CN104017750B - 一种耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株lj及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ及其应用，其分类命名为甲基营养型芽孢杆菌<i>Bacillus？methylotrophicus</i>，其保藏编号为:CGMCC？NO.7570。本发明对其进行耐盐度分析、对农作物致病性测试以及菌株对致病菌抑制效果试验，结果表明，该菌株耐盐度为25%-30%，对农作物无致病性，菌株对烟草细菌性病害、病毒性病害、真菌性病害都有较理想的抑制效果。该菌株可与大量元素进行复配，保存期长，有效活菌率高。该菌株可以在盐碱地使用，有改良土壤，抵抗病害，提高产量等良好效果。本发明解决了微生物制剂在特殊环境中为植物防病和促生等起到积极效果，该菌剂有耐盐促生菌与防病促生菌的作用，适合盐渍、碱土和酸性土壤的改良。

Description

一种耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ及其应用。

背景技术

干旱和半干旱地区因长期滴灌栽培引起的土壤次生盐渍化、化肥使用超量低效及土传病害严重等作物苗期生产中的突出问题，以及农用微生物菌剂在生产及应用中存在活菌数低、功能单一、持效性与稳定性差等问题，因此有必要以特殊环境中的微生物与植物互作为植物耐盐、防病和促生途径，对不同生物环境中耐盐促生菌与防病促生菌的资源挖掘与整理、生物学特性与作用机进行制研究。面对日益严重的土壤盐渍化现象，分离耐盐基因，构建转基因耐盐植物，开发利用盐碱地是世界各国密切关注的研究方向，耐盐菌也称为兼性嗜盐菌，能够在有盐环境和无盐环境中生长繁殖，耐盐度可高达20％，它最主要的特点是兼性嗜盐，能生长的环境范围广，是耐盐菌的基因的丰富来源，虽然生长在极端环境下的一些极端嗜盐菌耐盐度较高，但是在低盐或无盐的条件下确不能生长。所以在普通环境下分离得到的耐盐菌应该具有更普遍的生物学意义。

水溶耐盐功能菌适合盐渍、碱土和酸性土壤的改良。水溶耐盐功能菌能分解出多种代谢产物，通过提高植物体内酶的活性，促进作物生长发育，刺激根系分生组织细胞的***与增长，使幼苗发根快，次生根增多，根的数量增加，根系伸长，因而能大大加强作物吸收能力。水溶耐盐功能菌增殖时会释放出高活性的分解酵素及多种促进因子，提高肥料使用率，促进植物吸收养分；溶解土壤中无效态磷，提高肥效；产生的聚麸胺酸具有较强的保水保肥能力。如美国亚利桑那大学已收集了数千种盐生植物，发现其中有几种可望用于粮食作物；用硫酸和硫酸铁快速中和土壤碱性。如美国在西部许多地区采用硫酸铵降低pH，以提高土壤透水性；在酸性土壤上种植耐酸多年生牧草或施用石灰石、硅酸盐和酸化磷矿粉等。

水溶耐盐功能菌适合配合生物肥料、有机肥肥料、生物菌肥等一起使用，水溶耐盐功能菌更适合添加到水溶性肥料中施用，如喷灌、滴灌的，有添加到冲施肥、叶面肥、复合肥、有机无机复混肥、大量元素水溶肥、中量元素水溶肥以及微量元素水溶肥等。

我国盐碱地面广量大，改造治理及合理开发利用这些资源是我国农业可持续发展的重要途径之一，也对改善生态环境,推动区域经济、社会和生态可持续发展具有特别重要意义。其中生物改良具有重要的现实意义，主要包括种植耐盐植物、使用微生物菌肥等。

发明内容

本发明提供了一种耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ及其应用，本发明从盐碱地区和盐场淤泥等生态条件下分离筛选较高耐盐度的菌株，可为耐盐基因的克隆及转基因耐盐植物的构建奠定基础，更可以用于耐盐微生物菌剂的研究与开发。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明筛选到一种耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ，其分类命名为甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为:CGMCCNO.7570。

所述菌株LJ的耐NaCl的耐盐度为25％-30％。所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ菌落呈白色，表面粗糙，边缘不规则，LJ菌落大小为2-4mm，易挑起，扁平，无突起，粉质，菌体短杆状，具运动性，可形成芽孢。

本发明提供了所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ在制备抑菌剂中的应用，所述甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ对烟草黑胫病病原菌、烟草赤星病病原菌、烟草镰刀菌、烟草青枯病病原菌和烟草普通花叶病毒有抑菌作用。

所述甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ对小麦、番茄、辣椒和黄瓜均无致病性。

本发明提供了所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ在制备微生物肥料中的应用，所述菌株LJ与大量元素的水溶肥料复配，复配后活菌数达4亿/g以上。

