CN115840018A - 一种吉祥草药材的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种吉祥草药材的质量检测方法，包括鉴别和/或含量的测定项目；其中鉴别是对吉祥草药材的薄层色谱鉴别；含量测定是采用高效液相色谱法测定吉祥草药材皂苷A的含量。采用所述的质量检测方法，能够对药材的真伪进行准确鉴别，有效的将吉祥草药材与其伪品、混淆品区分开来；并能够准确、快速的测定出吉祥草药材中皂苷A的含量，从而有利于对吉祥草药材的质量进行控制。采用所述的吉祥草药材的质量检测方法能有效地控制吉祥草药材的整体质量、保证吉祥草药材临床用药的安全有效性。

Description

一种吉祥草药材的质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种吉祥草药材检测领域，特别是一种吉祥草药材的质量检测方法。

背景技术

吉祥草为百合科植物吉祥草Reineckia carnea(Andr.)Kunth的干燥全草。吉祥草药材名称在有关专著和标准中多使用“吉祥草”，仅《陕西省药材标准》(2015 年版)中使用“小竹根七(吉祥草)”名称，系地方习用名。本标准中采用“吉祥草”名称。

吉祥草为百合科植物吉祥草Reineckia carnea(Andr.)Kunth的干燥全草。吉祥草主要分布于华东、中南、西南各省区，为各地民间和少数民族地区常用的传统草药之一。吉祥草原标准收载于《广西壮族自治区中药材标准》(1990年版)、《江西省中药材标准》(1996年版)、《贵州省中药材、民族药材质量标准》 (2003年版)、《云南省中药材标准》(2005年版，第一册：彝药)《湖南省中药材标准》(2009年版)、《陕西省药材标准》[2015年版，小竹根七(吉祥草)]中，规定有性状、显微鉴别(横切面、粉末)、对照药材的薄层鉴别、杂志、总灰分、酸不溶性灰分、70％醇浸出物(热浸法)、水溶性浸出物等的规定，但无含量测定项的规定，且标准尚不完善。因此，亟需研发建立一种吉祥草的质量检测方法，对控制吉祥草药材的整体质量和保证吉祥草药材的临床用药的安全有效性具有重要重要意义。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种吉祥草药材的质量检测方法。本发明具有能有效地控制吉祥草药材的整体质量、保证吉祥草药材临床用药的安全有效性的特点。

本发明的技术方案：一种吉祥草药材的质量检测方法，包括鉴别和/或含量的测定项目；其中鉴别是对吉祥草药材的薄层色谱鉴别；含量测定是采用高效液相色谱法测定吉祥草药材皂苷A的含量。

前述的一种吉祥草药材的质量检测方法中，对吉祥草药材的薄层色谱鉴别包括以下步骤：

(1)取吉祥草药材供试品粉末1g，加甲醇20ml，加热回流30分钟，滤过，取上清液作为供试品溶液；另取吉祥草对照药材1g，同法制成对照药材溶液；

(2)照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以氯仿：乙酸乙酯：甲醇：水＝15：40：22：10混合液的下层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则为吉祥草药材。

前述的一种吉祥草药材的质量检测方法中，高效液相色谱法测定方法包括以下步骤：

1)标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.04ml、0.08ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml，分别置10ml具塞试管中，按香草醛-乙醇-高氯酸法处理对照品溶液并在452nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

2)含量测定供试品溶液的制备

取药材粉末0.5g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称重，加热回流1.5小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，滤渣再用甲醇同法提取两次，将三次滤液合并，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得含量测定供试品溶液。

3)测定

精密量取含量测定供试品溶液0.15ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线的制备项下的方法，依法测定吸光度，从标准曲线上读出含量测定供试品溶液中皂苷A的重量，计算得到总皂苷的含量。

前述的一种吉祥草药材的质量检测方法中，步骤2)中，药材粉末需过四号筛。

前述的一种吉祥草药材的质量检测方法中，步骤1)中，对照品溶液的制备过程为：取皂苷A对照品适量，用甲醇溶解后转移至25ml容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.85mg/ml的对照品溶液。

前述的一种吉祥草药材的质量检测方法中，步骤1)中，香草醛-乙醇-高氯酸法处理对照品溶液的具体方法为：将各个对照品溶液于水浴中挥干溶剂，依次精密加入0.2ml的8％香草醛乙醇溶液和0.1ml的高氯酸溶液，密塞，摇匀后置60℃水浴中恒温加热15分钟，取出，冰水冷却5min，精密加入冰醋酸5 ml，摇匀，以相应的试剂作为空白参比，照紫外-可见分光光度法在452nm波长处分别测定吸光度。

