CN115112810B - 一种用于25羟基维生素d检测的样品前处理方法和应用 - Google Patents

一种用于25羟基维生素d检测的样品前处理方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种用于25羟基维生素D检测的样品前处理方法和应用。该方法包括：S1，将待测样品与25羟基维生素D内标准品溶液混合后再与蛋白解除剂溶液混合，静置后，获得混合液；S2，将样品处理板与样品收集板进行叠合固定，然后将混合液转移至样品处理板的对应孔中，待混合液全部浸入至样品处理板孔中的筛板后进行静置；S3，在样品处理板的对应孔中加入萃取剂，待样品处理板孔中的液体全部流至样品收集板的对应孔中后进行静置，重复操作2~5次，获得收集液；S4，将样品收集板对应孔中的收集液用惰性气体吹干，得到的固体用复溶液进行复溶，获得样品前处理液。该方法能同时完成样品富集和纯化，提高了25羟基维生素D检测的准确度。

Description

一种用于25羟基维生素D检测的样品前处理方法和应用
技术领域
本申请涉及25羟基维生素D检测的技术领域，尤其是涉及一种用于25羟基维生素D检测的样品前处理方法和应用。
背景技术
维生素D(vitaminD)为脂溶性的固醇类物质，简称VD，其被认为是黄金激素，具有极广泛的生理功能，通过促进食物中钙、磷在肠道、肾脏等脏器中的吸收代谢功能以维持骨骼健康。VD缺乏与各类肿瘤、高血压、糖尿病、心血管疾病及自身免疫性疾病等多种疾病呈高度相关性。维生素D家族成员中最重要的成员是VD2(麦角钙化醇)和VD3(胆钙化醇)，其中VD2通过膳食途径摄入，如酵母或真菌类食物，而VD3则大部分是人体经光照将皮肤中的7-脱氢胆固醇转化得到的，但也能通过饮食获得，如鱼、鱼肝油或蛋黄等食物。
维生素D在肝脏中可转化为25-羟基维生素D，从而被机体转运或储藏，另外25-羟基维生素D在体内稳定，半衰期长，其浓度水平与体内维生素D含量直接相关，因此25-羟基维生素D可作为一类主要的生物标志物用于体现人体维生素D的营养水平。
目前，25-羟基维生素D的检测方法有多种，包括免疫检测、高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)等。但是血清中88％左右的25-羟基维生素D与维生素D结合蛋白(DBP)结合，12％左右的25-羟基维生素D与白蛋白结合，同时人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此对25-羟基维生素D检测时存在严重的干扰。
为了精确测量血清中25-羟基维生素D的浓度，需要对待测样品进行前处理，以将25-羟基维生素D从结合蛋白上释放出来，同时还需去除基质中的干扰物质。然而现有技术中存在的对待测样品进行前处理的方法效果不佳，例如25-羟基维生素D不能被有效释放或者基质中的干扰物质不能有效去除等。因此需要提供一种能够对25羟基维生素D进行准确检测的样品前处理方法。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种新的用于25羟基维生素D检测的样品前处理方法，所述方法能同时完成样品富集和纯化，且经处理后获得的样品前处理液中25羟基维生素D的收率高，提高了待测样品中25羟基维生素D检测的准确度。
对此，本申请第一方面提供了一种用于25羟基维生素D检测的样品前处理方法，所述方法包括以下步骤：
S1，将待测样品与25羟基维生素D内标准品溶液混合后再与蛋白解除剂溶液混合，静置后，获得混合液；
S2，将样品处理板与样品收集板进行叠合固定，然后将所述混合液转移至所述样品处理板的对应孔中，待所述混合液全部浸入至样品处理板孔中的筛板后进行静置；
S3，在所述样品处理板的对应孔中加入萃取剂，待样品处理板孔中的液体全部流至样品收集板的对应孔中后进行静置，重复操作2～5次，获得收集液；
S4，将样品收集板对应孔中的所述收集液用惰性气体吹干，得到的固体用复溶液进行复溶，获得样品前处理液；
