CN115433696B - 一种用于缓解再植障碍的菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于缓解再植障碍的菌剂及其制备方法。用于缓解再植障碍的菌剂包括土地杆菌（Pedobacter sp.）、噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）中一种或几种。采用本发明的菌剂可以有效降低ARD土壤中根皮苷，提高土壤中益生菌的数量，有效缓解苹果再植障碍。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种用于缓解再植障碍的菌剂及其制备方法。
背景技术
苹果属于蔷薇科苹果属，是我国第一大水果品种，栽培面积约有200km2，栽培面积和产量占世界总量的40%。作为世界上最受欢迎的可食用水果之一，也是温带地区产量最大的水果作物，在过去20年，苹果的全球产量翻了一倍多，从1990年的4100万吨增加到2018年的8600万吨，总贸易额为75.3亿美元。
苹果再植障碍，也可以称作苹果再植病(ARD)，是老果园更新时无法避免的重大农业生产问题。ARD在在美国、加拿大、澳大利亚、欧洲，南非和世界其他地方普遍发生，会导致植物矮小，生长迟缓，根系受损产量质量下降，严重危及整个果园的使用寿命，给农民造成巨大的经济损失，目前已成为苹果产业面临的最大难题。ARD的病因复杂，大量的研究表明，ARD形成的主要原因是微生物群落结构不平衡，有益微生物数量减少(包括植物激素产生菌、固氮菌等)，土壤病原微生物数量增加，以及有害物质积累。根皮苷是苹果属特征性酚类化合物，是形成ARD的典型有害物质。研究表明微量根皮苷 (约0.001 mmol/L)可促进幼苗的生长，但浓度达到1 mmol/L时会抑制幼苗的生长，且随着浓度的增加，抑制作用加强。另外，根皮苷的降解产物根皮素、间苯三酚和肉桂酸等均能抑制果树生长。
如何制备一种菌剂来降低根际有害物质浓度，并提高根际益生菌的数量是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种用于缓解再植障碍的菌剂及其制备方法。能够有效降低ARD土壤中根皮苷，提高土壤中益生菌的数量，有效缓解ARD。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种用于缓解再植障碍的菌剂，包括土地杆菌（Pedobacter sp.）、噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）中一种或几种。
采取上述技术方案的有益效果包括：有效降低ARD土壤中根皮苷，提高土壤中益生菌的数量，有效缓解ARD。
进一步，土地杆菌选自土地杆菌R25E21（Pedobacter sp. R25E21）,保藏编号为CGMCC No.24984。该菌株于2022年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步，噬尼古丁类节杆菌选自噬尼古丁类节杆菌S10T11（Paenarthrobacter nicotinovorans S10T11），保藏编号为CGMCC No.24985。该菌株于2022年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步，玫瑰色考克氏菌选自玫瑰色考克氏菌SCKK7（Kocuria rosea SCKK7），保藏编号为CGMCC No.24986。该菌株于2022年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
采取上述技术方案的有益效果包括：采用上述菌株可以进一步提高缓解ARD的效果。上述菌株具有高效的根皮苷降解能力，以及植物激素IAA产生能力，固氮能力和产氨能力，降低ARD土壤中有害物质，提高土壤氮含量和植物激素含量，促进植物生长，促进叶绿素的含量，降低黄叶比例，缓解幼苗的衰老以及缓解因根皮苷导致的再植障碍。嗜烟碱节杆菌和玫瑰色考克氏菌还可以增加株高。
优选地，菌剂包括上述三株菌。三株菌可以良性共存且具有协同效果，可以进一步增加上述效果。
进一步，菌剂还可以包括辅料。
本领域技术人员可以根据使用需求添加其他成分作为辅料或者将菌剂制作成不同剂型。本发明对于辅料的成分以及菌剂的剂型没有特殊限制。
本发明提供一种上述菌剂的制备方法，包括以下步骤：将土地杆菌（Pedobacter sp.）、噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）中的一种或几种发酵培养。