前述的一种吉祥草药材的质量检测方法中，绘制标准曲线的回归方程为 Y＝11.0109X-0.0120。

前述的一种吉祥草药材的质量检测方法中，所述皂苷A为皂苷(1β,3β,16 β,22S)-cholest-5-ene-1,3,16,22-tetrol 1,16-di(β-D-glucopyranoside)。

与现有技术相比，本发明的质量检测方法包括吉祥草药材的薄层鉴别方法和吉祥草药材中皂苷A的含量测定方法，采用所述的质量检测方法，能够对药材的真伪进行准确鉴别，有效的将吉祥草药材与其伪品、混淆品区分开来；并能够准确、快速的测定出吉祥草药材中皂苷A的含量，从而有利于对吉祥草药材的质量进行控制。采用所述的吉祥草药材的质量检测方法能有效地控制吉祥草药材的整体质量、保证吉祥草药材临床用药的安全有效性。

具体的，本申请吉祥草药材的薄层鉴别方法具有灵敏度高、专属性强以及分离效果好等特点，简便可行，重现性强，能够对药材的真伪进行准确的鉴别，有效的将吉祥草药材与其伪品、混淆品区分开来。

本申请的吉祥草药材中皂苷A的含量测定方法能够准确、快速的测定出吉祥草药材的含量，为吉祥草药材提供有效的定性定量分析手段，从而有利于对吉祥草药材的质量进行控制。采用本发明提供的吉祥草药材的质量检测方法能有效的控制吉祥草药材的整体质量、保证吉祥草药材临床用药的安全有效性。

本发明提供的吉祥草药材的质量检测方法，有助于弥补《广西壮族自治区中药材标准》(1990年版)、《江西省中药材标准》(1996年版)、《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)、《云南省中药材标准》(2005年版，第一册：彝药)《湖南省中药材标准》(2009年版)、《陕西省药材标准》[2015 年版，小竹根七(吉祥草)]中，规定有性状、显微鉴别(横切面、粉末)、对照药材的薄层鉴别、杂志、总灰分、酸不溶性灰分、70％醇浸出物(热浸法)、水溶性浸出物等的规定，无含测项规定，标准尚不完善。本发明方法对于吉祥草药材的进一步质量控制具有重要的意义，可为吉祥草药材质量表混的制定提供科学依据。

综上所述，本发明具有能有效地控制吉祥草药材的整体质量、保证吉祥草药材临床用药的安全有效性的特点。

附图说明

图1是以氯仿-甲醇-水(65∶35∶10，下层)展开的薄层色谱图；

图2是以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10，下层)展开的薄层色谱图；

图3是以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶2∶1∶0.2)展开的薄层色谱图；

图4是以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(1.5∶4∶2.7∶1)展开的薄层色谱图；

(图1-4中，1为.皂苷A对照品6μL；2为吉祥草(S14)10μL；3为吉祥草 (S14)10μL；4为吉祥草(S14)10μL)；

图5是不同提取溶剂考察的薄层色谱图；

(图5中，1-皂苷A对照品6μL；2-吉祥草(S14)10μL(甲醇)；3-吉祥草(S14)10μL(乙醇)；4-吉祥草(S14)10μL(水))；

图6是不同提取方式考察的薄层色谱图；

(图6中，1-皂苷A对照品6μL；2-吉祥草(S14)10μL(加热回流提取30min)； 3-吉祥草(S14)10μL(超声提取30min)；4-吉祥草(S14)10μL(冷浸1h 后超声提取30min))；

