CN102202493A

CN102202493A - 植物的耐盐性

Info

Publication number: CN102202493A
Application number: CN2009801435046A
Authority: CN
Inventors: 斯图尔特·约翰·罗伊; 马克·阿尔弗雷德·特斯特
Original assignee: Australian Centre for Plant Functional Genomics Pty Ltd
Current assignee: Australian Centre for Plant Functional Genomics Pty Ltd
Priority date: 2008-09-04
Filing date: 2009-09-04
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2029-09-04
Also published as: US9206400B2; US20110209243A1; ZA201101587B; AU2009290140A1; AU2009290140B2; EA201170404A1; CN102202493B; AU2009290140B9; WO2010025513A1

Abstract

本发明部分基于对植物耐盐性所涉及的基因的鉴定。因此，本发明涉及用于调节植物耐盐性的方法。本发明还提供具有调节的耐盐性的植物细胞和植物。在进一步的实施方案中，本发明还提供用于确定植物细胞和植物的耐盐性的方法。

Description

植物的耐盐性

优先权要求

本专利申请要求于2008年9月4日提交的澳大利亚临时专利申请2008904596的优先权，其内容通过参考完全结合于此。

领域

本发明部分对植物耐盐性所涉及的基因的鉴定。因此，本发明涉及用于调节植物耐盐性的方法。本发明还提供具有调节的耐盐性的植物细胞和植物。在进一步的实施方案中，本发明还提供用于确定植物细胞和植物的耐盐性的方法。

背景

在澳大利亚，盐度是影响农作物的主要非生物胁迫，其导致大量的产量损失和数百亿美元的收入损失。茎组织中高水平的Na⁺具有不利的渗透作用，并且减少可用于基本的生物过程的K⁺量。至关紧要的是，谷物产量通常与茎Na⁺累积的程度成反比。

为了解决这一问题，需要知晓盐怎样进入植物中和一旦盐在其中植物怎样处理盐。因此，需要鉴定耐盐性所涉及的基因、抗性植物培育品种和细胞过程，目的是将这些因素引入到可商购的作物中。

在本说明书中引用任何现有技术不是，也不应该被视为是现有技术在任何国家中形成公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。

概述

本发明部分基于使用拟南芥(Arabidopsis thaliana)的重组纯系(RILs)来鉴定与Na⁺外排所涉及的新基因所联系的数量性状基因座(QTLs)。使用由两个具有巨大地理、生态和遗传距离的亲本产生的Bay-0×Shahdara作图群体来鉴定与茎外排Na⁺相联系的新型重要的QTL，其位于2号染色体上。当与具有Shahdara基因型的那些相比较时，这些在QTL具有Bay-0基因型的RILs具有两倍减少的Na⁺累积。通过产生20个酶切扩增多态序列(CAPS)标记以更好地绘制QTL，鉴定了一种目的候选基因CIPK16。

在第一方面中，本发明提供一种用于调节植物细胞的耐盐性的方法，所述方法包括调节所述植物细胞中CIPK16多肽的表达。

在一些实施方案中，CIPK16多肽的表达通过调节植物细胞中CIPK16核酸的表达而进行调节。

在一些实施方案中，植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被上调，并且植物细胞的耐盐性提高。在一些实施方案中，植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被下调，并且植物细胞的耐盐性降低。

在第二方面中，本发明提供一种用于调节包括多个植物细胞的多细胞结构的耐盐性的方法，所述方法包括依据本发明第一方面的方法调节所述多细胞结构中的一个或多个植物细胞的耐盐性。

在一些实施方案中，一个或多个植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被上调，并且所述多细胞结构的耐盐性提高。在一些实施方案中，一个或多个植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被下调，并且所述多细胞结构的耐盐性被降低。

在一些实施方案中，所述多细胞结构包括完整的植物、植物组织、植物器官、植物部分、植物繁殖材料或培养的植物组织。

在第三方面中，本发明提供相对于野生型植物细胞具有调节的耐盐性的遗传修饰的植物细胞，其中调节所述植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达。

在一些实施方案中，植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被上调，并且所述植物细胞的耐盐性提高。在一些实施方案中，植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被下调，并且所述植物细胞的耐盐性降低。

在第四方面中，本发明提供具体调节的耐盐性的多细胞结构，其中所述多细胞结构包括一个或多个依据本发明第三方面所述的植物细胞。

在一些实施方案中，一个或多个植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被上调，并且所述多细胞结构的耐盐性提高。在一些实施方案中，一个或多个植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被下调，并且所述多细胞结构的耐盐性降低。

在第五方面中，本发明提供一种用于确定或预测植物细胞的耐盐性的方法，所述方法包括确定所述植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达。

在一些实施方案中，植物细胞中相对高的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达与所述植物细胞中提高的耐盐性相关。在一些实施方案中，植物细胞中相对低的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达与所述植物细胞中降低的耐盐性相关。

在第六方面中，本发明提供一种用于确定或预测包括植物细胞的多细胞结构的耐盐性的方法，所述方法包括依据本发明第五方面的方法确定或预测该多细胞结构中的植物细胞的耐盐性。

在一些实施方案中，植物细胞中相对高的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达与所述多细胞结构中提高的耐盐性相关。在一些实施方案中，植物细胞中相对低的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达与所述多细胞结构中降低的耐盐性相关。

本文所引用的核苷酸和氨基酸序列由序列标识号(SEQ ID NO：)表示。SEQ ID NOs：数字对应序列标识<400>1(SEQ ID NO：1)，<400>2(SEQ ID NO：2)等。表1提供了序列标识的总结。在说明书最后提供序列表。

表1-序列标识总结

示例性实施方案的描述

应该理解下述描述仅是出于描述具体的实施方案的目的，并不是意欲关于上述描述进行限制。

本发明所涉及的植物细胞可以包括任何植物细胞，包括被子植物或裸子植物高等植物细胞以及低等植物细胞，如苔藓类植物、蕨类植物和木贼属植物(horsetails)细胞。

在一些实施方案中，所述植物细胞可以是单子叶被子植物的植物细胞。

在一些实施方案中，所述单子叶植物的植物细胞可以是谷物农作物植物细胞。当用于本文时，术语“谷物农作物”包括生产用作人或动物食物的食用谷物的禾本科(Poaceae)(草本家族)的成员。不以任何方式限制本发明的禾本科谷物农作物的实例包括大麦、小麦、稻、玉米、稷、高粱、黑麦、黑小麦、燕麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、野生稻、斯佩尔特小麦等。然而，术语谷物农作物还应该理解成包括也生产可食用谷物并且其已知为假谷物(pseudocereals)的多种非禾本科物种，诸如苋紫(amaranth)、荞麦(buckwheat)和奎奴亚藜(quinoa)。

在一些实施方案中，所述植物细胞可以是稻属植物细胞。如本文所提及的，“稻(rice)”包括稻属(Oryza)的多个成员，其包括稻(Oryza sativa)和光稃稻(Oryza glaberrima)物种。因此，术语“稻”包括稻栽培品种，如日本或中国品种(粳稻，japonica or sinica varieties)、印度品种(籼稻，indica varieties)和爪哇品种(javonica varieties)。在一些实施方案中，术语“稻”指稻(Oryza sativa)物种的稻。

在一些实施方案中，所述植物细胞双子叶被子植物的植物细胞。示例性的双子叶植物包括，例如，特别是拟南芥属物种(Arabidopsis spp.)，苜蓿属物种(Medicago spp.)，烟草属物种(Nicotiana spp.)，大豆(soybean)，芸苔(canola)，油菜(oil seed rape)，甜菜(sugar beet)，芥属(mustard)，向日葵(sunflower)，番茄(tomato)，马铃薯(potato)，红花(safflower)，木薯(cassava)，薯蓣属(yams)，甘薯(sweet potato)，其它十字花科(Brassicaceae)尤其如小盐芥(Thellungiella halophila)。

如上文所列出，本发明涉及调节植物细胞的耐盐性。

术语“盐度”用在本文中通常指植物生长环境中所有盐的水平。因此，在一些实施方案中，术语“耐盐性”涉及植物细胞或植物在特定的环境盐浓度存活和/或生长的能力。

然而，对大部分作物***最相关的盐是NaCl。因此，在一些实施方案中，术语“耐盐性”指植物在特定的环境钠浓度存活和/或生长的能力。在一些实施方案中，耐盐性还指植物在特定的环境钠浓度保持一个或多个植物组织(例如，茎)中的适当的钠浓度的能力。

“调节”耐盐性是指相对于未修饰的或野生型形式的细胞，植物细胞或植物的耐盐性的提高或降低。

耐盐性的提高可以包括，例如：

植物细胞或植物可以存活、生长或维持适当的茎钠浓度的环境盐度水平的增加(相对于未修饰的或野生型形式的植物)；

在特定的环境盐度水平下植物的生物量生产、生长速率、种子产率等的增加(相对于未修饰的或野生型形式的植物)；和/或

在特定的环境盐度水平下植物或其特定部分(如茎)中钠积累速率或水平的减少(相对于未修饰的或野生型形式的植物)。

相反，耐盐性的降低可以包括，例如：

植物细胞或植物可以存活、生长或维持适当的茎钠浓度的环境盐度水平的降低(相对于未修饰的或野生型形式的植物)；

在特定的环境盐度水平下植物的生物量生产、生长速率、种子产率等的减少(相对于未修饰的或野生型形式的植物)；和/或

在特定的环境盐度水平下植物或其特定部分(如茎)中钠积累速率或水平的增加(相对于未修饰的或野生型形式的植物)。

如上文所述，本发明涉及通过调节植物细胞中CIPK16多肽的表达来调节植物细胞的耐盐性。

如本文所引用，“CIPK16多肽”包括以TAIR登记号At2g25090描述的拟南芥(Arabidopsis thaliana)多肽。术语“CIPK16多肽”还应该理解为延伸至TAIR登记号At2g25090所述的多肽的功能同源物。

TAIR登记号At2g25090所述的多肽的“功能同源物”应该理解为包括调节植物耐盐性的多肽。在一些实施方案中，功能同源物可以包括，例如，相对于包括At2g25090所述的氨基酸序列的多肽具有一个或多个氨基酸***、缺失或取代的多肽；包括At2g25090所述的氨基酸序列的多肽的突变形式或等位基因变体；包括At2g25090所述的氨基酸序列的多肽在另一种植物物种中的直向同源物等。

