CN111019856A - 玫瑰色考克氏菌sdb9及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及玫瑰色考克氏菌SDB9及其制备方法和在促进植物生长中的应用，属于微生物应用技术领域。玫瑰色考克氏菌SDB9保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.17922，保藏日期：2019年6月12日，分类学名称：Kocuria rosea strain SDB9。本发明通过从陕北抗逆性非常强的天然沙地柏根部中成功分离获得耐盐碱且具有促进植物生长作用的根部内生细菌：玫瑰色考克氏菌SDB9。玫瑰色考克氏菌SDB9耐盐碱性能高且能够显著促进植物生长，使植物根系发达，新生侧根明显增多，并且具有解钾作用，从而为微生物法改良盐碱地且促进植物生长和提高土壤速效钾技术奠定了基础。

Description

玫瑰色考克氏菌SDB9及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体来说，涉及玫瑰色考克氏菌SDB9及其制备方法和在促进植物生长中的应用。

背景技术

植物根际促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR)是生活在植物根圈微域内，对病原菌有拮抗或可促进植物生长的有益根际细菌的统称。根际促生细菌能通过分泌吲哚乙酸等激素，促进植物对营养物质的吸收和提高宿主***抗性来改善植物生长状况。中国是盐碱地大国，在盐碱地面积排前10名的国家中位居第三。盐碱荒地和影响耕地的盐碱地总面积超过5亿亩，其中具有农业发展潜力的盐碱地占中国耕地总面积10％以上。大面积的盐碱地和盐渍化土壤，使得一部分农作物品种因受不同程度盐害的影响而难以发挥产量潜力。由于自然条件及人类活动的原因，世界上超过6％的土地面积和大约20％的耕地受到盐害威胁且逐年增加。土壤中的可溶性盐类不断积累，当盐分达到一定量时，就会造成土壤盐碱化。利用根际促生细菌改善植物根际微生物的种类和数量，同时改良土壤的性质并促进植物的生长，进而提高盐碱地利用效率，是一种环境友好且可持续的方法。

参照我国目前的施肥状况，在农田三要素的平衡中，钾素一般处于亏损状态。土壤钾素不足已构成我国农作物产量提高、品质改善的限制因素。但实际上土壤并不缺钾，在我国土壤中，存在非常丰富的钾资源，但是土壤中的钾为矿物钾形态，主要存在于钾长石和云母中，可供作物吸收利用的速效性钾含量不足全钾的2％，矿物态钾不能被农作物直接吸收和利用。据资料显示，中国的钾肥生产量只占世界产量的0.34％，而消耗量却占14.7％，虽然每年进口约200万吨钾肥，仍不能满足农业生产对钾肥的需要。在化学钾肥供不应求的情况下，研发新的效果好、成本低、无污染的微生物肥料，挖掘土壤中的潜在的钾素资源，具有重要的研究和应用意义。

目前，专家学者对PGPR提高植物耐盐碱方面的研究越来越重视，但对PGPR在盐碱胁迫下对植物根际微环境影响的研究成果较少。虽然近年来学者研究分离了大量的根际促生细菌，这些细菌具有分泌激素、固氮、溶磷、解钾、提高宿主***抗性等一种或多种特性，但这些细菌本身的抗逆性不强，在合适的栽培条件下具有促生功能，而在不良的生长环境下，这些细菌虽然可能存活，却丧失了促生特性，如不再分泌激素等。因此，亟需筛选出自身具有优良抗逆性、并且具有促生作用的PGPR菌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有高耐盐碱能力且能够显著促进植物生长作用的细菌，玫瑰色考克氏菌SDB9能耐受1.5mol/L的NaCl胁迫，且是一种兼性耐碱菌，在pH7-pH12的培养基上都能生长，并且具有解钾作用，解决了现有技术中存在微生物菌种抗逆性不足及不能兼顾促进植物生长发育和提高土壤速效钾的问题。

为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

玫瑰色考克氏菌SDB9保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.17922，保藏日期：2019年6月12日，分类学名称：Kocuria rosea strain SDB9。

所述玫瑰色考克氏菌SDB9的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

玫瑰色考克氏菌SDB9的基因组上存在显著变异，能够作为所述玫瑰色考克氏菌SDB9特有的条形码序列的乙醛脱氢酶aldehyde dehydrogenase基因ALDH4的序列如SEQ IDNO：2所示。

考克氏菌SDB9的制备方法为：

(1)沙地柏根部表面彻底消毒；

(2)沙地柏根部内生细菌的培养、分离和纯化；

(3)耐盐碱细菌的培养、分离和鉴定；

(4)耐盐碱菌SDB9的生长特性观察及生理生化鉴定；

(5)耐盐碱菌SDB9分离株的16S rDNA测序和基因组测序；

(6)玫瑰色考克氏菌SDB9的鉴定。

玫瑰色考克氏菌SDB9为球状、革兰氏阳性，菌落长时间培养呈玫瑰色，环境扫描电镜结果显示该菌种具有一层厚厚的荚膜，从高分辨率扫描镜检照片可看出该菌直径范围为784.8nm-890.6nm。

