CN117986339B - 提高小麦穗发芽抗性及耐干旱的转录因子TaMYB7A-CS及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提高小麦穗发芽抗性及耐干旱的转录因子TaMYB7A‑CS及其应用，所述转录因子TaMYB7A‑CS对应基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在NCBI中基因序列号为KAF7004882.1。本发明通过构建TaMYB7A‑CS的过表达载体pUBI‑TaMYB7A‑His利用农杆菌侵染法转化野生型小麦Fielder，获得过表达植株。分析结果表明在正常萌发环境下过表达植株的小麦种子萌发率相比于野生型明显下降。过表达植株在干旱胁迫下，相对于野生型，TaMYB7A‑CS‑OE株系能够明显提高植株的抗旱能力，明显增加小麦的粒宽和千粒重，从而为小麦抗穗发芽和抗干旱分子育种提供了基因资源。

Description

提高小麦穗发芽抗性及耐干旱的转录因子TaMYB7A-CS及其 应用

技术领域

本发明属于遗传工程领域，具体涉及一种提高小麦穗发芽抗性及耐干旱的转录因子TaMYB7A-CS及其应用。

背景技术

普通小麦 (Triticumaestivum L., 2n=6x=42, AABBDD) 是世界三大作物之一，也是人类日常生活中的主要粮食作物，其生产粮食安全与人民生活息息相关。而穗发芽是指作物收获季节遇到连日阴雨天气导致种子直接在植株上发芽的现象，穗发芽灾害作为普遍存在于主粮作物如小麦，水稻，玉米当中的自然灾害，会严重影响到粮食作物的产量和品质。会大幅度降低小麦的加工品质，同时对产量有一定的影响，显著影响小麦的生产价值。穗发芽性状成因十分复杂，包括温度、降水和光照等外部环境因素，而近年来随着降水线的北移，小麦收获季节更易出现高温高湿环境，很容易造成大范围的穗发芽灾害，影响小麦生产加工品质。而种子休眠的强弱是穗发芽最重要的内因，一定程度上提高小麦种子休眠能力对提高品种的穗发芽抗性有很大意义。影响种子休眠的调控机制在物种间均比较保守，主要是由ABA和GA的拮抗作用调节，其中ABA主要调控种子休眠而GA主要在种子萌发过程中起作用。同时种子休眠和萌发也受到一些萌发相关酶如α-淀粉酶的调节。

而随着全球气候的变化，非生物胁迫也严重影响了小麦生产，其中干旱胁迫已经成为限制小麦生产的最主要非生物胁迫之一。因此，挖掘小麦抗旱基因、揭示小麦抗旱性特异调控的分子机理及遗传网络，对于小麦抗旱遗传改良、培育抗旱小麦新品种具有重要意义。而影响小麦抗干旱的因素有很多，包括根长，根表面积，气孔大小和开度等等。而ABA通常会影响到小麦叶片的气孔发育，间接影响到小麦植株抗干旱的能力。所以小麦种子萌发和干旱胁迫在调控机制方面有相似之处。

MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，参与众多生物学过程，已有大量研究表明MYB转录因子可以参与到植物的初生代谢和次生代谢，植物细胞形态建成以及植物非生物胁迫等等。而已有研究发现MYBs可以影响到植株的种子萌发，侧根发育，增加根重，诱导根部生长，影响气孔开度等等。

发明内容

本发明人通过对192份小麦自然群体进行小麦穗发芽性状的GWAS分析发现了一个未知的穗发芽抗性位点qPHS.2A，对这个GWAS位点进行分析后发现在LD block内共有38个候选基因，其中只有两个基因在种子当中特异性表达，其中TaMYB7A在种子发育及种子休眠建立阶段表达量逐渐升高，在萌发过程中表达量逐渐降低，符合调控种子休眠与萌发的基因的表达模式。通过亚细胞定位将TaMYB7A定位于细胞核。利用一代测序我们发现TaMYB7A有两种等位基因，其中TaMYB7A-CS为优势等位基因，TaMYB7A-CS表达量更高而劣势单倍型TaMYB7A-KN表达量更低。通过转录组分析我们发现TaMYB7A-CS作用于ABA信号通路，通过EMSA和双荧光素酶报告***的检测都证明了TaABI4可以激活TaMYB7A-CS的表达，并且TaMYB7A-CS可以激活TaABI5的表达，进一步证明了TaMYB7A-CS作用于ABA信号通路中。过表达TaMYB7A-CS的小麦株系的结果表明TaMYB7A-CS上调成熟种子中TaABI5基因的表达并最终降低成熟种子的种子萌发率。同时，TaMYB7A-CS在小麦根重也有一定量的表达，我们进一步测试了过表达TaMYB7A-CS的小麦株系与野生型在干旱胁迫下的表现，过表达株系表现除了明显的粒宽和千粒重的增加。最后通过序列分析我们认为优势等位基因来源于野生一粒小麦的基因渗入而不是小麦A亚基因组来源乌拉尔图小麦。