在一些实施方案中，包括At2g25090所述的氨基酸序列的多肽的功能同源物还包括与At2g25090至少40％，42％，44％，46％，48％，50％，52％，54％，56％，58％，60％，62％，64％，66％，68％，70％，72％，74％，76％，78％，80％，82％，84％，86％，88％，90％，92％，94％，96％，98％或100％的氨基酸序列同一性。

当比较氨基酸序列时，比较的序列应该在至少100个氨基酸残基、至少200个氨基酸残基、至少300个氨基酸残基、至少400个氨基酸残基的比较窗口或SEQ ID NO：2的全长进行比较。当与参照序列(其不包含添加或缺失)比较时，比较窗口可以包括约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以进行两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的最佳序列比对可以通过计算机执行的算法进行，诸如例如通过Altschul等(Nucl.Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402，1997)公开的BLAST家族程序进行。更详细的序列分析的讨论可以在Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学流程)，John Wiley & Sons Inc，1998)Unit 19.3中找到。

由于CIPK家族内基因和蛋白命名的不一致性，应该理解拟南芥CIPK16(At2g25090)直向同源物可以分类成不同的CIPK亚族。例如，拟南芥CIPK16(At2g25090)的同源物或直向同源物可以包括拟南芥CIPK5(At5g10930)，拟南芥CIPK25(At5g25110)，稻CIPK16(Q6ERS4)，毛果杨(Populus trichocarpa)CIPK20(ABJ91235)，毛果杨CIPK23(ABJ91229)和毛果杨CIPK6(ABJ91234)。

如上文所述，本发明部分基于对细胞中CIPK16多肽表达的调节。

如本文所引用，调节CIPK16多肽的“表达”包括调节所述多肽的水平和/或活性。

调节多肽的“水平”应该理解为包括在细胞中或细胞特定部分中CIPK16多肽的水平或量的增加或减少。类似地，调节CIPK16多肽的“活性”应该理解为包括，例如，在细胞中CIPK16多肽的完整活性、特异性活性、半衰期和/或稳定性的增加或减少。

例如，“增加”意欲在细胞中CIPK16多肽的活性水平的1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2-倍，5-倍，10-倍，20倍，50-倍，100-倍的增加。例如，“减少”意欲在细胞中CIPK16多肽的活性水平的1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的减少。

“调节”还应该理解为包括将特定的CIPK16多肽引入到通常不表达所引入的多肽的细胞中，或在正常表达所述多肽的细胞中基本上完全抑制CIPK16多肽活性。

在一些实施方案中，在植物细胞中，CIPK16多肽的表达被上调。“上调”应该理解为包括细胞中CIPK16水平或活性的增加和/或将特定的CIPK16多肽引入到通常不表达所引入的多肽的细胞中。

在一些实施方案中，增加或上调细胞中CIPK16多肽的表达导致所述细胞耐盐性的增加。

在另一个实施方案中，在植物细胞中，CIPK16多肽的表达被下调。“下调”应该理解为包括细胞中CIPK16水平或活性的减少和/或对通常表达CIPK16多肽的细胞中的特定CIPK16多肽的基本上完全的抑制。

在一些实施方案中，减少或下调细胞中CIPK16多肽的表达导致所述细胞耐盐性的降低。

本发明涉及可以调节细胞中CIPK16多肽表达的任何方式。例如，这包括这样的方法，如应用调节细胞中的CIPK16多肽活性的试剂，包括应用激动剂或拮抗剂；应用模拟细胞中的CIPK16多肽活性的试剂；调节细胞中编码CIPK16多肽的核酸的表达；影响细胞中修饰的或突变的核酸的表达，从而由所述细胞表达具有增加的或减少的特异性活性、半衰期和/或稳定性的CIPK16多肽；或调节细胞中CIPK16多肽的表达水平、模式和/或靶向，例如通过调节与CIPK16多肽相缔合的转录控制序列和/或信号肽。

在一些实施方案中，多肽的表达通过调节细胞中编码CIPK16多肽的核酸的表达而被调节。

如本文引用，编码CIPK16多肽的核酸(“CIPK16核酸”)是指编码上述CIPK16多肽的任何核酸。

本发明所涉及的CIPK16核酸可以来源于任何来源。例如，CIPK16核酸可以来源于生物体，如植物。备选地，CIPK16核酸可以是合成的核酸。

本发明所涉及的CIPK16核酸还可以包括一个或多个非翻译区，如3’和5’非翻译区和/或内含子。

例如，本发明所涉及的CIPK16核酸可以包括mRNA序列，cDNA序列或基因组核苷酸序列。

关于CIPK16核酸表达的术语“调节”可以包括增加或减少细胞中CIPK16核酸的转录和/或翻译。

例如，“增加”是指CIPK16核酸的转录和/或翻译的1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2-倍，5-倍，10-倍，20-倍，50-倍，100-倍或更多的增加。例如，“减少”是指CIPK16核酸的转录和/或翻译的1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的减少。调节还包括在特定细胞中诱导通常不存在的CIPK16核酸的表达；或在通常具有这样的活性的细胞中对CIPK16核酸表达的基本上完全的抑制(例如，敲除)。

在一些实施方案中，植物细胞中CIPK16核酸的表达被上调。“上调”应该理解为包括细胞中CIPK16核酸的转录和/或翻译的增加和/或在通常不表达所引入的核酸的细胞中诱导特定CIPK16核酸的转录和/或翻译。

在一些实施方案中，植物细胞中CIPK16核酸的表达被下调。“下调”应该理解为包括细胞中CIPK16核酸的转录和/或翻译的减少和/或在通常不表达CIPK16核酸的细胞中基本上消除特定的CIPK16核酸的转录和/或翻译。

本发明涉及可以用来调节CIPK16核酸表达的任何方式。用于调节CIPK16核酸表达的方法包括，例如：细胞的遗传修饰，以上调或下调内源性CIPK16核酸表达；通过转化CIPK16核酸进行遗传修饰；遗传修饰，以增加细胞中CIPK16核酸的拷贝数；将调节细胞中的内源性CIPK16核酸表达的核酸分子施用到所述细胞中；等等。

在一些实施方案中，CIPK16核酸表达通过细胞的遗传修饰进行调节。术语“遗传修饰”用在本文中应该理解为包括相对于非遗传修饰形式的细胞，在遗传修饰的细胞中对CIPK16核酸表达施加改变的任何遗传修饰。示例性类型的遗传修饰包括：随机诱变(诸如转座子、化学、UV和噬菌体诱变)以及对过表达或不足表达内源性CIPK16核酸的突变体的选择；将一种或多种在细胞中指导CIPK16核酸的表达和/或过表达的核酸分子瞬时或稳定导入所述细胞中；通过内源CIPK16核酸的位点定向诱变调节内源性CIPK16多肽；将一种或多种抑制内源性CIPK16核酸表达的核酸分子导入到细胞中，所述核酸分子例如，共抑制构建体，RNAi构建体或miRNA构建体；等等。

在一些实施方案中，本发明涉及通过向细胞中引入CIPK16核酸的表达，上调细胞中CIPK16核酸的表达和/或增加细胞中CIPK16核酸的拷贝数来增加细胞中CIPK16多肽的水平。

在多种细胞类型中转化和表达所引入的核苷酸序列的方法在本领域中是已知的，并且本发明涉及使用任何适当的方法。

然而，关于植物细胞的转化的实例，参考Zhao等(Mol Breeding(分子杂交)DOI 10.1007/s11032-006-9005-6，2006)，Katsuhara等(Plant Cell Physiol(植物细胞生理学)44(12)：1378-1383，2003)，Ohta等(FEBSLetters(FEBS通信)532：279-282，2002)和Wu等(Plant Science(植物科学)169：65-73，2005)。关于向植物细胞中引入核酸分子的其它适合的方法包括，例如：农杆菌属(Agrobacterium)-介导的转化，其它细菌-介导的转化(参见Broothaerts等，2005，同上)，基于微粒轰击的转化法和基于直接的DNA摄入的方法。Roa-Rodriguez等(Agrobacterium-mediated transformation of plants(农杆菌属-介导的植物转化)，第3版，CAMBIA Intellectual Property Resource(CAMBIA知识产权资源)，Canberra，澳大利亚，2003)评述了用于宽范围植物物种的宽泛数量的合适的农杆菌介导的植物转化法。微粒轰击也可以用来转化植物组织和用于转化植物、特别是谷物植物的方法，并且Casas等(Plant Breeding Rev.(植物杂交综述)13：235-264，1995)评述了所述方法。直接的DNA摄入转化流程如原生质体转化和电穿孔详细记述在Galbraith等(eds.)，Methods in Cell Biology(细胞生物学方法)Vol.50，Academic Press(学院出版社)，San Diego，1995)中。除了上述方法之外，还可以使用一定范围的其它转化流程。这些包括细胞和组织的渗透、电穿孔，胚茎的电穿孔，显微注射，花粉管途径，碳化硅和脂质体介导的转化。Rakoczy-Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.(细胞分子生物学通信)7：849-858，2002)评述了诸如这些的方法。一定范围的其它植物转化法对于本领域的技术人员也是明显的。

在其它实施方案中，本发明还提供了用于下调细胞中CIPK16核酸表达的方法。例如，随着CIPK16核酸序列的鉴定，本发明还有助于使用下述方法诸如在细胞中敲除、敲降(knockdown)或下调CIPK16核酸的方法，所使用的方法包括，例如：

***诱变，包括通过与敲除构建体同源重组而敲除或敲降细胞中的核酸(靶向的基因分解的实例参见Terada等，Nat.Biotechnol.(自然生物技术)20：1030-1034，2002)；

细胞中的转录后基因沉默(PTGS)或核酸的RNAi(关于PTGS和RNAi的综述参见Sharp，Genes Dev.(基因发育)15(5)：485-490，2001；和Hannon，Nature(自然)418：244-51，2002)；

用针对核酸反义构建体转化细胞(反义抑制的实例参见van der Krol等，Nature(自然)333：866-869；van der Krol等，BioTechniques(生物技术)6：958-967；和van der Krol等，Gen.Genet.(基因遗传学)220：204-212)；

用针对核酸的共抑制构建体转化细胞(共抑制的实例参见van der Krol等，Plant Cell(植物细胞)2(4)：291-299)；

用编码针对核酸的双链RNA的构建体转化细胞(dsRNA介导的基因沉默的实例参见Waterhouse等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)95：13959-13964，1998)；

用编码针对核酸的siRNA或发夹RNA转化细胞(siRNA或发夹RNA介导的基因沉默的实例参见Lu等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)32(21)：e171；doi:10.1093/nar/gnh170，2004)；和

