CN115851821A - Bbx16基因在提高植物盐耐受性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种BBX16基因在提高植物盐耐受性中的应用，所述BBX16基因在TAIR官网的基因号为AT1G73870。本发明通过植物基因组克隆获得拟南芥BBX16基因，构建了BBX16过表达载体，利用农杆菌介导的方法获得BBX16过表达转基因系。发明人通过培养基盐胁迫模拟实验，揭示了BBX16在植物耐盐中的作用，为作物耐盐分子育种提供基因资源。可使植物能够在超出其原本的适应的盐浓度范围内存活和生长，为植物的分子育种和遗传改造提供了一种新的途径。

Description

BBX16基因在提高植物盐耐受性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及BBX16基因在提高植物盐耐受性中的应用。

背景技术

土壤盐渍化是世界性生态环境问题之一，是影响农、林业生产的主要因素。盐胁迫影响植物的发芽、生长，最终导致农作物减产。通常，在盐胁迫下，植物表现出种子低萌发率以及营养和生殖阶段生长延迟，严重时导致植物叶片发黄死亡。目前全球耕地盐渍化对农作物的生产已构成较大威胁，并呈现逐年增长的趋势。了解植物盐胁迫适应性机制有利于科学选育耐盐作物，进而有效利用盐地滩涂减轻日益增加的粮食压力。

BBX (B-box) 是锌指结构蛋白家族的一个亚家族，其氨基酸序列中包含1个或2个参与蛋白质-蛋白质之间互作的B-box基序。BBX蛋白家族根据蛋白质序列分为五个主要亚家族，其中BBX16属于第三亚家族，该亚家族成员共有四个（BBX14-BBX17），它们有一个B-box基序和一个CCT结构域，根据文献介绍BBX家族蛋白广泛参与生物胁迫和非生物胁迫等，但是在参与盐胁迫中的功能尚未有明确的研究。

发明内容

本发明的目的是提供BBX16基因在提高植物盐耐受性中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：

基于TAIR官网（http://www.arabidopsis.org/）公布的拟南芥全基因组测序，获得拟南芥BBX16基因（B-BOX转录因子，也即是AT1G73870）的核苷酸序列信息。BBX16基因编码框核苷酸序列长度为1179bp，由392个氨基酸组成，其序列可以通过TAIR官网查询获得。

本发明还构建一系列植物表达载体，含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因植物系以及含有所述载体的宿主细胞在提高植物耐盐性方面的功能也落入本发明的保护范围之内。

本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述BBX16基因，还包括与BBX16基因具有较高同源性（如同源性高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％）的同源基因在耐盐性方面的功能。

本发明根据BBX16的CDS基因序列构建了35S启动的pCAMBIA1300过表达载体，通过农杆菌侵染获得了BBX16过表达株系，分析了bbx16突变体和BBX16过表达转基因系在盐胁迫中的生物学功能，从而为作物抗盐分子育种提供基因资源。

本发明公开的BBX16基因在植物耐盐中的生物学功能，具体表现在：在盐胁迫下，BBX16敲除突变株的种子萌发率和/或萌发速率低于野生型；而BBX16过表达株系的种子萌发率和/或萌发速率高于野生型。

上述应用通过在培养基和土壤中模拟盐胁迫实验得出结论。

根据其功能，可以通过转基因的方式来获得耐盐的植株，具体地，可以通过将BBX16基因导入目的植物，得到转基因植物，该植株耐盐性高于目的植物。

具体地，BBX16基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种新的植物育种方法，包括如下步骤（1）或（2）:

（1）通过增加目的植物中BBX16蛋白的活性，获得耐盐性强于目的植物的植株；

（2）通过促进目的植物中BBX16基因的表达，获得耐盐性强于目的植物的植株；

“促进目的植物中BBX16基因的表达”的实现方式可为如下（1）或（2）或（3）:

（1）将BBX16基因导入目的植物；

（2）引入强启动子和/或增强子；

（3）本领域内的其它常见方法。

其中，目的植物（target plant），本发明所述目的植物是拟南芥。

目的基因（target gene），也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：拟南芥，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。

