CN112557557A

CN112557557A - 检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法

Info

Publication number: CN112557557A
Application number: CN202011402903.4A
Authority: CN
Inventors: 李曼; 张嘉楠; 曹秀梅; 李宏娟; 杨赵伟; 张珍珍; 王爱卿; 段培姿; 马珊珊; 王狄; 李博; 侯桂双; 陈军; 王艳华; 郭万加
Original assignee: Qinhuangdao Agricultural Product Quality And Safety Supervision And Inspection Center Qinhuangdao Veterinary Drug Supervision Institute Qinhuangdao Feed Monitoring Station
Current assignee: Qinhuangdao Agricultural Product Quality And Safety Supervision And Inspection Center Qinhuangdao Veterinary Drug Supervision Institute Qinhuangdao Feed Monitoring Station
Priority date: 2020-12-04
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2021-03-26

Abstract

本发明涉及抗生素检测技术领域，提出了检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，包括S1、样品前处理：取蔬菜样品冷冻干燥后，磨碎后过筛，得过筛样品；S2、样品粗提：在过筛样品中加入提取剂对样品进行提取；S3、二次提取；S4、浓缩定容过滤；S5、进行高效液相色谱‑串联质谱分析，得到残留量。通过上述技术方案，解决了现有技术中的前处理手段复杂，不能实现较好的分离提取，所能检测的抗生素种类单一问题。

Description

检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法

技术领域

本发明涉及抗生素检测技术领域，具体的，涉及检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法。

背景技术

抗生素是指由微生物或高等动植物在生活过程中产生的次级代谢产物或由人工根据抗生素的化学结构合成的类似物。抗生素可以随着食物链的传递不断累积，达到一定浓度后严重危害人体健康。随着人民生活水平的不断提高，人们越来越重视营养均衡，对素食蔬菜的需求量也逐渐增大，同时，由抗生素带来的食品安全问题也愈发受到大家的关注。因此，需要通过不断优化蔬菜中抗生素的分析检测技术来为食品安全提供支撑、为国民吃得放心提供保障。

现有的检测技术前处理手段复杂，不能实现较好的分离提取，会对后续的测谱图分析和测试结果造成影响。并且目前的方法所能检测的抗生素种类单一，不能通过一次检测多种抗生素的残留量，而且目前的方法对于多种抗生素的测定费用较高。

发明内容

本发明提出检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，解决了现有技术中的前处理分离提取效果差，检测抗生素种类单一的问题。

本发明的技术方案如下：

检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，包括以下步骤：

S1、样品前处理：取蔬菜样品冷冻干燥后，磨碎后过筛，得过筛样品；

S2、样品粗提：在过筛样品中加入提取剂对样品进行提取；

S3、二次提取；

S4、浓缩定容过滤；

S5、进行高效液相色谱-串联质谱分析，得到残留量。

作为进一步的技术方案，所述提取剂包括甲酸乙腈溶液、柠檬酸、磷酸氢二钠和乙二胺四乙酸二钠。

作为进一步的技术方案，所述S3与S4之间还包括S30，在S3样品中加入复配吸附剂进行净化；

其中复配吸附剂包括N-丙基乙二胺、C₁₈吸附剂、石墨炭黑，三者质量比为10:10:1。

作为进一步的技术方案，所述步骤S2具体为，称取10g样品于50mL离心管中，精确至0.01g，加入10mL甲酸-乙腈溶液、0.12g柠檬酸、0.14g磷酸氢二钠和0.34g乙二胺四乙酸二钠，均质提取2min，8000r/min离心5min，转移上清液于另一离心管中

其中甲酸-乙腈溶液为体积浓度为0.1％的甲酸-乙腈溶液。

作为进一步的技术方案，所述步骤S3具体为，用10mL体积浓度0.1％甲酸-乙腈溶液重复提取一次，所得上清液与S2所得上清液合并，用乙腈定容到30mL。

作为进一步的技术方案，所述步骤S30具体为，取8mL上清液加入150mg N-丙基乙二胺、150mg C₁₈吸附剂和15mg石墨炭黑，漩涡混合30s，8000r/min离心5min，取6mL上清于刻度试管中。