本发明提供一种上述菌剂的制备方法，可以包括将土地杆菌（Pedobacter sp.）、噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）中的至少两种复配的步骤。
例如：本发明提供一种上述菌剂的制备方法，可以包括以下步骤：将土地杆菌（Pedobacter sp.）、噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）复配。
例如，可以将土地杆菌、噬尼古丁类节杆菌、玫瑰色考克氏菌分别接种LB培养基，发酵培养，分别获得菌悬液，将菌悬液等比例混合，或先用吸附剂吸附制成固体菌剂后等比例混合。所述吸附剂可以为玉米粉也可以为其他吸附剂。
采取上述技术方案的有益效果包括：采用上述方法制备的菌剂可以有效降低ARD土壤中根皮苷，提高土壤中益生菌的数量，有效缓解ARD。
进一步，包括以下步骤：将土地杆菌（Pedobacter sp.）、噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）发酵培养后复配。
进一步，包括以下步骤：将土地杆菌（Pedobacter sp.）、噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）接种培养基，发酵培养，分别获得菌悬液，将菌悬液等比例充分混合。
例如，也可以调整菌悬液OD600为0.1后，将制成的菌悬液等比例充分混合。
进一步，发酵培养的温度为28℃-32℃，发酵培养时间为24h-28h。
采取上述技术方案的有益效果包括：采用上述条件有利于菌株的培养，从而有利于保证制备的菌剂的效果。
本发明提供一种土地杆菌，为土地杆菌R25E21（Pedobacter sp. R25E21）,保藏编号为CGMCC No.24984。本发明提供一种菌剂，包括上述土地杆菌和/或其发酵液。
本发明提供一种噬尼古丁类节杆菌，为噬尼古丁类节杆菌S10T11（Paenarthrobacter nicotinovorans S10T11），保藏编号为CGMCC No.24985。本发明提供一种菌剂，包括上述噬尼古丁类节杆菌和/或其发酵液。
本发明提供一种玫瑰色考克氏菌，为玫瑰色考克氏菌SCKK7（Kocuria roseaSCKK7），保藏编号为CGMCC No.24986。本发明提供一种菌剂，包括上述玫瑰色考克氏菌和/或其发酵液。
上述三株菌株均于2022年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
本发明提供上述菌株中的一种或几种在缓解再植障碍中的应用。优选地，在因根皮苷导致的再植障碍中的应用。
本发明提供上述菌剂中的一种或几种在缓解再植障碍中的应用。优选地，在因根皮苷导致的再植障碍中的应用。
本发明意外的发现，上述菌株及菌剂均可以对根皮苷引起苹果幼苗再植障碍具有缓解效果，SCKK7的效果最好、其次是S10T11，最后是R25E21；SCKK7+S10T11组合的效果最好，SCKK7+R25E21次之，最后是S10T11+R25E21。三株能降解根皮苷的菌均能缓解再植障碍，SCKK7和S10T11表现在能增加叶绿素含量、促进生长（株高增加显著）、减少黄叶比例、延缓衰老，R25E21表现在能增加叶绿素含量、显著减少黄叶比例，延缓果树衰老。
附图说明
图1为三株根皮苷降解菌菌株的***发育进化树。
图2为三株菌株及其组合对根皮苷降解率的检测结果。
图3为IAA的标准曲线。
图4为三株菌株及其组合对IAA产量的检测结果。
图5为三株菌株及其组合对氨的产生的检测结果。
图6为三株菌株及其组合对固氮活性的检测结果。
图7为三株根皮苷降解菌在有根皮苷存在情况下促进苹果幼苗生长的实验结果。
图8为三株根皮苷降解菌在有根皮苷存在情况下对苹果幼苗SPAD(a)、株高(b)和黄叶比例(c)的影响的实验结果。
图9为菌株SCKK7和S10T11降解根皮苷促进苹果幼苗生长的实验结果。
图10为菌株SCKK7和S10T11在根皮苷存在情况下对苹果幼苗SPAD(a)、株高(b)和黄叶比例(c)的影响的实验结果。
图11为菌株SCKK7和R25E21在根皮苷存在情况下对苹果幼苗的影响的实验结果。
图12为菌株SCKK7和R25E21在根皮苷存在情况下对苹果幼苗SPAD(a)、株高(b)和黄叶比例(c)的影响的实验结果。
图13为菌株S10T11和R25E21在根皮苷存在情况下对苹果幼苗的影响的实验结果。
图14为菌株S10T11和R25E21在根皮苷存在情况下对苹果幼苗SPAD(a)、株高(b)和黄叶比例(c)的影响的实验结果。
图15为三株菌SCKK7、S10T11和R25E21的组合在有无根皮苷存在情况下对苹果幼苗生长的促进的实验结果。