本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

本发明的优点：

（1）本发明通过植物基因组克隆获得拟南芥BBX16基因，构建了BBX16过表达载体，利用农杆菌介导的方法获得BBX16过表达转基因系。发明人通过在培养基盐胁迫模拟实验，揭示了BBX16在植物耐盐中的作用，为作物耐盐分子育种提供基因资源。

（2）可以通过转基因的方式来获得耐盐性的植株，具体地，可以通过将BBX16基因导入目的植物，得到转基因植物，该植株耐盐性高于目的植物，为植物耐盐育种提供一种新的途径。

附图说明

图1是BBX16基因扩增产物电泳图；图中，图1A是BBX16基因扩增电泳图，图1B是BBX16过表达重组载体大肠杆菌菌液PCR电泳图。

图2是BBX16过表达转基因表达量和bbx16突变体鉴定；图中，图2A是Col-0、BBX16转基因过表达植株的QPCR基因表达量检测；图2B是bbx16突变体鉴定的PCR电泳图。

图3为BBX16相关遗传材料在不同氯化钠浓度培养基下随时间变化的萌发率统计图；

图4为BBX16相关遗传材料在不同氯化钠浓度培养基上生长八天后的表型图。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、***发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

另外，为了对本发明技术方案更直观的理解，对于本发明涉及到的一些专业术语解释如下：

“突变体”（Mutant），是指发生突变的个体，具有与野生型不同的表型的特点。

“表达载体”（Expression vectors），是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。

本发明中BBX16 T-DNA***纯合突变株(bbx16)购买自拟南芥欧洲种子库，种子号为N657281。

发明人利用分子克隆技术克隆了BBX16基因的编码框序列，构建了BBX16过表达载体，并通过农杆菌浸花法获得了BBX16过表达转基因系。本发明还将其与过表达转基因植株在盐胁迫下进行功能验证。

1.基因来源及分离：

基于TAIR 官网（http://www.arabidopsis.org/）公布的拟南芥全基因组测序，获得拟南芥中介因子BBX16的核苷酸序列信息。BBX16基因（AT1G73870）编码框核苷酸序列长度为1179bp，由392个氨基酸组成，分子量大小约为44.02kD。利用Primer Premier 5 软件设计序列特异性引物（F：5' –ATGGTGGTCGATGTAGAGAGCC-3'；R：5'-TCACGTCAAAAGTGACGTCCTC-3' ）。以Col-0 生态型拟南芥幼苗的cDNA 为模板，使用2 xPLANTA MAX MASTER MIX 高保真酶扩增（Vazyme），退火温度为58℃。基因克隆结果如图1中的图1A 所示。

2.BBX16基因的功能鉴定

为了研究BBX16基因在植物耐盐中的作用，通过拟南芥bbx16突变体和BBX16过表达转基因比较分析其功能。

2.1 过表达材料的构建

以拟南芥野生型为出发植株。BBX16 T-DNA***纯合突变株(bbx16)购买自拟南芥欧洲种子库，种子号为N657281。

过表达株系构建选择的是pCAMBIA1300载体，由35S启动。方法如下：过表达BBX16株系是根据BBX16基因的CDS基因序列构建了35S启动的pCAMBIA1300过表达载体，并转化大肠杆菌。随后对含有重组载体的菌液进行PCR 鉴定（图1B）。挑选正确的菌液提质粒送测序。

2.2 BBX16过表达转基因阳性株的筛选

将构建好正确的重组质粒利用液氮冻融法转入农杆菌GV3101中，过夜摇菌，转接摇至OD=0.8，使用转基因缓冲液重悬，侵染Col-0拟南芥花序，避光一天，在长日照光照培养箱中培养收种，收获的种子在含有潮霉素B（Hygromycin B ）的1/2MS固体培养基上进行筛选。筛选过程如下：用10%次氯酸钠溶液进行表面消毒10 min，无菌水漂洗5次干净后，4℃春化三天。将种子播种于pH=5.8，含有终浓度50µg/mL Hygromycin B的1/2MS培养基中。16 h/8 h 光暗，25℃，70%相对湿度的光照培养箱中培养。以野生型拟南芥作为对照，筛选出抗Hygromycin B的小苗7 d后移至土中（营养土：蛭石=1：1）在上述条件下进行培养。收获T0代种子后，继续在含有潮霉素B的1/2MS培养基上筛选T1阳性植株。真叶展开后提取蛋白，利用免疫印迹实验（WB）鉴定阳性植株。收获种子，扩繁鉴定直至T3代纯合。