***miRNA靶向序列，以致其与核酸可操作性连接(miRNA介导的基因沉默的实例参见Brown等，Blood(血液)110(13)：4144-4152，2007)。

本发明还通过使用合成的寡核苷酸，例如，针对CIPK16核酸的siRNAs或miRNAs促进细胞中CIPK16核酸的下调(合成的siRNA介导的沉默的实例参见Caplen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)98：9742-9747，2001；Elbashir等，Genes Dev.(基因发育)15：188-200，2001；Elbashir等，Nature(自然)411：494-498，2001；Elbashir等，EMBO J.(胚胎学杂志)20：6877-6888，2001；和Elbashir等，Methods(方法)26：199-213，2002)。

除了上述实例之外，所引入的核酸还可以包括不直接与CIPK16核酸相关但是可以直接或间接地调节细胞中CIPK16核酸的表达的核苷酸序列。实例包括编码促进或抑制细胞中内源CIPK16核酸分子的表达的转录因子或其它蛋白的核酸分子；和直接或间接地促进或抑制内源CIPK16多肽表达的其它非翻译的RNAs等。

为了影响细胞中所引入的核酸的表达，在适当的情形中，可以将所引入的核酸可操作性地与一种或多种转录控制序列和/或启动子连接。

术语“转录控制序列”应该理解为包括影响可操作性连接的核酸的转录的任何核酸序列。转录控制序列可以包括，例如，前导序列，多腺苷酸化序列，启动子，增强子或上游活化序列，和转录终止子。典型地，转录控制序列至少包括启动子。术语“启动子”用在本文中描述在细胞中赋予、激活或增强核酸分子的表达的任何核酸。

在一些实施方案中，至少一种转录控制序列与CIPK16核酸可操作性连接。出于本说明书的目的，当转录控制序列能够促进、抑制或另外调节给定的基因或其它核苷酸序列的转录时，视为该转录控制序列与所述基因或其它核苷酸序列“可操作性连接”。

关于表达所发生的细胞、组织、器官或发育阶段，响应外界刺激特别如生理胁迫、病原体、或金属离子，或响应一种或多种转录激活剂，启动子可以组成型或差异型调节可操作性连接的核苷酸序列的表达。因此，依据本发明的方法所用的启动子可以包括，例如，组成型启动子，可诱导的启动子，组织特异性启动子或激活性启动子。

植物组成型启动子典型地在几乎所有的植物组织中指导表达，并且很大程度上不依赖于环境和发育因子。依据本发明可以使用的组成型启动子的实例包括植物病毒来源的启动子，如花椰菜花叶病毒35S和19S(CaMV 35S和CaMV 19S)启动子；细菌性植物病原体来源的启动子如来源于农杆菌属物种(Agrobacterium spp.)的冠瘿碱启动子；例如，农杆菌属来源的胭脂碱合酶(nos)启动子；和植物来源的启动子，如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基基因(rbcS)启动子，植物泛蛋白启动子(Pubi)和稻属肌动蛋白启动子(Pact)。

在一些实施方案中，可以使用组成型转录控制序列。在一些实施方案中，所述组成型转录控制序列包括一个或多个CaMV 35S启动子重复。在一些实施方案中，所述转录控制序列包括两个CaMV 35S启动子重复。

“可诱导的”启动子包括，但不限于，化学可诱导的启动子和物理可诱导的启动子。化学可诱导的启动子包括具有通过化学化合物如醇、抗生素、类固醇、金属离子或其它化合物调节的活性的启动子。化学可诱导的启动子的实例包括：醇调节的启动子(例如，参见欧洲专利637 339)；四环素调节的启动子(例如，参见美国专利5,851,796和美国专利5,464,758)；类固醇响应性启动子，如糖皮质激素受体启动子(例如，参见美国专利5,512,483)，***受体启动子(例如，参见欧洲专利申请1 232 273)，蜕皮技术受体启动子(例如，参见美国专利6,379,945)等；金属响应性启动子，如金属硫蛋白启动子(例如，参见美国专利4,940,661，美国专利4,579,821和US 4,601,978)；和发病机理相关的启动子，如几丁质酶或溶菌酶启动子(例如，参见美国专利5,654,414)或PR蛋白质启动子(例如，参见美国专利5,689,044，美国专利5,789,214，澳大利亚708850，美国专利6,429,362)。

在一些实施方案中，可以使用盐或钠盐可诱导的启动子。这样的启动子的实例包括AtGRP9启动子(Chen等，Journal of Plant Research(植物研究杂志)120：337-343，2007；登记号At2g05440)和VHAc3启动子(登记号At4g38920)。

可诱导的启动子也可以是物理调节的启动子，其由非化学环境因素如温度(热和冷)、光等调节。物理调节的启动子的实例包括热休克启动子(例如，参见美国专利5,447858，澳大利亚专利732872，加拿大专利申请1324097)；冷诱导启动子(例如，参见美国专利6,479,260，美国专利6,184,443和美国专利5,847,102)；光诱导启动子(例如，参见美国专利5,750,385和加拿大专利1321563)；光抑制启动子(例如，参见新西兰专利508103和美国专利5,639,952)。

“组织特异性启动子”包括优先或特异性在生物体的一种或多种特异性细胞、组织或器官和/或生物体的一个或多个发育阶段表达的启动子。应该理解组织特异性启动子也是组成型或可诱导的。

植物组织特异性启动子的实例包括：根特异性启动子，如美国专利申请2001047525中所述的那些；果实特异性启动子，包括子房特异性和花托组织特异性启动子，诸如在欧洲专利316 441，美国专利5,753,475和欧洲专利申请973 922中所述的那些；和种子特异性启动子，诸如在澳大利亚专利612326和欧洲专利申请0 781 849和澳大利亚专利746032中所述的那些。

在一些实施方案中，可以使用优先或特异性指导在根、或其一个或多个部分中的表达的启动子。可以使用的根特异性或优先性启动子的实例包括Chen等(J.Plant Res.(植物研究杂志)120：337-343，2007)所述的根中柱基因AtGRP9(At2g05440)的启动子和美国专利5,837,876所述的来自烟草的根皮层启动子(root cortex promoter)。

启动子还可以是可由一种或多种转录激活剂激活的启动子，其在本文中称为“可激活的启动子”。例如，可激活的启动子可以包括与上游激活序列(UAS)可操作性连接的最小的启动子，所述上游激活序列(UAS)特别包括一种或多种专利激活剂的DNA结合位点。

如本文引用的，术语“最小的启动子”应该理解为包括结合至少RNA聚合酶结合位点和任选的TATA盒与转录起始位点和/或一个或多个CAAT盒的任何启动子。在一些实施方案中，其中所述细胞是植物细胞，最小的启动子可以来源于花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子。所述来源于CaMV 35S的最小的启动子可以包括，例如，基本上对应于CaMV 35S启动子的-90至+1位置(转录起始位点)的序列(也称为-90 CaMV 35S最小启动子)，对应于CaMV 35S启动子的-60至+1位置的序列(也称为-60 CaMV 35S最小启动子)或对应于CaMV 35S启动子的-45至+1位置的序列(也称为-45 CaMV 35S最小启动子)。

如上文所述，可激活的启动子可以包括与上游激活序列(UAS)融合的最小的启动子。UAS可以是能够结合转录激活剂以激活最小启动子的任何序列。示例性的转录激活剂包括，例如：酵母来源的转录激活剂，如Gal4，Pdr1，Gcn4和Ace1；病毒来源的转录激活剂，VP16；Hap1(Hach等，J Biol Chem(生物化学杂志)278：248-254，2000)；Gaf1(Hoe等，Gene(基因)215(2)：319-328，1998)；E2F(Albani等，J Biol Chem(生物化学杂志)275：19258-19267，2000)；HAND2(Dai和Cserjesi，J Biol Chem(生物化学杂志)277：12604-12612，2002)；NRF-1和EWG(Herzig等，J Cell Sci(细胞科学杂志)113：4263-4273，2000)；P/CAF(Itoh等，Nucl Acids Res(核酸研究)28：4291-4298，2000)；MafA(Kataoka等，J Biol Chem(生物化学杂志)277：49903-49910，2002)；人激活转录因子4(Liang和Hai，J Biol Chem(生物化学杂志)272：24088-24095，1997)；Bcl10(Liu等，Biochem Biophys Res Comm(生物化学生物物理研究通讯)320(1)：1-6，2004)；CREB-H(Omori等，Nucl Acids Res(核酸研究)29：2154-2162，2001)；ARR1和ARR2(Sakai等，Plant J(植物杂志)24(6)：703-711，2000)；Fos(Szuts和Bienz，Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院学报)97：5351-5356，2000)；HSF4(Tanabe等，J Biol Chem(生物化学杂志)274：27845-27856，1999)；MAML1(Wu等，Nat Genet(自然遗传学)26：484-489，2000)。

在一些实施方案中，所述UAS包括能够与GAL4转录激活剂的至少DNA结合结构域结合的核苷酸序列。

可激活的启动子的实例包括Johnson等(Plant J.(植物杂志)41：779-789，2005)和

等(Plant cell(植物细胞)21：2163-2178，2009)所述的用于拟南芥和稻的增强子捕获***。

在一些实施方案中，CIPK16核酸的表达处于来源于钠耐受性植物的CIPK16转录控制序列的转录控制之下。

“CIPK16转录控制序列”是指在其天然状态下对CIPK16核酸施加转录控制的转录控制序列或启动子。

术语“来源于”用在本文中是指转录控制序列或启动子的来源或出处。例如，“来源于CIPK16核酸”的转录控制序列是指在其天然状态下对CIPK16核酸施加至少一些转录控制的转录控制序列。术语来源于还应该理解为是指关于转录控制序列的序列信息的来源，并且不限于核酸本身的来源。因此，来源于CIPK16核酸的转录控制序列不必直接与所述基因分离。例如，具有关于在其天然状态下对CIPK16核酸施加至少一些转录控制的序列(该序列参照转录控制序列所确定)的合成的核酸应该被视为是来源于CIPK16核酸的。

如上述，CIPK16转录控制序列可以是来源于钠耐受性植物。在一些实施方案中，术语“钠耐受性植物”可以包括与引入所述转录控制序列的植物相比，表现出较高的钠耐受性程度的任何植物。在其它实施方案中，术语钠耐受性植物是指与植物物种中的至少一种其它培育品种或生态型相比，在植物物种内表现出较高程度的钠耐受性的特定培育品种或生态型。