玫瑰色考克氏菌SDB9能够在浓度为0-1.5mol/L的NaCl培养基和pH值为7-12的培养基上能正常生长。盐碱复合胁迫与上述单独胁迫结果类似，说明所述玫瑰色考克氏菌SDB9具有很强的耐盐碱能力。

同样的，研究发现玫瑰色考克氏菌SDB9对植物生长具有显著地促进作用，特别是在盐碱胁迫下仍然具有显著地促进植物生长和提高抗氧化的能力。

玫瑰色考克氏菌SDB9的菌液具有解钾和促进植物氮、磷吸收的功效。

玫瑰色考克氏菌SDB9应用于促进植物生长中，其具体方法为：

将所述玫瑰色考克氏菌SDB9接种于培养基中，于25-30℃培养20-28h，得到培养液，将所述培养液离心后得到玫瑰色考克氏菌SDB9菌体，将玫瑰色考克氏菌SDB9菌体用水重悬得到玫瑰色考克氏菌SDB9菌液，将玫瑰色考克氏菌SDB9菌液稀释后用于植物的浸种、灌根、接种。植物定植后，随着根系的生长，玫瑰色考克氏菌SDB9开始进行自己扩繁，在定植80d左右时表现出明显地促进植物生长的作用，具体体现在主要根系发达，新生侧根明显增多。

其中，菌液的使用浓度是比较宽的一个范围，从1×10⁶-1×10¹⁰CFU/mL，浓度过高的情况下需要稀释后使用。梯度试验表明只要将玫瑰色考克氏菌SDB9菌液接种于植物的根部，即可发挥促进植物生长的作用，但超高浓度浸种会抑制种子萌发。

优选地，所述玫瑰色考克氏菌SDB9菌液的使用浓度为1×10⁷CFU/mL。

本发明的有益效果在于：

本发明通过从陕北抗逆性非常强的天然沙地柏根部中成功分离获得耐盐碱且具有促进植物生长作用的根部内生细菌，该菌被鉴定为玫瑰色考克氏菌SDB9，于2019年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.17922，分类学名称：Kocuriarosea strain SDB9。玫瑰色考克氏菌SDB9高耐盐碱且能够显著促进植物生长，使植物根系发达，新生侧根明显增多，并且具有解钾作用，从而为微生物法改良盐碱地且促进植物生长和提高土壤速效钾技术奠定了基础。

附图说明

图1A为玫瑰色考克氏菌SDB9的耐盐性分析；

图1B为玫瑰色考克氏菌SDB9的耐碱性分析；

图2为玫瑰色考克氏菌SDB9环境扫描电镜结果；

图3为玫瑰色考克氏菌SDB9高分辨率电镜结果；

图4A为绿豆植株第一节长度测定结果的比较；

图4B为绿豆植株叶长测定结果的比较；

图4C为绿豆植株叶宽测定结果的比较；

图4D为绿豆植株根重测定结果的比较；

图4E为绿豆植株地上重测定结果的比较；

图5A为绿豆根系活力测定结果的比较；

图5B为绿豆叶绿素含量测定结果的比较；

图5C为绿豆SOD活性测定结果的比较；

图5D为绿豆POD活性测定结果的比较；

图5E为绿豆CAT活性测定结果的比较；

图5F为绿豆MDA含量测定结果的比较；

图5G为绿豆脯氨酸含量测定结果的比较；

图6A为玉米株高测定结果的比较；

图6B为玉米鲜重测定结果的比较；

图6C为玉米叶绿素含量测定结果的比较；

图6D为玉米POD活性测定结果的比较；

图6E为玉米CAT活性测定结果的比较；

图6F为玉米SOD活性测定结果的比较；

图6G为玉米MDA含量测定结果的比较；

图6H为玉米根系活力测定结果的比较；

图6I为玉米脯氨酸含量测定结果的比较；

图7A为玉米根际土壤氨态氮含量的比较；

图7B为玉米根际土壤硝态氮含量的比较；

图7C为玉米根际土壤有效磷含量的比较；

图7D为玉米根际土壤速效钾含量的比较；

图8A为玉米植株中氮含量的比较；

图8B为玉米植株中磷含量的比较；

图8C为玉米植株中钾含量的比较；

图9A为水稻茎基部的比较；

图9B为水稻穗基部的比较；

图9C为水稻穗长的比较；

图9D为水稻穗下茎的比较；

图9E为水稻株高的比较；

图10A为水稻根系根长的比较；

图10B为水稻根系根表面积的比较；

图10C为水稻根系根体积的比较；

图11A为水稻小穗数的比较；

图11B为水稻粒数的比较；

图11C为水稻秕谷率的比较；

图11D为水稻地上部分鲜重的比较；

图11E为水稻稻谷鲜重的比较。

具体实施方式

下面将对本发明做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述实施例。

玫瑰色考克氏菌SDB9保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.17922，保藏日期：2019年6月12日，分类学名称：Kocuria roseastrainSDB9。

