CN112680373B - 一种胶质芽孢杆菌及使用其固态发酵制备生物有机肥的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及到一种具有高效解钾功能和促生能力的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)M‑1，保藏编号为：CGMCC No.19428及使用其固态发酵制备生物有机肥的方法。固态发酵制备生物有机肥的方法，包括以下步骤：(1)活化斜面种子；(2)培养液体种子；(3)预处理基质；(4)固态发酵培养。本发明缓解了传统的胶质芽孢杆菌液体发酵，存在发酵液粘稠、活菌数和芽孢率偏低的问题，采用固态发酵法，以牛粪为基质同时发酵生产胶质芽孢杆菌和有机肥的二次腐熟，最终形成生物有机肥，工艺简单、易于实施。

Description

一种胶质芽孢杆菌及使用其固态发酵制备生物有机肥的方法

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及到一种胶质芽孢杆菌及使用其固态发酵制备生物有机肥的方法。

背景技术

胶质芽孢杆菌(又名胶冻样芽孢杆菌)能够分解出长石、云母等矿物中的钾、硅，促进土壤无效磷钾的转化，增加土壤磷钾的供给，提高作物产量，目前是我国应用面积最大的微生物肥料菌种之一，生产时间最长，生产企业最多。一方面由于胶质芽孢杆菌一直采用传统工艺液体发酵，活菌数太少和和芽孢率偏低；另一方面胶质芽孢杆菌固体粉剂的生产，由于发酵液粘稠，浓缩干燥成为难题，这成为企业和行业发展的障碍。

另外，传统生物有机肥的生产，生物菌剂和有机肥为两个独立过程，最后混合制肥；有机肥在堆肥过程中，会发生大量氮素损。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种胶质芽孢杆菌及使用其固态发酵制备生物有机肥的方法，采用固态发酵法，以牛粪为基质同时发酵生产胶质芽孢杆菌和有机肥的二次腐熟，最终形成生物有机肥，工艺简单、易于实施，缓解了传统的胶质芽孢杆菌液体发酵，存在发酵液粘稠、活菌数和芽孢率偏低的问题。

本发明是通过如下技术方案实现的：

提供一种具有高效解钾功能和促生能力的胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)M-1，保藏编号为：CGMCC No.19428。

该胶质芽孢杆菌M-1是从菜园地土壤中分离纯化所得，并对菌株的16S rDNA部分序列进行测定，通过***发育分析，确定为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，并命名为M-1。该菌形态特征是：在无氮固体培养基菌上，菌落***，呈现玻璃半球状，表面湿润有光泽，透明，胶质粘稠有弹性；菌体呈杆状，两端钝圆，大小为4～7μm×1～1.4μm；在含淀粉培养基中培养30h后在菌体中形成大量芽孢，芽孢中生或近端生，椭圆形，大小约为1.5～1.7μm×2.8～3.4μm。

该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏日期为2020年2月19日。

胶质芽孢杆菌M-1在生物肥料中应用。

一种使用胶质芽孢杆菌M-1固态发酵制备生物有机肥的方法，包括以下步骤：

(1)活化斜面种子：将胶质芽孢杆菌M-1无菌接种于营养琼脂斜面培养基上，温度37±2℃下培养36～48h，得到斜面种子；

(2)培养液体种子：将步骤(1)得到的斜面种子接种于液体培养基中，温度37±1℃下培养36～48h，得到液体种子；

(3)预处理基质：粉碎物料基质并调节水分55％～60％，将混合后的物料置于发酵器内并升温至75℃±3℃，经过8-10h高温快速无害化、腐熟，至臭味消失；

(4)固态发酵培养：将步骤(2)得到的液体种子按重量份的5～10份接种于步骤(3)预处理后的基质中，温度37±2℃下培养5-7d，得到发酵产物，烘干发酵产物至含水率≤15％，得到最终生物有机肥。

进一步的，物料基质包括以下重量份的组分：牛粪50～60份，蘑菇渣20～30份、木屑10～20份和糖蜜2～4份。

进一步的，步骤(4)中接种的M-1液体种子的pH值为6.5～7.5。

一种使用固态发酵制备生物有机肥的方法制备的生物有机肥。

进一步的，生物有机肥中胶质芽孢杆菌M-1的活菌数含量为1.2×10⁹个/克以上。

本发明的有益效果：

采用固态发酵法，以牛粪为主要基质同时发酵生产胶质芽孢杆菌，实现有机肥的二次腐熟，同时减少了有机肥的氮损失、活化有机肥中的速效钾，本发明缓解了传统的胶质芽孢杆菌液体发酵，存在发酵液粘稠、活菌数和芽孢率偏低的问题，本发明最终形成生物有机肥，工艺简单、易于实施，实现生物有机肥的同步制备。该生物有机肥的使用可提高与保持土壤肥力、转化营养元素、减少化肥的使用并提高化肥利用率、促进作物生长、拮抗土传病害、净化环境与平衡生态***。不仅不会引起新的污染，还可治理和改善环境，产生长期良好的生态效应。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