在一些实施方案中，术语“钠耐受性”可以包括盐生植物。如本文所指，“盐生植物”应该理解为包括可以耐受在灌溉水中至少5g/l，至少10g/l，至少15g/l，至少20g/l，至少25g/l，至少30g/l，至少40g/l，至少50g/l或至少60g/l的完全溶解的固体的植物。

在一些实施方案中，CIPK16核酸处在包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的转录控制序列或其功能活性片段或其变体的转录控制之下。

SEQ ID NO：1是来源于拟南芥生态型Bay-0的CIPK16启动子的核苷酸序列。如下文所述，相对于拟南芥生态型Shahdara，该拟南芥生态型表现出提高的耐盐性。

SEQ ID NO：1的“功能活性片段”包括在至少一种植物类型中以与SEQ ID NO：1基本上相同的模式指导可操作性连接的核苷酸序列的表达的转录控制序列的片段。在一些实施方案中，该片段包括来自SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列的至少200nt，至少500nt，至少1000nt或至少1500nt。

本发明的转录控制序列的“功能活性变体”包括SEQ ID NO：1的直向同源物、突变体、合成的变体、类似物等，其在至少一种植物类型中以与SEQ ID NO：1基本上相同的模式指导可操作性连接的核苷酸序列的表达。应该认为术语“变体”特异性包括，例如，来自其它生物体的直向同源的转录控制序列；转录控制序列的突变体；转录控制序列的变体，其中在该序列内的一个或多个核苷酸被取代、添加或缺失；和由于稳定性或由于其它原因包含一个或多个修饰的碱基或修饰的DNA或RNA主链的类似物。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基和不常见的碱基如肌苷。

在一些实施方案中，所述功能活性片段或变体包括与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少82％，至少85％，至少87％，至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的核苷酸序列同一性。

当比较核酸序列以计算百分数同一性时，所比较的核苷酸序列应该沿SEQ ID NO：1的至少500个核苷酸残基，至少1000个核苷酸残基，至少1500个核苷酸残基或沿SEQ ID NO：1的全长的比较窗口进行比较。与参照序列相比(其不包含添加或缺失)，比较窗口应该包含约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)，以进行两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的最佳序列比对可以通过计算机化执行算法而进行，所述算法如BLAST家族的程序，如例如Altschul等(1997，同上)所公开的。序列分析的详细讨论可以在Ausubel等(1998，同上)Unit 19.3中找到。

在一些实施方案中，功能活性片段或变体包括在严格条件下与限定本发明的转录控制序列的核酸分子杂交的核酸分子。在一些实施方案中，所述功能活性片段或变体包括在严格条件下与包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸分子。

当用在本文中时，“严格的”杂交条件是这样的条件，其中在pH 7.0至8.3盐浓度小于约1.5M Na离子，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，温度为至少30℃。严格条件还可以通过添加脱盐试剂如甲酰胺获得。在一些实施方案中，严格的杂交条件可以是低级严格条件，中等严格条件或高级严格条件。示例性的低级严格条件包括在37℃用30至35％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，和在50至55℃在1x至2xSSC(20xSSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃在40至45％甲酰胺，1.0MNaCl，1％SDS中杂交，和在55至60℃在0.5x至1xSSC中洗涤。示例性的高等严格条件包括在37℃在50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中杂交，和在60至65℃在0.1xSSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包括约0.1％至约1％的SDS。杂交的持续时间通常小于24小时，通常为4至12小时。

杂交特异性也是杂交后洗涤的函数，关键的因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，T_m可以由Meinkoth和Wahl(Anal.Biochem.(分析化学)138：267-284，1984)方程近似计算，即，T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，L是杂交体以碱基对为单位的长度。T_m是50％的互补靶点序列与极好匹配的探针杂交的温度(在定义的离子强度和pH下)。每1％错配，T_m减少约1℃；因此，可以调节T_m，杂交，和/或洗涤条件以与不同互补程度的序列杂交。例如，可以通过使T_m减少约10℃，而与具有≥90％同一性的序列杂交。通常，选择在定义的离子强度和pH下比关于特定序列及其互补链的热解链点(T_m)低约5℃的严格条件。然而，高级严格条件可以使用在例如比热解链点(T_m)低1，2，3，或4℃的温度下进行杂交和/或洗涤；中等严格条件可以使用在例如比热解链点(T_m)低6，7，8，9，或10℃的温度下进行杂交和/或洗涤；低级严格条件可以使用在例如比热解链点(T_m)低11，12，13，14，15，或20℃的温度下进行杂交和/或洗涤。使用所述方程，杂交和洗涤组成，和所需要的T_m，普通技术人员应该理解杂交和/或洗涤溶液的严格性中的变化是固有地描述的。如果所需要的错配程度导致小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，优先增加SSC浓度，以使可以使用更高的温度。关于核酸杂交的深入指导见Tijssen(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridisation with Nucleic Acid Probes(生化和分子生物学实验室技术----用核酸探针杂交)，Pt I，第2章，Elsevier，纽约，1993)，Ausubel等，编(Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学方法)，第2章，Greene Publishing and Wiley-Interscience，纽约，1995)和Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Plainview，NY，1989)。

所述转录控制序列还可以包括终止子。术语“终止子”是指在转录单位末尾给出终止转录的信号的DNA序列。终止子是通常包含多腺苷酸信号的3′-非翻译DNA序列，其促进向初级转录物的3′-端添加多腺苷酸序列。当使用启动子序列时，终止子可以是在意欲使用所述终止子的细胞、组织或器官中可操作的任何终止子序列。可以用于植物细胞的适宜的终止子序列的实例包括：胭脂碱合酶(nos)终止子，CaMV 35S终止子，章鱼肉碱合酶(ocs)终止子，马铃薯蛋白酶抑制剂基因(pin)终止子，诸如pinII和pinIII终止子等。

在第二方面中，本发明提供用于调节包括多个植物细胞的多细胞结构的耐盐性的方法，所述方法包括依据本发明第一方面的方法调节所述多细胞结构中的一个或多个植物细胞的耐盐性。

在一些实施方案中，一个或多个植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被上调，并且所述多细胞结构的耐盐性提高。

在一些实施方案中，一个或多个植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被下调，并且所述多细胞结构的耐盐性降低。

当本文所引用时，“多细胞结构”包括一个或多个上述植物细胞的任何聚集。因此，多细胞结构特异性包括组织、器官、完整生物体及其部分。此外，多细胞结构还应该理解为包括培养的细胞的多细胞聚集，如群落、植物愈伤组织(plant calli)、液体或悬浮培养物等。

依据上述，术语“多细胞结构”应该理解为包括完整的植物、植物组织、植物器官、植物部分、植物繁殖材料或培养的植物组织(例如，愈伤组织或悬浮培养物)。

本发明第二方面所涉及的植物可以包括任何植物，包括被子植物或裸子植物高等植物以及诸如苔藓类植物、蕨类植物和木贼属植物的低等植物。

在一些实施方案中，植物细胞可以是单子叶被子植物。在一些实施方案中，所述单子叶植物可以是上述谷物农作物。在一些实施方案中，植物可以是上述稻植物。

在一些实施方案中，所述植物可以是上述双子叶被子植物。

在一些实施方案中，所述多细胞结构包括植物或其部分，对植物耐盐性的调节可以通过调节在所述植物的至少一个或多个根细胞中的CIPK16多肽的表达而实施。

在第三方面中，本发明提供相对于野生型的植物细胞具有调节的耐盐性的遗传修饰的植物细胞，其中所述植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被调节。

如本文所引用，“遗传修饰的细胞”包括关于野生型细胞被遗传修饰的细胞。因此，遗传修饰的细胞可以是本身被遗传修饰的细胞和/或所述细胞的后代。

本发明的植物细胞可以包括前述植物细胞。例如，在一些实施方案中，所述植物细胞可以是被子植物、裸子植物或苔藓类植物细胞中的任一种。在一些实施方案中，所述细胞可以是单子叶被子植物的植物细胞，谷物农作物的植物细胞或稻细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以是双子叶被子植物的植物细胞。

如上述，植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被调节。CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的调节可以如关于本发明第一方面所述。在一些实施方案中，可以依据本发明第一方面的方法产生本发明第三方面的植物细胞。

在第四方面中，本发明提供具有调节的耐盐性的多细胞结构，其中所述多细胞结构包括一个或多个本发明第三方面所述的植物细胞。

多细胞结构可以是前述任何多细胞结构。在本发明的一些实施方案中，相对于野生型多细胞结构，由于包括一个或多个具有调节的耐盐性的细胞，可以调节作为整体(例如，植物)的所述多细胞结构的耐盐性。在一些实施方案中，本发明提供了相对于野生型植物具有提高的耐盐性的植物。

在第五方面中，本发明提供用于确定或预测植物细胞的耐盐性的方法，所述方法包括确定所述植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达。

如上述，植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达与植物细胞中耐盐性的水平相关。因此，植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的相对高的表达与所述植物细胞中提高的耐盐性相关，并且植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的低表达与所述植物细胞中降低的耐盐性相关。

确定核酸或多肽表达水平和/或模式的方法在本领域中是已知的。检测RNA表达的示例性方法包括这样的方法，诸如定量或半定量反转录酶PCR(例如，参见Burton等，Plant Physiology(植物生理学)134：224-236，2004)，原位杂交(例如，参见Linnestad等，Plant Physiology(植物生理学)118：1169-1180，1998)；RNA印迹法(例如，参见Mizuno等，Plant Physiology(植物生理学)132：1989-1997，2003)；等等。用于多肽表达的示例性方法包括蛋白质印迹法(例如，参见Fido等，Methods Mol Biol.(分子生物学方法)49：423-37，1995)；ELISA(例如，参见Gendloff等，Plant Molecular Biology(植物分子生物学)14：575-583)；免疫显微镜法(例如，参见Asghar等，Protoplasma(原生质)177：87-94，1994)等等。在另一个实施方案中，CIPK16核酸序列的表达可以通过确定在一个或多个生物体细胞的基因组DNA中存在的CIPK16核酸的数目来确定。

本发明第五方面所涉及的植物细胞可以包括前述任何植物细胞。

在第六方面中，本发明提供用于确定或预测包括植物细胞的多细胞结构的耐盐性的方法，所述方法包括依据本发明第五方面任一项的方法来确定或预测所述多细胞结构中的植物细胞的耐盐性。

在一些实施方案中，多细胞结构的植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达与包括所述植物细胞的多细胞结构的耐盐性水平相关。因此，植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的相对高的表达与多细胞结构中提高的耐盐性相关，植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的低表达与多细胞结构中降低的耐盐性相关。