作为进一步的技术方案，所述步骤S4具体为，将S3所得上清液在50℃用氮气浓缩至小于0.5mL，用体积浓度为0.1％的甲酸-水溶液定容至2mL，过0.22μm滤膜，得待测样品。

作为进一步的技术方案，所述步骤S5高效液相色谱-串联质谱分析的色谱条件具体为：

色谱柱：Phenomenex Kinetex F5，3.0×50mm，2.6μm，；

流动相A：体积浓度0.1％甲酸水溶液，B：乙腈；

梯度洗脱程序：0～0.25min，10％B；0.25～6min，10％～30％B；6～9min，30％～50％ B；9～10min，50％～90％B；10～11min，90％B；11～13min，10％B；

流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：5μL。

作为进一步的技术方案，所述步骤S5高效液相色谱-串联质谱分析的质谱条件具体为：

电喷雾离子源ESI，正离子模式；

离子源温度：550℃；

喷雾电压：5500V；

气帘气压力为206.8kPa；

雾化气压力为413.7kPa；

辅助雾化气压力为482.6kPa；

Schedule-MRM设置条件为40s的时间监测窗口，即每个化合物的采集时间为其保留时间±40s。

本发明的工作原理及有益效果为：

1、本发明通过一次前处理，可实现蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类等34种抗生素残留量的同时测定。

2、本发明通过甲酸乙腈溶液，柠檬酸，磷酸氢二钠和乙二胺四乙酸二钠四组分复配得到复配提取液，加标回收率较高。这是因为四环素类抗生素容易与重金属发生配合或者鳌合作用，形成稳定的配合物或者螯合物，从而影响提取效率，能够更好的减小提取过程中重金属对四环素类药物的干扰。

3、本发明采用Phenomenex Kinetex F5色谱柱，采用的五氟苯基固定相适合卤代化合物、共轭化合物、异构或强极性化合物的分析，尤其是对苯环取代基异位的同分异构体能够实现较好的分离效果。

4、本发明采用的配制基质匹配标准溶液的方法，34种抗生素总体上呈现中等至较强的基质效应，本实验能够较好的消除基质影响，满足分析要求。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为浓度为10ug/L的34种抗生素的总离子流图；

图2为34种抗生素在四种蔬菜基质中的基质效应。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

试剂与原料：

乙腈、甲醇(HPLC级，美国TEDIA公司)；

甲酸(HPLC级，迪马科技)；

水(Millipore超纯水机制备得到)；

柠檬酸(分析纯)；

磷酸氢二钠(分析纯)；

乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA)(优级纯，迪马科技)；

QuEChERS分散固相试剂盒(150mg PSA、150mg C18、15mgGCB)，购自博纳艾吉尔科技有限公司；

16种磺胺类、14种喹诺酮类、4种四环素类抗生素标准品均购自Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均高于94.6％，药物名称见表1。

标准储备液的配制

将标准品用甲醇配制标准储备液(1000mg/L)，于-18℃下保存。

准确吸取适量标准储备液，初始流动相(0.1％甲酸溶液和乙腈，比例为8:2)逐级稀释，配制成系列标准工作溶液，现用现配。

实验1：色谱条件的优化

实施例1

将浓度为10ug/L混合标准液过0.22μm的针头滤器到棕色进样瓶，再利用高效液相色谱串联质谱法同时测定混合标准液中34种抗生素的含量，具体条件如下：

①色谱条件：

色谱柱：Phenomenex Kinetex F5(3.0×50mm，2.6μm)；

流动相：A：体积浓度0.1％甲酸水溶液，B：乙腈；

梯度洗脱程序：0～0.25min，10％B；0.25～6min，10％～30％B；6～9min，30％～50％ B；9～10min，50％～90％B；10～11min，90％B；11.01-13min，10％B；

流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：5μL

②质谱条件：

电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；

离子源温度：550℃；

喷雾电压：5500V；

气帘气压力为206.8kPa；

雾化气压力为413.7kPa；

辅助雾化气压力为482.6kPa；

实施例2

将实施例1采用色谱柱替换为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，其他与实施例1保持相同。

结果显示ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱对其大多数化合物具有良好的分离效果，但是较难实现对磺胺对甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪的分离，其保留时间接近，色谱图呈交叉峰，相互之间影响定量分析。而Phenomenex Kinetex F5色谱柱能够较好的分离这两种同分异构体，这是因为Phenomenex Kinetex F5色谱柱采用的五氟苯基固定相适合卤代化合物、共轭化合物、异构或强极性化合物的分析，尤其是对苯环取代基异位的同分异构体能够实现较好的分离效果。因此，本发明最终选择了Phenomenex Kinetex F5(3.0×50mm，2.6μm)色谱柱对34种抗生素进行分离。