图7是点样量考察的薄层色谱图；

图8是在湿度为25％条件下展开的薄层色谱图；

图9是在湿度为75％条件下展开的薄层色谱图；

图10是在温度为25℃条件下展开的薄层色谱图；

图11是在温度为4℃条件下展开的薄层色谱图；

(图7-11中，1-皂苷A对照品6μL；2-吉祥草(S14)6μL；3-吉祥草(S14)8μL；4-吉祥草(S14)10μL)；

图12是15批吉祥草药材的对照药材薄层鉴别薄层色谱图1；

(图12中，s为皂苷A对照品6μL，S1～S7为吉祥草10μL)；

图13是15批吉祥草药材的对照药材薄层鉴别薄层色谱图2；

(图13中，s为皂苷A对照品6μL，S8～S15为吉祥草10μL)；

图14是对照品溶液和供试品溶液吸收光谱图(香草醛-乙醇-高氯酸法)； (图14中，a为对照品；b为供试品；c为对照品和供试品)；

图15是对照品溶液和供试品溶液吸收光谱图(高氯酸法)；

(图15中，d:对照品；e：供试品；f：对照品和供试品)；

图16是对照品溶液和供试品溶液吸收光谱(香草醛-冰醋酸-高氯酸法)； (图16中，g：对照品；h：供试品；i：对照品和供试品)；

图17是皂苷A的线性关系图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例。一种吉祥草药材的质量检测方法，

仪器：

Agilent 1260型液相色谱仪；蒸发光散射检测器(Alltech ELSD-2000)； AUW220D型电子天平(十万分之一，日本岛津公司)；BS224S型电子天平(万分之一，Sartorius)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DHG－9140A电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)；8 －10型箱式电阻炉(中国沈阳市节能电炉厂制造)。

试剂与试药

1.对照品

(1β,3β,16β,22S)-cholest-5-ene-1,3,16,22-tetrol1,16-di(β-D-glucopyranoside) (以下简称“皂苷A”)，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心自制，纯度>98％。

2.试剂

乙腈(色谱纯，Fisher Scientific，Fairlawn,NJ,USA)；甲酸(色谱纯，Sigma-Aldrich Co.Ltd，St Louis,MO,USA)；甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；氯仿(分析纯，上海实验试剂有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，广东光华科技股份有限公司)；无水乙醇(分析纯，上海振兴化工一厂)；GF254 硅胶板(青岛海洋化工厂)；硫酸(分析纯，西陇科学股份有限公司)；水为超纯水。

3.药材

本次研究所用药材购自贵州省，由江西中医药大学民族药资源中心钟国跃教授鉴定为百合科吉祥草属植物吉祥草Reineckia carnea(Andr.)Kunth的全草，标本(Z-140310-01)保存在江西中医药大学民族药资源中心。(表1)

表1吉祥草药材批次

【药材名称】吉祥草。

吉祥草药材名称在有关专著和标准中多使用“吉祥草”，仅《陕西省药材标准》(2015年版)中使用“小竹根七(吉祥草)”名称，系地方习用名。本标准中采用“吉祥草”名称

吉祥草始载于隋唐时期陈藏器《本草拾遗》。《本草纲目》云：“吉祥草，叶如漳兰，四时青翠，夏开紫花成穗，易繁。”《植物名实图考》曰：“松寿兰，叶微宽，花六出稍大，冬开，盆盎中植之。秋结实如天门冬，实色红紫有尖。”以上描述并结合附图，可确证其原植物与今百合科植物吉祥草Reineckia carnea(Andr.)Kunth相符。又，《生草药性备要》所载“万年青”中云其“似兰花叶样”，特征与万年青不符，而应为吉祥草。《本草纲目拾遗》称之为解晕草。《类证活人书》又名洋吉祥草。《中国药用植物志》名竹叶青。《四川中药志》名九节莲。《贵州草药》名小九龙盘。《贵州中草药名录》名观音草、地娱蚁、千里马^[2]。吉祥草主要分布于华东、中南、西南各省区，在各地民间广泛药用。

吉祥草在有关专著和原标准中均规定其来源为百合科植物吉祥草Reineckiacarnea(Andr.)Kunth，药用部位为“干燥全草”或“干燥带根全草”。本标准草案中规定为“百合科植物吉祥草Reineckia carnea(Andr.)Kunth的干燥全草”。

吉祥草药材名称在有关专著和标准中多使用“吉祥草”，仅《陕西省药材标准》(2015年版)中使用“小竹根七(吉祥草)”名称，系地方习用名。本标准中采用“吉祥草”名称。。