图16为三株菌SCKK7、S10T11和R25E21的组合在有无根皮苷存在情况下对苹果幼苗SPAD(a)、株高(b)和黄叶比例(c)的影响的实验结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明从山东省栖霞市官道镇连续种植苹果果园中苹果树的根际土壤中分离细菌菌株，并对根皮苷降解菌和植物促生菌进行筛选。
根皮苷降解菌的筛选方法为：在以2 mmol/L根皮苷为唯一碳源的无机盐（MM）培养基中，28℃，200 rpm培养细菌菌株24 h，对培养上清液进行OD325吸光度的测定，计算根皮苷降解率。
植物促生菌的筛选方法为：在色氨酸诱导的LB液体培养基中测定IAA的产量，在蛋白胨水培养基种进行氨的产生测定，在阿须贝无氮（Ashby）培养基平板上进行划线，筛选固氮活性。
对上述根皮苷降解菌和植物促生菌进行组合，最终获得包含嗜烟碱节杆菌属（Paenarthrobacter nicotinovorans）、土地杆菌属（Pedobacter sp.）、玫瑰色考克氏菌属（Kocuria rosea）一种或几种的菌株组合。
嗜烟碱节杆菌属（Paenarthrobacter nicotinovorans）也可以称为噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）。
上述菌株可以用于制备菌剂，菌剂可以包括土地杆菌（Pedobacter sp.）、噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）中一种或几种。也可以包括除上述菌株外的其他原料。
以制备包含一种菌株的菌剂为例，制备方法可以包括以下步骤：将纯化的菌株以LB培养基在28℃，200 rpm条件下培养24 h，将菌液与60%甘油等比例充分混合，置于2 mL的无菌保菌管中，在-80℃条件下保存，使用之前放至室温，在LB培养基，28℃，200 rpm条件下培养24 h活化，测定OD600，可以获得菌剂。菌株可以选自土地杆菌（Pedobacter sp.）、噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）中的一种。在菌剂的制备的过程中也可以加入其他成分。
以制备包含两种菌株的菌剂为例，制备方法可以包括以下步骤：将纯化的两种菌株分别以LB培养基在28℃，200 rpm条件下培养24 h，将每种菌株菌液与60%甘油等比例充分混合，置于2 mL的无菌保菌管中，在-80℃条件下保存，使用之前放至室温，在LB培养基，28℃，200 rpm条件下培养24 h活化，测定OD600，以无菌生理盐水将每种菌株稀释至同一数量级，制成的菌悬液等比例充分混合，可以获得混合菌剂。菌株可以选自土地杆菌（Pedobacter sp.）、噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）中的两种。在菌剂的制备的过程中也可以加入其他成分。
以制备包含三种菌株的的菌剂为例，制备方法可以包括以下步骤：
将纯化的嗜烟碱节杆菌属（Paenarthrobacter nicotinovorans）、土地杆菌属（Pedobacter sp.）和玫瑰色考克氏菌属（Kocuria rosea）三种菌株分别以LB培养基在28℃，200 rpm条件下培养24 h，将每种菌株菌液与60%甘油等比例充分混合，置于2 mL的无菌保菌管中，在-80℃条件下保存，使用之前放至室温，在LB培养基，28℃，200 rpm条件下培养24 h活化，测定OD600，以无菌生理盐水将每种菌株稀释至同一数量级，制成的菌悬液等比例充分混合，可以获得混合菌剂。在菌剂的制备的过程中也可以加入其他成分。
当然，上述的菌剂也可以制备成固体产品，例如，可以将菌悬液先用吸附剂吸附制成固体菌剂后等比例混合。所述吸附剂可以为玉米粉，也可以为其他吸附剂。
三株菌株可以良性共存。菌株以及包括菌株在内的菌剂同时具有高效的根皮苷降解能力，以及植物激素IAA产生能力，固氮能力和产氨能力，降低ARD土壤中有害物质，土壤氮含量和植物激素含量，促进植物生长，促进叶绿素的含量，降低黄叶比例，缓解幼苗的衰老以及缓解因根皮苷导致的再植障碍。嗜烟碱节杆菌和玫瑰色考克氏菌还可以增加株高。
现有的ARD土壤改良菌剂存在功能单一、根皮苷降解率低的缺点。本发明经过实验证实，意外的发现本发明提供的菌株复配组合的根皮苷降解率能够达到95.30%，同时复配菌株的IAA产量可以为3.87 mg/L，固氮活性仍为阳性。上述结果表明三株细菌菌株的复配组合可以进一步显著提高根皮苷的降解率且不以牺牲促生特性为代价。复配组合能够通过产生IAA、固氮等功能，提高土壤中生长素的含量、氮的含量，适用于ARD土壤的改良，缓解苹果再植障碍，具有广阔的应用前景。