所述玫瑰色考克氏菌SDB9的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

能够作为所述玫瑰色考克氏菌SDB9特有的条形码序列的乙醛脱氢酶aldehydedehydrogenase基因ALDH4的序列如SEQ ID NO：2所示。

考克氏菌SDB9的制备方法为：

(1)沙地柏根部表面彻底消毒；

(2)沙地柏根部内生细菌的培养、分离和纯化；

(3)耐盐碱细菌的培养、分离和鉴定；

(4)耐盐碱菌SDB9的生长特性观察及生理生化鉴定；

(5)耐盐碱菌SDB9分离株的16S rDNA测序和基因组测序；

(6)玫瑰色考克氏菌SDB9的鉴定。

玫瑰色考克氏菌SDB9为球状、革兰氏阳性，菌落长时间培养呈玫瑰色，环境扫描电镜结果显示该菌种具有一层厚厚的荚膜，从高分辨率扫描镜检照片可看出该菌直径范围为784.8nm-890.6nm。

玫瑰色考克氏菌SDB9应用于促进植物生长中，其具体方法为：

将所述玫瑰色考克氏菌SDB9接种于培养基中，于28℃培养24h，得到培养液，将所述培养液离心后得到玫瑰色考克氏菌SDB9菌体，将玫瑰色考克氏菌SDB9菌体用水重悬得到玫瑰色考克氏菌SDB9菌液，将玫瑰色考克氏菌SDB9菌液用于植物的浸种、灌根、接种。植物定植后，随着根系的生长，玫瑰色考克氏菌SDB9开始进行自己扩繁，在定植80d左右时表现出明显地促进植物生长的作用，具体体现在主要根系发达，新生侧根明显增多。

其中，所述培养基为LB培养基，其组成为：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g NaCl和1000mL蒸馏水，pH为8.0。

所述玫瑰色考克氏菌SDB9菌液的使用浓度为1×10⁷CFU/mL。

实施例1耐盐碱细菌的分离与鉴定

(1)沙地柏根部表面彻底消毒

将沙地柏根部表面的泥土用自来水冲洗干净，放入超净工作台中，紫外线灭菌20min，用无菌水冲洗3-4次。用75％的乙醇浸泡10min，再依次用无菌水冲洗3次，用3％次氯酸钠浸泡5min，最后再用无菌水冲洗4-5次。保留最后一次冲洗的无菌水，用于消毒检验是否彻底。将最后一次消毒的无菌水均匀涂布在LB培养基平板上，放置在28℃环境里培养3-5天，检查是否有菌落形成。消毒检查结果：若无菌落生成，则表明消毒很彻底。

(2)沙地柏根部内生细菌的培养、分离和纯化

操作在超净工作台中进行，紫外灯灭菌20min，将沙地柏根部用灭菌的手术刀切成小块，置于研钵中进行研磨。研磨成浆状后静置30min，之后用移液枪取其上清液。将上清液依次稀释为10倍、100倍、1000倍三个不同的浓度，并将三个浓度的组织液用涂布法均匀的涂布在LB(10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g NaCl、15g/L琼脂和1000mL蒸馏水，pH为7.0)和TSA(5g/L大豆蛋白胨、15g/L胰蛋白胨、5g/L NaCl、15g/L琼脂和1000mL蒸馏水，pH为7.0)培养基平板上。将培养基倒置放置于28℃的培养箱中，等待培养基平板上长出菌落，根据菌种的形态和颜色，用平板划线的方法分离纯化菌种。如此反复，一直到能够分离纯化出单一的菌落。再放入设置温度为28℃的培养箱中继续培养。

(3)耐盐碱细菌的培养、分离和鉴定

采用滴板实验，将步骤(2)分离得到的所有菌种分别连续稀释为1、10、10²三个不同倍数的菌液，滴到不同pH值培养基和不同NaCl浓度的培养基上，观察其生长情况，最终鉴定得到一株能在浓度为1.5mol/L NaCl培养基和pH值为12的固体LB培养基上生长的细菌SDB9，如图1所示。

(4)耐盐碱菌SDB9的生长特性观察及生理生化鉴定

如图2和图3所示，SDB9菌落为玫瑰色革兰氏阳性球状菌，含有一层厚厚的夹膜，菌体直径范围为784.8nm-890.6nm，菌落较小，菌落呈圆形凸起，整齐湿润不透明。SDB9菌落的最适生长培养基为LB培养基(10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g NaCl、1000mL蒸馏水，pH为8.0)、最适生长温度为28℃，液相质谱测定其激素合成能力结果表明：SDB9菌株内IAA(生长素)含量为7748.1ng/g，细胞***素主要是异戊烯基腺苷(iPR)和异戊烯基腺嘌呤(iP)，其含量分别为28.9ng/g和1.41ng/g，而反式玉米素类细胞***素含量很少。