本发明的目的是提供一个可以增强小麦穗发芽抗性和干旱胁迫抗性的MYB转录因子，该转录因子参与ABA信号调控通路。本发明所提供的转录因子TaMYB7A-CS来源于小麦品种中国春，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示的DNA长度为906 bp，属于MYB家族，编码301个氨基酸残基的蛋白质。TaMYB7A-KN是另一种劣势等位基因，主要存在于KN9204等材料中，是具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列组成的基因，其DNA序列长度为891bp，编码297个氨基酸残基的蛋白质。

本发明还开发了与TaMYB7A-CS基因紧密连锁的KASP分子标记，提供检测优势等位基因TaMYB7A-CS的KASP分子标记引物，以大规模检测小麦品种。其中，所述KASP分子标记引物的序列如下：

上游引物：5’-TATAAAGCGAGACGAAAACC-3’（SEQ ID NO.3）；

下游引物1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGGGTAATTACGTGGAGTA-3’（SEQ IDNO.4）；

下游引物2：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGGGTAATTACGTGAAGTG-3’（SEQ IDNO.5）。

本发明还提供转录因子TaMYB7A-CS在小麦种子休眠建立期间ABA信号通路基因的表达中的应用。

进一步地是将所述转录因子转化小麦，筛选转录因子TaMYB7A-CS的过量表达阳性植株。

更进一步的是在小麦品种中敲除TaMYB7A-CS基因，筛选基因敲除的阳性植株。

本发明提供检测转录因子对TaABI5基因启动子区调控强度的方法，将转录因子的过表达载体和TaABI5基因启动子驱动萤火虫荧光素酶 (Firefly luciferase) 基因表达的报告载体共转化本式烟草，并以海肾荧光素 (Renilla luciferase) 作为对照，检测转录因子调控TaABI5基因启动子活性的强度。

本发明还构建一系列植物表达载体，含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因植物系以及含有所述载体的宿主细胞在提高植物穗发芽抗性和干旱胁迫方面的功能也落入本发明的保护范围之内。

本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述TaMYB7A-CS基因，还包括与TaMYB7A- CS基因具有较高同源性的同源基因OsMYB6（水稻）和ATMYBS2（拟南芥）在穗发芽抗性方面的功能。

本发明公开的TaMYB7A-CS基因在小麦抗穗发芽和耐干旱中的生物学功能，具体表现在：在正常萌发环境下，TaMYB7A-CS基因过表达株系的种子萌发率和穗发芽发生率低于野生型，在干旱胁迫下，TaMYB7A-CS基因过表达系的粒宽和千粒重高于野生型。

根据其功能，可以通过转基因的方式来获得抗穗发芽小麦。

具体地，可以通过将TaMYB7A-CS基因导入目的植物，得到转基因小麦，该植株抗穗发芽和耐干旱能力高于野生型小麦。

更具体地，TaMYB7A-CS基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的小麦幼胚组织培育成小麦植株。

为了进一步提高小麦的穗发芽抗性和干旱抗性，本发明还保护一种新的小麦育种方法，所述方法为以下（1）或（2）：

（1）通过饱和编辑TaMYB7A-CS的启动子位置，获得TaMYB7A-CS高表达的小麦植株，增强TaMYB7A-CS的表达，获得穗发芽抗性和干旱抗性更强的小麦植株；

（2）直接在小麦品种中过表达TaMYB7A-CS，获得穗发芽抗性和干旱抗性更强的小麦植株；

相反的，如果为了实验需要，为了降低小麦的穗发芽抗性和干旱抗性，可以通过以下方法：通过饱和编辑TaMYB7A-CS的启动子位置，获得TaMYB7A-CS低表达的小麦植株，降低TaMYB7A-CS的表达，获得穗发芽抗性和干旱抗性更弱的小麦植株。

