CN115747117A - 一种复合微生态菌剂的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及复合微生态菌剂的制备方法及其应用，可有效解决用于制备复合微生态菌剂，实现在改良小麦种植土壤中的应用问题，技术方案是，将菌株RGZ1‑4‑29和SJ3‑6分别在营养琼脂平板上划线培养，对菌株活化；分别挑取活化菌种的单菌落，接入种子液，摇床培养，成种子液；将种子液接种于发酵培养基中，得微生物菌悬液，将微生物菌悬液、纤维素酶和蛋白酶加入载体中，加水，混匀，堆积薄膜发酵，发酵结束后晾干，加入广西黄腐酸钾、壳聚糖、聚谷氨酸，再次混合均匀，成复合微生态菌剂；本发明方法原料丰富，配伍科学合理，制备方法易操作，产品质量好，可有效用于对麦田土壤的改良，提高小麦产量，是麦田土壤改良上的一大创新，有巨大的经济和社会效益。

Description

一种复合微生态菌剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是一种复合微生态菌剂的制备方法及其应用。

背景技术

小麦是人类主要食物来源之一，特别是在我国占着农作物重要的作用，广而种植，但近年来，由于化肥和农药的不合理使用导致的土壤酸化问题日趋严重，表现在土壤pH值降低、土壤钙镁等养分淋失、有毒金属离子活性增强。适合小麦生长的土壤酸碱度在6.5-7.5之间，目前酸化土壤的pH在6.0以下，有些严重地块甚至达到了4.0以下，导致麦苗黄化、难以生长，减产甚至绝产，而且土壤酸化也增加了土传病害的发病率，严重影响了小麦产量。镰刀菌（Fusarium）是一种重要的土传病害病原真菌，寄主范围广、侵染能力强，可引起小麦根腐病（腐霉菌、平脐蠕孢菌和禾谷镰刀菌）、小麦赤霉病（禾谷镰刀菌）、小麦茎基腐病（禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌），不仅会造成小麦严重减产，而且产生的真菌毒素，食用后会引起急性中毒症状，同时会降低免疫能力和生育能力等，危害人畜健康。

传统的化学改良剂生石灰，可以短时间内迅速提高土壤pH，改善土壤性质，并取得一定的增产效果，但长期施用会破坏土壤结构，造成土壤板结，土壤“复酸化”，在酸性土壤中会发生铁、铝体系的转化，引起土壤磷、钾、钙、镁、铁等元素的平衡失调，土壤中重金属污染加重。水溶性磷肥施入酸性土壤中后，磷酸根离子和酸性土壤中的活性铁、铝离子反应，生成无定型磷酸铁铝盐，随后逐渐转化为晶质的粉红磷铁矿、磷铝石，从而使其有效性明显降低。近年来，科研工作者应用生物炭开展改良土壤的工作，田间试验证明虽然有较好的改良效果，但是由于其成本高和使用不方便等因素，很难大面积推广应用。而微生物通过改善土壤理化性质、提高土壤肥力、抑制病原物生长、提高植物抗逆能力等起到改良土壤、调节作物生长的作用。因此，如何研制一种复合微生态菌剂，实现对麦田酸化土壤的改良，提高小麦对土传病害的抗性、促进小麦丰产丰收，具有重要的意义，但至今未见有复合微生态菌剂用于麦田土壤（酸化+土传病害）改良的公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种复合微生态菌剂的制备方法及其应用，可有效解决用于制备复合微生态菌剂，实现在改良小麦种植土壤中的应用问题。

本发明解决的技术方案是，一种复合微生态菌剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将保藏的菌株RGZ1-4-29和SJ3-6分别在营养琼脂平板上划线，25～30℃培养24～48h，对菌株活化；

所述的菌株RGZ1-4-29为西藏日格则地区小麦农田土壤筛选分离得到，分类命名类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.），2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：23622，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

所述的菌株SJ3-6为自河南驻马店酸化土壤生长良好的小麦根部分离得到，分类命名副伯克霍尔德氏菌（Paraburkholderia fungorum），2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：23621，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

所述的营养琼脂平板为蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化钠5.0g和琼脂15.0g加水至1000mL，121℃下高压灭菌30min，pH7.2±0.2（公知技术）；

（2）种子培养：分别挑取活化菌种的单菌落，接入装有100mL NB培养基的250mL三角瓶中，25～30℃、120～180r/min摇床培养至种子液的OD₆₀₀值为1.2以上，成种子液；