采用Salkowski比色法测定SDB9菌株分泌植物生长激素(IAA)的性能。将100μL供试菌株的悬浮液(1×10⁷个/mL)接种到5mL的L-色氨酸生长培养基中，于28℃暗培养2d；取1mL菌液于10000r/min离心5min，取上清液作为待测样。将1g/L的IAA母液稀释为0、20、40、60、80和100μg/mL的IAA系列标准样。取标准样和待测样150μL分别加入Costar 96孔板，然后立即在所有加样孔中加入100μL Salkowski′s试剂(0.5mmol/L FeCl₃，35％HClO₄)，在30℃下显色30min，观察显色反应结果，用SpectraMax分光光度计测定吸光值OD530，根据标准曲线得到SDB9菌IAA的分泌量高达722μg/mL。

在250mL三角瓶中装入50mL培养液，121℃灭菌30min，冷却至室温。SDB9处理组按体积分数4％的接种量接种，对照组加等量灭活菌液，以28℃、200r/min全温振荡培养箱培养72h。把培养液全部转到蒸发皿中，水浴浓缩至10mL左右，加入6％H₂O₂ 5mL，不断搅拌。如此反复，直至粘液完全灰化为止，去除多余的双氧水，加水过滤到50mL容量瓶中，采用火焰分光光度计法测定水溶性钾含量，结果表明SDB9处理组能使有效态钾增加47.2％。

(5)耐盐碱菌SDB9分离株的16S rDNA测序和基因组测序

将目标菌的菌株划线接种于LB培养基中，于28℃恒温培养箱中培养24h，得到单菌落。

采用细菌16S rDNA通用引物：

27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和

1942R(5’-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增16S rDNA基因序列。

反应体系为：10×PCR缓冲液5μL、MgCl₂(25mmol/L)2.0μL、dNTP(4mmol/L)、TaqDNA聚合酶1μL、引物各1μL、模板2μL，补充去离子水至50μL。反应条件为：95℃5min；94℃30s；50℃30s；72℃1min；33个循环，最后72℃保温5min。反应结束后取2μL PCR产物在1％琼脂凝胶上进行电泳，用凝胶成像***观察扩增产物的电泳结果，16S rDNA的PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。根据测序结果登录NCBI(National Center forBiotechnology Information)数据库，进行BLAST序列比对，结果表明耐盐碱菌SDB9的16SrDNA的序列与玫瑰色考克氏菌(Kocuria rosea)的同源性最高，因此耐盐碱菌SDB9被鉴定为玫瑰色考克氏菌(Kocuria rosea)。

耐盐碱菌SDB9分离株的基因组测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成，对基因组测序结果深入挖掘分析表明：耐盐碱菌SDB9基因组上存在4个乙醛脱氢酶aldehydedehydrogenase基因，该类基因属于生长素(IAA)合成的IPyA/TAM/TSO通路，其中ALDH4基因是比较特殊的，跟NCBI数据库中的序列同源性最高的是节杆菌属的Arthrobacter sp.U41，同源性为80.39％(NCBI登录号：CP015732.1)，而跟考克氏菌属的同源性比较低，因此该基因序列可以看作本研究筛选的考克氏菌SDB9菌的特有序列，是耐盐碱菌SDB9的条形码，以区别于其他玫瑰色考克氏菌。节杆菌属Arthrobacter的细菌常能合成IAA，是目前细菌合成IAA机理研究比较深入的菌属，再考虑到耐盐碱菌SDB9能大量合成IAA，而耐盐碱菌SDB9内其他IAA合成相关基因没有特殊性，而ALDH4序列比较特殊，并且跟节杆菌属Arthrobacter的同源性最高，因此推测ALDH4是赋予耐盐碱菌SDB9具有大量合成IAA能力的关键基因。

(6)玫瑰色考克氏菌SDB9的鉴定

耐盐碱菌SDB9被称为玫瑰色考克氏菌SDB9，于2019年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.17922。

实施例2玫瑰色考克氏菌SDB9在盐碱胁迫下提高植物的保绿功能

盐碱地主要是由于土壤中的碳酸钠含量高而形成的。本发明进行了苏打(碳酸钠)模拟盐碱胁迫保绿实验。以横山大明绿豆为试验材料，利用从陕西省榆林市鱼河镇取的盐碱土栽培，经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液浸泡24h后栽种到上口径为65mm、高为90mm的花盆中，每次定量浇水50mL，栽培2周后，采用10g/L的苏打水进行浇灌绿豆幼苗，每次50mL。胁迫2周后，发现玫瑰色考克氏菌SDB9能提高绿豆幼苗的保绿性。