其中，所述蛋白解除剂溶液中包括0.8～1.0wt％的全氟庚酸，0.1～0.3wt％的二甲基甲酰胺，0.1～0.5wt％的异丙醇和98～99wt％的Tris-HCl缓冲液。
本申请中，所述前处理方法先将待测样品中的25羟基维生素D与其结合蛋白进行解离，进而将25羟基维生素D释放至混合液中，然后采用萃取剂对混合液中的25羟基维生素D进行充分萃取，获得包含萃取的25羟基维生素D的收集液，然后对收集液中的25羟基维生素D的进行富集，最终获得含有富集的25羟基维生素D的样品前处理液，该样品前处理液可以直接用于后续的检测。
本申请中，所述蛋白解除剂溶液中的全氟庚酸、二甲基甲酰胺和异丙醇能够发生协同作用，进而使25羟基维生素D与其结合蛋白充分解离，并最终提高待测样品中25羟基维生素D检测的准确性；所述蛋白解除剂溶液中的Tris-HCl缓冲液用于稳定蛋白解除剂溶液的pH值。
本申请中，所述样品处理板与样品收集板均为多孔板，且所述样品处理板与样品收集板具有相同数量的孔。因此，将所述样品处理板与样品收集板进行叠合固定后，所述样品处理板与样品收集板上的孔一一对应。
在一些实施方式中，所述Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.05～0.1M。
在一些具体实施方式中，所述蛋白解除剂溶液中仅由0.8～1.0wt％的全氟庚酸，0.1～0.3wt％的二甲基甲酰胺，0.1～0.5wt％的异丙醇和98～99wt％的Tris-HCl缓冲液组成，所述Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.05～0.1M。
在一些优选的具体实施方式中，所述蛋白解除剂溶液包括1.0wt％的全氟庚酸，0.2wt％的二甲基甲酰胺，0.3wt％的异丙醇和98.5wt％的Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.05M。
本申请通过将蛋白解除剂溶液中的各组分的含量控制在上述范围内，能够使所述蛋白解除剂溶液的性能最佳。
在一些实施方式中，所述蛋白解除剂溶液的pH值为6.8～7.2。
在一些具体实施方式中，所述蛋白解除剂溶液的pH值为7.0。
本申请中，当蛋白解除剂溶液的pH值为7时，能够使所述蛋白解除剂溶液的性能最佳。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述待测样品与所述25羟基维生素D内标准品溶液的体积比为10:(1～2)。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述待测样品与所述蛋白解除剂溶液的体积比为1:(1～5)。在一些具体实施例中，步骤S1中，所述待测样品与所述蛋白解除剂溶液的体积比可以为1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。在一些优选的实施方式中，步骤S1中，所述待测样品与所述蛋白解除剂溶液的体积比为1:(2～3)。
本申请通过将所述待测样品与所述蛋白解除剂溶液的体积比控制在上述范围内，能够使待测样品中25羟基维生素D与其结合蛋白充分解离，所述蛋白解除剂溶液的体积的过多或过少，均会降低所述蛋白解除剂溶液的解离效果。
在一些实施方式中，所述样品处理板孔中的筛板为活性炭筛板。
本申请中，所述活性炭筛板具有发达的微孔结构，能够有效吸附或者去除待测样品(如血清样品)中的磷脂等干扰物质。血清中的磷脂是基质效应的主要来源，可造成分析结果的差异性，并导致无法预测的质谱结果。本申请中的活性炭筛板能选择性吸附导致离子抑制作用的磷脂类干扰物质，且不会造成25羟基维生素D的损失，因此为含脂的待测样品提供了优良的净化效果，从而能够有效地提高仪器检测25羟基维生素D的准确性和灵敏度。
在一些实施方式中，步骤S3中，所述萃取剂为正己烷和甲基叔丁基醚的混合溶剂；所述混合溶剂中正己烷和甲基叔丁基醚的体积比为(1～3):(1～3)。
现有技术中多采用正己烷作为萃取剂萃取溶液中的25羟基维生素D。而本申请的发明人通过研究发现，采用正己烷和甲基叔丁基醚的混合溶剂作为萃取剂时，能够发挥协同效果，进而明显提升萃取剂的萃取效果。