实施例3

将实施例1的流动相B替换为甲醇，其他操作与实施例1相同。

实施例4

将实施例1的流动相A替换为体积浓度0.2％甲酸水溶液，其他操作与实施例1相同。

实施例5

将实施例1的流动相A替换为体积浓度0.2％甲酸水溶液，B替换为甲醇，其他操作与实施例1相同。

结果表明，在ESI(+)模式下，体积浓度0.1％甲酸水溶液-乙腈组成的流动相中，34种抗生素中有较好的峰形和较高的响应值，因此本实验最终选择了体积浓度0.1％甲酸水溶液-乙腈作为流动相。34种化合物的总离子流色谱图(TIC)见图1。

实验2：质谱条件的优化

实施例6

采用实施例1的样品制备方法，分别制备10μg/kg,20μg/kg,50μg/kg的标准混合液，色谱条件与实施例1相同，本实施例研究了34种抗生素在ESI正离子模式下，采用注射泵连续进样模式对每一种化合物进行一级质谱扫描获得其准分子离子峰；然后再对其进行二级质谱分析，获得碎片离子信息，确定定量离子和定性离子。通过优化各化合物的去簇电压(Declustering Potential)、碰撞能量(Collison Energy)使34种化合物的准分子离子与特征碎片离子的强度达到最大；对离子源温度、去溶剂气温度及流量、碰撞气流量等参数进行优化，使每种化合物的离子化效率达到最佳。根据欧盟2002/657/EC对兽药残留确证方法的要求，确证检测需要4个鉴别点。本实验通过优化和筛选，每种化合物最终选择2个监测离子对，以满足欧盟兽残检测确证方法的要求，具体优化得到的质谱条件见表1。

表1 34种抗生素保留时间、离子对信息、回收率和相对标准偏差

实验3：提取条件的优化

实施例7

将采集生菜样品冷冻干燥，研磨后2mm筛过滤，准确称取10g研磨样品，将抗生素混合标准液混合于生菜样品中得到0.01mg/kg的加标生菜样品。将加标生菜样品置于50mL离心管中，加入提取液(10mL体积浓度0.1％甲酸-乙腈溶液、0.12g柠檬酸、0.14g磷酸氢二钠和0.34g乙二胺四乙酸二钠)后均质提取2min，8000r/min离心5min，转移上清液于另一离心管中，用10mL体积浓度0.1％甲酸-乙腈溶液，合并两步所得上清液，用乙腈定容到30 mL。取8mL上清液加入150mg N-丙基乙二胺(PSA)、150mg C₁₈吸附剂和15mg石墨炭黑(GCB)，漩涡混合30s，8000r/min离心5min，取6mL上清液于刻度试管中，在50℃用氮气浓缩至小于0.5mL，用体积浓度0.1％甲酸-水溶液定容至2mL，过0.22μm滤膜，供 UPLC-MS/MS测定，测试条件与实施例1的条件相同。

实施例8

将实施例7中的提取液替换为乙腈，体积浓度0.1％甲酸-乙腈溶液替换为乙腈，其他操作相同。

实施例9

将实施例7中的提取液替换为10ml酸化乙腈(含1％甲酸的乙腈溶液，v/v)，体积浓度 0.1％甲酸-乙腈溶液替换为酸化乙腈，其他操作相同。

实施例10

将实施例7中的提取液替换为10ml Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液-乙腈(1:1，v/v)，体积浓度0.1％甲酸-乙腈溶液替换为Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液-乙腈(1:1，v/v)，其他操作相同。

实施例11

将实施例7中的提取液替换为10ml Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液-乙腈(3:7，v/v)，体积浓度0.1％甲酸-乙腈溶液替换为Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液-乙腈(3:7，v/v)，其他操作相同。

