CN115119899A - 一种混菌发酵微生物制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种混菌发酵微生物制剂及其制备方法。制备方法为:将麸皮、豆粕和玉米粉分别粉碎过筛,然后与蒸馏水混合,调节pH为6.7‑7.0,灭菌后得到固体培养基;将黄芪和甘草分别粉碎后混合得到混合物,然后进行超声细胞破碎,将得到的滤液进行浓缩,得到植物提取物;向固体培养基中添加植物提取物,混合均匀后,接种混菌发酵液进行发酵,得到的发酵物;将发酵物干燥直至含水量为8‑12wt%,得到混菌发酵微生物制剂。本发明制备混菌发酵微生物制剂通过双协同作用:黄芪和甘草的协同提取,混菌与黄芪‑甘草提取物之间的协同作用,既能促进肠道微生态平衡、改善动物体消化***;又能提高动物体免疫以及抗应激的能力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物制剂技术领域,具体涉及一种混菌发酵微生物制剂及其制备方法。
背景技术
随着饲料中抗生素的禁用,动物的发病率和饲料转化效率问题也随之显现,如何提升动物自身免疫功能,保障养殖动物的健康与防控畜禽常见多发性疾病,成为了养殖行业从滥用药物添加剂到无抗健康养殖顺利转变的前提条件。中草药在我国养殖业上具有悠久的历史和广泛的应用,尤其是在食品卫生安全被高度重视的今天,中草药代替抗生素作为饲料添加剂得到了普遍的认可。同时,中草药以其所具有的无毒、无副作用、无残留、促生长及增强免疫等特点受到国内外科研工作者的广泛关注,所以含有中药的饲料添加剂以及含有中药的微生物制剂逐步被用于畜禽养殖中,以提高禽畜的免疫力等。
黄芪是畜牧生产中常用的一味中草药,性温、味甘,具有增强机体免疫力、抗脂质过氧化损伤、抗炎保肝、抗病毒、抗疲劳、抗肿瘤等多种生物学功效。甘草中含有多糖、黄酮类物质、甘草甙元、异甘草甙元,对消化***,如抗溃疡、胃酸分泌、保肝等均有效果。目前对益生菌发酵黄芪、黄芪药渣及黄芪提取物的研究较多,但大多集中在单一菌种或同类菌种发酵,且发酵一般是为了提高黄芪多糖的收率,限制了黄芪在畜禽生产上的应用。但黄芪中还含有黄酮类、苷类、生物碱等多种物质,可用于提高禽畜的抗病毒等能力。因此需要不含抗生素等促生长药物且无毒副作用的微生物制剂,能将上述功能结合在一起,既能改善禽畜的消化***,又能提高禽畜的免疫力和抗应激能力。
发明内容
针对上述现有技术,本发明的目的是提供一种混菌发酵微生物制剂及其制备方法。本发明制备的微生物制剂通过黄芪和甘草的混合提取,两者协同提取,得到性能更高的多糖、皂苷黄酮及微量元素等有效活性成分;黄芪-甘草提取物又能与混菌协同作用。通过上述双协同作用,既能促进肠道微生态平衡、改善动物体消化***,又能提高动物体免疫以及抗应激的能力。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面,提供一种混菌发酵微生物制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)将麸皮、豆粕和玉米粉分别粉碎过筛,所述麸皮、豆粕和玉米粉的质量比为1:1:1,然后与蒸馏水混合,调节pH为6.7~7.0,灭菌后得到固体培养基,所述固体培养基的含水量占固体培养基总质量的40~50%;
(2)将黄芪和甘草分别粉碎后按照(1~3):1的质量比混合得到混合物,然后进行超声细胞破碎,将得到的滤液进行浓缩,得到植物提取物;所述超声细胞破碎为:混合物与蒸馏水按照1:8的料液比混合,进行超声细胞破碎1h,过滤后,滤渣再按照1:6的料液比与蒸馏水混合,进行超声细胞破碎40min,过滤,合并滤液;
(3)向步骤(1)得到的固体培养基中添加步骤(2)得到的植物提取物,混合均匀后,接种混菌发酵液进行发酵,所述混菌发酵液由植物乳杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液按1:1的质量比混合得到,发酵完成得到的发酵物;所述固体培养基与植物提取物的质量比为(10~20):1;所述固体培养基和混菌发酵液的质量比为2:1;所述植物乳杆菌发酵液是由植物乳杆菌通过MRS培养基37℃静置培养24h得到;所述植物乳杆菌发酵液中植物乳杆菌的含量≥1.0×109cfu/g;所述枯草芽孢杆菌发酵液是由枯草芽孢杆菌通过LB培养基37℃150-180r/min震荡培养24h得到;所枯草芽孢杆菌发酵液中枯草芽孢杆菌的含量≥1.0×109cfu/g;
(4)将发酵物干燥直至含水量为8-12wt%,得到混菌发酵微生物制剂。
优选地,步骤(2)中,滤液浓缩至:50℃下测得,相对密度为1.15~1.25。
优选地,步骤(3)中,所述发酵的温度为37-39℃,发酵的时间为5d。