所述的NB培养基为蛋白胨10g、牛肉粉3g和氯化钠5g加水至1000mL，121℃下高压灭菌30min；

（3）发酵培养：将种子液以发酵培养基2～5％的体积量接种于发酵培养基中，温度25～30℃，pH5～8，发酵时间18～32h，得微生物菌悬液，微生物菌悬液中含类芽孢杆菌RGZ1-4-29、副伯克霍尔德氏菌SJ3-6的有效活菌数为5.0×10⁸～5.0×10¹⁰cfu/mL；

所述的发酵培养基为重量百分计：酪蛋白胨0.5％、广西黄腐酸钾1％、尿素0.5%、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.05％和FeSO₄0.02％，余量为水，混合均匀制成；

（4）微生态菌剂的制备：将微生物菌悬液、纤维素酶3～5kU/Kg和蛋白酶5～10kU/kg加入载体中，加水至载体含水率50%，混合均匀，堆积之后再覆盖薄膜，25～35℃发酵72～120h，发酵结束后晾干，加入晾干发酵物重量的：广西黄腐酸钾3～5%、壳聚糖0.03～0.05%、聚谷氨酸0.02～0.03%，再次混合均匀，成复合微生态菌剂；

所述的蛋白酶为胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或木瓜蛋白酶中的一种；

所述的载体为香菇菌渣、杏鲍菇或金针菇菌渣中的一种（现有技术）。

本发明方法制备的复合微生态菌剂施于麦田土壤中，有效用于改良麦田土壤，抑制小麦土传病害，保证小麦丰产丰收，实现在酸化土壤小麦种植中的应用。

本发明方法原料丰富，配伍科学合理，制备方法易操作，产品质量好，可有效用于对麦田土壤的改良，提高小麦产量，是麦田土壤改良上的一大创新，有巨大的经济和社会效益。

附图说明

图1为本发明菌株RGZ1-4-29的抗镰刀菌性能和菌株 SJ3-6的解磷功能图，其中：A为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）RGZ1-4-29对禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）的拮抗效果；B为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）RGZ1-4-29对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）的拮抗效果；左边为对照病原菌，右边为不同的筛选菌株产生的抑菌圈；C为SJ3-6在无机磷平板上产生的水解圈。

图2为本发明菌株RGZ1-4-29与SJ3-6在营养琼脂平板上的拮抗试验图。

图3为本发明复合微生态菌剂对酸化土壤改良的盆栽效果对比图。

具体实施方式

以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中可由以下实施例给出。

实施例1

本发明一种复合微生态菌剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将保藏的菌株RGZ1-4-29和SJ3-6分别在营养琼脂平板上划线，26～28℃培养30～40h，对菌株活化；

（2）种子培养：分别挑取活化菌种的单菌落，接入装有100mL NB培养基的250mL三角瓶中，26～28℃、150r/min摇床培养至种子液的OD₆₀₀值为1.2以上，成种子液；

（3）发酵培养：将种子液以发酵培养基3.5％的体积量接种于发酵培养基中，温度26～28℃，pH7，发酵时间25h，得微生物菌悬液，微生物菌悬液中含类芽孢杆菌RGZ1-4-29、副伯克霍尔德氏菌SJ3-6的有效活菌数为5.0×10⁸～5.0×10¹⁰cfu/mL；

（4）微生态菌剂的制备：将微生物菌悬液、纤维素酶4kU/Kg和枯草杆菌蛋白酶7kU/kg加入载体香菇菌渣中，加水至载体含水率50%，混合均匀，堆积之后再覆盖薄膜，30℃发酵96h，发酵结束后晾干，加入晾干发酵物重量的：广西黄腐酸钾4%、壳聚糖0.04%、聚谷氨酸0.025%，再次混合均匀，成复合微生态菌剂。

实施例2

本发明一种复合微生态菌剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将保藏的菌株RGZ1-4-29和SJ3-6分别在营养琼脂平板上划线，27℃培养45h，对菌株活化；

（2）种子培养：分别挑取活化菌种的单菌落，接入装有100mL NB培养基的250mL三角瓶中，27℃、170r/min摇床培养至种子液的OD₆₀₀值为1.2以上，成种子液；