实施例3玫瑰色考克氏菌SDB9在盐碱胁迫下的促进植物生长和提高抗氧化能力

(1)以横山大明绿豆为试验材料，栽培方式同实施例2，只是没有进行高浓度碳酸钠模拟盐碱胁迫。经过80天的生长，观察地上部分生长情况，并将根部从土壤中完整的挖出来，根部的泥土用清水清洗干净。结果表明：玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理过的绿豆幼苗与对照相比，新叶长出的速度较快、根系更发达、侧根较多，尤其是复叶叶柄明显变长，说明经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理能更好的促进植物生长。如图4所示，经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理的绿豆幼苗(SDB9)与对照组(CK)相比，第一节较长(图4A)、根部鲜重(图4D)和地上部分鲜重(图4E)都有明显的增加。经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理之后绿豆幼苗，地上部分长度、地下部分长度都没有明显变化；还可观察到经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理的绿豆幼苗叶长、叶宽都没有明显变化(图4B、C)。推测玫瑰色考克氏菌SDB9可能主要有促进植物根部生长的作用，使其根系更加发达。

(2)以横山大明绿豆为试验材料，栽培条件实施例2，只是没有进行浸种和高浓度碳酸钠模拟盐碱胁迫，在绿豆幼苗长出真叶时，利用50ml浓度为1×10⁷CFU/mL的玫瑰色考克氏菌SDB9菌液进行灌根处理，对照组浇灌自来水。待绿豆生长60天后进行碳酸钠模拟盐碱胁迫三次，三次的浓度分别是0.025mol/L、0.05mol/L和0.1mol/L，每盆浇50ml，三次盐碱胁迫间隔时间为1周，接下来对绿豆形态和抗氧化生理指标进行观察和测定。结果表明：与对照组(CK)相比，经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理的绿豆根系活力指数增长不大，二者差异不显著(图5A)。经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理的绿豆叶绿素增长了7.81％，经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理的绿豆叶片明显比对照要绿，说明玫瑰色考克氏菌SDB9可以提高绿豆叶绿素的含量，这也与前期结果相一致(图5B)。经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理的绿豆超氧化物歧化酶(SOD)酶活性与对照组的差异不显著(图5C)，POD含量没有明显的变化、差异不显著(图5D)。但经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理的绿豆过氧化氢酶(CAT)酶活性增长了5倍之多，差异极显著(图5E)；经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理的绿豆丙二醛(MDA)的含量有所降低，降低了5.34％，差异不显著(图5F)；经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理的绿豆体内的脯氨酸含量明显高于对照组，相比增长了41.24％，二者差异极显著(图5G)。

(3)为了验证玫瑰色考克氏菌SDB9对单子叶植物的促进生长的作用，本实施例利用玉米郑单958品种为试验材料，挑选约200粒颗粒饱满、无病虫害、无损伤、并且大小相差不大的玉米种子，用自来水冲洗已挑选好的玉米种子2-4次，将洗干净的玉米种子于清水中浸泡6小时，而后置于28℃培养箱中发芽，并准备上口径为11cm、高为14cm的装有蛭石花盆若干个，将处理完成后的玉米种子种于其中，按每盆约8-10粒种子进行播种，然后放入生长室中进行培养。待玉米种子长出第二片真叶时，需要间除长势不良的幼苗，最终使每盆中保留3株玉米幼苗。在玉米幼苗高5cm时，利用150ml浓度为1×10⁷CFU/mL的玫瑰色考克氏菌SDB9菌液进行灌根处理形成试验组(SDB9)，对照组(CK)浇灌自来水。待玉米生长60天后进行碳酸钠模拟盐碱胁迫三次，三次的浓度分别是0.025mol/L、0.05mol/L和0.1mol/L，每盆浇150ml，三次盐碱胁迫间隔时间为1周，接下来对玉米形态和抗氧化生理指标进行观察和测定。结果表明：

对照组玉米幼苗与试验组玉米幼苗的株高无显著差异。本次试验结果显示，对照组玉米幼苗的株高为49.7cm，试验组玉米幼苗的株高为52cm，相比较于对照组玉米幼苗的株高而言，试验组玉米幼苗的株高均呈现出增长趋势，平均增长量2.3cm，约增长0.05倍，但株高增加效果不明显，统计上差异不显著(图6A)。

与对照组相比，试验组玉米幼苗根部细小的分生根多于对照组玉米幼苗根部细小的分支根，尤其在次生根部分此现象更加明显。而且试验组玉米幼苗的须根表现为更加细长，其根部的外观颜色为淡黄偏白色，而对照组玉米幼苗的须根表现为更加短粗，根部外观颜色呈现为较暗的黄色。在通常情况下，玉米受到不良胁迫下，根系会呈现出暗黄色，故说明本次试验所用的SDB9内生细菌对玉米幼苗根部耐受性具有提高作用。