在一些实施例中，所述混合溶剂中正己烷和甲基叔丁基醚的体积比可以为1:1、2:1、3:1、1:2或1:3等。在一些优选的实施方式中，所述混合溶剂中正己烷和甲基叔丁基醚的体积比为(1～3):1。在一些最优选的实施方式中，所述混合溶剂中正己烷和甲基叔丁基醚的体积比为2:1。
本申请通过将所述混合溶剂中正己烷和甲基叔丁基醚的体积比控制在上述范围内，能够使萃取剂的萃取25羟基维生素D的效果最佳。
在一些实施方式中，所述萃取剂与待测样品的体积比为(2～5):1。在一些实施例中，所述萃取剂与待测样品的体积比为2:1、3:1、4:1或5:1等。在一些优选的实施方式中，所述萃取剂与待测样品的体积比为(4～5):1。
本申请通过将所述萃取剂与待测样品的体积比控制在上述范围内，能够充分对25羟基维生素D进行萃取。
在一些实施方式中，步骤S4中，所述复溶液为甲醇和水的混合溶液；所述混合溶液中甲醇和水的体积比为(2～4):1。
本申请中，所述复溶液用于溶解经净化并富集后的25羟基维生素D形成待测物，所述待测物可以直接用于后续的液相色谱串联质谱检测。
在一些具体的实施方式中，所述复溶液中甲醇和水的体积比为4:1。
本申请对步骤S4中所采用的惰性气体的种类没有明确限定，其可以为本领域技术人员的常规选择。在一些具体实施例中，所述惰性气体可以为氮气。
在一些实施方式中，步骤S4中，所述吹干在温度为35～40℃的条件下进行。
本申请中，所述吹干在较低温度下进行，避免温度过高对25羟基维生素D带来损害。
本申请中，步骤S1中静置的时间至少为5分钟，例如为8分钟；步骤S2中静置的时间为3～5分钟，例如为5分钟；步骤S3中静置的时间为1～3分钟，例如为2分钟。
本申请第二方面提供了一种血清中25羟基维生素D的检测方法，其采用如本申请第一方面所述的前处理方法对待测样品进行前处理获得样品前处理液，并将所述样品前处理液作为待测物进行检测，所述检测的方法为高效液相色谱串联质谱法。
本申请中，通过高效液相色谱串联质谱法检测待测物中的25羟基维生素D时，具体的检测参数为本领域技术人员的常规选择。
本申请中的待测样品可以为血清、血浆等。
本申请的有益技术效果为：本申请所提供的用于25羟基维生素D检测的样品前处理方法能充分释放和萃取待测样本中的25羟基维生素D，同时完成待测样品中25羟基维生素D纯化和富集，使获得的样品前处理液中25羟基维生素D的含量和纯度高，提高了待测样品中25羟基维生素D检测的准确度。另外获得的样品前处理液可以直接作为高效液相色谱串联质谱法待测物，进行上样检测。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：待测血清的样品前处理方法
(1)在离心管中加入100uL待测血清，然后加入10uL的25羟基维生素D内标准品溶液，涡旋混匀30s以上；然后在离心管中加入200uL蛋白解除剂溶液，涡旋混匀，静置8分钟，获得混合液；
(2)将所述混合液转移至样品处理板的对应孔中，待所述混合液全部浸入至样品处理板孔中的活性炭筛板后，静置5分钟；
(3)将所述样品处理板与样品收集板进行叠合固定，然后在所述样品处理板的对应孔中加入300uL萃取剂，靠重力自然滴落，待样品处理板孔中的液体全部流至样品收集板的对应孔中后静置2分钟，重复该操作3次，合并收集液；
(4)在40℃条件下将样品收集板对应孔中的所述收集液用氮气吹干，获得的固体用100μL复溶液进行复溶，获得样品前处理液1；
其中，所述蛋白解除剂溶液中包括1.0wt％的全氟庚酸，0.2wt％的二甲基甲酰胺，0.3wt％的异丙醇和98.5wt％的0.05M Tris-HCl缓冲液，蛋白解除剂溶液的pH值为7；待测血清与蛋白解除剂溶液的体积比为1:2；
所述萃取剂为正己烷和甲基叔丁基醚的混合溶剂，混合溶剂中正己烷和甲基叔丁基醚的体积比为2:1；萃取剂与待测血清的体积比为4:1；
所述复溶液为甲醇和水的混合溶液，混合溶液中甲醇和水的体积比为4:1。
实施例2：待测血清的样品前处理方法