本发明中，对于适用于本发明的植物（小麦）没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，在其他农作物中也可以进行，如水稻，玉米等。凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。

本发明的优点：

本发明提供的来源于中国春小麦转录因子TaMYB7A-CS提供小麦更高的穗发芽抗性，更低的种子萌发率，更强的抵抗干旱胁迫能力。其在普通小麦中的优势等位基因TaMYB7A-CS在种子中的表达较高，增强了TaABI5基因的转录，相似的TaMYB7A-CS的过表达转基因株系使小麦植株获得更高的穗发芽抗性，更低的种子萌发率和更强的抵抗干旱胁迫能力。在双荧光素酶报告***分析中，TaABI4可以显著激活TaMYB7A-CS。TaMYB7A-CS可以显著激活TaABI5基因启动子的活性。TaMYB7A-CS过表达系中TaABI5基因的转录被显著激活了，尤其以种子发育后期最强。在普通小麦（Triticum aestivum）中的劣势等位基因TaMYB7A-KN表达量比较低，并且无法激活TaABI5的表达。同时TaMYB7A-CS过表达系的株高、有效分蘖，穗粒数和千粒重等农艺性状都没有受到显著影响。综上所述，TaMYB7A-CS 能够激活TaABI5基因的表达，作用于ABA信号通路中，最终影响到小麦穗发芽抗性和干旱胁迫抗性。另外，本发明还提供了验证转录因子调控TaABI5基因表达的实验体系。因此，TaMYB7A- CS对小麦的品质改良具有重要意义。

本发明还开发了与TaMYB7A-CS基因紧密连锁的KASP分子标记，利用本发明的分子标记能够在出芽期或苗期即可准确快速的鉴定出小麦是否具有穗发芽抗性及耐干旱性状，还可以对TaMYB7A-CS基因进行快速的定位，具有检测方便、扩增产物稳定的优点。

本发明采用群体遗传学的方法，创新性地对普通小麦（Triticum aestivum）中MYBs转录因子TaMYB7A进行了克隆。构建TaMYB7A-CS基因过表达载体UBI-TaMYB7A，利用农杆菌侵染小麦幼胚的方法将含有UBI-TaMYB7A-CS的农杆菌转化进小麦幼胚，获得TaMYB7A- CS过表达的植株，结果表明过表达TaMYB7A-CS基因的小麦植株穗发芽抗性明显提高，种子发芽率明显下降，在干旱胁迫下过表达系的千粒重和粒宽明显增加，表明TaMYB7A-CS对穗发芽和干旱均有作用，为作物耐盐分子育种提供基因资源。

附图说明

图1为小麦穗发芽的GWAS分析；图1A显示自然群体的种子萌发率GWAS分析，两个主要的位点为R基因和qPHS-2A；图1B显示qPHS-2A的具***置。

图2 显示GWAS位点内最显著marker的单倍型分析。

图3 显示TaMYB7A-CS在种子休眠和种子萌发过程中的表达情况。

图4显示TaMYB7A-CS，TaMYB7B-CS，TaMYB7D-CS随着种子休眠建立的表达情况。

图5显示TaMYB7A-CS2.2kb的启动子和外显子一代测序结果。

图6为TaMYB7A-CS在不同群体中的单倍型分析；图6A显示PHS群体三个单倍型的不同表型分析；图6B显示MCC群体两个主要单倍型的不同表型分析。

图7为TaMYB7A不同单倍型表达水平的差异。图7A显示种子开花后10DAP和20DAP两个不同单倍型的表达量变化（RNA-seq）；显示种子开花后25DAP和30DAP两个不同单倍型的表达量变化（qRT-PCR）。

图8显示TaMYB7A-CS参与ABA信号通路的功能解析。图8A显示过表达株系于野生型的花后25DAP的RNA-seq；图8B显示种子休眠期差异基因的GO富集；图8C显示TaMYB7A-CS的下游靶基因TaABI5和TaPYL9。

图9显示通过烟草瞬时表达***验证TaABI4对TaMYB7A-CS的激活作用。

图10显示通过烟草瞬时表达***验证TaMYB7A-CS对TaABI5的激活作用。

图11显示TaMYB7A-CS来源于野生一粒小麦的分析。图11A显示启动子区变异在二倍体，四倍体和六倍体小麦中的分布；图11B显示TaMYB7A的CDS序列在二倍体，四倍体和六倍体的比对。