优选地,步骤(3)中,所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的保藏号为CICC21809;所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的保藏号为CICC24713。
优选的,步骤(4)中,所述干燥的温度为40~60℃。
本发明的第二方面,提供上述制备方法得到的混菌发酵微生物制剂。
本发明的第三方面,提供混菌发酵微生物制剂在如下1)~3)至少一项中的应用:
1)提高鸡消化能力和胃肠道健康;
2)提高鸡的免疫力;
3)提高鸡的抗应激能力。
本发明的混菌发酵微生物制剂用量为饲料质量的0.5%~2.0%。
本发明的有益效果:
(1)本发明通过向固体培养基中添加黄芪-甘草提取物,利用植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌发酵黄芪-甘草提取物,制备得到的微生物制剂添加到饲料中,混菌与黄芪-甘草提取物之间协同作用,能够提高动物的生长性能和机体消化率,增强免疫功能和抗应激能力。
(2)本发明利用混菌发酵甘草和黄芪,使发酵物中富含多糖、皂苷、黄酮类物质及微量元素等活性成分含量,还可以改善黄芪的味道,增加适口性,降低毒性。
(3)本发明制备的混菌发酵微生物制剂以成本极低的麦麸、豆粕和玉米粉为固体发酵基,采用混菌对黄芪-甘草提取物进行发酵,比单独发酵黄芪或甘草相比,具有协同增效作用,能够提高混菌发酵微生物制剂的在促消化、提高禽畜免疫力和抗应激能力等方面的作用。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的,在提高多糖产率上一般以单一菌种对黄芪进行发酵,限制了黄芪的使用。基于此,本发明的目的是提供一种混菌发酵微生物制剂及其制备方法。本发明通过研究发现,采用混菌同时发酵黄芪-甘草提取物得到的微生物制剂,比采用混菌发酵黄芪或甘草、亦或者是混菌同时发酵黄芪提取物和甘草提取物得到的微生物制剂效果都高。黄芪和甘草的协同提取可能源自于同时提取黄芪和甘草时,两者能够协同作用得到效果更好的复合多糖或者复合皂苷等复合物。混菌与黄芪-甘草提取物之间也产生协同作用:一方面黄芪和甘草中的多糖成分对肠道内菌群活性具有选择性的刺激作用,另一方面肠道菌群对黄芪和甘草在机体内的代谢及生物转化过程发挥着重要作用,大大提高了禽畜的免疫力和抗应激能力等能力。所以本发明的混菌发酵微生物制剂可以通过双协同作用促进肠道微生态平衡、改善动物体消化***,提高动物体免疫以及抗应激的能力。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料,均可通过商业渠道购买得到。
说明:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CICC21809。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CICC24713。
实施例1
(1)将麸皮、豆粕和玉米粉分别粉碎过45目筛,按照1:1:1的质量比混合,然后与水混合至含水量为45wt%,调节pH为6.8。121℃下灭菌20min得到固体培养基。
(2)将黄芪和甘草分别粉碎至20目后,按照2:1的质量比混合均匀,得到混合物。混合物与蒸馏水按照1:8的料液比混合,进行超声细胞破碎1h,过滤后,滤渣再按照1:6的料液比与蒸馏水混合,进行超声细胞破碎40min,过滤,合并滤液;滤液浓缩至相对密度为1.20(50℃下测得),得到植物提取物。
(3)植物乳杆菌通过MRS培养基37℃静置培养24h得到植物乳杆菌发酵液;枯草芽孢杆菌通过LB培养基37℃165r/min震荡培养24h得到枯草芽孢杆菌发酵液。植物乳杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液按1:1的质量比混合得到混菌发酵液。
向固体培养基中按照15:1的质量比添加植物提取物。再按照2:1的质量比向固体培养基中加入混菌发酵液,38℃培养5d,得到发酵物。
(4)将发酵物于50℃下干燥直至水分含量在10wt%,得到混菌发酵微生态制剂。
实施例2
(1)将麸皮、豆粕和玉米粉分别粉碎过40目筛,按照1:1:1的质量比混合,然后与水混合至含水量为50wt%,调节pH为7.0,105℃下灭菌30 min得到固体培养基。
(2)将黄芪和甘草分别粉碎至20目后,按照3:1的质量比混合均匀,得到混合物。混合物与蒸馏水按照1:8的料液比混合,进行超声细胞破碎1h,过滤后,滤渣再按照1:6的料液比与蒸馏水混合,进行超声细胞破碎40min,过滤,合并滤液;滤液浓缩至相对密度为1.15(50℃下测得),得到植物提取物。