下面通过具体实施例进行介绍。
R2A培养基配方：酸水解酪蛋白0.5 g，酵母浸粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.5g，淀粉0.5 g，K3PO4 0.3 g，MgSO4 0.024 g，丙酮酸钠0.3 g，琼脂15 g，去离子水1 L，pH=7.2。
TSB培养基配方：酪蛋白17 g，大豆蛋白胨3 g，葡萄糖2.5 g，NaCl 5 g，K2HPO4 2.5g，琼脂20 g，去离子水1 L，pH=7.0。
TYG培养基配方：胰蛋白胨1 g，酵母浸粉1 g，葡萄糖0.5 g，KCl 6.34 g，NaCl 1.2g，MgSO4·7H2O 0.25 g，K2HPO4 0.13 g，CaCl2·2H2O 0.22 g，K2SO4 0.17 g，Na2SO4 2.4 g，NaHCO3 0.5 g，Na2CO3 0.09 g，Fe-EDTA 0.07 g，琼脂20 g，去离子水1 L，pH=7.0。
YEM培养基配方：酵母浸粉0.5 g，甘露醇5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，琼脂20 g，去离子水1 L，pH=7.0。
KB培养基配方：蛋白胨20 g，甘油10 mL，K2HPO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，琼脂20 g，去离子水1 L，pH=7.0。
LB液体培养基配方：酵母浸粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10 g，去离子水1 L，pH=7.0。LB固体培养基中，琼脂1.5g/L。
本发明中的实验材料若未经特殊说明，均为本领域常规的实验材料，可以通过本领域常规方法配制或市购获得。
实施例1菌株的分离及鉴定
2021年5月从山东省栖霞市官道镇连续种植苹果果园中健康苹果树的根际采集土壤样品，称取土壤样品 0.5 g ，加入装有 4.5 mL PBS的离心管中。涡旋振荡混合均匀，使样品充分分散。将 500 μL 样品悬液 10倍梯度稀释至 2×105，然后从稀释好的样品中取100 μL 同时涂布于5种分离平板，每个稀释梯度涂布 5 个平板。
5种分离平板包括：1/2 R2A培养基（即浓度减半的R2A培养基）、1/2 TSB培养基（即浓度减半的TSB培养基）、1/2 TYG培养基（即浓度减半的TYG培养基）、1/2 YEM培养基（即浓度减半的YEM培养基）和1/2 KB培养基（即浓度减半的KB培养基），28℃倒置培养。
观察到平板上有菌落长出后，将形态不同的菌株转接至新的 LB 培养基，用四区划线法进行纯化。获得纯化后的菌株 795株，通过对菌株进行促生指标（包括根皮苷降解能力、IAA和氨的产生以及固氮活性）的测定选择其中的三株菌，分别命名为菌株S10T11、菌株R25E21和菌株SCKK7。
菌株S10T11的形态特征包括：菌落呈圆形，黄色，表面平整，边缘光滑。
菌株R25E21的形态特征包括：菌落呈圆形，淡粉色，表面和边缘光滑。
菌株SCKK7的形态特征包括：菌落呈圆形，粉色，表面和边缘光滑。
将上述三株菌株分别接种至 LB液体培养基中活化，200 rpm，28℃培养过夜，分别取 700 μL 菌液与 700 μL 60%甘油至 2 mL保菌管混匀， -80℃保存。
利用菌落PCR的方法扩增上述三株菌株的16S rRNA基因片段，通过Blast进行序列比对，构建***发育进化树以确定上述三株菌株的分类（图1）。
经鉴定，菌株R25E21属于土地杆菌（Pedobacter sp.），为土地杆菌R25E21（Pedobacter sp. R25E21）。
菌株S10T11属于噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans），为噬尼古丁类节杆菌S10T11（Paenarthrobacter nicotinovorans S10T11）。
菌株SCKK7属于玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea），为玫瑰色考克氏菌SCKK7（Kocuria rosea SCKK7）。
将三株菌株进行保藏，菌株R25E21保藏编号为CGMCC No.24984、菌株S10T11保藏编号为CGMCC No.24985、菌株SCKK7保藏编号为CGMCC No.24986。
上述三株菌保藏时间均为2022年5月30日，保藏单位名称均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址均为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例2复合菌剂的制备