基本过程同实施例1，不同之处在于，所述蛋白解除剂溶液中包括0.8wt％的全氟庚酸，0.3wt％的二甲基甲酰胺，0.4wt％的异丙醇和98.5wt％的0.05M Tris-HCl缓冲液，蛋白解除剂溶液的pH值为7。
最终获得样品处理液2。
实施例3：待测血清的样品前处理方法
基本过程同实施例1，不同之处在于，待测血清与蛋白解除剂溶液的体积比为1:1。
最终获得样品处理液3。
实施例4：待测血清的样品前处理方法
基本过程同实施例1，不同之处在于，待测血清与蛋白解除剂溶液的体积比为1:5。
最终获得样品处理液4。
实施例5：待测血清的样品前处理方法
基本过程同实施例1，不同之处在于，正己烷和甲基叔丁基醚的混合溶剂中正己烷和甲基叔丁基醚的体积比为3:1。
最终获得样品处理液5。
实施例6：待测血清的样品前处理方法
基本过程同实施例1，不同之处在于，正己烷和甲基叔丁基醚的混合溶剂中正己烷和甲基叔丁基醚的体积比为1:3。
最终获得样品处理液6。
实施例7：待测血清的样品前处理方法
基本过程同实施例1，不同之处在于，萃取剂与待测血清的体积比为2:1。
最终获得样品处理液7。
对比例1
基本过程同实施例1，不同之处在于，所述蛋白解除剂溶液中包括1.2wt％的全氟庚酸，0.3wt％的异丙醇和98.5wt％的0.05M Tris-HCl缓冲液，蛋白解除剂溶液的pH值为7。
最终获得样品处理液8。
对比例2
基本过程同实施例1，不同之处在于，所述蛋白解除剂溶液中包括1.3wt％的全氟庚酸，0.2wt％的二甲基甲酰胺和98.5wt％的0.05M Tris-HCl缓冲液，蛋白解除剂溶液的pH值为7。
最终获得样品处理液9。
对比例3
基本过程同实施例1，不同之处在于，所述萃取剂为正己烷。
最终获得样品处理液10。
实施例8：待测血清中25羟基维生素D的检测
将实施例1-7和对比例1-3中获得的样品处理液1-10分别作为待测物1-10用于检测其中的25羟基维生素D。将所述待测物1-10分别上样至高效液相色谱串联质谱仪，采用高效液相色谱串联质谱法进行检测。
高效液相色谱采用梯度洗脱模式，液相色谱条件为：
色谱柱：Phenomenex Kinetex C18Column(4.6x50mm,2.6μm,
Figure BDA0003737454730000061
)；
色谱柱柱温：25℃；
进样量：20μL；
流速：1.0mL/min；
流动相：流动相A为含0.2％甲酸的水，流动相B为含0.2％甲酸的甲醇；所述梯度洗脱的条件如下表1所示：
表1
时间(min) 流速(mL/min) 流动A相比例(％) 流动相B比例(％)
0.00 1.00 18 82
3.50 1.00 10 90
3.51 1.00 0 100
4.60 1.00 0 100
4.61 1.00 18 82
5.50 1.00 18 82
所述质谱法采用正离子模式，并采用多反应监测MRM的扫描方式，所述多反应监测MRM的参数如下表2所示：
表2
Figure BDA0003737454730000071
所述质谱中质谱离子源参数如下：
电离源：大气压化学电离APCI源；
喷雾气(GS1)压力：60psi；
温度(TEM)：550℃；
电晕针(NC)电流：5μA；
气帘气(CUR)：30psi；
碰撞气(CAD)：5psi。
根据上述试验条件，对上述待测物1-10分别进行检测，每个样本重复检测3次，并根据建立的标准曲线计算检测结果(取平均值)，准确度(加标回收率)分别如下表3-12所示。
表3：待测物1的检测结果
项目 理论值(ng/mL) 检测值(ng/mL) 加标回收率
25羟基维生素D2-L 3.0 2.74 91.33％
25羟基维生素D2-M 14.4 14.12 98.06％
25羟基维生素D2-H 28.8 29.07 100.10％
25羟基维生素D3-L 7.5 7.69 102.53％
25羟基维生素D3-M 36.0 35.71 99.19％
25羟基维生素D3-H 72.0 72.90 101.25％
表4：待测物2的检测结果
项目 理论值(ng/mL) 检测值(ng/mL) 加标回收率