对收获的纯合种子进行了QPCR基因表达量的检测（图2A），与Col-0相比，我们选择了表达量相对较高的两个Line，分别为BBX16过表达株系1（BBX16-OE1）和BBX16过表达株系2（BBX16-OE2）进行后续的实验。

2.3 突变体纯合检测

基于拟南芥T-DNA ***突变体的序列号，在突变体查询网站下载并合成测序序列

（http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html）。bbx16（SALK_117808C）LP:5'–AACCCCATAAAACCTTCATCG-3' ，RP ：5'–CCATCTTCAACAGTGTTTGCC-3' 。通过PCR 进行纯合鉴定（图2B）。

2.4 突变体和转基因株系表型分析

为了分析野生型拟南芥株系（col-0）、BBX16敲除突变株系（bbx16）、BBX16过表达株系1（BBX16-OE1）和BBX16过表达株系2（BBX16-OE2）的种子萌发对盐的敏感性。对以上株系进行逆境处理，具体如下：

为了统计不同盐浓度下的萌发率，我们使用了含不同浓度氯化钠的MS培养基对拟南芥进行处理和培养，氯化钠浓度分别为0mM，180mM，200mM，250mM。萌发率实验处理如下：将拟南芥种子接种在不同氯化钠浓度的培养基上，接种后于四度避光春化三天，然后移至温度为22℃，湿度60％，光照强度为100μmol.m^-2.s^-1全日照下生长8天后进行拍照，同时在每天固定的时间点统计当天的萌发情况。

萌发率的实验我们将培养框均分为由四个大格构成的田字格，从左上起，按顺时针方向分别接种野生型（col-0）、BBX16敲除突变株系（bbx16）、BBX16过表达株系1（BBX16-OE1）和BBX16过表达株系2（BBX16-OE2）。

接种后每天对每个株系进行萌发率的统计，得到的萌发率数据如图3所示。结果显示，BBX16基因敲降后的拟南芥在含不同浓度氯化钠的培养基处理后的萌发率大大降低，特别是在高浓度氯化钠培养基处理后，而过表达BBX16基因的拟南芥在含不同浓度氯化钠的培养基处理后的萌发率显著高于野生型（col-0）。这表明，在拟南芥中，BBX16基因的下调表达严重影响其对盐的耐受性，而超表达BBX16基因可提高拟南芥植株的耐盐能力。

接种后，BBX16相关遗传材料在不同氯化钠浓度生长表型图如图4所示。结果显示，BBX16基因敲降后的拟南芥在含不同浓度氯化钠的培养基处理后萌发速率大大降低，而过表达BBX16基因的拟南芥在含不同浓度氯化钠的培养基处理后的萌发速率显著高于野生型（col-0），特别是在高浓度氯化钠浓度下。这表明，在拟南芥中，BBX16基因的下调表达严重影响其对盐的耐受性，而超表达BBX16基因可提高拟南芥植株的耐盐能力。

通过以上实验数据表明，在拟南芥中，超表达BBX16基因可显著提高拟南芥植株的耐盐胁迫能力。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (7)

1.BBX16基因在提高植物盐耐受性中的应用，其特征在于，所述BBX16基因在TAIR官网的基因号为AT1G73870。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述盐耐受性为高浓度盐耐受性，高浓度盐浓度范围为180mM-250mM。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过构建BBX16过量表达载体，获得耐盐的转基因植株。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述盐耐受性表现为：在盐胁迫下，BBX16敲除突变株的种子萌发率和/或萌发速率低于野生型；而BBX16过表达株系的种子萌发率和/或萌发速率高于野生型。

6.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为通过促进目的植物中BBX16基因的表达，获得耐盐性强于目的植物的植株；所述BBX16基因在TAIR官网的基因号为AT1G73870。

7.根据权利要求6所述的植物育种方法，其特征在于，所述目的植物为拟南芥。

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