（3）发酵培养：将种子液以发酵培养基3％的体积量接种于发酵培养基中，温度26℃，pH5，发酵时间30h，得微生物菌悬液，微生物菌悬液中含类芽孢杆菌RGZ1-4-29、副伯克霍尔德氏菌SJ3-6的有效活菌数为5.0×10⁸～5.0×10¹⁰cfu/mL；

（4）微生态菌剂的制备：将微生物菌悬液、纤维素酶3.5kU/Kg和木瓜蛋白酶6kU/kg加入载体杏鲍菇菌渣中，加水至载体含水率50%，混合均匀，堆积之后再覆盖薄膜，26℃发酵118h，发酵结束后晾干，加入晾干发酵物重量的：广西黄腐酸钾3.5%、壳聚糖0.03%、聚谷氨酸0.02%，再次混合均匀，成复合微生态菌剂。

实施例3

本发明一种复合微生态菌剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将保藏的菌株RGZ1-4-29和SJ3-6分别在营养琼脂平板上划线，29℃培养25h，对菌株活化；

（2）种子培养：分别挑取活化菌种的单菌落，接入装有100mL NB培养基的250mL三角瓶中，29℃、130r/min摇床培养至种子液的OD₆₀₀值为1.2以上，成种子液；

（3）发酵培养：将种子液以发酵培养基5％的体积量接种于发酵培养基中，温度29℃，pH8，发酵时间19h，得微生物菌悬液，微生物菌悬液中含类芽孢杆菌RGZ1-4-29、副伯克霍尔德氏菌SJ3-6的有效活菌数为5.0×10⁸～5.0×10¹⁰cfu/mL；

（4）微生态菌剂的制备：将微生物菌悬液、纤维素酶5kU/Kg和胰蛋白酶9kU/kg加入载体金针菇菌渣中，加水至载体含水率50%，混合均匀，堆积之后再覆盖薄膜，34℃发酵73h，发酵结束后晾干，加入晾干发酵物重量的：广西黄腐酸钾5%、壳聚糖0.05%、聚谷氨酸0.03%，再次混合均匀，成复合微生态菌剂。

要指出的是，以上所述仅为本发明的实施例，是用于说明本发明的具体实施情况，并不是用以限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何等同或等效的修改和替代，在本质上与本发明的技术方案相同，均包含在本发明的保护范围内。

本发明菌株SJ3-6有很好的解磷、解钾、产铁载体能力；菌株RGZ1-4-29有良好的产酶能力，可以抑制尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、腐霉菌等多种小麦真菌病害病原，能有效防治小麦根腐病和赤霉病。以上两种菌之间没有拮抗作用。将上述两种益生菌混合发酵并添加益生元制备成复合微生态菌剂用于小麦田酸化土壤的改良，能有效提高土壤pH，改善土壤微生态结构，增加土壤酶含量，促进小麦生长，改善苗黄、苗弱甚至死亡的现象，减少赤霉病、根腐病的发生，提高小麦产量。有关试验资料如下：

通过筛选和应用解磷、解钾、产酶微生物，促进土壤释放沉积的磷、钾、铁等元素，增加作物吸收利用率，缓解对于过量施用化学肥料对土壤的污染和板结；应用益生元改善土壤微生物生存环境，激发土壤活力，增加土壤生物酶含量，改善土壤团粒结构，减少土壤板结。土壤改良微生物菌剂中植物益生菌增加了有益菌含量，益生元促进有益菌的生长繁殖，可改善植物根际微生物菌群结构，抑制病原菌的生长，起到减少化学肥料和农药使用、改良土壤、提高作物产量的效果。

在本发明中，所述的菌株SJ3-6为副伯克霍尔德氏菌，革兰氏阴性，氧化酶、接触酶、硝酸盐还原阳性，30℃在营养琼脂平板上培养24h，菌落呈乳黄色，圆形不透明状，表面光滑，边缘整齐；所述的菌株RGZ1-4-29为类芽孢杆菌，革兰氏阳性，酪蛋白水解、接触酶、明胶水解、硝酸盐还原阳性。在营养琼脂平板上菌落白色透明、圆形，边缘整齐，表面湿润、光滑、微***。

本发明副伯克霍尔德氏菌SJ3-6分离自驻马店小麦田酸化土壤，环境耐受性好，与土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势，具备固氮、溶解无机磷酸盐、产生植物激素能力，可以促进植物对氮、磷的吸收；类芽孢杆菌RGZ1-4-29能够分泌多种细胞壁水解酶及抗菌物质，对多种植物病原真菌有拮抗作用，在植物促生方面表现良好，是重要的植物益生菌（见图1）。