多年生草本，茎甸甸于地上，似根茎，绿色，多节，节上生须根。叶簇生于茎顶或茎节，每簇3～8枚，叶片条形至披针形，长10～38厘米，宽0.5～3.5厘米，先端渐尖，向下渐狭成柄。花葶长5～15厘米，穗状花序长2～6.5厘米，上部花有时仅具有雄蕊；苞片卵状三角形，膜质，淡褐色，或带紫色；花被片合生成短管状，上部6裂，裂片长圆形，长5～7毫米，稍肉质，开花时反卷，粉红色，花芳香；雄蕊6枚，花丝丝状，花药近长圆形，两端微凹；子房瓶状，3室，短于花柱，柱头头状，3裂。浆果球形，直径6～10毫米，熟时鲜红色。花果期7～11 月。生于海拔170～3200m的阴湿山坡、山谷或密林下或栽培。分布于江苏、浙江、安徽、江西、湖北、湖南、贵州、云南、四川、广西、广东、河南、陕西(秦岭以南)等地。

【性状】吉祥草原有标准中均规定有性状鉴别，经观察，原标准的性状描述与药材性状基本相符，根据实际观察对文字进行了修改。

本品根茎呈圆柱形，长短不等，直径0.2～0.5cm，表面黄棕色或黄绿色；节明显，稍膨大，常有残留的膜质鳞叶和弯曲卷缩的须状根，根上密布白色毛状物；节间短缩，有纵皱纹。叶簇生于茎顶或节处，叶片绿褐色或棕褐色，多皱缩，完整者湿润展开后呈条状披针形，全缘，无柄，平行脉，中脉明显。气微，味苦，微苦。

薄层鉴别：

原贵州、湖南、陕西省标准中的对照药材薄层鉴别方法不同，其展开剂分别为：氯仿-乙酸乙酯-甲酸(8∶5∶0.2)(贵州)、二氯甲烷-甲醇-水(8∶3∶0.4) (湖南)、三氯甲烷-甲醇-甲酸(36∶4∶0.5)(陕西)。经对三种展开剂的复核试验，展开效果不佳。故建立了新的薄层鉴别方法。研究中曾建立了以吉祥草所含皂苷中的主要皂苷成分(1β,3β,16β,22S)-cholest-5-ene-1,3,16,22-tetrol 1,16-di(β-D-glucopyranoside，C₃₉H₆₆O₁₄，以下简称皂苷A为对照的薄层鉴别，故在对照药材的方法学考察中，以皂苷A为对照。

取本品粉末1g，加甲醇20ml，加热回流30分钟，滤过，取上清液作为供试品溶液。另取吉祥草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502) 试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)下层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

1)展开剂的考察

取吉祥草药材粉末3份，照上法制备供试品溶液。以皂苷A对照品，考察了四种展开剂：氯仿-甲醇-水(65∶35∶10，下层)；氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶ 40∶22∶10，下层)；氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶2∶1∶0.2)；氯仿-乙酸乙酯 -甲醇-水(1.5∶4∶2.7∶1)，薄层板：硅胶GF254板(50×100mm)，展开方式与展距：上行展开8cm，显色方法：10％硫酸乙醇溶液105℃加热5min，置日光下检视。

结果表明，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10，下层)为展开剂展开的色谱图中，各斑点分离较好，斑点清晰，最终故选择以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10，下层)为展开剂。(见图1～图4)

2)提取溶剂的考察

取吉祥草药材粉末1g，三份，分别加入甲醇、乙醇、水20ml，加热回流提取30min，冷却，滤过，取滤液作为供试品溶液。点样，展开。

以甲醇作为提取溶剂时提取效果较好，斑点较为清晰，故选择甲醇作为提取溶剂(见图5)。

3)提取方式的考察

取吉祥草药材粉末1g，三份，加甲醇20ml，分别采取加热回流提取30min、超声提取30min、冷浸1h后超声提取30min三种提取方式进行提取，冷却，滤过，取滤液作为供试品溶液。点样，展开。

结果表明，加热回流提取30min的提取效果较好，斑点较为清晰故选择加热回流提取30min作为吉祥草薄层鉴别药材的提取方式。(见图6)

4)点样量考察

取吉祥草药材粉末1g(过四号筛)，三份，照上法制备供试品溶液，点样，展开。

结果表明，供试品点样量为10μl时，斑点较清晰。故确定样品的点样量为 10μl.(见图7)。

5)展开环境条件的耐用性试验考察

取吉祥草药材粉末1g(过四号筛)，三份，照上法制备供试品溶液，点样，展开。

结果表明，对上述选定的展开剂进行了25％和75％相对湿度考察以及4℃ (冰箱)和室温(25℃)的温度考察，均取得了良好的分离效果(见图8～图11)。

6)15批样品鉴别结果

照上法对15批吉祥草样品进行对照药材的薄层鉴别。

最终确定的吉祥草对照药材薄层鉴别方法为：取本品粉末1g，加甲醇20ml，加热回流30分钟，滤过，取上清液作为供试品溶液。另取吉祥草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水 (15∶40∶22∶10)下层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(见图12～图13)