1）微生物的单株培养
分别选择实施例1获得的菌株S10T11、菌株R25E21和菌株SCKK7，从甘油管中吸取20 uL菌液-甘油混合液于LB平板一区，利用接种环进行四区划线，28℃培养箱培养48 h，直至LB平板上长出单菌落。
分别用接种环于LB平板上挑取分离菌株S10T11、R25E21和SCKK7接种至液体LB培养基中，28℃，200 rpm培养24 h，测定OD600，将菌液调节至OD600=0.1，分别得到菌株嗜烟碱节杆菌属（Paenarthrobacter nicotinovorans）、土地杆菌属（Pedobacter sp.）和玫瑰色考克氏菌属（Kocuria rosea）培养液。
2）微生物组的混合培养
用接种环于LB平板上挑取菌株S10T11、R25E21和SCKK7接种至液体LB培养基中，28℃，200 rpm培养12 h作为原液，测定OD600，将菌液调节至OD600=0.1，将三种菌液以体积比1:1:1的比例进行混合，制得三株菌复合微生物降解菌剂。
实施例3 检测根皮苷降解能力
根据实施例2中微生物的单株培养和混合培养方法，将培养液以2%接种量接种至以2 mmol/L根皮苷为唯一碳源的无机盐（MM）培养基中，28℃，200 rpm培养24 h，吸取1 mL菌液8000 rpm离心10 min，将上清液稀释10倍进行OD325吸光度的测定，使其吸光度处于0.2-0.8之间，以未接菌的培养基作为对照，计算菌株对根皮苷的降解率。
根皮苷降解率（%）=（对照组吸光度-处理组吸光度）/对照组吸光度×100%
无机盐（MM）培养基的配方：NH4NO3 1.0 g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.5 g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 0.5 g，唯一碳源为2 mmol/L的根皮苷。
对根皮苷的降解率的检测结果如图2所示，菌株S10T11、R25E21和SCKK7对根皮苷的降解率分别为93.84%、94.91%和34.02%，可以看出每株菌对根皮苷都有降解能力。三株菌复合微生物降解菌剂对根皮苷的降解率为95.30%，说明三株菌复合后具有协同效果可以进一步提高对根皮苷的降解率。
实施例4 检测促生能力
4.1 IAA产量的测定
（1）标准曲线的绘制
PC比色法（测定0.3-20.0 mg/L范围的IAA）将购自上海沪试试剂的IAA配制成0、5、10、15、20 mg/L浓度的溶液，取1 mL不同浓度的IAA溶液加入1 mL反应液混合，反应液为Salkowski比色液（含有12 g/L FeCl3的7.9 mol/L的H2SO4溶液），室温暗反应30 min，以去离子水作为对照，用石英比色皿于530 nm处，分别测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，以不同IAA浓度的系列外标溶液为横坐标做标准曲线（图3），建立IAA浓度和吸光度的回归方程，经拟合方程为y = 0.0513x + 0.0084，R2 = 0.9995。
Salkowski比色液的配制方法包括：将FeCl3加入至H2SO4溶液中，混合均匀，室温保存，避光备用。
（2）IAA产生能力的测定
设置菌株S10T11、菌株R25E21、菌株SCKK7和三株菌复合微生物降解菌剂，共四组实验。
菌株S10T11组：用接种环于LB平板上挑取分离菌株S10T11接种至液体LB培养基中，28℃，200 rpm培养24 h作为种子液，测定OD600，将菌液调节至OD600=0.1，将种子液以1%接种量接种至含有500 mg/L的色氨酸的LB培养基中，28℃，200 rpm培养24 h，诱导IAA的产生。检测方法：取1.5 mL菌液12000 rpm离心5 min，取上清液加入等体积的Salkowski比色液（PC法），避光静置20 min，测定反应液在OD530的吸光值。用LB空白培养基相同处理调零，每处理重复3次。IAA分泌量单位为mg/L。
菌株R25E21组：接种的菌株为R25E21，其他同上。
菌株SCKK7组：接种的菌株为SCKK7，其他同上。
三株菌复合微生物降解菌剂组：将菌液调节至OD600=0.1后，将三种菌液S10T11、R25E21和SCKK7以体积比1:1:1的比例进行混合，混合后的菌液以1%接种量接种至含有500mg/L的色氨酸的LB培养基中，其他同上。
