍生40min，取50ul衍生后的样本，加入125ul 1M二硫苏糖醇和12.5ul 1M柠檬酸，混匀后室温反应2小时，得到空白样本。
检测条件如下：
质谱条件：
电喷雾电离（ESI）源，离子源温度550oC，离子源电压负/正模式-4500，鞘气35psi，辅助气50psi，碰撞气55psi；采用多重反应监测（MRM）进行扫描；
标准品和内标的质谱检测参数见下表：
色谱条件：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7um，2.1X100mm；
流动相：A相：10mM乙酸铵水；
B相：50%乙腈异丙醇；
柱温：40oC；
进样量：2μl；
色谱梯度如下表所示：
检测物质：12种短链脂肪酸如下表所示：
12种短链脂肪酸中包含多个同分异构体，通过调节色谱的方法可以将同分异构体进行区分，如图2所示（横坐标为时间/min）。
试验例1
以甲酸为例，分别使用3-NPH（3-硝基苯肼）和实施例1提供的3-NPH-D4（3-硝基苯肼-氘4）进行衍生，之后通过针泵模式进样，结果如图3（使用3-NPH进行衍生）和图4（使用3-NPH-D4进行衍生）所示（横坐标m/z，Da），由图3和图4可知，甲酸经3-NPH-D4衍生后，其母离子质核比（184.2）和子离子质核比（141.0）比经3-NPH衍生后的母离子质核比（180.1）和子离子质核比（137.2）增加了4，说明甲酸经过3-NPH-D4的衍生后成功生成了甲酸-D4。
试验例2
甲酸和乙酸很容易残留在色谱仪器中，过量的衍生化试剂则会将残留的甲酸和乙酸衍生化，导致检测过程中甲酸和乙酸残留在空白样本中，进而影响该物质的回收率。为了解决该问题，在衍生化反应后引入终止反应，即向衍生后的体系中加入二硫苏糖醇和柠檬酸以消耗过量的EDC，实现终止反应，这样一来空白样本中衍生化的甲酸和乙酸信号，以及EDC的含量均得到显著降低，如下表所示。
综上所述，针对短链脂肪酸的检测，常用的质谱检测手段会出现灵敏度较差的情况，本发明采用的衍生方法能够有效解决上述问题；由于短链脂肪酸是内源性物质而没有同位素内标，本发明在衍生化过程中，首次使用了3-NPH-D4（3-硝基苯肼-氘4）的重标衍生化试剂，解决了短链脂肪酸没有同位素内标的问题；此外，甲酸和乙酸容易在色谱***中残留而导致回收率不达标，本发明在衍生化反应后引入了终止反应，进而有效改善了甲酸和乙酸的回收率。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种用于衍生短链脂肪酸标准品作为内标的重标试剂，其特征在于，具有如下结构：
2.一种权利要求1所述的重标试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3-硝基苯胺-D4经重氮化反应，得到重氮盐，之后经还原反应，得到所述重标试剂。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述重氮化反应的温度为0 ℃；
所述还原反应的温度为0 ℃。
4.一种权利要求1所述的重标试剂在短链脂肪酸检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述短链脂肪酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、己酸、异己酸、2-甲基戊酸以及3-甲基戊酸中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述短链脂肪酸检测包括以下步骤：
（a）在质谱检测中，用所述重标试剂衍生短链脂肪酸标准品作为内标；
（b）取生物样本与3-硝基苯肼进行衍生化反应，得到待测样品，将所述待测样品进行质谱检测。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述质谱检测包括电喷雾离子源质谱检测。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述衍生化反应的催化剂包括吡啶；
所述衍生化反应的活化剂包括N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述衍生化反应之后还包括终止衍生化反应的步骤。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述终止衍生化反应的试剂包括二硫苏糖醇和柠檬酸。
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