CN116396888A - 一种适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂及其制备方法，该微生物复合菌剂中的菌由以下菌组成：所述细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)的DNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。所述芽孢杆菌(Bacillus sp)的DNA基因序列如SEQ ID NO.2所示。所述短芽孢杆菌(Brevibacillus sp)的DNA基因序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的微生物复合菌剂的菌株来源于秸秆堆肥自然发酵过程中的高温优势菌群，经长期筛选、驯化，可以有效地促进以秸秆和畜禽粪污为主要原料的有机肥发酵生产过程，提高有机肥的生产效率和肥效，同时提高秸秆、粪污的无害化处理效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂及其制备方法。
背景技术
有机肥含有丰富的腐植酸、氨基酸等有机养分，也含有氮、磷、钾等无机养分，在我国农业发展过程中一直发挥着重要的作用。现代农业科学技术的发展过程中，化肥的使用给农业生产带来了巨大的效益，增加了农作物产量和农民收入。然而，自20世纪中期以来，由于化肥的大量施用，人们对有机肥的重视不够，有机肥的施用面积和施用量逐渐减少，造成土壤退化、土地板结、有机质和有益微生物减少、农田生态环境失衡、产品品质下降，农业环境和地下水资源污染等不良后果，对人类的健康构成了潜在的威胁。市场经济的发展和人们对绿色食品需求的不断提高，使人们对农产品品质尤其是果蔬产品提出了更高的要求。因此必需使用适量的、无害化、稳定性高的有机肥料，补充作物从土壤带走的物质，培肥地力，才能达到生态、安全、高产、优质、高效的目标。
秸秆是成熟农作物茎叶(穗)部分的总称，秸秆富含氮、磷、钾、钙、镁和有机质等，是一种具有多用途的可再生的生物资源，畜禽粪便主要指畜禽养殖业中产生的一类农村固体废物，包括猪粪、牛粪、羊粪、鸡粪、鸭粪等，农业生产上常将秸秆与畜禽粪便混合发酵作为有机肥料投入农田进行再次使用，然而现有的秸秆与畜禽粪便混合发酵采用的发酵菌剂比较单一，单一的微生物菌种功能受限，并不能最大化的实现畜禽粪污和秸秆发酵堆肥效率提升技术问题。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂，所述微生物复合菌剂中的菌由以下菌组成：细长赖氨酸芽孢杆菌、芽孢杆菌和短芽孢杆菌；其中，所述细长赖氨酸芽孢杆菌的分类命名为细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24857；所述芽孢杆菌的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24858；所述短芽孢杆菌的分类命名为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24859，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选的是，所述细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)的DNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的是，所述芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)的DNA基因序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的是，所述短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)的DNA基因序列如SEQID NO.3所示。
本发明还提供一种如上所述的适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂的制备方法，用接种环分别挑取两环细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)、芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)和短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，分别制得细长赖氨酸芽孢杆菌一级种子液、芽孢杆菌一级种子液和短芽孢杆菌一级种子液；将赖氨酸芽孢杆菌一级种子液以3％(v/v)的接种量接种于250mL优化培养基，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，制得细长赖氨酸芽孢杆菌二级种子液；将芽孢杆菌一级种子液和短芽孢杆菌一级种子液以6％(v/v)的接种量接种于250mL营养肉汤培养基中，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，分别制得芽孢杆菌二级种子液和短芽孢杆菌二级种子液；将细长赖氨酸芽孢杆菌二级种子液、芽孢杆菌二级种子液和短芽孢杆菌二级种子液按1-1.5：2：2比例组合，得到微生物复合菌剂。
优选的是，所述优化培养基的组成为：CMC-Na 5.0g、(NH4)2SO4 2.0g、K2HPO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.1g、蒸馏水1000mL、pH值7.0～7.2。
优选的是，所述复合菌液菌落总数达到2.5×109CFU/mL。