IAA的检测结果如图4所示，培养24 h时，菌株S10T11、R25E21和SCKK7的IAA产量分别为3.02 mg/L、0.39mg/L和0.69mg/L，三株菌复合微生物降解菌剂的IAA产量为3.87 mg/L，说明无论是菌株S10T11、R25E21和SCKK7单独培养还是复合培养均能够产生IAA，三株菌复合后具有协同效果可以进一步提高IAA的产生能力。
4.2 氨的产生
设置菌株S10T11、菌株R25E21、菌株SCKK7和三株菌复合微生物降解菌剂共四组实验组，以及阴性对照组（control）。
用接种环于LB平板上分别挑取分离菌株S10T11、R25E21和SCKK7分别接种至液体LB培养基中，28℃，200 rpm培养24 h，以1%接种量接种至10 mL质量浓度为1%蛋白胨水培养基，28℃培养72 h，加入0.5 mL的购自麦克林（CAS:7783-33-7）的Nessler’s reagent试剂检测氨的产生，若培养基由棕色变为黄色，则氨的产生活性为阳性。
三株菌复合微生物降解菌剂组：28℃，200 rpm培养24 h后，将三种菌液的复合液以1%接种量接种至10 mL质量浓度为1%蛋白胨水培养基，三种菌液的复合液为S10T11、R25E21和SCKK7以体积比1:1:1的比例进行混合的菌液，其他同上。
蛋白胨水培养基：以配制1L为例，磷酸氢二钠2g、蛋白胨10克、磷酸氢二钾2g、氯化钠5克、葡萄糖5g，pH调至 7.8。
阴性对照组（control）中不接种微生物，其余操作与其他实验组一致。
实验结果如图5所示，从左到右分别为control、菌株S10T11、菌株R25E21、菌株SCKK7、三株菌复合微生物降解菌剂组。培养72 h后，菌株S10T11、R25E21、SCKK7的氨产生活性均为阳性，其中菌株S10T11活性较高。三株菌复合后具有协同效果三种复合微生物降解菌剂的氨产生能力进一步增强。
4.3固氮活性
共设置4组，S10T11组、R25E21组、SCKK7组和S10T11+R25E21+SCKK7组。
S10T11组：将菌株S10T11单独划线到阿须贝培养基上。
R25E21组：将菌株R25E21单独划线到阿须贝培养基上。
SCKK7组：将菌株SCKK7单独划线到阿须贝培养基上。
S10T11+R25E21+SCKK7组：将3株菌的复合菌剂划线到阿须贝培养基上。
阿须贝培养基（Ashby培养基）配方包括：甘露醇10 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO3 5 g，pH=7.0。
上述划线到阿须贝培养基的方法包括：用接种环于LB平板上挑取分离菌株于新的LB固体培养基上，28℃培养48 h，将活化好的细菌单菌落接种于阿须贝无氮（Ashby）培养基平板上，以无菌水为对照，三次重复，平板置于 28℃培养箱培养，第 7 天平板上若有菌落者为阳性。
培养7 d后，以无菌水为对照组未有菌落长出实验结果为阴性（图6未示出），菌株S10T11、R25E21和SCKK7以及三者的组合的固氮活性均为阳性，复合微生物降解菌剂的各菌株均能够在阿须贝无氮（Ashby）培养基平板上正常生长（图6）。
综上所述，三株根皮苷降解菌菌株复配后，根皮苷降解率进一步显著提高，且不以牺牲促生能力为代价（表1）。
表1 三株降解菌株的促生特性
| 菌株编号 | IAA | 氨 | 固氮 |
| S10T11 | ++ | ++ | + |
| R25E21 | + | + | + |
| SCKK7 | + | + | + |
| S10T11+R25E21+SCKK7 | +++ | +++ | + |
注：IAA指标中+代表产量小于1 mg/L，++代表产量大于1 mg/L；氨的产生指标中颜色深浅代表产氨能力的强弱，+代表浅黄，++代表黄色，+++代表深黄；固氮指标中+代表具有固氮能力。
实施例5 检测对苹果幼苗生长的影响
5.1 三株根皮苷降解菌在有根皮苷存在情况下对苹果幼苗生长的影响
实验方法：选择一个月左右的苹果幼苗，温室适应2周后添加0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌菌悬液10 mL，2周后测定苹果的SPAD、株高、总叶数和黄叶数。
实验分为5个处理：
对照Control：只浇水；
根皮苷Phloridzin：添加0.1 mmol/L的根皮苷；
玫瑰色考克氏菌SCKK7+根皮苷Phloridzin：添加0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌玫瑰色考克氏菌SCKK7菌悬液10 mL；
嗜烟碱节杆菌S10T11+根皮苷Phloridzin：添加0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌嗜烟碱节杆菌S10T11菌悬液10 mL；