实施例12

将实施例7中的提取液替换为1.86g Na₂EDTA，10ml 0.1％甲酸乙腈(v/v)，其他操作相同。

实验发现：使用乙腈或酸化乙腈提取时，磺胺类和喹诺酮类药物的加标回收率均低于 20％，四环素类药物的加标回收率低于10％，这是由于蔬菜样品含水量过高(一般为70～ 98％)，而抗生素的化学性质比较复杂，尤其是喹诺酮类抗生素是两性离子化合物，在酸性或碱性条件下溶解度较大，并且四环素在酸性条件下水溶性较高；采用不同比例的Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液-乙腈混合溶剂对蔬菜中34种抗生素提取时发现，生菜经均质提取离心后不能和提取溶液完全分离，需要经滤纸过滤收集，同时给浓缩带来较大难度，34种抗生素的加标回收率均低于30％。考虑到生菜含水量高，本实验将10g生菜中的水分折算成 10mL，通过加入一定量的Na₂EDTA、柠檬酸、磷酸氢二钠等盐形成浓度均为0.1mol/L的 Na₂EDTA和Na₂EDTA-Mcllvaine两种缓冲溶液体系，然后加入酸化乙腈提取。通过实验对比发现，采用Na₂EDTA和酸化乙腈提取对部分喹诺酮类抗生素例如沙拉沙星、诺氟沙星以及四环素类抗生素中的土霉素的加标回收率均不到30％；而采用柠檬酸、磷酸氢二钠、Na₂EDTA 混合盐和酸化乙腈提取对四环素类抗生素的加标回收率比用Na₂EDTA和酸化乙腈提取增加 30～40％，喹诺酮类及磺胺类抗生素的加标回收率也在60～90％之间。这是因为四环素类抗生素容易与重金属发生配合或者鳌合作用，形成稳定的配合物或者螯合物，从而影响提取效率，而Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液相比Na₂EDTA缓冲溶液作为螯合剂，能够更好的减小提取过程中重金属对四环素类药物的干扰。因此，本实验最终选择了0.12g柠檬酸、0.14g磷酸氢二钠、0.34g Na₂EDTA、和10mL 0.1％甲酸-乙腈(v/v)作为提取溶剂。

实验4：净化条件的优化

实施例13

由于吸附剂可以吸附脂肪等强疏水性干扰物，但是净化往往是个双面的，一方面在净化的同时可能会吸附掉目标化合物。本实验以白菜为基质，在0.01mg/kg的水平下，考察了不同加入量的吸附剂对目标化合物回收率的影响。其他操作于实验6相同，不同的是调节吸附剂的加入量。实验结果表明，PSA和C₁₈吸附剂的加入量在50～200mg的范围内，对34种抗生素并无明显吸附作用；而当石墨炭黑(GCB)的加入量不超过15mg时，对34种抗生素吸附率小于5％；当石墨炭黑(GCB)的加入量在15～50mg范围内，对34种抗生素的平均吸附率为1.1～51.2％。因此，在保证对样品净化效果的基础上本实验最终确定PSA、C18及石墨炭黑(GCB)的加入量分别为150mg、150mg和15mg。

实验5：基质效应的评价

实施例14

本实验分别选择生菜、黄瓜、水萝卜和白菜等4种基质，将空白样品按照实验6的方法进行处理，分别用基质空白液和溶剂配制质量浓度为5、10、20、50、100μg/L的混合标准溶液，以峰面积对应的质量浓度分别做标准曲线，然后比较这两条标准曲线斜率的差异，从而判断基质效应的强弱。

基质效应主要是由于样品在离子化时基质中的其他成分与目标化合物竞争电离进而影响目标化合物的检测灵敏度和重现性的现象，包括基质增强效应和基质抑制效应。基质效应 (ME)通过下式计算：ME(％)＝(基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1)×100％。基质效应为负值表示存在基质抑制效应；正值表示为基质增强效应。绝对值在0～20％，表示存在较弱的基质效应；绝对值在20～50％，表示存在中等的基质效应；绝对值＞50％，表示存在较强的基质效应。