25羟基维生素D2-L 3.0 2.69 89.67％
25羟基维生素D2-M 14.4 15.01 104.24％
25羟基维生素D2-H 28.8 29.80 103.47％
25羟基维生素D3-L 7.5 7.92 105.60％
25羟基维生素D3-M 36.0 35.02 97.28％
25羟基维生素D3-H 72.0 73.81 102.51％
表5：待测物3的检测结果
项目 理论值(ng/mL) 检测值(ng/mL) 加标回收率
25羟基维生素D2-L 3.0 2.64 88.00％
25羟基维生素D2-M 14.4 13.98 97.08％
25羟基维生素D2-H 28.8 29.81 103.51％
25羟基维生素D3-L 7.5 7.01 93.47％
25羟基维生素D3-M 36.0 35.22 97.83％
25羟基维生素D3-H 72.0 70.29 97.63％
表6：待测物4的检测结果
Figure BDA0003737454730000081
Figure BDA0003737454730000091
表7：待测物5的检测结果
项目 理论值(ng/mL) 检测值(ng/mL) 加标回收率
25羟基维生素D2-L 3.0 2.70 90.00％
25羟基维生素D2-M 14.4 14.58 101.25％
25羟基维生素D2-H 28.8 29.42 102.15％
25羟基维生素D3-L 7.5 7.81 104.13％
25羟基维生素D3-M 36.0 36.87 102.42％
25羟基维生素D3-H 72.0 73.02 101.42％
表8：待测物6的检测结果
项目 理论值(ng/mL) 检测值(ng/mL) 加标回收率
25羟基维生素D2-L 3.0 2.63 87.66％
25羟基维生素D2-M 14.4 13.57 94.24％
25羟基维生素D2-H 28.8 26.35 91.49％
25羟基维生素D3-L 7.5 6.82 90.93％
25羟基维生素D3-M 36.0 34.92 97.00％
25羟基维生素D3-H 72.0 69.08 95.94％
表9：待测物7的检测结果
项目 理论值(ng/mL) 检测值(ng/mL) 加标回收率
25羟基维生素D2-L 3.0 2.65 88.33％
25羟基维生素D2-M 14.4 13.72 95.28％
25羟基维生素D2-H 28.8 30.15 104.69％
25羟基维生素D3-L 7.5 6.91 92.13％
25羟基维生素D3-M 36.0 34.22 95.06％
25羟基维生素D3-H 72.0 74.13 102.96％
表10：待测物8的检测结果
Figure BDA0003737454730000092
Figure BDA0003737454730000101
表11：待测物9的检测结果
项目 理论值(ng/mL) 检测值(ng/mL) 加标回收率
25羟基维生素D2-L 3.0 2.32 77.33％
25羟基维生素D2-M 14.4 12.37 85.90％
25羟基维生素D2-H 28.8 24.86 86.32％
25羟基维生素D3-L 7.5 6.42 85.60％
25羟基维生素D3-M 36.0 32.17 89.36％
25羟基维生素D3-H 72.0 65.83 91.43％
表12：待测物10的检测结果
项目 理论值(ng/mL) 检测值(ng/mL) 加标回收率
25羟基维生素D2-L 3.0 2.41 80.33％
25羟基维生素D2-M 14.4 12.85 89.24％
25羟基维生素D2-H 28.8 25.63 88.99％
25羟基维生素D3-L 7.5 6.37 84.93％
25羟基维生素D3-M 36.0 31.05 86.25％
25羟基维生素D3-H 72.0 65.39 90.81％