本发明还提供了所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ在制备用于生物修复盐碱地的微生物菌剂中的应用，其中所述甲基营养型芽孢杆菌含菌量为300亿/g以上，菌剂使用量为2kg/亩。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明从盐碱地筛选到耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株，对该菌株进行遗传分析学测试和生理生化实验，确定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌；并对其进行耐盐度分析、对农作物致病性测试以及菌株对致病菌抑制效果试验，结果表明，该菌株耐盐度为25-30％，所述菌株LJ对农作物无致病性，菌株对烟草细菌性病害、病毒性病害、真菌性病害都有较理想的抑制效果。该菌株可与大量元素进行复配，保存期长，有效活菌率高。该菌株可以在盐碱地使用，有改良土壤，抵抗病害，提高产量等良好效果。本发明解决了微生物制剂在特殊环境中为植物防病和促生等起到积极效果，该菌剂有耐盐促生菌与防病促生菌的作用，适合盐渍、碱土和酸性土壤的改良。

附图说明

图1是本发明所述甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ的平板培养图。

图2是本发明所述甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ的耐盐性实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

一、耐盐菌株的分离及筛选

2012年7月4日从山东滨州烟田烟株根际土壤采集土样24份，各取土样1g悬浮于100ml无菌水中，并以此稀释至10⁵倍。采用Gibbons改良培养基或牛肉膏蛋白胨培养基进行筛选，Gibbons改良培养基配方：酪素水解物5.0g，柠檬酸钠3.0g，酵母浸粉10.0g，KCl2.0g,蛋白胨，5.0g,MgSO₄·7H₂O，20gNaCl100g，pH7.0。利用1％、4％、7％、10％的NaCl逐级筛选耐盐菌株。用移液器分别取土壤稀释液0.1ml涂布于两种培养基平板上，30℃培养2～3天，选取在10％盐浓度生长良好的菌落，经反复划线纯化后保存备用，筛选到一株耐盐菌株LJ。

二、耐盐菌株LJ的鉴定

将筛选到的菌株LJ进行平板培养，可见菌落呈白色，表面粗糙，边缘不规则，LJ菌落大小为2-4mm，易挑起，扁平，无突起，粉质，菌体短杆状，具运动性，可形成芽孢。菌株的平板培养图片如图1所示。

对筛选到的耐盐菌株LJ进行细菌分子遗传学分类鉴定：对菌株LJ提取DNA，以该DNA为模板，16SrDNA通用引物为引物，对16SrDNA片段进行扩增。将扩增的片段直接进行序列测定。将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，结果显示该菌株16SrDNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属中的Bacillusmethylotrophicus的16srDNA序列同源度最高，同源率达到99％。通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16SrDNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株LJ16SrDNA与Bacillusmethylotrophicus同源性最高，因此可以初步判定该菌株为芽孢杆菌属的甲基营养型芽孢杆菌。

参考《常见细菌***鉴定手册》，通过对耐盐菌株进行生理生化测定进行初步鉴定：革兰氏阳性，V-P反应、甲基红反应阳性，吲哚阳性，可厌氧生长，能水解淀粉，硫化氢阴性，能利用柠檬酸盐，液化明胶，硝酸盐还原、过氧化氢酶、接触酶阳性，能水解酪素。

根据上述鉴定结果，该菌株LJ鉴定为甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus。

将筛选到的菌株LJ进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年5月8日；保藏编号为：Bacillusmethylotrophicus的编号为CGMCCNo.7570。

三、甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ的耐盐性分析

将分离纯化的耐盐菌株LJ菌悬液，分别转接相同量到不同盐浓度的液体培养基中集中，37℃，200r/min摇床培养，观察生长情况，每隔一段时间测其菌浓度(OD₆₀₀)，以确定细菌耐盐程度。

耐盐性实验结果如图2所示，可见菌株LJ对氯化钠有较宽的适应范围，菌株在无盐情况下不发生自溶现象，在盐浓度达到30％情况下仍然可保持较高的菌体浓度，0-35％的盐浓度下均可生长，最适盐浓度为25％-30％。

四、甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ对农作物致病性测试实验

用无菌注射器将耐盐菌株LJ的悬浮液注射到小麦、番茄、辣椒和黄瓜的苗茎基部，每苗0.5ml，重复12次，保湿24h，3天后开始观察苗茎基部是否出现病斑。

试验结果表明，将耐盐菌悬液接种到小麦、烟草、玉米和西瓜幼苗茎基部，培养3天后均无明显病斑出现。因此，可以确认该株耐盐菌对上述4种作物无潜在的致病性。

五、甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ对真菌性、细菌性病害、病毒性病害的抑制作用

采用平板对峙法测试所述菌株LJ对指示菌的抑菌活性，9cmPDA平板中央接种指示菌烟草黑胫病病原菌，在距离指示菌菌块2.8cm处接种待测试单菌落，另一侧不接菌，以供测量空白指示菌半径，25℃恒温培养5d，观察指示菌菌丝生长情况，测量抑菌结果。

重复上述步骤，将菌株LJ用于抑制烟草链格孢菌(赤星病病原菌)、烟草黑胫病病原菌、尖镰孢菌烟草变种的实验中。实验结果如表1所示，该耐盐菌株LJ对病害的抑制率均可达到60％以上。