【含量测定】原吉祥草原各标准中均未有“含测”项规定。

文献报道，从吉祥草中已发现的化合物类型包括甾体皂苷类、黄酮类、木脂素类、萜类等。其中对甾体皂苷类成分研究较多，较为常见的甾体皂苷及甾体皂苷元有：原蜘蛛抱蛋苷、新蜘蛛抱蛋苷、凯提皂苷元、异万年青皂苷元、 (1β,3β,16β,22S)-cholest-5-ene-1,3,16,22-tetrol1,16-di(β-D-glucopyranoside)、 (1β,3β,16β,22S)-cholest-5-ene-1,3,16,22-tetrol1-[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D -glucopyranoside]16-(β-D-glucopyranoside)、吉祥草皂苷元、薯蓣皂甙元、蜘蛛抱蛋苷、异卡里亚皂苷元、β-谷甾醇、β-谷甾醇-β-D-葡萄糖苷、豆甾醇-3-O-β-D- 吡喃葡萄糖苷、β-香树脂醇、α-菠甾醇-3-O-葡萄糖苷等；黄酮类有：7-甲氧基-8- 甲基-4'-羟基-黄酮、1，6-二羟基-8-甲基-苍耳烷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-6) -β-D-吡喃葡萄糖苷、广豆根黄酮苷B、6,8-二甲基-5,7,4'-三羟基黄酮、(R)-8- 甲基柚皮素、柚皮素、大豆素、3'-羟基大豆苷元等；萜类有：熊果酸鲨烯等；木脂素类有：丁香脂素-1-β-D-葡萄糖苷、丁香脂素等；其它类有：l-O-十六烷酸甘油酯、棕榈酸、十四烷酸、肌糖、N-p-香豆酰酪胺、亚油酸甲酯、正三十烷、大豆脑苷N-苯甲酰-L-苯丙氨醇、邻苯二甲酸-2-乙基己酯、邻苯二乙酸二丁基酯、刺五加酮等^[5-11]。有研究表明吉祥草皂苷类成分具有抗肿瘤活性。关于吉祥草的质量评价研究，有文献报道，对贵州13个样品测定总皂苷含量，平均值为1.28％ (0.86～1.73％)，建议规定为总皂苷含量不低于1.0％；对3批吉祥草药材测定结果表明，其阿魏酸含量在0.011～0.013％，芦丁含量在0.047～0.054％。

本研究中，首先对文献报道的吉祥草所含成分进行了初步考察，结果显示皂苷类是其主要成分，而其他各类成分的单体化合物的含量均较低。同时对吉祥草各提取部位进行了镇咳、祛痰活性试验，结果显示80％乙醇提取物及其乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有良好的镇咳祛痰作用；进一步对从80％乙醇提取物的乙酸乙酯部位和正丁醇部位分离纯化鉴定得到了27个化合物(其中新化合物4个，新天然产物1个，该属植物中首次发现13个)，主要为皂苷类成分；再对27 个成分进行了抗补体活性测定，结果显示多数皂苷类成分水解后均显示出抗补体活性。

以上研究结果显示皂苷类成分是吉祥草的主要生物活性成分，故选择其主要的皂苷(1β,3β,16β,22S)-cholest-5-ene-1,3,16,22-tetrol 1,16-di(β-D-glucopyranoside)(以下简称皂苷A，C₃₉H₆₆O₁₄)，并制备获得该化合物单体(纯度大于98％)，参考有关对吉祥草总皂苷、阿魏酸、芦丁等的含量测定的文献报道，以总皂苷作为含测指标应更为符合药材的实际状况，故选择以总皂苷作为含测项限量规定。

照紫外-可见分光光度法色谱法(《中国药典》2020版第四部通则0401)测定。测定方法如下：

对照品溶液的制备取皂苷A对照品21.22mg，用甲醇溶解后转移至25ml容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.8488mg/ml的对照品溶液。

1显色体系和检测波长的选择

称取吉祥草药材粉末(过四号筛)0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，加入甲醇20ml，称重，加热回流提取30分钟，放冷，用甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液，即得。