从表3-12的结果可知，相较于对比例1-3的前处理方法，将本申请实施例1-7所述样品前处理方法处理后获得的样品处理液作为待测物进行25羟基维生素D的检测结果的准确性更好，且经实施例1所述样品前处理方法方法处理后获得的待测物的检测结果的准确性最优。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (8)

1.一种用于25羟基维生素D检测的样品前处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1，将待测样品与25羟基维生素D内标准品溶液混合后再与蛋白解除剂溶液混合，静置后，获得混合液；
S2，将样品处理板与样品收集板进行叠合固定，然后将所述混合液转移至所述样品处理板的对应孔中，待所述混合液全部浸入至样品处理板孔中的筛板后进行静置；
S3，在所述样品处理板的对应孔中加入萃取剂，待样品处理板孔中的液体全部流至样品收集板的对应孔中后进行静置，重复操作2~5次，获得收集液；
S4，将样品收集板对应孔中的所述收集液用惰性气体吹干，得到的固体用复溶液进行复溶，获得样品前处理液；
其中，所述蛋白解除剂溶液中包括0.8~1.0wt%的全氟庚酸，0.2~0.3wt%的二甲基甲酰胺，0.3~0.4wt%的异丙醇和98.5wt%的Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.05M，所述蛋白解除剂溶液的pH值为7.0；
所述萃取剂为正己烷和甲基叔丁基醚的混合溶剂；所述混合溶剂中正己烷和甲基叔丁基醚的体积比为（1~3）:（1~3）。
2.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测样品与所述25羟基维生素D内标准品溶液的体积比为10:（1~2）。
3.根据权利要求1或2所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测样品与所述蛋白解除剂溶液的体积比为1:（1~5）。
4.根据权利要求1或2所述的样品前处理方法，其特征在于，所述样品处理板孔中的筛板为活性炭筛板。
5.根据权利要求1或2所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤S3中，所述萃取剂与待测样品的体积比为（2~4）:1。
6.根据权利要求1或2所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤S4中，所述复溶液为甲醇和水的混合溶液；所述混合溶液中甲醇和水的体积比为（2~4）:1。
7.根据权利要求1或2所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤S4中，所述吹干在温度为35~40℃的条件下进行。
8.一种待测样品中25羟基维生素D的检测方法，其采用如权利要求1-7中任意一项所述的前处理方法对待测样品进行前处理获得样品前处理液，并将所述样品前处理液作为待测物进行检测，所述检测的方法为高效液相色谱串联质谱法。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109212091A (zh) * 2018-10-24 2019-01-15 天津国科医工科技发展有限公司 血清中25-羟基维生素d液相色谱串联质谱联用检测方法及试剂盒
CN109781909A (zh) * 2019-03-20 2019-05-21 上海润达榕嘉生物科技有限公司 一种人血清25-羟基维生素d的检测方法及试剂盒

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109212091A (zh) * 2018-10-24 2019-01-15 天津国科医工科技发展有限公司 血清中25-羟基维生素d液相色谱串联质谱联用检测方法及试剂盒
CN109781909A (zh) * 2019-03-20 2019-05-21 上海润达榕嘉生物科技有限公司 一种人血清25-羟基维生素d的检测方法及试剂盒

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