对照组玉米幼苗地下部的鲜重为2.33g，而试验组玉米幼苗地下部的鲜重为3.09g，试验组玉米幼苗地下部的鲜重增加0.76g，差异显著。对地上部分鲜重进行比较分析得到类似结果，对照组玉米幼苗地上部分的鲜重为3.2g，试验组玉米幼苗地上部分的鲜重为4.93g，试验组玉米幼苗地上部的鲜重增加了1.73g，试验组相较于对照组增加了0.5倍，差异显著(图6B)。

对照组玉米幼苗的叶绿素含量为0.378mg/g，而接种菌株的试验组玉米幼苗的叶绿素含量为0.412mg/g，试验组玉米幼苗的叶绿素含量表现出增长现象，平均每克叶片中的叶绿素含量增加了0.034g，增加的量较少，无显著差异(图6C)。

试验组玉米幼苗的过氧化物酶(POD)活性有所上升。对照组玉米幼苗叶片中的过氧化物酶活性为207.778U/mg，而试验组为221.111U/mg，试验组玉米幼苗叶片中的过氧化物酶活性提高了0.064倍，提高幅度并不明显，差异不显著(图6D)。

试验组玉米幼苗的过氧化氢酶(CAT)活性明显高于对照组。对照组玉米幼苗叶片的过氧化氢酶活性为35.294U/mg，试验组为402.353U/mg，相比较与对照组，试验组玉米幼苗叶片的过氧化氢酶活性的提高了10倍，提高幅度巨大，差异极显著(图6E)。

对照组玉米幼苗叶片中超氧化物歧化酶(SOD)的活性为917.588U/mg，试验组为921.298U/mg，试验组玉米幼苗叶片中超氧化物歧化酶的含量虽有所增加，但增加幅度很小，无显著性差异(图6F)。

试验组玉米幼苗叶片中的丙二醛(MDA)含量大幅度的少于对照组。对照组玉米幼苗叶片中的丙二醛含量为32.733nmol/g，而试验组为14.408nmol/g，试验组玉米幼苗叶片中的丙二醛含量明显低于对照组玉米幼苗叶片中的丙二醛含量，差异显著(图6G)。

对照组玉米幼苗的根系活力为0.112mg/g/h，而试验组为0.129mg/g/h，相比较于对照组玉米幼苗的根系活力，试验组玉米幼苗的根系活力增加了0.15倍，增加幅度较小，无显著性差异(图6H)。

对照组玉米幼苗叶片中的脯氨酸含量为0.001473μg/g，而试验组为0.001683μg/g，试验组含量有微小的增加，增加了0.14倍，无显著差异(图6I)。

实施例4玫瑰色考克氏菌SDB9在大田试验条件下促进植物生长

在陕西省榆林市红石峡试验基地和宁夏回族自治区银川市兵沟黄河大桥盐碱地分别进行了玉米(郑单958)和水稻(吉宏6号)试验。

玉米在幼苗高5cm时用浓度为1×10⁷CFU/mL的玫瑰色考克氏菌SDB9菌液进行灌根处理，结果表明：在没有施肥的土壤里，玉米在种植80天后，经菌液处理的试验组(SDB9)玉米呈绿色，而对照组(CK)叶子都是发黄，并且试验组根系也更发达、玉米的果穗也更大、成熟度也更高，对照组玉米籽粒还比较鲜嫩饱满，而试验组已经呈马齿形，突尖也变得很小。

对玉米根际土壤进行了氨态氮、硝态氮、有效磷和速效钾测定，测定方法为氨硝态氮采用氯化钾浸提流动分析仪，有效磷采用碳酸氢钠浸提钼锑抗比色，速效钾采用硝酸浸提剂后分光光度计测定。结果表明：与对照组相比，实验组的玉米根际土壤氨态氮、有效磷含量变化不明显(图7A、C)，但试验组的玉米根际土壤硝态氮含量下降了约21％(图7B)，而速效钾含量增加了约57％(图7D)，推测是由于玫瑰色考克氏菌SDB9具有解钾能力造成的，这也与实施例1中的验证的玫瑰色考克氏菌SDB9具有解钾能力的结论相一致，并促进了硝态氮的吸收。

对玉米植株不同部位全氮全磷全钾的含量进行测定，方法为：全氮采用浓硫酸双氧水浸提后流动分析仪分析、全磷采用钼锑抗比色法分析、全钾采用火焰光度计分析。结果表明：与对照组(CK)相比，玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理的试验组(SDB9)的玉米根和茎中的钾含量显著增多(图8C)，并且促进了氮的吸收，试验组中玉米的根、茎和籽粒中的氮含量显著增加(图8A)，但对磷的吸收也有影响，试验组中玉米的根、茎和叶中磷含量降低，而籽粒中磷含量增加(图8B)。