(1)香草醛-乙醇-高氯酸法：精密吸取对照品溶液0.5ml和供试品溶液0.15 ml，分别置于10ml具塞试管中，水浴中挥干溶剂，依次加入0.2ml 8％香草醛乙醇溶液和0.1ml高氯酸溶液，密塞，摇匀后置60℃水浴中恒温加热15 min，取出后立即用冰水冷却5min，加5ml冰醋酸，摇匀。以显色剂作为空白参比。

(2)高氯酸法：精密吸取对照品溶液0.4ml和供试品溶液0.15ml，分别置于10ml具塞试管中，水浴中挥干溶剂，精密加入高氯酸5ml，摇匀，置室温反应25min。以显色剂作为空白参比。

(3)香草醛-冰醋酸-高氯酸法：精密吸取对照品溶液0.2ml和供试品溶液 40μl，分别置于10ml具塞试管中，水浴中挥干溶剂，依次加入0.2ml 5％香草醛-冰醋酸溶液和0.8ml高氯酸，密塞，摇匀后置60℃水浴中恒温加热20 min，取出后立即用冰水冷却5min，加5ml冰醋酸，摇匀。以显色剂作为空白参比。

用紫外分光光度计在350～800nm内进行扫描，结果显示，香草醛-乙醇-高氯酸法为显色剂时，对照品溶液和供试品溶液在可见光区吸收光谱的一致性较好，故确定最大吸收波长为452nm。结果见表2，图14～图16

表2对照品溶液和供试品溶液最大吸收波长

2 提取方法考察

2.1 提取溶剂考察

称取药材粉末(过四号筛)0.5g，六份，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，分别加入甲醇、乙醇、水三种不同溶剂20ml，称重，加热回流提取30分钟，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得，分别测定总皂苷含量。(表3) 表3不同提取溶剂考察结果

由上表可知，以甲醇作为提取溶剂时，总皂苷含量最高，故选择甲醇作为提取溶剂。

2.2不同浓度提取溶剂考察

称取药材粉末(过四号筛)0.5g，八份，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，分别加入30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇20ml，称重，加热回流提取30 分钟，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得，分别测定总皂苷含量。

(表4)

表4不同浓度提取溶剂考察结果

由上表可知，无水的甲醇作为提取溶剂时，总皂苷含量最高，故选择甲醇作为提取溶剂。

2.3提取时间考察

称取药材粉末(过四号筛)0.5g，八份，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，分别加入甲醇20ml，称重，分别加热回流提取0.5h、1h、1.5h、2h，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得，分别测定总皂苷含量。(表5)

表5不同提取时间考察结果

由上表可知，加热回流提取1.5h与加热回流提取2h相比，总皂苷含量相差较小，从节省时间考虑，选择加热回流提取1.5h。

2.4提取次数考察

称取药材粉末(过四号筛)0.5g，六份，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，分别加入甲醇20ml，称重，分别加热回流提取1次、2次、3次，每次1.5h放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得，分别测定总皂苷含量。(表6) 表6不同提取次数考察结果

由上表可知，加热回流提取3次时，总皂苷含量最高，故选择加热回流提取 3次。

最终确定吉祥草总皂苷含量测定的供试品溶液制备方法为：取药材粉末(过四号筛)0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称重，加热回流1.5小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，滤渣再用甲醇同法提取两次，将三次滤液合并，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3方法学验证

3.1线性实验

分别精密吸取0.04、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6ml对照品溶液，分别置10ml 具塞试管中，按香草醛-乙醇-高氯酸法处理样品并在452nm处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为 Y＝11.0109X-0.0120(r²＝0.9996)，皂苷A在33.95～509.28μg与吸光度有良好的线性。(图17)

3.2稳定性实验

取同一份吉祥草药材供试品溶液0.15ml，按香草醛-乙醇-高氯酸法处理样品，并分别在0、10、20、30、40、50、60min后于452nm处测定吸光度，计算RSD值。(表7)

表7稳定性实验考察结果

结果表明，同一份吉祥草药材供试品溶液在0、10、20、30、40、50、60min 后进行测定，RSD值为2.02％，方法溶液稳定性良好。

3.3精密度实验

取同一份吉祥草药材供试品溶液0.15ml，按香草醛-乙醇-高氯酸法处理样品，并在452nm处测定吸光度，连续测定6次，计算RSD值。(表8)。

表8精密度实验考察结果

结果表明，连续测定六次，其RSD值为1.45％，表明仪器精密度良好。

3.4重复性实验

取同一批次吉祥草药材6份，按照上述吉祥草总皂苷提取方法制备供试品溶液，并按香草醛-乙醇-高氯酸法处理样品，并在452nm处测定吸光度，计算RSD 值。(表9)