本发明第六方面所涉及的多细胞结构可以包括前述任何多细胞结构，包括植物或其部分。

用于确定CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达的细胞可以是任何适当的植物细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以包括根细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以包括叶细胞。

在其它实施方案中，本发明第六方面的方法可以用来确定生物体的盐度敏感性或耐受性，然后基于所确定的盐度敏感性或耐受性来选择个体生物体。例如，在植物的情形中，可以选择具有提高的耐盐性的植物栽培在盐渍土中，或可以选择具有提高的耐盐性的植物用于育种方案，从而产生植物的耐盐性培育品种。

最后，参考标准的分子生物学教科书，其包含用于实施本发明所包括的基本技术的方法，其包括用于产生本文所述的各种基因构建体的DNA限制性和连接。参见，例如，Maniatis等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，纽约，1982)和Sambrook等(2000，同上)。

本发明的实施方案通过下述非限制性实施例进行进一步的描述：

附图简述

图1显示以LR比例绘制的与2号染色体上Na⁺叶片外排连锁的数量性状基因座。将420株系的Bay-0×Shahdara绘图群体在土壤中生长6周，并且在第2，3，4，5和6周提供2mM。取决于萌茎和存活，每个株系进行1至8次重复。黑线显示似然比统计量，长虚线显示相加效应。短虚线显示显著性水平，从下到上为提示的、显著的和极显著的。

图2显示通过火焰光谱测定法确定的Bay-0×Shahdara绘图群体株系中在位于QTL峰下的标记MSAT2.41处的Na⁺浓度，所述绘图群体株系具有Bay-0或Shahdara基因型。结果是平均值±s.e.m.(对于Bay-0基因型，n＝228，对于Shahdara基因型，n＝133)。

图3显示不同拟南芥组织中AtCIPK16表达模式的Genevestigator heatmap输出结果。白色和浅蓝色表示无或低基因表达，深色表示高表达。列出了为每种组织进行了数据挖掘的阵列的数目。

图4显示在不同实验条件下AtCIPK16表达增加的部分Genevestigator绘图结果。箭头表示盐和渗透压实验。列出了为每种组织进行了数据挖掘的阵列的数目(实验/对照)。

图5显示以水培法生长5周然后在0或50mM NaCl中暴露5天的三种拟南芥生态型的茎中AtCIPK16基因表达的水平。结果为平均值±s.e.m。(n＝3)

图6显示以水培法生长5周然后在0或50mM NaCl中暴露5天的三种拟南芥生态型的根中AtCIPK16基因表达的水平。结果为平均值±s.e.m。(n＝3)

图7显示以水培法生长5周然后在0或100mM NaCl中暴露5天的三种拟南芥生态型的根中AtCIPK16基因表达的水平。结果为平均值±s.e.m。(n＝3)。

图8显示在T₁拟南芥植物中AtCIPK16转基因的表达。由生长在土壤中的植物的茎提取RNA并且产生cDNA。利用PCR来证实AtCIPK16和Actin2基因的存在。

图9显示通过火焰光谱测定法确定的在来自株系11，33和野生型(WT)Col-0植物的平均植物的Na⁺浓度。结果显示为8-16次生物学重复的平均值±S.E.。Y轴表示Na⁺的μmol/g鲜重。

图10显示在100mM NaCl中生长10天的5周龄拟南芥植物的根中天然AtCIPK16和AtCIPK16转基因的表达。结果显示为8-16次生物学重复的平均值±S.E.。Y轴表示相对基因表达，其中野生型中的表达水平＝1。

图11显示在100mM NaCl中生长10天的5周龄拟南芥植物的茎中天然AtCIPK16和AtCIPK16转基因的表达。结果显示为8-16次生物学重复的平均值±S.E.。Y轴表示相对基因表达，其中野生型中的表达水平＝1。

图12显示以水培法生长5周然后加入0或100mM NaCl 10天后在株系11和33以及野生型(WT)Col-0植物的T2分离拟南芥植物中的总茎生物量。结果显示为8-16次生物学重复的平均值±S.E.。Y轴表示茎生物量的鲜重(g)。对于每次处理，左侧柱状物显示在0mM NaCl的茎生物量鲜重，而右侧柱状物显示在100mM NaCl的茎生物量鲜重。

图13显示相对于野生型对照(带有误差条的点)的散点图，在拟南芥amiRNA株系中，火焰光谱测定法(以确定茎Na⁺浓度)和半定量RT-PCR(以评估AtCIPK16基因表达的水平)的结果的散点图。

图14显示以水培法生长5周然后加入100mM NaCl 10天的株系111，132，222和2122的个体T₂分离拟南芥植物中，以火焰光谱测定法确定的Na⁺浓度。在提取过程中丢失了样品2122C。Y轴显示Na⁺的μmol/g鲜重。

图15显示当以水培法生长5周然后加入100mM NaCl 10天时，表达amiRNA CIPK16-1(株系111或132的植物)或amiRNA AtCIPK16-2(株系222或2122)的个体拟南芥植物中关于AtCIPK16的半定量RT-PCR的结果。关于野生型(WT)Col-0植物的结果为3次生物学重复的平均值±S.E.Y轴表示相对基因表达，其中野生型中的表达水平＝1。

图16显示两种水稻转化体(16-1和16-2)(左图)。右图显示在16-1和16-2中可以检测到AtCIPK16和潮霉素抗性基因。

图17显示以水培法生长2周然后加入75mM NaCl 5天的来自株系16_1和16_2的分离的T₂ 35S::AtCIPK16水稻植物的第四叶片生物量。Y轴显示以g为单位的第4叶片干重。

图18显示以水培法生长2周然后加入75mM NaCl 5天的来自株系16_1和16_2的分离的T₂ 35S::AtCIPK16水稻植物中茎的钠浓度(上图)和AtCIPK16表达(下图)的比较。上图中的Y轴表示μmol Na⁺/g干重。下图中的Y轴表示相对基因表达，其中野生型中的表达水平＝1。

实施例1

Bay-0×Shahdara绘图群体的生长和分型

在由欧洲拟南芥种子中心(European Arabidopsis Stock Centre)(Nottingham，英国)获得的Bay-0×Shahdara拟南芥绘图群体的420株重组近交系(RILs)上进行关于Na⁺外排的分型。植物在人工土壤混合物上萌发，所述人工土壤混合物由3.6L Coira，3.6L珍珠岩和0.25L沙组成，并且提供有300ml营养液(2mM Ca(NO₃)，15mM KNO₃，0.5mM MgSO₄，0.5mM NaH₂PO₄，15mM NH₄NO₃，2.5μM NaFeEDTA，200μM H₃BO₃，0.2μM Na₂MoO₄，0.2μM NiCl₂，1μM ZnSO₄，2μM MnCl₂，2μM CuSO₄和0.2μM CoCl₂)。一周后，且接着进行5周，植物每周提供一次300ml包含2mMNaCl的营养液。如果需要，每周提供一次另外的300ml水，24小时后去除过量的水。

生长6周后，摘取最后完全展开的叶片，获得其鲜重。将叶片在hotblock(Thermoline Scientific，Northgate，澳大利亚)中在85℃1％硝酸中消化过夜。当冷却时，必要时稀释样品，然后通过420型火焰光谱测定计(Sherwood Scientific，Cambridge，英国)确定组织中的Na⁺和K⁺浓度。

实施例2

QTL绘图

从http://dbsgap.versailles.inra.fr/vnat/Documentation/33/DOC.html获得关于所有420株系的38种微卫星标记的基因型数据。除了表型数据，也将这些数据输入到绘图程序MapManager QTX(http://www.mapmanager.org/)中。对于茎Na⁺和K⁺浓度以及茎Na⁺/K⁺比例进行区间绘图，具有1000种排列。

实施例3

由RILs进行DNA提取

由在QTL的侧翼标记之间存在重组的RILs提取DNA。叶片组织在液氮中冷冻，然后使用研钵和研棒碾成粉末。向碾碎的植物材料中加入400μl Edwards缓冲液(200mM Tris HCl(pH 7.5)，250mM NaCl，25mM EDTA和0.5％SDS)，并将样品在室温(RT)下放置1小时。将提取物以10,000g离心1分钟，并且将300μl上清加入到300μl异丙醇中。将样品在RT下放置2分钟，然后以10,000g离心5分钟。去除上清，并将沉淀重悬在200μl TE缓冲液中在4℃过夜。将样品以10,000g离心5分钟，然后将150μl悬浮液添加到15μl 3M NaAc和115μl异丙醇中。将样品在室温下放置10分钟，然后以10,000g离心5分钟。去除上清，并将DNA沉淀用70％乙醇洗涤两次，然后空气晾干。将DNA重悬在100μl TE缓冲液中。

实施例4

QTL的精细绘图

为了精细绘图QTL，设计20种酶切扩增多态位点(CAPS)标记来识别QTL区间中Bay-0与Shahdara DNA之间的差异。设计每种CAPS标记来扩增长度为500-1000个碱基的基因组DNA区域，在该区域中具有针对一条亲本DNA而非另一条亲本DNA上的特异性限制性酶的识别位点。使用特异性CAPS标记引物和Platinum Taq(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，在所有DNA上进行聚合酶链式反应(PCR)，并且将PCR产物用所需要的限制性酶消化3小时。关于新CAPS标记的绘图株系的基因型显现在2％琼脂糖凝胶上。

实施例5

在线微阵列数据挖掘

使用Genevestigator版本3(https://www.genevestigator.ethz.ch/gv/index.jsp)来对3110拟南芥Affymetrix ATH1：22k微阵列进行数据挖掘，以获得不同植物组织和在不同实验条件下AtCIPK16(At2g25090)的表达模式。

实施例6

Q-PCR水培法

从欧洲拟南芥种子中心(Nottingham，英国)获得拟南芥生态型Columbia(Col)，Wassilewskija(Ws)和Landsberg erecta(Ler)的种子。将单个的种子在1.5ml微量离心管中在补充有半强度拟南芥营养培养基的0.8％细菌培养用琼脂顶部萌发(Arteca和Arteca，Physiologia Plantarum 108：188-193，2000)。在4℃春化处理2天后，将管转移到具有10小时光照/14小时黑暗的光周期的栽培室中，照射为70μmol.m^-2.s^-1，恒定温度为21℃。当植物的根已经生长至琼脂距离的三分之二时，去除微量离心管的底部，以允许根暴露出来。当根从管中暴露出来时，将它们转移到包含完全强度的营养液的连续通气的水培设置中。监测水培液的pH，并且保持在pH5.7。在萌发后通过加入50或100mM NaCl应用盐胁迫5周，如果需要，通过加入另外的CaCl₂来维持营养液中的钙活性(其使用Visual Minteq V 2.3(US Environmental Protection Agency(美国环境保护处)；美国)计算)。在盐处理5天后收集完整的根和茎，并且立即冷冻在液氮中。