水稻采用上述相同浓度的玫瑰色考克氏菌SDB9菌液浸种1小时，然后进行催芽，直接播种。在生长120天后，经玫瑰色考克氏菌SDB9菌液处理的试验组(SDB9)的水稻株高、穗长都比对照组(CK)大些，而且试验组的根系更发达，并且根茎结合部位的新生根数量明显比对照组多，试验组的水稻灌浆也提前，对照组还没有开始灌浆，试验组的籽粒已经有3mm左右长。

水稻成熟后，对株型分析发现：试验组和对照组各随机选取10株进行统计，与对照组相比，试验组的水稻株高显著增加，大约增高2.5cm(图9E)，茎基部直径也有所增粗(图9A)，穗基部直径、穗长和穗下茎长度都显著增加(图9B、C、D)，株高的增加主要是由于穗下茎增加造成的。

对水稻根系扫描后，采用Win RHIZO PRO 2009软件(Regent Inc.，Quebec，Canada)分析发现：取样同上述株型分析，与对照组相比，试验组水稻的根长、根表面积和根体积都显著增加，分别增加约53％、61％和70％(图10A、B、C)。

对水稻产量相关指标进行分析表明：取样同上述株型分析，与对照组相比，试验组水稻的小穗数和粒数显著增加，分别增加约27％和83％(图11A、B)，秕谷率下降约12％(图11C)，千粒重没有显著差异；取样1平米，3次重复，对照组和试验组地上部分重量(从茎基部剪掉根部)没有显著差异(图11D)，说明亩穗数可能没有显著增加，但试验组稻谷鲜重(带颖壳)增加约12％(图11E)。初步分析表明玫瑰色考克氏菌SDB9菌液通过促进水稻穗长的增加，进而促进水稻小穗数和粒数的增加，达到增产的效果。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，这些具体实施方式都是基于本发明整体构思下的不同实现方式，而且本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 榆林市中泰农业科技有限公司

榆林学院

<120> 玫瑰色考克氏菌SDB9及其制备方法和应用

<130> 20191210

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 2919

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

atntnvrsng agggtgctac acatgcagtc gaacgatgat gcccagcttg ctgggcggat 60

tagtggcgaa cgggtgagta atacgtgagt aacctgccct tgactctggg ataagcctgg 120

gaaactgggt ctaatactgg atactacctc ttgccgcatg gtgggtggtg gaaagggttt 180

tactggtttt ggatgggctc acggcctatc agcttgttgg tggggtaatg gctcaccaag 240

gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggtg accggccaca ctgggactga gacacggccc 300

agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcggaagc ctgatgcagc 360

gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagtag ggaagaagcg 420

agagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480

cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg cggtttgtcg 540

cgtctgctgt gaaagcccgg ggctcaaccc cgggtctgca gtgggtacgg gcagactaga 600

gtgcagtagg ggagactgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga 660

acaccgatgg cgaaggcagg tctctgggct gttactgacg ctgaggagcg aaagcatggg 720

gagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgttgggca ctaggtgtgg 780

gggacattcc acgttttccg cgccgtagct aacgcattaa gtgccccgcc tggggagtac 840

ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgcg 900

gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acattcaccg gaccgcccca 960

gagatggggt ttcccttcgg ggctggtgga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1020

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc tcgttctatg ttgccagcac 1080

gtgatggtgg ggactcatag gagactgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggatgacg 1140

tcaaatcatc atgcccctta tgtcttgggc ttcacgcatg ctacaatggc cggtacaaag 1200

ggttgcgata ctgtgaggtg gagctaatcc caaaaagccg gtctcagttc ggattgaggt 1260

ctgcaactcg acctcatgaa gtcggagtcg ctagtaatcg cagatcagca acgctgcggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcaagtc acgaaagttg gtaacacccg 1380