实验1：功能菌株之间的拮抗反应测试实验

采用双划线法将两株菌接种在同一个营养琼脂平板上，先将一个菌株沿平板表面横向划线接种，再将另一菌种沿平板表面纵向划线接种。在25-30℃培养箱内培养3d。观察平板纵横划线交界处两株菌的生长状况，若交界处出现明显的抑制现象，则表明两株菌之间有拮抗作用，不适宜混合培养；若交界面两株菌生长无明显的抑制现象，则表明菌株之间不发生拮抗作用，可以混合培养（见图2）。

实验2：复合微生态菌剂对小麦酸化土壤的改良效果实验（以实施例1为例）

试验设2个处理，分别为（1）CK：酸化土壤2 kg/盆；（2）酸化土壤1.9 kg+复合微生态菌剂0.1 kg/盆；每个处理设3次重复，1个月后取样比较处理效果。

通过对处理前后小麦的生物学性状观察和测量以及土壤理化性质测定，表明该复合微生态菌剂对酸化土壤有明显的改良效果。麦苗在对照酸化土壤中苗稀、苗弱，叶片枯黄、生长缓慢，在处理过的土壤中麦苗健壮，生长良好（图3），小麦株高、根长、地上、地下部鲜重和干重与对照相比提高了2-4倍，叶绿素含量提高1.7倍。土壤pH有了明显升高，从pH3.8升高到了pH5.3。土壤的理化形状也有了明显改善，土壤有机质含量明显增加。土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤过氧化氢酶主要来源于土壤微生物和植物根系的分泌物，是土壤生物代谢的重要酶类，主要功能是解除土壤中过氧化氢的毒害作用，在活性氧清除***中具有重要作用。从表1可以看出处理过的土壤磷酸酶活性提高了1.6倍；过氧化氢酶提高了2倍以上，说明土壤有机磷分解转化能力和有害物质清除能力都有了很大提高。

表1 酸化土壤改良微生态菌剂对土壤改良的盆栽效果

处理	CK	复合微生态菌剂
			株高	10.925±0.763	22.443±0.273
根长	5.867±0.506	12.756±0.931
			地下部分鲜重	0.037±0.003	0.156±0.033
地下部分干重	0.008±0.002	0.016±0.003
			地上部分鲜重	0.133±0.020	0.348±0.005
地上部分干重	0.014±0.002	0.034±0.001
			叶绿素含量	21.050±4.579	35.725±1.209
土壤pH	3.828±0.112	5.330±0.087
			土壤脲酶活性	23.532±3.544	31.305±2.359
土壤磷酸酶活性	2956.239±890.9	7725.505±863.510
			土壤过氧化氢酶活性	3.763±0.392	12.486±3.945
土壤碱解氮含量	220.500±16.663	159.250±20.903
			土壤速效磷含量	199.834±6.957	206.922±22.428
土壤速效钾含量	109.304±5.378	121.403±15.906
			土壤有机质含量	5.150±0.252	8.400±1.461

实验3：复合微生态菌剂对小麦抗病及产量的影响实验

供试小麦品种为丰德存麦21号，试验地河南省驻马店市驿城区。以不施用任何农药和肥料的为空白对照，施用基肥（N+P₂O₅+K₂O≥45%）为常规施肥处理，基肥+（50~100 kg/亩）复合微生态菌剂为菌剂处理，每个处理4个重复小区，每个小区面积为30m²。种植前将复合微生态菌剂和基肥一起均匀撒施在麦田土壤表面，施用后对麦田旋耕，深度为15cm～30cm左右，与土壤均匀混合，机械播种小麦，各处理间农艺措施一致。

出苗情况观察：小麦出苗后7d，观察处理之间出苗差异。齐苗后，每处理5点调查，每点随机取1 m²，计算出苗率。

在小麦灌浆后期至乳熟期，采用5点取样法，对每个处理进行赤霉病病情调查。每点调查40穗，每小区调查200穗，记录小麦的病穗数和病小穗数，计算病穗率、病情指数和防效。