实施例7

在水培生长的植物中CIPK16的表达分析

按照先前所述的流程(Chomczynski，BioTechniques(生物技术)15：532-537，1993)，使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)由冷冻的根和茎样品提取总RNA。使用Ambion的DNA-free(Promega，Madison，WI，USA)去除基因组DNA污染，使用Superscript III(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)用200ng总RNA合成cDNA。按照Burton等的方法(Plant Physiol.(植物生理学)134：224-236，2004)使用RG6000 Rotor-Gene实时热循环仪(Corbett Research，悉尼，澳大利亚)，对基因AtCIPK16(At2g25090)的cDNA进行定量实时PCR(Q-PCR)。亲环蛋白(At2g36130)，微管蛋白α2链(TUA2，At1g50010)和甘油醛3-磷酸脱氢酶A(GAPA，At3g26650)用作对照基因，从而将结果标准化。显示的结果为三次生物学重复的平均值±s.e.m.。引物序列参见下表2。

表2-用于Q-PCR实验的引物

实施例8

在2号染色体上检测到的新型QTL

从在第2，3，4，5和6周用2mM NaCl浇灌的6周龄拟南芥RILs收集茎Na⁺和K⁺累积物。对于萌发的每一株系，重复的数目为1和8之间，这取决于植物的存活。将表型数据以及由网络下载的RIL基因型数据输入到MapManager中，并且用于QTL绘图。使用区间绘图，在2号染色体上侧翼标记MSAT2.36和MSAT2.7之间的微卫星标记MSAT2.41处发现极显著QTL，其解释具有100.9的似然比(LR)的24％的总表型变化(参见图1和下表3)。当通过在MSAT2.41处具有Bay-0或Shahdara等位基因的那些之间的表型分离RILs时，可以发现在这些株系之间在Na⁺累积上存在约2倍的差别。这些在MSAT2.41处具有Bay-0等位基因的RILs具有6.9±0.25微摩尔Na⁺g^-1 FW的平均茎Na⁺浓度，n＝228，而具有Shahdara等位基因的那些具有14.7±0.74微摩尔Na⁺g^-1FW，n＝133，结果是平均值±平均值的标准误差(s.e.m.)(图2)。

表3-由Na⁺外排表型和RIL基因表型数据计算的区间绘图结果。列显示微卫星标记的位置，关于Na⁺外排表型的DNA区域效应的可能性得分，由区域和相加效应解释的％总表型变化。

实施例9

QTL的精细绘图

在侧翼标记MSAT2.36和MSAT2.7之间，存在约1200种基因，其中没有Na⁺转运涉及的明显的候选基因，如AtSOS1，AtNHX1，AtHKT1；1或AtAVP1。为了将区间缩小到更少的基因数目，设计20种CAPS标记，并且用于具有在这两个侧翼标记之间的重组的RILs的基因分型。精细绘图将QTL的区间缩小至基因At2g24970和At2g25355之间(一个包含41种基因的区间)(见下表4)。在该区域内是目的候选基因AtCIPK16(At2g25090)，其编码钙依赖磷酸酶B样相互作用蛋白酶，并且属于如AtCIPK24(At5g35410)(也称为AtSOS2)基因的同一家族。

表4-QTL区间内保留的候选基因的数目，以及每种基因的简述。

AtCIPK16以粗体显示。

实施例10

CIPK16表达的特异性和诱导性

用Genevestigator检索揭示AtCIPK16主要在根组织中和在幼小植物如幼苗中表达(见图3)。在茎中存在非常少的基因表达。发现许多环境刺激增加根中的AtCIPK16表达，所述环境刺激包括盐度和渗透压(见图4)。

实施例11

水培生长的拟南芥生态型中的AtCIPK16表达

将三种拟南芥培育品种Col，Ler和Ws水培生长5周，然后暴露于0，50或100mM NaCl 5天。尽管在对照或盐胁迫条件下，在任何生态型的茎中没有检测到显著的AtCIPK16表达(见图5)，在50和100mM NaCl盐胁迫下的所有生态型的根中存在基因表达的显著上调(分别参见图6和7)。取决于生态型和NaCl浓度，在AtCIPK16表达中存在1.5至3.1-倍的增加。

实施例12

由野生型和转基因拟南芥和水稻植物的DNA和RNA提取以及cDNA合成

使用Edwards等(Nucleic Acids Res(核酸研究)19：1349，1991)的方法，从拟南芥的嫩叶提取基因组DNA。简言之，将植物茎或根组织在液氮中骤冷，并且用研钵和研棒碾成细碎的粉末。向该粉末中，加入400μlEdwards缓冲液(200mM Tris pH 8，25mM EDTA，250mM NaCl和0.5％SDS)，并将样品在室温下放置1小时。将样品以13,000g离心2分钟，并且去除上清。通过加入300μl 100％异丙醇，然后将样品在室温下温育2分钟，之后以13,000g离心5分钟，而沉淀DNA。DNA沉淀用70％乙醇洗涤，并允许空气晾干，然后重悬在100μl TE缓冲液中。

按照Chomczynski(Biotechniques(生物技术)15：532-537，1993)所述的流程，使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取总RNA。使用DNA-free(Ambion，Madison，WI，USA)去除基因组DNA污染，并且使用Superscript III(Invitrogen)用2μg总RNA合成cDNA。

实施例13

AtCIPK16在拟南芥植物和稻中的过表达

使用引物AtCIPK16完整基因正向(ATGGAAGAATCAAACCGTAGTAGTACTGTC；SEQ ID NO：10)和AtCIPK16完整基因反向(TTGGAATTGGATGTGCGAGG；SEQ ID NO：11)，将来自拟南芥基因组DNA的AtCIPK16基因(2069个核苷酸)克隆到pCR8 Gateway入门载体中(pCR8 Gateway enabled entry vector)。利用质粒的限制性消化和测序来证实所述基因在载体中的方向，并且确保在所克隆的基因的编码序列中没有错误。

为了拟南芥转化，然后，使用Gateway反应，将该基因转移到pTOOL2目的载体中，并且转化到根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL1中。

对于稻转化，将基因用Gateway反应转移到pMDC32目的载体中，并且转化到根瘤农杆菌(A.tumefaciens)菌株AGL1中。这两个载体都使用双重CaMV35S启动子来驱动转基因的表达。

实施例14

amiRNA敲降

与大多数拟南芥基因不同，对于AtCIPK16不存在可获得的商购T-DNA***敲除突变体。实验室的早期实验研究了在AtCIPK16起点ATG的5′的GABI-Kat(Max Planck Institute for Plant Breeding Research(Max Planck植物培育研究所)，Koeln，德国)T-DNA***140bp是否破坏基因的表达。然而，发现T-DNA不影响基因的表达，这表明缺失AtCIPK16表达的植物是致死性的或不能很好地生长。因此，使用人工微RNA构建体(artificial micro RNA construct)(amiRNA)，产生基因敲降突变体，来研究减少的AtCIPK16表达对茎Na⁺积累的影响。利用WMD 2-Web MicroRNA Designer(http://wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl)，鉴定了两种21个核苷酸序列的AtCIPK16，针对其可以设计两种独立的减少该基因表达的amiRNA构建体。将这些构建体命名为amiRNA AtCIPK16-1(TTTTCGTCGATAAACGGCAAG；SEQ ID NO：12)和amiRNA AtCIPK16-2(TTATTCCGTAAAACCTCCGGC；SEQ ID NO：13)。将包含产生21bp amiRNAs所需要的序列的引物(见表5)结合到amiRNA载体MIR319a中，并且按照http://wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl？page＝7的流程，将完整的amiRNA构建体克隆到pCR8中。测序后，为了检验任何序列错误并确定序列的正确方向，进行Gateway LR将两种amiRNA构建体转移到pTOOL2载体中，其使用CaMV35S启动子来驱动amiRNA的表达。

表5-用于将amiRNA序列结合到载体中的引物序列

实施例15

拟南芥转化

使用根瘤农杆菌菌株AGL1，通过花浸法(floral dip method)(Clough和Bent，Plant J(植物杂志)16：735-743，1998)，用包含35S过表达或amiRNA构建体的pTOOL2载体转化拟南芥Col-0生态型。收集转化的植物的种子，并且在人工土壤培养基(3.6L珍珠岩-培养基等级，3.6L coira和0.25L河沙)上萌发，并用100mg L^-1 BASTA(AgrEvo，Düsseldorf，德国)喷雾以鉴定推定的T₁转化体。将转化体转移到土壤中，每周用300ml营养液(2mM Ca(NO₃)，15mM KNO₃，0.5mM MgSO₄，0.5mM NaH₂PO₄，15mM NH₄NO₃，2.5μM NaFeEDTA，200μM H₃BO₃，0.2μM Na₂MoO₄，0.2μM NiCl₂，1μM ZnSO₄，2μM MnCl₂，2μM CuSO₄和0.2μM CoCl₂)浇水，并生长至开花以收集T₂种子。由T₁植物提取DNA和RNA，以确定转基因的存在和表达和通过限制性消化和DNA印迹法确定的***物的数目。

实施例16

确定转基因的存在和活性

对由转基因植物获得的DNA和cDNA进行PCR反应，以确定AtCIPK16转基因或amiRNA构建体的存在和活性。反应使用PlatinumTaq(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)按照供应商的方法用下表6列出的引物进行。

表6-用于验证转基因存在于转化体拟南芥和稻植物中的引物序列

实施例17

使用DNA印迹法确定***数目

将基因组DNA(10μg)在37℃用400U HindIII消化5小时。消化的DNA在1％(w/v)琼脂糖凝胶上分离，并且将DNA片段用Southern法(Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)98：503，1975)转移到尼龙膜上。将尼龙膜在2×SSC溶液中中和。将膜在使用探针前在80℃在真空下干印迹并晾干。膜的预杂交在6×SSC，1×Denhardt’s III溶液(2％w/v BSA，2％w/v Ficoll 400和2％PVP)，1％(w/v)SDS和2.5mg变性的鲑鱼***DNA中在65℃最少进行4小时。包含3×SSC，1×Denhardt’s III溶液，1％(w/v)SDS和2.5mg变性的鲑鱼***DNA的杂交混合物(10ml)用来替换弃掉的预杂交混合物。DNA探针用Megaprime DNA标记试剂盒按照供应商(Amersham，英国)的指导用[α-³²P]-dCTP进行放射性标记。将探针在65℃杂交16小时。将膜在65℃先后用包含0.1％(w/v)SDS的2×SSC，用1×SSC/0.1％(w/v)SDS和用0.5×SSC/0.1％(w/v)SDS洗涤20分钟。将膜进行干印迹，密封在塑料中，并且用增光屏将RX X-射线胶片在-80℃暴露于该膜24-48小时。