采用双层平板法，进行菌株LJ对烟草青枯病的拮抗作用实验。先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有青枯病病原菌和一定稀释度待检测菌株的发酵液的半固体培养基。培养一段时间后，观察透明圈大小，测量抑菌结果，该菌株对青枯病有较强的抑制作用。

采用局部枯斑法，将充分发病的TMV烟草嫩叶用灭菌研钵研磨成匀浆，与灭菌后的磷酸缓冲液(PH7.0)1：40比例稀释。左半叶接种NB培养基与病毒等体积混和液作对照，右半叶接种活性菌株发酵上清液与病毒等体积混和液作处理，接种后立即用水喷洒叶面，3d后统计枯斑数目，抑制率计算方法如下：抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]×100％。菌株对TMV的抑制效果达到了72％，该菌株对其他病害的抑制效果亦非常突出，可以作为广谱型抗病害生防菌株。

表1菌株LJ对各种病害致病菌的抑制实验结果

六、甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ与大量元素水溶肥料的复配

制备LJ菌株种子液，然后按常用的接种比例接种到发酵培养基中，通过调整发酵培养基碳氮源、PH值、发酵温度、接种比例优化混合发酵条件，使发酵液的菌落总数达到8×10⁹cfu/ml。

与载体以一定比例混合，喷雾干燥，形成菌粉。菌粉有效活菌数为300亿/g。与尿素、硫酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾，制备出氮磷钾比列为10-3-15，并含中微量元素硼、锰、铁、镁、铜、锌等，有效活菌数≥4亿/g高效复合生物大量元素水溶肥料。将该产品在室温下放置，每隔一段时间对制剂进行平板计数，检测活菌数的稳定性。

表2LJ菌制剂室温下活性降解规律

时间	0d	30d	60d	90d	120d	180d	240d	360d
									有效菌数(亿/g)	5.26	5.24	5.01	5.03	4.96	4.52	4.39	4.25

通过表2看出，该产品在室温下保存，随着时间的延长，菌数稍有下降，保存12个月，菌数由原来的5.26亿/g降为4.25亿/g，说明含有耐盐活性菌株的大量元素水溶肥料在室温下，有效活菌保存时间长，不易变质。分析其原因主要是该菌株含有耐盐基因，在高盐的环境下仍可长期存活；另外，该菌株为芽孢杆菌，形成芽孢易于贮存和运输，具有开发为生防制剂的潜质。

施用添加了所述菌株LJ的微生物肥料或者生物肥料，可以明显降低盐渍土壤的含盐量、增加有机质含量以及土壤中微生物类群的数量，对于改良土壤物理、化学和生物性质起到良好作用。同时，在使用不同种类和浓度的微生物肥料后，植物的生长状况均得到了改善，生长效果均好于空白对照组，且浓度与效应关系显著。菌株LJ含有丰富且高价值的活性菌，具有解磷、释钾，促进土壤有机质分解、改善土壤中微生物群，改良土壤结构的功能，显著提高肥料的利用率。同时可提高土壤保水能力。

七、盐碱地生物修复

实验主要在盐碱地进行。田间试验采用随机区组设计。以烟草为实验对象。实验设两个处理，LJ微生物菌剂处理：甲基营养型芽孢杆菌菌剂300亿/g+常规施肥，菌剂使用量为每次2kg/亩，移栽和团棵期穴施。对照处理(CK)：常规施肥。每个处理5行，每行36棵烟株，株距0.5m，行距1m。每个处理设置3个平行。其他栽培管理措施同大田一致。调查发现施用微生物菌剂可以改良土壤物理性质,土壤总孔隙度和毛孔隙度增加，透水性能改善，可增加土壤有机质，提高土壤肥力，促进近地空间的生态平衡，抑制地表返盐，确保作物正常生长发育，抗病虫害和促生长的能力显著，增产幅度达30％以上。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ，其特征在于：其分类命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为:CGMCCNO.7570。

2.根据权利要求1所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ，其特征在于：所述菌株LJ的耐NaCl的耐盐度为25％-30％。

3.根据权利要求1所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ，其特征在于：菌落呈白色，表面粗糙，边缘不规则，LJ菌落大小为2-4mm，易挑起，扁平，无突起，粉质，菌体短杆状，具运动性，可形成芽孢。

4.根据权利要求1所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ在制备抑菌剂中的应用，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ对烟草黑胫病病原菌、烟草赤星病病原菌、烟草镰刀菌、烟草青枯病病原菌和烟草普通花叶病毒有抑菌作用。

5.根据权利要求4所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ在制备抑菌剂中的应用，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ对小麦、番茄、辣椒和黄瓜均无致病性。

6.根据权利要求1所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ在制备微生物肥料中的应用。

7.根据权利要求6所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ在制备微生物肥料中的应用，其特征在于：所述菌株LJ与大量元素的水溶肥料复配，复配后活菌数4亿/g以上。

8.根据权利要求1所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ在制备用于生物修复盐碱地的微生物菌剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ在制备用于生物修复盐碱地的微生物菌剂中的应用，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌含菌量为300亿/g以上，菌剂使用量为2kg/亩。