实施例1：

解钾菌的分离

其分离过程，通常为以下步骤：

第一步，制备亚历山鲍罗夫培养基：其组分包括：Na₂HPO₄ 2g，FeCl₃0.005g，MgSO4·7H₂O 0.5g，CaCO₃ 0.1g，蔗糖3g，钾长石粉(用去离子水洗五次)1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，琼脂20g，121℃灭菌20min。

第二步，解钾菌的初筛：将富集接种到亚历山鲍罗夫培养基固体培养基上置于37℃恒温培养箱培养10天，观察培养基上有无透明环形成及其大小。用直尺测量水解圈和菌落直径，可以根据水解圈与菌落圈的直径比来判断该菌株解钾能力的相对大小。挑取水解圈最大的菌株，并命名为菌株M-1。

实施例2：

菌株M-1的16S rDNA序列分子鉴定

采用Chelex法提取菌株QF-101基因组DNA，使用16S rDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')、1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，对菌株QF-101基因组DNA的16S rDNA基因全长序列进行PCR扩增。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，目的条带切割后采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(SangonBiotech，Order NO.B518131)回收目的DNA片段。使用3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems)进行DNA片段的序列分析，测序试剂盒使用BigDyeTerminator v3.1(Applied Biosystems)。

双向测序结果使用SeqMan(DNASTAR Lasergene)进行拼接，得到接近全长的16SrRNA基因序列。使用EzBioCloud Identify service(https：//www.ezbiocloud.net/identify)和NCBI Nucleotide BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，将16S rRNA基因序列结果与GenBank数据库进行比对，选择有效命名的模式菌株作为参考。

菌株M-1经鉴定为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)。该菌株的形态特征是：在无氮固体培养基菌上，菌落***，呈现玻璃半球状，表面湿润有光泽，透明，胶质粘稠有弹性；菌体呈杆状，两端钝圆，大小为4～7μm×1～1.4μm；在含淀粉培养基中培养30h后在菌体中形成大量芽孢，芽孢中生或近端生，椭圆形，大小约为1.5～1.7μm×2.8～3.4μm。

实施例3：

菌株M-1解钾能力定性试验

培养菌株M-1的培养液，250mL的三角瓶装液量为50mL，培养48h，以121℃30min灭菌的发酵液为空白对照。称取12.5g钾长石粉，分别添加到培养液和灭活的培养液中，每个处理做3个平行，在37℃、160rpm培养，在第5天和第10天，采用四苯硼酸钾重量法测定可溶性钾的含量。

表1菌株M-1解钾能力定性试验

	5天的解钾量(mg/L)	10天的解钾量(mg/L)
			空白对照	2.381	4.912
菌株M-1	30.735	58.975

该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.19428，命名为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)M-1。该菌具有较强的解钾能力、促生能力，在培养液中的解钾量可以5d和10d分别达到30.735mg/L和58.975m g/L。

该菌株胶质芽孢杆菌M-1 16S rDNA序列

菌株胶质芽孢杆菌M-1 16S rDNA序列

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGACCGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGAGCACTTCGGTGCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTGTAAGATCGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAAGACCGGATAGCTGGTTTCGGTGCATGCCGGAATCATGAAACACGGGGCAACCTGTCGCTTACGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGCGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAATGTCGTGGAGAGTAACTGCTCTGCGAATGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGGTGTTTAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTTCGCACCGGAAACTGGAAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGACTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAACGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTAAACACAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCCCTCCTTCGGGACAGAGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGACTTTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAGAGTGACTGCCGGTGACAAACAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGTCGCGAGATGGAGCGAATCCTTAGAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATACCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGCCGGTGGGGTAACCCGTAAGGGAGCCAGCCGTCGAAGGTGGGGTAGATGAATGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC

实施例4：

菌株M-1发酵液的促生试验

菌株M-1发酵液的促生采用小麦水培法，以均匀大小的小麦种子作为试验对象，每个平皿均匀摆放25粒种子，设3个平行试验，4次重复，空白为清水对照；清水调整菌株M-1发酵液活菌数为10⁶，处理1为菌株M-1灭活；处理2为菌株M-1活菌发酵液。接种后，室内光照培养，每天10h光照，14h暗培养，随机排列。小麦定植生长40天后，将植株和麦粒用剪刀剪开，测定地上部分鲜重，并且从每个平皿中取出10株测定植株的高度。试验结果表明菌株M-1发酵液灭活后较对照地上鲜重增加4.21％，株高增加8.46％；含有活菌的发酵液较对照地上鲜重增加15.5％，株高增加18.58％，可以提高小麦的株高和地上鲜重，对小麦生长发育具有促进作用。

表2菌株M-1发酵液小麦水培地上部分的影响

表3菌株M-1发酵液小麦水培株高的影响

实施例5：

生物有机肥的固态发酵生产和普通有机肥发酵生产

一种固态发酵制备生物有机肥的方法，具体步骤如下：

(1)活化斜面种子：将胶质芽孢杆菌M-1在无菌条件下接种于营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子：