表9重复性实验考察结果

结果表明，平行制备6份吉祥草药材供试品溶液进行测定，其RSD值为 1.43％，方法重复性良好。

3.5加样回收率实验

分别精密称取0.25g已知总皂苷含量的吉祥草药材6份，加入一定量的皂苷 A对照品，按照上述吉祥草总皂苷提取方法制备供试品溶液，并按香草醛-乙醇- 高氯酸法处理样品，在452nm处测定吸光度，计算总皂苷的含量并计算回收率。

(表10)

表10加样回收率实验考察结果

测得平均加样回收率为99.24％(RSD＝2.43％)，表明方法回收率良好。

4、吉祥草药材中总皂苷的含量测定

取不同批次吉祥草药材各0.5g，按供试品溶液的制备方法制备，各取供试品溶液0.15ml按香草醛-乙醇-高氯酸法处理样品，在452nm处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中皂苷A的重量(mg)，计算得总皂苷的含量。(表 11)

表11 28批吉祥草药材中总皂苷含量测定结果

结果显示，28批吉祥草药材中总皂苷含量在3.00％～9.49％之间，平均为5.98％。取均值下浮20％为4.78％，28批药材中有6批不合格，合格率为79％，据此确定吉祥草总皂苷含量不得低于4.5％，合格率为86％。

Claims (8)

1.一种吉祥草药材的质量检测方法，其特征在于：包括鉴别和/或含量的测定项目；其中鉴别是对吉祥草药材的薄层色谱鉴别；含量测定是采用高效液相色谱法测定吉祥草药材皂苷A的含量。

2.根据权利要求1所述的一种吉祥草药材的质量检测方法，其特征在于，对吉祥草药材的薄层色谱鉴别包括以下步骤：

(1)取吉祥草药材供试品粉末1g，加甲醇20ml，加热回流30分钟，滤过，取上清液作为供试品溶液；另取吉祥草对照药材1g，同法制成对照药材溶液；

(2)照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿：乙酸乙酯：甲醇：水＝15：40：22：10混合液的下层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则为吉祥草药材。

3.根据权利要求2所述的一种吉祥草药材的质量检测方法，其特征在于，高效液相色谱法测定方法包括以下步骤：

1)标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.04ml、0.08ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml，分别置10ml具塞试管中，按香草醛-乙醇-高氯酸法处理对照品溶液并在452nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

2)含量测定供试品溶液的制备

取药材粉末0.5g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称重，加热回流1.5小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，滤渣再用甲醇同法提取两次，将三次滤液合并，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得含量测定供试品溶液。

3)测定

精密量取含量测定供试品溶液0.15ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线的制备项下的方法，依法测定吸光度，从标准曲线上读出含量测定供试品溶液中皂苷A的重量，计算得到总皂苷的含量。

4.根据权利要求3所述的一种吉祥草药材的质量检测方法，其特征在于：步骤2)中，药材粉末需过四号筛。

5.根据权利要求3所述的一种吉祥草药材的质量检测方法，其特征在于，步骤1)中，对照品溶液的制备过程为：取皂苷A对照品适量，用甲醇溶解后转移至25ml容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.85mg/ml的对照品溶液。

6.根据权利要求3所述的一种吉祥草药材的质量检测方法，其特征在于，步骤1)中，香草醛-乙醇-高氯酸法处理对照品溶液的具体方法为：将各个对照品溶液于水浴中挥干溶剂，依次精密加入0.2ml的8％香草醛乙醇溶液和0.1ml的高氯酸溶液，密塞，摇匀后置60℃水浴中恒温加热15分钟，取出，冰水冷却5min，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以相应的试剂作为空白参比，照紫外-可见分光光度法在452nm波长处分别测定吸光度。

7.根据权利要求3所述的一种吉祥草药材的质量检测方法，其特征在于：绘制标准曲线的回归方程为Y＝11.0109X-0.0120。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的一种吉祥草药材的质量检测方法，其特征在于，所述皂苷A为皂苷(1β,3β,16β,22S)-cholest-5-ene-1,3,16,22-tetrol1,16-di(β-D-glucopyranoside)。

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