图12显示TaMYB7A-CS过表达株系和野生型的种子萌发和穗发芽表型。

图13显示干旱胁迫下TaMYB7A-CS过表达株系和野生型的种子相关表型；图13A显示干旱胁迫下TaMYB7A-CS过表达株系和野生型的千粒重表型；图13B显示干旱胁迫下TaMYB7A-CS过表达株系和野生型的有效小穗数表型；图13C显示干旱胁迫下TaMYB7A-CS过表达株系和野生型的单位面积产量表型。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、***发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

生物材料

TaMYB7A-CS过表达株系种子和野生型种子Fielder为实验室保存；

过表达载体UBI-TaMYB7A为实验室保存；烟草瞬时转化***的过表达载体35S-ABI4，35S-TaMYB7A，CP461- TaMYB7A（pro），CP461- TaABI5（pro）为实验室所保存；烟草瞬时转化***CP462-35Smini空白载体，CP462-TE，各类转座子激活所用载体均为实验室所保存；

大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101为实验室保存；

引物合成及测序，由华大基因公司和睿博公司完成。

实验试剂

RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购买自华越洋公司和诺唯赞生物科技有限公司；

烟草瞬时转化测试试剂购买自promaga公司；

各种核酸内切酶购买自莫纳生物科技有限公司；

一步克隆酶购买自金沙生物生物科技有限公司；

质粒小量提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购买自北京天根生物技术有限公司；

扩增片段mix购买自诺维赞生物科技有限公司；

T4连接酶购买自碧云天生物科技有限公司。

实施例1 PHS自然群体小麦的GWAS分析及TaMYB7A基因的获得

（1）PHS自然群体GWAS分析：通过2018年，2019年和2021年调查PHS群体（192份小麦材料）的种子萌发表型。取花后30DAP的小麦种子，首先使用次氯酸钠溶液对种子消毒，然后加入适量ddH₂O连续七天观察小麦的萌发情况并记录。使用660K基因芯片的数据进行GWAS分析，通过GWAS分析在三年时间里分别关联到了两个稳定的GWAS位点：TaMYB10-D（R基因），PHS-2A（图1A、B，图2）。

（2）TaMYB7A基因的获得：取小麦品种中国春花后10DAP，20DAP，25DAP，35DAP和吸涨萌发后1h，3h，6h，12h，24h，36h，48h，60h，84h，108h，156h使用华越洋公司的RNA提取试剂盒提取小麦品种中国春RNA，使用诺维赞公司的反转录试剂盒和qPT-PCR试剂盒进行RNA样品的反转录（2ug）和qRT-PCR分析。通过qRT-PCR发现TaMYB7A在休眠建立时期表达量升高同时在种子吸涨萌发之后表达量又会快速下降，符合种子休眠调控基因的表达特征，所以我们认为TaMYB7A是候选基因（图3）。根据中国春种子发育的转录组数据发现A亚基因组的TaMYB7A表达量要显著高于B，D亚基因组的同源基因TaMYB7B和TaMYB7D（图4）。

实施例2TaMYB7A不同等位基因的确定

（1）TaMYB7A一代测序：取小麦自然群体共81份叶片样本使用CTAB法提取DNA（CTAB提取法和常规方法相同），使用对应引物和mix扩增目的片段在华大基因公司进行一代测序。测序结果使用SnapGene软件进行分析，分析结果显示：用一代测序对110份小麦自然群体的TaMYB7A启动子区（~2.2Kb）进行测序，发现了丰富的SNP和Indel变异，其中启动子区有一个221bp的片段***，CDS区存在4个氨基酸替换变异和4个氨基酸缺失（图5）。同时我们发现TaMYB7A可以分为三种不同的等位基因：Hap L，Hap H-1和Hap H-2。经过对PHS群体的单倍型分析发现，Hap H-1和HapH-2之间没有显著的表型差异，且测序中发现Hap H-1和HapH-2之间差异并不大所以我们后续的分析将Hap H-1和Hap H-2合成Hap H。Hap H（高穗发芽）和Hap L（低穗发芽），在MCC（微核心群体）和PHS（穗发芽群体）两个群体中Hap H（TaMYB7A-KN）和Hap L（TaMYB7A-CS）之间的种子萌发表型均有极显著差异（图6A、B）。