(2)培养液体种子：将斜面种子接种于液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；

(3)预处理基质：按重量份数选取：牛粪55份，蘑菇渣20份、木屑15份、糖蜜2份，物料基质混合粉碎后，调节水分60％左右，pH值为7.5，将混合后的物料放置在内置抛翻设备的密闭发酵器内，通过外部设备将物料加热到75℃，经过9h高温快速无害化、腐熟臭味消失，完成物料的预处理；

(4)固态发酵培养：将步骤(2)得到的液体种子按重量比的5％接种于步骤(3)预处理后的基质中，培养温度37℃，培养时间5d，得到发酵产物：将发酵产物经造粒后烘干至含水率≤15％，得到生物有机肥。

而普通有机肥发酵：取与上述步骤(3)相同质量分数的预处理后的固体基质，培养温度37℃，培养时间5d，得到发酵产物，将发酵产物经造粒后烘干至含水率≤15％，得到普通有机肥。

表4菌株M-1发酵液对堆肥发酵养分的影响

添加菌株M-1生产的生物有机肥比不加菌的普通有机肥，总氮提高32.9％，速效钾提高23.6％，说明菌株M-1在基质的固态发酵过程中具有保氮、解钾，提高有机肥的总养分的功能。

本发明最终得到的生物有机肥经检测有机质含量为61.5％，总养分9.22％，胶质芽孢杆菌M-1活菌数可达1.2×10⁹个/克以上，芽孢转化率达到83％，pH7.6，高于农业行业标准《生物有机肥(NY884-2012)》，同时也满足《农用微生物菌剂(GB 20287-2006)》的要求。本发明解决了传统的胶质芽孢杆菌液体发酵难，存在发酵液的要求粘稠、活菌数和芽孢率偏低的问题，同时实现了以牛粪为基质同时发酵生产胶质芽孢杆菌和有机肥的腐熟，最终形成生物有机肥，工艺简单、易于实施。

实施例6：

生物有机肥的应用试验

按本发明制备的胶质芽孢杆菌生物有机肥作为基肥，用于山东博兴县西红柿(品质为倍盈)田间种植试验，种植密度每亩960株。在施用30kg过磷酸钙基肥的基础上，试验安排如表5，习惯施肥CK1、普通牛粪有机肥CK2、生物有机肥Treat1、生物有机肥Treat2等四组，3个重复，小区面积0.05亩(48株)。种植期间追施15％复合肥1次；其他施肥时间、灌溉、打药等栽培措施相同。成熟后开始采摘，20天内采摘完毕。

表5生物有机肥在西红柿中的应用试验安排(Kg/亩)

表6生物有机肥对西红柿生长的影响

结果表明处理4生长势、品质、座果率和产量最好，但处理3与处理4差异不大，均优于习惯施肥CK1和普通有机肥CK2，从投入产出的角度处理3最佳。施用生物有机肥的土壤疏松性，植物发病率低。

当然，上述说明也并不仅限于上述举例，本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述；以上实施例仅用于说明本发明的技术方案并非是对本发明的限制，参照优选的实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换都不脱离本发明的宗旨，也应属于本发明的权利要求保护范围。

Claims (7)

1.一种具有解钾功能和促生能力的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)M-1，保藏编号为：CGMCC No.19428。

2.根据权利要求1所述的胶质芽孢杆菌M-1在生物肥料中应用。

3.一种使用权利要求1所述的胶质芽孢杆菌M-1固态发酵制备生物有机肥的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)活化斜面种子：将胶质芽孢杆菌M-1无菌接种于营养琼脂斜面培养基上，温度37±2℃下培养36～48h，得到斜面种子；

(2)培养液体种子：将步骤(1)得到的斜面种子接种于液体培养基中，温度37±1℃下培养36～48h，得到液体种子；

(3)预处理基质：粉碎物料基质并调节水分55％～60％，将混合后的物料置于发酵器内并升温至75℃±3℃，经过8-10h高温快速无害化、腐熟，至臭味消失；

(4)固态发酵培养：将步骤(2)得到的液体种子按重量份的5～10份接种于步骤(3)预处理后的基质中，温度37±2℃下培养5-7d，得到发酵产物，烘干发酵产物至含水率≤15％，得到最终生物有机肥。

4.根据权利要求3所述的固态发酵制备生物有机肥的方法，其特征在于：物料基质包括以下重量份的组分：牛粪50～60份，蘑菇渣20～30份、木屑10～20份和糖蜜2～4份。

5.根据权利要求3所述的固态发酵制备生物有机肥的方法，其特征在于：步骤(4)中接种的M-1液体种子的pH值为6.5～7.5。

6.一种使用权利要求3-5任一项所述的固态发酵制备生物有机肥的方法制备的生物有机肥。

7.根据权利要求6所述的生物有机肥，其特征在于：生物有机肥中胶质芽孢杆菌M-1的活菌数含量在1.2×10⁹个/克以上。