土地杆菌R25E21+根皮苷Phloridzin：添加0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌土地杆菌R25E21菌悬液10 mL。
实验结果如图7和图8所示。可以看出，与对照组相比，根皮苷能够显著降低苹果幼苗的叶绿素（SPAD）含量，增加黄叶比例，说明根皮苷确实抑制苹果树生长。在有根皮苷存在情况下，分别接种三株菌（玫瑰色考克氏菌SCKK7、嗜烟碱节杆菌S10T11、土地杆菌R25E21）均能够显著增加苹果幼苗的叶绿素含量（SPAD）；SCKK7和S10T11还能够显著促进苹果幼苗的株高。与根皮苷处理组相比，三株菌均能够显著降低苹果苗黄叶比例，说明能缓解根皮苷引起的再植障碍。
5.2 菌株SCKK7和S10T11降解根皮苷对苹果幼苗生长的影响
对照Control：只浇水；
根皮苷Phloridzin：添加0.1 mmol/L的根皮苷；
玫瑰色考克氏菌SCKK7+根皮苷Phloridzin：添加0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌玫瑰色考克氏菌SCKK7菌悬液10 mL；
嗜烟碱节杆菌S10T11+根皮苷Phloridzin：添加0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌嗜烟碱节杆菌S10T11菌悬液10 mL；
SCKK7+S10T11+根皮苷：添加0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌玫瑰色考克氏菌SCKK7菌悬液和嗜烟碱节杆菌S10T11菌悬液各5 mL。
实验结果如图9和图10所示。可以看出，与根皮苷处理组相比，加根皮苷并接种SCKK7、S10T11或同时接种SCKK7+S10T11均能够促进苹果幼苗的SPAD、株高，并减少黄叶比例；说明SCKK7和S10T11具有促生活性，并能够缓解苹果幼苗的衰老。
5.3 菌株SCKK7和R25E21对苹果幼苗的影响
对照Control：只浇水；
根皮苷Phloridzin：添加0.1 mmol/L的根皮苷；
玫瑰色考克氏菌SCKK7+根皮苷Phloridzin：接种0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌玫瑰色考克氏菌SCKK7菌悬液10 mL；
地杆菌R25E21+根皮苷Phloridzin：接种0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌土地杆菌R25E21菌悬液10 mL。
SCKK7+R25E21+根皮苷：添加0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌玫瑰色考克氏菌SCKK7菌悬液和根皮苷降解菌土地杆菌R25E21菌悬液各5 mL。
实验结果如图11和图12所示。可以看出，与根皮苷处理相比，加根皮苷并接种SCKK7、土地杆菌R25E21、同时接种SCKK7和R25E21均能够显著促进苹果幼苗的SPAD；接种SCKK7还能显著促进苹果幼苗的株高。接种SCKK7可以降低黄叶率，接种R25E21、接种SCKK7+R25E21的处理组黄叶率为0，推测SCKK7、R25E21能够缓解苹果幼苗的衰老，尤其R25E21缓解苹果幼苗的衰老的效果更好。
5.4 菌株S10T11和R25E21对苹果幼苗的影响
对照Control：只浇水；
根皮苷Phloridzin：添加0.1 mmol/L的根皮苷；
嗜烟碱节杆菌S10T11+根皮苷Phloridzin：接种0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌嗜烟碱节杆菌S10T11菌悬液10 mL；
土地杆菌R25E21+根皮苷Phloridzin：接种0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌土地杆菌R25E21菌悬液10 mL。
S10T11+R25E21+根皮苷：添加0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌嗜烟碱节杆菌S10T11菌悬液和根皮苷降解菌土地杆菌R25E21菌悬液各5 mL。
实验结果如图13和图14所示。可以看出，与只有根皮苷处理组相比，有根皮苷并接种S10T11、R25E21或同时接种S10T11和R25E21均能够显著促进苹果幼苗的SPAD，接种S10T11还能显著促进苹果幼苗的株高。在有根皮苷存在情况下，接种R25E21、S10T11或同时接种S10T11和R25E21均能较少黄叶比例，其中，接种R25E21、接种S10T11+R25E21的处理组黄叶率为0，说明R25E21单独或与其他成分组合缓解苹果幼苗的衰老的效果更好。