分级标准：

０级：无病；

1级，病小穗占全穗的1/4以下；

3 级，病小穗占全穗1/4~1/2；

5级，病小穗占全穗1/2~3/4；

7级，病小穗占全穗3/4以上。

其中，病穗率=病穗数/调查总穗数×100%；

病情指数=∑（各级病穗数×相应级数值）/（调查总穗数×7）×100

防治效果（%）＝（对照区平均病情指数－处理区平均病情指数）/对照区平均病情指数×100%

于收获前，每处理5点取样，每点1m²样方，调查有效穗数、每穗实粒数，测千粒重，计算理论产量和增产率。单位面积理论产量=穗粒数×千粒重×亩穗数×0.85。

计算亩穗数、穗粒数及产量。

表2复合微生态菌剂对小麦抗病及产量的影响

处理	土壤pH	出苗率（%）	病情指数（%）	防治效果（%）	亩穗数（万）	穗粒数	千粒重（g）	产量（kg/亩）
									空白对照	4.26	58.98	0.23	0	27.85	28.28	35.98	240.87
常规施肥	4.22	59.75	0.21	6.40	30.89	30.22	38.76	307.55
									复合微生态菌剂+常规施肥	5.88~6.05	89.12~95.17	9~17	40.44~60.90	40.06~41.87	31.70~32.87	40.77~41.56	463.66~484.8

从表2可以看出，该复合微生态菌剂能通过调节土壤pH、改善土壤微生态结构，提高小麦出苗率、有效减轻小麦赤霉病发病率，改善苗期小麦的根系生长状况以及后期茎秆发育情况，提高小麦抗逆性能，增加小麦千粒重和亩产量，亩产提高50.8-57.6%，效果之好是未曾料到的。

在对实施例1作实验的同时，对其它实施例也作了相同的实验，均取得了相同和类似的结果，这里不再一一说明。

总之，本发明利用副伯克霍尔德氏菌（Burkholderia fungorum）SJ3-6和类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）RGZ1-4-29混合发酵制备酸化土壤改良微生态菌剂，对酸化严重的土壤有明显的改良效果，通过微生态的平衡至作物需要的程度，有助于土壤重返适合小麦生长的状态，可有效提高酸化土壤小麦出苗率，减少小麦真菌病害的发生，提高土壤肥力，减少污染，且施用简单；菌株对环境适应性强、有固氮、溶磷作用，可产生植物激素，能分泌多种酶，具有防病、促生、改良土壤的作用，大大提高了小麦产量，产量可提高50%以上，且对人畜安全无污染，对环境友好，符合农业绿色、可持续发展方向，具有良好的开发应用前景。

Claims (6)

1.一种复合微生态菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将保藏的菌株RGZ1-4-29和SJ3-6分别在营养琼脂平板上划线，25～30℃培养24～48h，对菌株活化；

所述的菌株RGZ1-4-29为西藏日格则地区小麦农田土壤筛选分离得到，分类命名类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.），2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：23622，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

所述的菌株SJ3-6为自河南驻马店酸化土壤生长良好的小麦根部分离得到，分类命名副伯克霍尔德氏菌（Paraburkholderia fungorum），2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：23621，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

所述的营养琼脂平板为蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化钠5.0g和琼脂15.0g加水至1000mL，121℃下高压灭菌30min，pH7.2±0.2；

（2）种子培养：分别挑取活化菌种的单菌落，接入装有100mL NB培养基的250mL三角瓶中，25～30℃、120～180r/min摇床培养至种子液的OD₆₀₀值为1.2以上，成种子液；

所述的NB培养基为蛋白胨10g、牛肉粉3g和氯化钠5g加水至1000mL，121℃下高压灭菌30min；

（3）发酵培养：将种子液以发酵培养基2～5％的体积量接种于发酵培养基中，温度25～30℃，pH5～8，发酵时间18～32h，得微生物菌悬液，微生物菌悬液中含类芽孢杆菌RGZ1-4-29、副伯克霍尔德氏菌SJ3-6的有效活菌数为5.0×10⁸～5.0×10¹⁰cfu/mL；

所述的发酵培养基为重量百分计：酪蛋白胨0.5％、广西黄腐酸钾1％、尿素0.5%、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.05％和FeSO₄0.02％，余量为水，混合均匀制成；

（4）微生态菌剂的制备：将微生物菌悬液、纤维素酶3～5kU/Kg和蛋白酶5～10kU/kg加入载体中，加水至载体含水率50%，混合均匀，堆积之后再覆盖薄膜，25～35℃发酵72～120h，发酵结束后晾干，加入晾干发酵物重量的：广西黄腐酸钾3～5%、壳聚糖0.03～0.05%、聚谷氨酸0.02～0.03%，再次混合均匀，成复合微生态菌剂；