本发明至少包括以下有益效果：本发明的微生物复合菌剂的菌株来源于秸秆堆肥自然发酵过程中的高温优势菌群，经长期筛选、驯化，可以有效地促进以秸秆和畜禽粪污为主要原料的有机肥发酵生产过程，提高有机肥的生产效率和肥效，同时提高秸秆、粪污的无害化处理效果。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明：
图1为本发明菌株的初筛过程中的染色的水解圈；
图2为本发明菌株的复筛过程中的葡萄糖标准曲线。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1：
一种适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂，所述微生物复合菌剂中的菌由以下菌组成：细长赖氨酸芽孢杆菌、芽孢杆菌和短芽孢杆菌；其中，所述细长赖氨酸芽孢杆菌的分类命名为细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.M 24857；所述芽孢杆菌的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.M 24858；所述短芽孢杆菌的分类命名为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24859；所述细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)的DNA基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)的DNA基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)的DNA基因序列如SEQ IDNO.3所示；
一种如上所述的适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂的制备方法，用接种环分别挑取两环细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)、芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)和短芽孢杆菌(Brevibacillussp.SWUST-2)斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，分别制得细长赖氨酸芽孢杆菌一级种子液、芽孢杆菌一级种子液和短芽孢杆菌一级种子液；将赖氨酸芽孢杆菌一级种子液以3％(v/v)的接种量接种于250mL优化培养基(CMC-Na 5.0g、(NH4)2SO4 2.0g、K2HPO41.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.1g、蒸馏水1000mL、pH值7.0～7.2)，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，制得细长赖氨酸芽孢杆菌二级种子液；将芽孢杆菌一级种子液和短芽孢杆菌一级种子液以6％(v/v)的接种量接种于250mL营养肉汤培养基中，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，分别制得芽孢杆菌二级种子液和短芽孢杆菌二级种子液；将细长赖氨酸芽孢杆菌二级种子液、芽孢杆菌二级种子液和短芽孢杆菌二级种子液按1.5：2：2比例组合，得到微生物复合菌剂；所述复合菌液菌落总数达到2.5×109CFU/mL。
应用例1：
将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入实施例1的复合微生物菌剂，接种量按重量比3％，加水调节含水量为60％，定期监测温度和含水量，保持温度60℃；并加水保持堆肥含水量为60％左右，待温度明显下降时翻堆，共翻堆3次，待温度不再明显升高后，腐熟10天可制得有机肥；其各项性能(表1)符合国家标准。
对比例1：
将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入细长赖氨酸芽孢杆菌菌剂，接种量按重量比3％，加水调节含水量为60％，定期监测温度和含水量，保持温度60℃，并加水保持堆肥含水量为60％左右，待温度明显下降时翻堆，共翻堆3次，待温度不再明显升高后，腐熟10天可制得有机肥；其各项性能如表1所示；
所述细长赖氨酸芽孢杆菌菌剂的制备方法为：用接种环挑取两环细长赖氨酸芽孢杆菌斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，制得细长赖氨酸芽孢杆菌一级种子液；将细长赖氨酸芽孢杆菌一级种子液以3％(v/v)的接种量接种于250mL优化培养基(CMC-Na 5.0g、(NH4)2SO4 2.0g、K2HPO4 1.0g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O 0.1g、蒸馏水1000mL、pH值7.0～7.2)，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，制得细长赖氨酸芽孢杆菌二级种子液，即细长赖氨酸芽孢杆菌菌剂；所述细长赖氨酸芽孢杆菌的分类命名为细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M24857；所述细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)的DNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
表1
对比例2：
将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入芽孢杆菌菌剂，接种量按重量比3％，加水调节含水量为60％，定期监测温度和含水量，保持温度60℃，并加水保持堆肥含水量为60％左右，待温度明显下降时翻堆，共翻堆3次，待温度不再明显升高后，腐熟10天可制得有机肥；其各项性能如表1所示；