aagccggtgg cctaacccct tgtgggaggg agccgtcgaa ggtgaccgat gaacaccgtg 1440

atccgtcccg ccacgaccgc cgccgaggtg gaccgggccg cccgcgccgc ccaccaggcg 1500

tacctggtgt ccgccgccca gacgcccgcc acccgggcgt cctggctcac ggccctggcc 1560

gaggccctgc gcgcccacga cgacgagctc gtcggcctgg ccgcggagga gacccacctc 1620

gccgaacccc ggctgcgcgg ggagctcaag cgcagcgcct tccaactgga cctgttcgcg 1680

caggaggtcc gcaccggggt ggccctggac gccgtcatcg accacgccga cccggactgg 1740

gggatgggcc cgcgcccgga catccgccgc gtcaacgtgc ccctgggcgt ggtgggcgtc 1800

ttcggcgcct ccaacttccc cttcgccttc agcgtcatgg gcggggacag cgcctcggcc 1860

ctggccgccg ggtgcgccgt cctgcacaag atccacggcg ggcatctgag gctcggtctg 1920

cgcaccgccg agatcgtcgt cgaggcgctg gagaaggtag gcgccccaca gggactgttc 1980

gccgtgctcg agggccggga ggcggccacc gcgctggtcg accacccgtt ggtgaaggcc 2040

atcgggttca ccggttccac cgccggcggc cgggcgctgt tcgatcgggc ggccgcccgg 2100

cccgagccca tccccttcta cggggagctg ggcagcatca accccgtgtt cgtgctcccc 2160

gcagcgtggg agcaccgctg gcaggagatc ctcaccggct acgccgggtc cttcaccatg 2220

ggcatgggcc agttctgcac caagcccggg gtgctcttcg tcccggacac gggcgagacg 2280

gagcaggtcc ggaccaccct gacctcggcc ctggccgatg ccccgctggc gaagcttctc 2340

acccccgggt tgcgtgagtc cttcggccag gcccgtgatg aggtcgccgc gctcgaaggc 2400

gtgcagacgc tcgtggccgg ctctgacgag gaggtgcccg acccgaccgt cctggccgtc 2460

gacgccgagc aggtccggcg gaaccccgag gtgctgcacc gggagatgtt cggcccggcc 2520

acagtgctcg tgcgatatcg ggaggccgct gacctgccgg cccttgccga gctgatggag 2580

ggacagctga cggccaccgt ccacggcgac gaggaggacg acagcgctgc gctggtgggc 2640

accctgaccg gcaaggccgg ccgggtgctg ttcaacggct ggcccaccgg ggtgaccgtc 2700

tcctacgccc agcaccacgg cggtccctac ccggcgacga ccacgaacac cacctcggtg 2760

ggcacggcct cgatcgggcg gttcatgcgc ccggtgtcct accaggacct ccccgacgcc 2820

gcgctgccgc cagccctgca ggaggccaat ccctggggga tcgcccgccg cgtggacggc 2880

cggttcgaac ccgccgagtc ggaaggagcc ggcgcatga 2919

Claims (10)

1.玫瑰色考克氏菌SDB9，其特征在于：

玫瑰色考克氏菌SDB9保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.17922，保藏日期：2019年6月12日，分类学名称：Kocuria rosea strainSDB9。

2.根据权利要求1所述的玫瑰色考克氏菌SDB9，其特征在于：

所述玫瑰色考克氏菌SDB9的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的玫瑰色考克氏菌SDB9，其特征在于：

能够作为所述玫瑰色考克氏菌SDB9特有的条形码序列的乙醛脱氢酶aldehydedehydrogenase基因ALDH4的序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求1所述的玫瑰色考克氏菌SDB9的制备方法，其特征在于：

(1)沙地柏根部表面彻底消毒；

(2)沙地柏根部内生细菌的培养、分离和纯化；

(3)耐盐碱细菌的培养、分离和鉴定；

(4)耐盐碱菌SDB9的生长特性观察及生理生化鉴定；

(5)耐盐碱菌SDB9分离株的16S rDNA测序和基因组测序；

(6)玫瑰色考克氏菌SDB9的鉴定。

5.根据权利要求4所述的玫瑰色考克氏菌SDB9的制备方法，其特征在于：

所述玫瑰色考克氏菌SDB9能够在浓度为0-1.5mol/L的NaCl培养基和pH值为7-12的培养基上生长。

6.权利要求1-5任一项所述的玫瑰色考克氏菌SDB9应用于促进植物生长中。

7.根据权利要求6所述的玫瑰色考克氏菌SDB9的应用，其特征在于：

所述玫瑰色考克氏菌SDB9的菌液具有明显的在盐碱胁迫环境下促进植物生长和提高植物抗氧化的能力。

8.根据权利要求7所述的玫瑰色考克氏菌SDB9的应用，其特征在于：

所述玫瑰色考克氏菌SDB9的菌液具有解钾和促进植物氮、磷吸收的功效。

9.根据权利要求6所述的玫瑰色考克氏菌SDB9的应用，其特征在于：

将所述玫瑰色考克氏菌SDB9接种于培养基中，于25-30℃培养20-28h，得到培养液，将所述培养液离心后得到玫瑰色考克氏菌SDB9菌体，将玫瑰色考克氏菌SDB9菌体用水重悬得到玫瑰色考克氏菌SDB9菌液，将玫瑰色考克氏菌SDB9菌液用于植物的浸种、灌根、接种，以促进植物生长。

10.根据权利要求6所述的玫瑰色考克氏菌SDB9的应用，其特征在于：

所述玫瑰色考克氏菌SDB9菌液的使用浓度为1×10⁶-1×10¹⁰CFU/mL。

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