实施例18

拟南芥盐胁迫测定

通过在70％乙醇中浸泡2分钟然后在无菌milli-Q水中润洗3-4次，将来自Col-0或分离的T₂植物的种子进行表面灭菌，然后将单个种子种植在装有半强度拟南芥营养液(Arteca和Arteca，Physiol Plantarum 108：188-193，2000)和0.8％细菌培养用琼脂中的1.5ml微量离心管中，所述Col-0或分离的T₂植物包含过表达或敲降AtCIPK16活性的构建体。将所述种子在4℃春化处理2天，然后转移至栽培室中，10小时光照/14小时黑暗的光周期，照射为150μmol m^-2s^-1，恒定温度为21℃。当出现子叶且幼苗的根已经向下生长至管长度的约三分之二时，去除微量离心管的0.5-0.7cm的底。当根从琼脂中暴露出来时，将植物转移到连续通气的包含完全强度的拟南芥营养液的水培箱中。监测水培液的pH，并且保持在pH 5.7。在萌发后通过加入100mM NaCl以12小时增加25mM应用盐胁迫5周。通过加入准确量的钙(其使用Visual Minteq Version 2.3(US Environmental Protection Agency(美国环境保护处)，美国)计算)，在每次盐应用将生长培养基中的钙活性保持在0.3mM。

在盐处理后10天收获植物。切离对照和盐处理的植物的完整的茎，并且记录鲜重。摘下最后完全展开的叶片，称重并且在Hot Block(Environmental Express，Mt Pleasant，South Carolina，USA)中在85℃在1％硝酸中消化过夜。使用420型火焰光谱测定计(Sherwood Scientific，Cambridge，UK)测量该叶片中的Na⁺和K⁺浓度。对于包含35S过表达或amiRNA构建体的转基因植物，将茎和根材料的剩余物冷冻在液氮中，以用于提取DNA和RNA，从而验证转基因的存在或活性。

实施例19

半定量PCR

在由以水培法生长的拟南芥和稻植物获得的cDNA上进行关于AtCIPK16的半定量PCR。按照供应商的流程使用Platinum Taq(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)并使用表6列出的引物。

简言之，将约2μg cDNA加入到1×PlatTaq PCR缓冲液，1.5mMMgCl₂，0.2mM dNTPs，0.2μM正向引物，0.2μM反向引物和1UPlatinumTaq中。扩增条件为初始在94℃变性2分钟，然后是28个循环：94℃30秒，50℃30秒和72℃1分钟。对于拟南芥和稻分别使用对照基因AtACT2和OsGAP。将样品在包含显现DNA的SyberSafe的琼脂糖凝胶上运行，并且拍照凝胶照片。利用图像程序Scion Image(Scion Coporation，Maryland，USA)来确定该凝胶上所观察到的所有PCR产物条带的强度，以及凝胶本身的背景信号。首先去除每个凝胶之间的背景强度，并且将来自每种样品的信号强度关于每种对照基因进行标准化。因此，使用使样品对照基因表达标准化所需要的因素调整每种样品的AtCIPK16表达，以允许不同样品之间的比较。

实施例20

水稻转化

使用改良的Toki等的方法(Plant J.(植物杂志)47：969-976，2006)转化水稻种子。将野生型Nipponbare水稻种子去壳，并用70％乙醇洗涤1分钟。将种子在30％White King漂白剂中消毒30分钟，然后用无菌milliQ水润洗10次。将种子转移到含有N6D培养基(Toki等，2006，同上)的平板上，并且在暗处在28℃生长5-8天以诱导萌发。将用包含AtCIPK16基因的pMDC32质粒转化的根瘤农杆菌悬浮在AAM培养基(Toki等，2006，同上)中，并且调整到600nm处的光学密度为0.1。将萌茎的水稻幼苗浸渍在含有AAM培养基的根瘤农杆菌中2分钟，然后在2N6-AS培养基(Toki等，2006，同上)中在暗处在25℃培养3天。三天后，将种子用无菌水润洗1分钟，然后用含有抗生素400mg L^-1头孢噻肟(Cefotaxime)和100mg L^-1万古霉素(Vancomycine)的无菌水润洗两次。将洗涤的种子转移到N6D-选择培养基上(表7)，所述N6D-选择培养基含有400mg L^-1头孢噻肟，100mg L^-1万古霉素和150mg L^-1 Genetacine，并在暗处在28℃生长三周。将转化的愈伤组织在PRN培养基(表7)上在28℃在暗处生长一周，在PRN培养基(表7)上在28℃在暗处生长一周，在RN培养基(表7)上在28℃在暗处生长三天，在RN培养基上在28℃光照生长，直到出现第一个茎。将新形成的茎与其余的愈伤组织分离，并且在光照下在28℃置于P培养基(表7)中直到足够大以足以转移到土壤中。然后，将原代转化体在栽培室中生长至结种，条件如下：28℃/25℃昼/夜，80％/60％昼/夜湿度和600μmol m^-2s^-1光，光照黑暗周期为12小时光照/12小时夜晚。

表7-水稻培养基

实施例21

水稻盐胁迫测定

将35S::AtCIPK16和野生型Nipponbare水稻在潮湿的滤纸上在28℃/25℃昼/夜，80％/60％昼/夜湿度和600μmol m^-2s^-1光，光照黑暗周期为12小时光照/12小时夜晚条件下萌发。将幼苗从滤纸上取下，并且置于1.5ml微量离心管中，所述离心管的底部已经去除，以允许根从管子中伸出来。将每个离心管小心地放置在充满ACPFG水稻营养液(5mM NH₄NO₃，5.0KNO₃，2mM Ca(NO₃)₂，2.0mM MgSO₄，0.1mM KH₂PO₄，0.5mM Na₂SiO₃，50μM NaFe_(III)EDTA，10μM H₃BO₃，5μM MnCl₂，5μM ZnSO₄，0.5μM CuSO₄和0.1μM Na₂MoO₃)的10L箱子上的支持物中，以允许幼苗的根接近培养基。将幼苗在28℃/25℃昼/夜，80％/60％昼/夜湿度和600μmol m^-2s^-1光，光照黑暗周期为12小时光照/12小时夜晚的条件下生长两周，每5天更换营养液。萌茎后19天时，将一半幼苗转移到含有75mM NaCl且补充了0.24mM CaCl₂的营养液中。为了不休克植物，盐的应用以三次12小时的25mM NaCl和0.8mM CaCl₂应用进行。在收获前，允许植物再生长两周。从每株植物上取下第4片完全展开的叶片，记录其鲜重，然后在65℃温育48小时，以获得干燥的组织测量干重。获得重量测量后，将组织用1％硝酸在85℃消化6小时。通过火焰光谱测定法确定每个叶片的Na⁺和K⁺测量。除了第4片样品之外，将每株植物的剩余的茎材料冷冻在液氮中，并且提取RNA来确定转基因水稻和野生型水稻中AtCIPK16的表达水平。RNA提取、DNA去除、反转录和PCR按前述进行。

实施例22

在拟南芥中组成型过表达AtCIPK16减少茎中Na ⁺ 的量并且提高耐盐性

将拟南芥生态型Col-0用35S::AtCIPK16构建体转化，该构建体设计为组成型表达AtCIPK16基因。从用35S::AtCIPK16转化的T₁转基因拟南芥植物提取DNA，并且利用DNA印迹法来确定转基因的***数目。使用设计成识别驱动AtCIPK16转基因表达的双重CaMV35S启动子的探针来探测所述DNA。植物株系11和33包含两个转基因***，其用于后续的实验。

为了证实AtCIPK16转基因在T₁植物中的表达，由在土壤中生长的植物的茎中提取RNA，并且产生cDNA。利用PCR来验证AtCIPK16和Actin2基因的存在。使用茎材料，因为先前已经显示在对照条件下，野生型Col-0在茎中具有很少至没有AtCIPK16表达。如在图8中所示，泳道1.1显示在株系11的茎中的AtCIPK16表达，泳道3.3显示在株系33中的基因表达。阴性泳道包含由野生型Col-0植物提取的cDNA，并且表明，尽管可以从这些样品扩增对照基因AtACT2，但是没有观察到AtCIPK16表达。

株系11和33的分离的T₂植物以水培法生长5周，然后加入100mMNaCl 10天。如在图9中所示，火焰光谱测定法确定，平均来看，与野生型(WT)Col-0植物相比，株系11和33的植物具有25％更少的茎Na⁺。然而，这些观察仍然包含零分离(null segregates)，其不过表达该基因。在该群体中，鉴定了许多具有30％至50％茎Na⁺积累和高AtCIPK16表达的个体植物。

从在100mM NaCl中生长10天的5周龄的植物的根提取RNA，并且确定天然AtCIPK16和AtCIPK16转基因的表达水平。如在图10中所示，平均来看，与野生型(WT)Col-0相比较，在株系11和33的分离的过表达T₂植物的根中存在3至4倍更高的AtCIPK16表达。

还从在100mM NaCl中生长10天的5周龄的植物的茎提取RNA，并且确定天然AtCIPK16和转基因的表达水平。如在图11中所示，平均来看，与野生型(WT)Col-0相比较，在株系11和33的分离的T₂植物的茎中存在10至25倍更高的AtCIPK16表达。与根相比(图10)，这种在茎中观察到的相对较高的表达是由于在野生型Col-0中低的茎AtCIPK16表达。

在以水培法生长5周，然后加入0或100mM NaCl 10天后，在株系11和33的T₂分离植物以及野生型(WT)Col-0植物中确定总的茎生物量。如在图12中所示，尽管在100mM NaCl中生长10天后，野生型茎的鲜重减少50％，但是株系11的植物没有表现出茎生物量减少。尽管株系33的T₂分离植物表现出与野生型植物相似的茎生物量减少，但是存在具有与株系11中观察到的那些相似的生物量的个体。