5.5 三株菌SCKK7、S10T11和R25E21对根皮苷的降解及对苹果幼苗生长的影响
对照Control：只浇水；
根皮苷Phloridzin：添加0.1 mmol/L的根皮苷；
SCKK7+S10T11+R25E21：OD600=1.0的根皮苷降解菌玫瑰色考克氏菌SCKK7菌悬液、嗜烟碱节杆菌S10T11菌悬液及土地杆菌R25E21菌悬液各3.3 mL。
SCKK7+S10T11+R25E21+根皮苷：添加0.1 mmol/L的根皮苷，24 h后接种OD600=1.0的根皮苷降解菌玫瑰色考克氏菌SCKK7菌悬液、嗜烟碱节杆菌S10T11菌悬液及土地杆菌R25E21菌悬液各3.3 mL。
实验结果如图15和图16所示。可以看出，在没有根皮苷存在情况下，同时接种三株菌的组合能促进苹果幼苗株高。在有根皮苷的情况下接种三株菌，能显著提高苹果幼苗叶绿素含量，减少黄叶比例。
在有根皮苷存在的条件下，SCKK7、S10T11以及二者的组合可以提高叶绿素含量、促进株高并降低黄叶比例。R25E21、R25E21和SCKK7的组合、R25E21和S10T11的组合、R25E21+SCKK7+S10T11可以提高叶绿素含量并降低黄叶比例。在没有根皮苷存在的条件下，同时接种三株菌的组合能促进株高，有利于植物的生长。
综上所述，三株菌均可以对根皮苷引起苹果幼苗再植障碍具有缓解效果，SCKK7的效果最好、其次是S10T11，最后是R25E21；SCKK7+S10T11组合的效果最好，SCKK7+R25E21次之，最后是S10T11+R25E21。三株能降解根皮苷的菌均能缓解再植障碍，SCKK7和S10T11表现在能增加叶绿素含量、促进生长（株高增加显著）、减少黄叶比例、延缓衰老，R25E21表现在能增加叶绿素含量、显著减少黄叶比例，延缓果树衰老。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于缓解再植障碍的菌剂，其特征在于，包括土地杆菌（Pedobacter sp.）、噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）中一种或几种；土地杆菌选自土地杆菌（Pedobacter sp.）R25E21,保藏编号为CGMCCNo.24984；噬尼古丁类节杆菌选自噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）S10T11，保藏编号为CGMCC No.24985；玫瑰色考克氏菌选自玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）SCKK7，保藏编号为CGMCC No.24986。
2.一种权利要求1所述菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将土地杆菌、噬尼古丁类节杆菌、玫瑰色考克氏菌中的一种或几种发酵培养；和/或
还包括将土地杆菌、噬尼古丁类节杆菌、玫瑰色考克氏菌中的至少两种复配的步骤。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，将土地杆菌、噬尼古丁类节杆菌、玫瑰色考克氏菌分别接种LB培养基，发酵培养，分别获得菌悬液，将菌悬液等比例混合或先用吸附剂吸附制成固体菌剂后等比例混合。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述吸附剂为玉米粉。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，发酵培养的温度为28℃-32℃，发酵培养时间为24h-28h。
6.一种土地杆菌，其特征在于，为土地杆菌（Pedobacter sp.）R25E21,保藏编号为CGMCC No.24984。
7.一种噬尼古丁类节杆菌，其特征在于，为噬尼古丁类节杆菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）S10T11，保藏编号为CGMCC No.24985。
8.一种玫瑰色考克氏菌，其特征在于，为玫瑰色考克氏菌SCKK7（Kocuria rosea）SCKK7，保藏编号为CGMCC No.24986。
9.权利要求6所述土地杆菌、权利要求7所述噬尼古丁类节杆菌、权利要求8所述玫瑰色考克氏菌中的一种或几种在缓解苹果再植障碍中的应用。
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