（2）不同等位基因之间表达量有显著差异：为了分析不同等位基因之间表型差异的来源，所以分析已经发表的种子RNA-seq数据（花后10DAP和花后20DAP），结合qRT-PCR（花后25DAP和花后30DAP）进行不同等位基因表达水平分析（方法同刚刚介绍），通过分析102份小麦自然群体10DAP和20DAP的种子RNA-seq结果（图7A），发现不同单倍型之间有极显著的表达量差异，暗示我们不同等位基因的TaMYB7A通过表达量的差异作用到穗发芽抗性当中。为了进一步验证种子休眠后期不同TaMYB7A单倍型知否也存在表达量上的显著差异，选取25DAP和30DAP的全种子材料提RNA，反转录之后对TaMYB7A进行qRT-PCR分析，同样发现了不同单倍型之间表达量有极显著差异（图7B）（n=20）。

实施例3TaMYB7A-CS参与ABA信号通路

（1）TaMYB7A-CS过表达株系的RNA-seq分析：发明人用华越洋公司的RNA提取试剂盒提取TaMYB7A-CS过表达株系和野生型Fielder的花后25DAP的种子进行RNA提取，送到华大基因进行测序分析。在种子休眠期间WT和OE株系相比上调的基因更多（图8A），休眠期RNA-seq鉴定到的差异基因富集到了一些乙烯合成，ABA信号激活，响应干旱胁迫，种子萌发，响应ABA，ABA代谢等通路（图8B）。为了进一步缩小TaMYB7A-CS下游靶基因的范围，所以发明人利用拟南芥的DAP-seq数据得到的motif信息结合小麦种子中的ATAC-seq数据去进一步筛选缩小靶基因范围，发现TaABI5和TaPYL9在基因启动子区的染色质开放区域存在GATAA的TaMYB7A-CS的结合序列，是TaMYB7A-CS在休眠期的下游靶基因（图8C）。

（2）TaMYB7A-CS在ABA信号通路起到作用：首先构建35S-TaABI4，35S-TaMYB7A和CP461-TaMYB7A，CP461-TaABI5，转化农杆菌之后侵染本式烟草，通过构建对应的report载体，转化农杆菌瞬时转化本式烟草，24℃三天后使用酶标仪测量荧光虫荧光强度和海参荧光素强度（内参）。通过烟草瞬时转化发现TaABI4可以激活TaMYB7A-CS的表达，而TaMYB7A-CS可以激活TaABI5和TaPYL9的表达（图9和图10），在瞬时转化实验中我们发现不同单倍型的TaMYB7A对下游靶基因的调控作用不同，TaMYB7A-KN对TaPYL9和TaABI5没有明显的调控作用，提示我们除了表达量的差异之外，两种单倍型的编码区域也是功能分化的原因之一。发明人同样用一代测序发现了在群体中TaMYB7A-KN相比于TaMYB7A-CS存在有四个氨基酸的缺失和4个氨基酸的替换，这些变异会导致CDS功能的分化。

实施例4TaMYB7A-CS最早来源于野生一粒小麦

在实验中发现TaMYB7A-CS和TaMYB7A-KN差异很大，所以发明人使用发表的小麦重测序数据进行序列分析。小麦A亚基因组来源于乌拉尔图小麦，而野生一粒小麦也对面包小麦有一定的基因贡献，但是暂时还没有相关的研究说明野生一粒小麦的渗入片段功能的解析，而野生一粒材料中存在大量可供利用的抗性和驯化基因。发明人发现启动子区的变异在野生一粒和栽培一粒的品种中存在，在乌拉尔图小麦中不存在（图11A），进一步证明了TaMYB7A-CS所在的片段是由野生一粒的渗入，而这个渗入事件是在栽培二粒（AABB）中才发生的。同时我们对比了二倍体，四倍体和六倍体小麦中TaMYB7A-CS的CDS序列，同样发现功能性的TaMYB7A-CS（Hap L）的CDS序列与野生一粒小麦中TaMYB7A-CS同源基因的序列更像而不是乌拉尔图（图11B），也证明了TaMYB7A-CS是由野生一粒小麦渗入进面包小麦中的。