实施例23

使用amiRNA减少AtCIPK16的表达水平导致茎Na ⁺ 浓度的增加

将拟南芥生态型Col-0用两种分离的amiRNA构建体转化，所述构建体设计为敲降天然AtCIPK16基因的表达。由转化了amiRNA AtCIPK16构建体的T₁转基因拟南芥植物提取DNA，并且利用DNA印迹法来确定转基因的***数目。使用设计成识别驱动amiRNA构建体表达的双重CaMV35S启动子的探针来探测所述DNA。发现植物株系111和132包含amiRNA CIPK16-1构建体，而发现植物株系222和2122包含amiRNACIPK16-2构建体。来自这四种株系的子代用在随后的实验中。这些植物包含1至5个amiRNA构建体***。

将来自株系111，132，222和2122的个体T₂分离植物以水培法生长5周，然后加入100mM NaCl 10天。利用火焰光谱测定法来确定茎Na⁺积累，并且利用半定量RT-PCR来估算相对于野生型对照的AtCIPK16基因表达水平，amiRNA株系的AtCIPK16基因表达水平(图13中显示为具有误差条的点)。如在图13中所示，观察到一种趋势，具有低根AtCIPK16表达那些amiRNA植物表现出增加的Na⁺积累。

将来自株系111，132，222和2122的个体T₂分离植物以水培法生长5周，然后加入100mM NaCl 10天。如在图14中所示，火焰光谱测定法鉴定了表达amiRNA的植物趋向于具有比野生型更高的茎Na⁺的趋势。

将来自株系111，132，222和2122的个体T₂分离植物以水培法生长5周，然后加入100mM NaCl 10天。半定量RT-PCR确定表达amiRNA CIPK16-1(来自株系111或132的植物)或amiRNA AtCIPK16-2(株系222或2122)的个体植物中的AtCIPK16表达水平。如在图15中所示，多种植物在根中表现出减少的AtCIPK16表达，并且这与在茎中观察到的Na⁺量相关。

实施例24

水稻中AtCIPK16的过表达

将水稻愈伤组织用设计为在水稻中表达AtCIPK16的35S::AtCIPK16载体转化。如在图16中所示，左图显示两种转化体(16_1和16_2)，而右图显示可以在16_1和16_2二者中检测到AtCIPK16和潮霉素抗性基因(用来从未转化的愈伤组织选择转基因愈伤组织)。在野生型(WT)Nipponbare水稻中没有检测到任何基因的表达。在所有植物中可以检测到对照基因GAP的表达。

将来自株系16_1和16_2的分离的T₂ 35S::AtCIPK16水稻植物以水培法生长两周，然后加入75mM NaCl 5天。取下每株植物的第四片叶片，记录其干重，然后可以确定叶片的Na⁺浓度。如图17中所示，当与野生型(WT)Nipponbare植物相比较，存在多种具有显著更高的叶生物量的个体植物。

将来自株系16_1和16_2的分离的T₂ 35S::AtCIPK16水稻植物以水培法生长两周，然后加入75mM NaCl 5天。如图18中所示，来自两种株系的植物具有可检测的AtCIPK16表达水平，与野生型(WT)Nipponbare植物(n＝对于WT植物)相比，具有显著更低的茎Na⁺。来自株系16_1和16_2的没有显示出转基因表达的T₂植物具有与野生型植物相似或更高的茎Na⁺。仅有4株个体植物不符合这种模式。令人鼓舞的是，植物16_1_4，16_1_5，16_1_6和16_2_6具有高AtCIPK16表达水平和极低的茎Na⁺。

本领域技术人员应该理解，本文所述的本发明容许除具体描述的那些之外的变化和修改。应该理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或笼统地引用或所示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两种或多种步骤或特征的任意组合和所有组合。

此外，必须注意到，用在本文中时，单数形式“一个(“a”，“an”)”和“这个(“the”)”包括复数方面，除非上下文已经另外指明。

在本说明书中，除非上下文另外需要，词语“包括(“comprise”)”或其变化形式如“comprises”或“comprising”应该理解成暗示包括所述要素或整数或一组要素或一组整数，而不排除任意其它的要素或整数或一组要素或一组整数。

Claims

1.用于调节植物细胞的耐盐性的方法，所述方法包括调节所述植物细胞中的CIPK16多肽的表达。

2.权利要求1的方法，其中CIPK16多肽的表达通过调节所述植物细胞中CIPK16核酸的表达而进行调节。

3.权利要求1或2的方法，其中在所述植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被上调，并且所述植物细胞的耐盐性提高。

4.权利要求1或2的方法，其中在所述植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被下调，并且所述植物细胞的耐盐性降低。

5.权利要求1至3中任一项的方法，其中在所述植物细胞中CIPK16核酸在组成型转录控制序列的转录控制下表达。

6.权利要求5的方法，其中所述转录控制序列包括一个或多个CaMV35S启动子重复。

7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述植物细胞是被子植物细胞。

8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述植物细胞是单子叶被子植物细胞。

9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述植物细胞是谷物农作物植物细胞。

10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述植物细胞是稻细胞。

11.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述植物细胞是双子叶被子植物细胞。

12.用于调节包含多个植物细胞的多细胞结构的耐盐性的方法，所述方法包括按照权利要求1至11中任一项的方法调节所述多细胞结构中的一个或多个植物细胞的耐盐性。

13.权利要求12的方法，其中在所述一个或多个植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被上调，并且所述多细胞结构的耐盐性提高。

14.权利要求12的方法，其中在所述一个或多个植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被下调，并且所述多细胞结构的耐盐性降低。

15.权利要求12至14中任一项的方法，其中所述多细胞结构包括完整的植物、植物组织、植物器官、植物部分、植物繁殖材料或培养的植物组织。

16.权利要求15的方法，其中所述植物是被子植物。

17.权利要求15或16的方法，其中所述植物是单子叶被子植物。

18.权利要求15至17中任一项的方法，其中所述植物是谷物农作物植物。

19.权利要求15至18中任一项的方法，其中所述植物是稻植物。

20.权利要求15或16的方法，其中所述植物是双子叶被子植物。

21.权利要求15至20中任一项的方法，其中所述多细胞结构包括植物或其部分，并且对所述植物或其部分的耐盐性的调节通过调节所述植物的至少一个或多个根细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核苷酸序列的表达而实施。

22.相对于野生型植物细胞具有调节的耐盐性的遗传修饰的植物细胞，其中调节所述植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达。

23.权利要求22的细胞，其中在所述植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被上调，并且所述植物细胞的耐盐性提高。

24.权利要求22的细胞，其中在所述植物细胞中CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被下调，并且所述植物细胞的耐盐性降低。

25.权利要求22或23的细胞，其中在所述植物细胞中，CIPK16核酸在组成型转录控制序列的转录控制下进行表达。

26.权利要求25的细胞，其中所述转录控制序列包含一个或多个CaMV35S启动子重复。

27.权利要求22至26中任一项的细胞，其中所述植物细胞是被子植物细胞。

28.权利要求22至27中任一项的细胞，其中所述植物细胞是单子叶被子植物细胞。

29.权利要求22至28中任一项的细胞，其中所述植物细胞是谷物农作物植物细胞。

30.权利要求22至29中任一项的细胞，其中所述植物细胞是稻细胞。

31.权利要求22至27中任一项的细胞，其中所述植物细胞是双子叶被子植物细胞。

32.具有调节的耐盐性的多细胞结构，其中所述多细胞结构包含一种或多种权利要求22至31中任一项所述的植物细胞。

33.权利要求32的多细胞结构，其中在所述一个或多个植物细胞中，CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被上调，并且所述多细胞结构的耐盐性提高。

34.权利要求32的多细胞结构，其中在所述一个或多个植物细胞中，CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达被下调，并且所述多细胞结构的耐盐性降低。

35.权利要求32至34中任一项的多细胞结构，其中所述多细胞结构包括完整的植物、植物组织、植物器官、植物部分、植物繁殖材料或培养的植物组织。

36.权利要求35的多细胞结构，其中所述植物是被子植物。

37.权利要求35或36的多细胞结构，其中所述植物是单子叶被子植物。

38.权利要求35至37中任一项的多细胞结构，其中所述植物是谷物农作物植物。

39.权利要求35至38中任一项的多细胞结构，其中所述植物是稻植物。

40.权利要求35或36的多细胞结构，其中所述植物是双子叶被子植物。

41.权利要求35至40中任一项的多细胞结构，其中所述多细胞结构包括植物或其部分，并且对所述植物或其部分的耐盐性的调节通过调节所述植物的至少一个或多个根细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核苷酸序列的表达而实施。

42.确定或预测植物细胞的耐盐性的方法，所述方法包括确定所述植物细胞中的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸的表达。

43.权利要求42的方法，其中在所述植物细胞中相对高的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸表达与所述植物细胞的提高的耐盐性相关。

44.权利要求42的方法，其中在所述植物细胞中相对低的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸表达与所述植物细胞的降低的耐盐性相关。

45.权利要求42至44中任一项的方法，其中所述植物细胞是被子植物的细胞。

46.权利要求42至45中任一项的方法，其中所述植物细胞是单子叶被子植物的细胞。

47.权利要求42至46中任一项的方法，其中所述植物细胞是谷物农作物植物的细胞。

48.权利要求42至47中任一项的方法，其中所述植物细胞是稻细胞。

49.权利要求42至45中任一项的方法，其中所述植物细胞是双子叶被子植物的细胞。

50.确定或预测包括植物细胞的多细胞结构的耐盐性的方法，所述方法包括按照权利要求43至49中任一项的方法确定或预测所述多细胞结构中的植物细胞的耐盐性。

51.权利要求50的方法，其中在所述植物细胞中相对高的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸表达与所述多细胞结构的提高的耐盐性相关。

52.权利要求50的方法，其中在所述植物细胞中相对低的CIPK16多肽和/或CIPK16核酸表达与所述多细胞结构的降低的耐盐性相关。

53.权利要求50至52中任一项的方法，其中所述多细胞结构包括完整的植物、植物组织、植物器官、植物部分、植物繁殖材料或培养的植物组织。

54.权利要求53的方法，其中所述植物是被子植物。

55.权利要求53或54的方法，其中所述植物是单子叶被子植物。

56.权利要求53至55中任一项的方法，其中所述植物是谷物农作物植物。

57.权利要求53至56中任一项的方法，其中所述植物是稻植物。

58.权利要求53至57中任一项的方法，其中所述植物是双子叶被子植物。

59.权利要求53至58中任一项的方法，其中所述植物细胞包括根细胞。