34种抗生素在4种蔬菜基质中平均的基质效应(ME)见图2。实验结果表明34种抗生素在四种蔬菜基质中的平均基质效应有3个(ME)位于0～20％之间，15个位于20～50％之间，16个＞50％，说明34种抗生素总体上呈现中等至较强的基质效应。因此，本实验采用配制基质匹配标准溶液的方法，能够较好的消除基质影响，满足分析要求。

实验6：线性范围、检出限和定量限

实施例15

采用空白基质配制质量浓度为1、2、5、10、20、50、100μg/L的34种抗生素系列混合标准溶液，在上述实施例1、实施例7的最优条件下进行分析测定，以各组分的峰面积(y) 对溶液中各组分的质量浓度(x)绘制标准曲线。结果显示30种磺胺和喹诺酮类抗生素在1～100μg/L的范围内成良好线性关系，其相关系数均大于0.997(见表2)；4种四环素类抗生素在2～100μg/L的范围内成良好线性关系，其相关系数均大于0.997(见表2)。以3倍和 10倍信噪比(S/N)确定化合物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，检出限和定量限分别为 0.02～0.35μg/kg和0.2～0.90μg/kg(见表2)。

表2 34种抗生素在在萝卜基质中线性范围、回归方程、相关系数(r)、检出限、定量下限及在生菜、黄瓜、水萝卜和白菜基质中的平均基质效应

实验7：回收率和精密度

实施例16

取空白蔬菜样品，在低、中、高3个添加水平(10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg)下进行加标回收试验，每个水平平行测定6次，结果见表1。34种抗生素的平均加标回收率为57.2～86.4％，相对标准偏差为4.2～11.9％。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2、样品粗提：在过筛样品中加入提取剂对样品进行提取；

S3、二次提取；

S4、浓缩定容过滤；

S5、进行高效液相色谱-串联质谱分析，得到残留量。

2.根据权利要求1所述的检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，其特征在于，所述提取剂包括甲酸乙腈溶液、柠檬酸、磷酸氢二钠和乙二胺四乙酸二钠。

3.根据权利要求1所述的检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，其特征在于，所述S3与S4之间还包括S30，在S3样品中加入复配吸附剂进行净化；

4.根据权利要求1所述的检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，其特征在于，所述步骤S2具体为，称取10g样品于50mL离心管中，精确至0.01g，加入10mL甲酸-乙腈溶液、0.12g柠檬酸、0.14g磷酸氢二钠和0.34g乙二胺四乙酸二钠，均质提取2min，8000r/min离心5min，转移上清液于另一离心管中；

其中甲酸-乙腈溶液为体积浓度为0.1％的甲酸-乙腈溶液。

5.根据权利要求1所述的检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，其特征在于，所述步骤S3具体为，用10mL体积浓度0.1％甲酸-乙腈溶液重复提取一次，所得上清液与S2所得上清液合并，用乙腈定容到30mL。

6.根据权利要求3所述的检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，其特征在于，所述步骤S30具体为，取8mL上清液加入150mg N-丙基乙二胺、150mg C₁₈吸附剂和15mg石墨炭黑，漩涡混合30s，8000r/min离心5min，取6mL上清于刻度试管中。

7.根据权利要求1所述的检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，其特征在于，所述步骤S4具体为，将S3所得上清液在50℃用氮气浓缩至小于0.5mL，用体积浓度为0.1％的甲酸-水溶液定容至2mL，过0.22μm滤膜，得待测样品。

8.根据权利要求1所述的检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，其特征在于，所述步骤S5高效液相色谱-串联质谱分析的色谱条件具体为：

色谱柱：Phenomenex Kinetex F5，3.0×50mm，2.6μm，；

流动相A：体积浓度0.1％甲酸水溶液，B：乙腈；

梯度洗脱程序：0～0.25min，10％B；0.25～6min，10％～30％B；6～9min，30％～50％B；9～10min，50％～90％B；10～11min，90％B；11～13min，10％B；

流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：5μL。

9.根据权利要求1所述的检测蔬菜中磺胺类、喹诺酮类及四环素类残留量的方法，其特征在于，所述步骤S5高效液相色谱-串联质谱分析的质谱条件具体为：

电喷雾离子源ESI，正离子模式；

离子源温度：550℃；

喷雾电压：5500V；

气帘气压力为206.8kPa；

雾化气压力为413.7kPa；

辅助雾化气压力为482.6kPa；