实施例5TaMYB7A-CS过表达株系的穗发芽抗性表型和一些发育性状表型

田间收获Fielder，TaMYB7A-CS-OE株系，济麦22，周麦27和对应的近等基因系的35DAP小麦整穗和种子。种子于37℃烘箱烘干处理36h-48h后浸入蒸馏水放入22℃恒温培养箱中处理观察10天，每天计数发芽种子的数量，直到Fielder株系大部分种子发芽。照片于种子吸涨后5-6天拍摄的，发芽定义为小麦根和芽均长出1cm。为了模拟自然田间降水条件下穗发芽的情况，将收获的小麦穗子插在泡沫板上，使用喷雾器模拟降水每天喷水8-10次，保证穗子持续处于湿润，在22°C恒温培养箱中培养。对于每个系得发芽率测定重复5个小麦穗子，照片是穗子吸涨7天后拍摄的。为了评估不同材料的种子的休眠水平，每天计数发芽的种子并用于计算发芽率和发芽势。对于小麦材料于2022年和2023年在北京重复进行发芽测定。发明人将TaMYB7A-CS的CDS序列与UBI启动子融合构建进LGY过表达载体当中，转化易穗发芽的小麦品种Fielder中，转基因阳性植株相比于野生型TaMYB7A的表达水平明显升高。于2022年和2023年7月在北京收获T2和T3代转基因材料进行穗发芽和种子萌发表型鉴定（30DAP），根据两年的表型鉴定发现过表达TaMYB7A-CS使Fielder成熟种子萌发率的下降和穗发芽抗性的提高（图12），表明TaMYB7A-CS是影响小麦穗发芽抗性和种子休眠的关键基因，同时我们也开发了可供大规模田间筛选TaMYB7A-CS优势基因的KASP标记，可以用于小麦实际生产育种中。

所述KASP标记的引物对如下：

上游引物：5’-TATAAAGCGAGACGAAAACC-3’（SEQ ID NO.3）；

下游引物1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGGGTAATTACGTGGAGTA-3’（SEQ IDNO.4）；

下游引物2：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGGGTAATTACGTGAAGTG-3’（SEQ IDNO.5）。

实施例6TaMYB7A-CS过表达株系的干旱抗性增加

TaMYB7A-CS在小麦根中也有一定的表达，同时参与ABA信号通路，所以我们猜测TaMYB7A-CS对干旱胁迫具有一定的应答，在2022年和2023年进一步考察了TaMYB7A-CS的OE株系的在干旱胁迫下的表现，在田间种植TaMYB7A-CS的OE株系和野生型材料，分别进行干旱处理和正常水处理，发现干旱处理下过表达TaMYB7A-CS可以显著的提高千粒重，有效穗数和单位面积产量（图13A、B、C），进一步证明了TaMYB7A-CS作用于小麦干旱胁迫。

Claims (8)

1.转录因子TaMYB7A-CS在提高小麦穗发芽抗性和耐干旱中的应用，其特征在于，所述转录因子TaMYB7A-CS对应基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过构建TaMYB7A-CS过表达载体，获得穗发芽抗性和干旱抗性高的转基因植株。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的穗发芽抗性和耐干旱表现为：在正常萌发条件下，与野生型相比，过表达TaMYB7A-CS基因植株的萌发率显著下降，穗发芽抗性明显提高；在干旱胁迫下，过表达TaMYB7A-CS基因植株的粒宽和千粒重显著提高，抗干旱能力显著提高。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转录因子TaMYB7A-CS来源于野生一粒小麦Triticum monococcum.的渗入。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转录因子TaMYB7A-CS参与ABA信号通路。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转录因子TaMYB7A-CS参与激活ABA信号通路基因TaABI5和TaPYL9的表达。

7.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为以下（1）或（2）：

（1）通过饱和编辑TaMYB7A-CS基因的启动子位置，获得TaMYB7A-CS基因高表达的植株，增强TaMYB7A-CS基因的表达，获得穗发芽抗性和干旱抗性更强的植株；

（2）直接在小麦品种中过表达TaMYB7A-CS基因，获得穗发芽抗性和干旱抗性更强的植株；

所述TaMYB7A-CS基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

8.与TaMYB7A-CS基因紧密连锁的KASP分子标记在鉴定或辅助鉴定小麦穗发芽抗性及耐干旱性状以及在TaMYB7A-CS基因定位中的应用，其特征在于，扩增所述KASP分子标记的引物序列如下所示：

上游引物：5’-TATAAAGCGAGACGAAAACC-3’；

下游引物1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGGGTAATTACGTGGAGTA-3’；

下游引物2：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGGGTAATTACGTGAAGTG-3’；

所述TaMYB7A-CS基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。