所述芽孢杆菌菌剂菌剂的制备方法为：用接种环挑取两环芽孢杆菌斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，制得芽孢杆菌一级种子液；将芽孢杆菌一级种子液以6％(v/v)的接种量接种于250mL营养肉汤培养基中，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，制得芽孢杆菌二级种子液，即芽孢杆菌菌剂菌剂；所述芽孢杆菌的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24858；述芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)的DNA基因序列如SEQ ID NO.2所示；
对比例3：
将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入短芽孢杆菌菌剂，接种量按重量比3％，加水调节含水量为60％，定期监测温度和含水量，保持温度60℃，并加水保持堆肥含水量为60％左右，待温度明显下降时翻堆，共翻堆3次，待温度不再明显升高后，腐熟10天可制得有机肥；其各项性能如表1所示；
所述短芽孢杆菌菌剂的制备方法为：用接种环挑取两环短芽孢杆菌斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，制得短芽孢杆菌一级种子液；将短芽孢杆菌一级种子液以6％(v/v)的接种量接种于250mL营养肉汤培养基中，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，制得短芽孢杆菌二级种子液；即短芽孢杆菌菌剂；所述短芽孢杆菌的分类命名为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24859；所述短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)的DNA基因序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明采用的细长赖氨酸芽孢杆菌、芽孢杆菌和短芽孢杆菌的的筛选与鉴定过程：
一、菌株的初筛(高温富集和高温培养)
取禽畜粪便堆肥过程中的粪样10g，在无菌条件下，放入装有100mL无菌生理盐水的250mL锥形瓶中；在50℃条件下，150r/min恒温震荡培养箱中活化富集24h；
将活化后的菌液用无菌水依次进行稀释，直至将菌液释到10-5、10-6、10-7三个梯度。分别取稀释液100μL，滴加到筛选培养基(羧甲基纤维素钠CMC-Na 5.0g，硫酸铵(NH4)2SO4 2.0g，磷酸氢二钾K2HPO4 1.0g，七水硫酸镁MgSO4·7H2O 0.5g，氯化钠NaCl 0.5g，七水硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.1g，琼脂粉20g，pH 7.0～7.2。将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL。121℃，0.1Mpa灭菌20min)平板中，均匀涂布后待菌液干燥固定，将平板倒置放入恒温培养箱，50℃条件下培养72h。
挑取大且明显的单菌落，在平板中反复划线进行分离纯化，革兰氏染色电子显微镜观察，直至没有杂菌为止。取分离纯化的菌落接种在筛选培养基平板30℃条件下培养72h。待菌落长出后，用刚果红染色0.5h，然后用1mol/L的无菌生理盐水浸泡0.5h，根据菌落产生透明水解圈直径大小，评定菌株的产酶能力。通常情况下水解圈越大，菌株的产酶能力越强(如图1)。对得到的菌株以0.7mL菌液：0.3mL甘油混匀，置于-80℃的冰箱中保存备用。
二、菌株的复筛(羧甲基纤维素酶活性测定)
将初筛所得到的纤维素降解菌接种到发酵培养基(羧甲基纤维素钠CMC-Na10.0g，硫酸铵(NH4)2SO4 2.0g，磷酸氢二钾K2HPO4 1.0g，七水硫酸镁MgSO4·7H2O 0.5g，氯化钠NaCl 0.5g，七水硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.1g，琼脂粉20g，pH 7.0～7.2。将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL。121℃，0.1Mpa灭菌20min)中，在30℃条件下，150r/min恒温震荡培养箱中培养72h。测定羧甲基纤维素酶(CMCase)活性，选取酶活性较高的菌株作为目标菌株，具体步骤如下：
1、葡萄糖标准曲线的绘制
取7支洗净并烘干的10mL比色管，分别加入总体积为2mL 0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.40mg/mL的葡萄糖柠檬酸混合液。然后加入1.5mL的DNS试剂，沸水浴10min，流水冲洗冷却后加入1.5mL蒸馏水定容至5mL，在540nm波长下以葡萄糖浓度为0的比色管调零，测定不同葡萄糖浓度的吸光度(图2)。
2、粗酶液的制备
取10mL发酵液，放置于洗净并烘干的50mL离心管中，在4℃条件下，5000r/min离心5min，吸取上清液即为粗酶液。
3、酶活性的测定
采用3,5-二硝基水杨酸显色法测定发酵液的酶活性，粗酶液将纤维素降解产生还原糖，还原糖可以将3,5-二硝基水杨酸的硝基还原为氨基生成新的氨基化合物，并发生使溶液变黄的显色反应。在一定的还原糖浓度条件下，混合液的颜色深度随着还原糖浓度的增大而增大，即酶活性的大小与显色反应程度呈正相关。