所述的蛋白酶为胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或木瓜蛋白酶中的一种；

所述的载体为香菇菌渣、杏鲍菇或金针菇菌渣中的一种。

2.根据权利要求1所述的复合微生态菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将保藏的菌株RGZ1-4-29和SJ3-6分别在营养琼脂平板上划线，26～28℃培养30～40h，对菌株活化；

（2）种子培养：分别挑取活化菌种的单菌落，接入装有100mL NB培养基的250mL三角瓶中，26～28℃、150r/min摇床培养至种子液的OD₆₀₀值为1.2以上，成种子液；

（3）发酵培养：将种子液以发酵培养基3.5％的体积量接种于发酵培养基中，温度26～28℃，pH7，发酵时间25h，得微生物菌悬液，微生物菌悬液中含类芽孢杆菌RGZ1-4-29、副伯克霍尔德氏菌SJ3-6的有效活菌数为5.0×10⁸～5.0×10¹⁰cfu/mL；

（4）微生态菌剂的制备：将微生物菌悬液、纤维素酶4kU/Kg和枯草杆菌蛋白酶7kU/kg加入载体香菇菌渣中，加水至载体含水率50%，混合均匀，堆积之后再覆盖薄膜，30℃发酵96h，发酵结束后晾干，加入晾干发酵物重量的：广西黄腐酸钾4%、壳聚糖0.04%、聚谷氨酸0.025%，再次混合均匀，成复合微生态菌剂。

3.根据权利要求1所述的复合微生态菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将保藏的菌株RGZ1-4-29和SJ3-6分别在营养琼脂平板上划线，27℃培养45h，对菌株活化；

（2）种子培养：分别挑取活化菌种的单菌落，接入装有100mL NB培养基的250mL三角瓶中，27℃、170r/min摇床培养至种子液的OD₆₀₀值为1.2以上，成种子液；

（3）发酵培养：将种子液以发酵培养基3％的体积量接种于发酵培养基中，温度26℃，pH5，发酵时间30h，得微生物菌悬液，微生物菌悬液中含类芽孢杆菌RGZ1-4-29、副伯克霍尔德氏菌SJ3-6的有效活菌数为5.0×10⁸～5.0×10¹⁰cfu/mL；

（4）微生态菌剂的制备：将微生物菌悬液、纤维素酶3.5kU/Kg和木瓜蛋白酶6kU/kg加入载体杏鲍菇菌渣中，加水至载体含水率50%，混合均匀，堆积之后再覆盖薄膜，26℃发酵118h，发酵结束后晾干，加入晾干发酵物重量的：广西黄腐酸钾3.5%、壳聚糖0.03%、聚谷氨酸0.02%，再次混合均匀，成复合微生态菌剂。

4.根据权利要求1所述的复合微生态菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将保藏的菌株RGZ1-4-29和SJ3-6分别在营养琼脂平板上划线，29℃培养25h，对菌株活化；

（2）种子培养：分别挑取活化菌种的单菌落，接入装有100mL NB培养基的250mL三角瓶中，29℃、130r/min摇床培养至种子液的OD₆₀₀值为1.2以上，成种子液；

（3）发酵培养：将种子液以发酵培养基5％的体积量接种于发酵培养基中，温度29℃，pH8，发酵时间19h，得微生物菌悬液，微生物菌悬液中含类芽孢杆菌RGZ1-4-29、副伯克霍尔德氏菌SJ3-6的有效活菌数为5.0×10⁸～5.0×10¹⁰cfu/mL；

（4）微生态菌剂的制备：将微生物菌悬液、纤维素酶5kU/Kg和胰蛋白酶9kU/kg加入载体金针菇菌渣中，加水至载体含水率50%，混合均匀，堆积之后再覆盖薄膜，34℃发酵73h，发酵结束后晾干，加入晾干发酵物重量的：广西黄腐酸钾5%、壳聚糖0.05%、聚谷氨酸0.03%，再次混合均匀，成复合微生态菌剂。

5.权利要求1-4任一项所述方法制备的复合微生态菌剂在酸化土壤小麦种植中的应用。

6.权利要求1-4任一项所述方法制备的复合微生态菌剂在制备小麦土传病害抑制剂中的应用。

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