CMCase活力测定：取4支灭菌且烘干的10mL比色管并编号，0号管加入1.5mL柠檬酸缓冲液作为空白样，另外三支比色管分别加入1.0％ CMC-Na溶液1.5mL。向4支比色管中分别加入0.5mL粗酶液，在50℃条件下水浴30min，水浴结束后加入1.5mL DNS试剂沸水浴10min，自来水冲洗迅速冷却，加入1.5mL蒸馏水。在波长540nm条件下测定其吸光度(表2)。
表2
三、菌株的分子鉴定
选取酶活高的1#、3#和5#菌株进行测序鉴定。采用试剂盒法提取菌落DNA，分别以27F(GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TACGGCTACCTTGTTACGAC)作为正向和反向引物进行PCR扩增，经电泳检测，这3株菌大约在1500bp处有扩增条带。1#菌株序列如SEQ ID NO.3所示；3#菌株序列如SEQ ID NO.1所示；5#菌株序列如SEQ ID NO.2所示；用ContigExpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分；将拼接好的序列在NCBI数据库(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对，1#菌株：短芽孢杆菌属(Brevibacillus sp.)；3#菌株:细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)；5#菌株:芽孢杆菌属(Bacillussp.)。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。
Claims (7)
1.一种适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂，其特征在于，所述微生物复合菌剂中的菌由以下菌组成：细长赖氨酸芽孢杆菌、芽孢杆菌和短芽孢杆菌；其中，所述细长赖氨酸芽孢杆菌的分类命名为细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24857；所述芽孢杆菌的分类命名为芽孢杆菌(Bacillussp.SWUST-3)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24858；所述短芽孢杆菌的分类命名为短芽孢杆菌(Brevibacillussp.SWUST-2)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24859。
2.如权利要求1所述的适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂，其特征在于，所述细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)的DNA基因序列如SEQ IDNO.1所示。
3.如权利要求1所述的适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂，其特征在于，所述芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)的DNA基因序列如SEQ IDNO.2所示。
4.如权利要求1所述的适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂，其特征在于，所述短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)的DNA基因序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种如权利要求1所述的适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，用接种环分别挑取两环细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroidesSWUST-1)、芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)和短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，分别制得细长赖氨酸芽孢杆菌一级种子液、芽孢杆菌一级种子液和短芽孢杆菌一级种子液；将赖氨酸芽孢杆菌一级种子液以3％(v/v)的接种量接种于250mL优化培养基，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，制得细长赖氨酸芽孢杆菌二级种子液；将芽孢杆菌一级种子液和短芽孢杆菌一级种子液以6％(v/v)的接种量接种于250mL营养肉汤培养基中，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，分别制得芽孢杆菌二级种子液和短芽孢杆菌二级种子液；将细长赖氨酸芽孢杆菌二级种子液、芽孢杆菌二级种子液和短芽孢杆菌二级种子液按1-1.5：2：2比例组合，得到微生物复合菌剂。
6.如权利要求5所述的适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述优化培养基的组成为：CMC-Na 5.0g、(NH4)2SO42.0g、K2HPO4 1.0g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.1g、蒸馏水1000mL、pH值7.0～7.2。
7.如权利要求5所述的适于畜禽粪污和秸秆发酵的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述复合菌液菌落总数达到2.5×109CFU/mL。
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