(3)植物乳杆菌通过MRS培养基37℃静置培养24h得到植物乳杆菌发酵液;枯草芽孢杆菌通过LB培养基37℃180r/min震荡培养24h得到枯草芽孢杆菌发酵液。植物乳杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液按1:1的质量比混合得到混菌发酵液。
向固体培养基中按照10:1的质量比添加植物提取物。再按照2:1的质量比向固体培养基中加入混菌发酵液,39℃培养5d,得到发酵物。
(4)将发酵物于40℃下干燥直至水分含量在12wt%,得到混菌发酵微生态制剂。
实施例3
(1)将麸皮、豆粕和玉米粉分别粉碎过50目筛,按照1:1:1的质量比混合,然后与水混合至含水量为40wt%,调节pH为6.7,113℃下灭菌25min得到固体培养基。
(2)将黄芪和甘草分别粉碎至20目后,按照1:1的质量比混合均匀,得到混合物。混合物与蒸馏水按照1:8的料液比混合,进行超声细胞破碎1h,过滤后,滤渣再按照1:6的料液比与蒸馏水混合,进行超声细胞破碎40min,过滤,合并滤液;滤液浓缩至相对密度为1.25(50℃下测得),得到植物提取物。
(3)植物乳杆菌通过MRS培养基37℃静置培养24h得到植物乳杆菌发酵液;枯草芽孢杆菌通过LB培养基37℃150r/min震荡培养24h得到枯草芽孢杆菌发酵液。植物乳杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液按1:1的质量比混合得到混菌发酵液。
向固体培养基中按照20:1的质量比添加植物提取物。再按照2:1的质量比想固体培养基中加入混菌发酵液,37℃培养5d,得到发酵物。
(4)将发酵物于60℃下干燥直至水分含量在8wt%,得到混菌发酵微生态制剂。
对比例1
与实施例1的区别在于:省略步骤(2),不添植物提取物,得到混菌发酵微生态制剂。
对比例2
与实施例1的区别在于:不添加混菌发酵液进行发酵,直接得到植物提取物。
对比例3
与实施例1的区别在于:步骤(2)中,将黄芪粉碎至20目后,与蒸馏水按照1:8的料液比混合,进行超声细胞破碎1h,过滤后,滤渣再按照1:6的料液比与蒸馏水混合,进行超声细胞破碎40min,过滤,合并滤液;滤液浓缩至相对密度为1.20(50℃下测得),得到黄芪提取物。
将甘草粉碎至20目后,与蒸馏水按照1:8的料液比混合,进行超声细胞破碎1h,过滤后,滤渣再按照1:6的料液比与蒸馏水混合,进行超声细胞破碎40min,过滤,合并滤液;滤液浓缩至相对密度为1.20(50℃下测得),得到甘草提取物。
将黄芪提取物和甘草提取物按照2:1的质量比混合,得到植物提取物。
最终制备得到混菌发酵微生态制剂。
试验例1:免疫力试验
选用清洁级4周龄(平均体重20±2g)雄性昆明小鼠84只,随机分为7组,对照组饲喂基础饲粮(基础饲粮为SPF大小鼠生长繁殖饲料,购自北京科澳协力饲料有限公司),实施例1~3组和对比例1~3组分别在基础饲粮的基础上添加2%实施例1~3和对比例1~3制备的混菌发酵微生物制剂。小鼠预饲期3d,使试验动物适应环境和日粮,正式期24d。试验开始后每隔6d对小鼠称重,统计小鼠的平均日增重。实验结束后小鼠眼眶采血,然后脱颈处死小鼠,解剖取出胸腺、脾脏、肝脏和肾脏,分别称湿重,计算器官指数。血清免疫球蛋白及细胞因子采用小鼠ELISA试剂盒检测。所得结果见表1~3。
表1 平均日增重
表2 器官指数
表3 免疫球蛋白和免疫细胞
由表1~3数据可知,与对照组相比,实施例1~3的体重增加量、器官指数、免疫球蛋白的含量等都高于对比例1和2的增加量之和。说明混菌与植物提取物之间能够产生协同作用提高小鼠的免疫力。而实施例1~3组的免疫能力也显著高于对比例3组,说明黄芪和甘草一起提取效果要好于单独提取黄芪、甘草后混用的效果,即黄芪、甘草混合提起可以起协同提取的作用。
试验例2:抗应激试验
参照申请号CN201911057806.3一种抗应激防猝死的复方发酵中药添加剂及其制备方法和应用中试验例2公开的鸡转群抗应激试验进行设置。
鸡转群时,由于生长环境变化,容易发生呼吸加快、体温升高、采食量降低、饮水量增加等现象,严重的,可能会内脏出血变性而致死。
试验设计:选择30日龄、体重相近的肉鸡3500羽,随机分成7组。按照管理要求在同等条件下进行转群。在转群前三天开始均按基础日粮重量的1%饲喂实施例1~3组和对比例1~3组制备的微生物制剂,空白对照在转群前三天开始饲喂基础日粮(见表4),共饲喂7天。
测定指标:存活数量、死淘数量、存活率,所得结果见表5。
表4 基础日粮组成
注:基础日粮中,代谢能的含量为12.63 MJ/kg,粗蛋白质含量为19.47wt%,钙含量为0.93 wt%,有效磷含量为0.35 wt%,赖氨酸含量为1.07 wt%,蛋氨酸含量为0.38 wt%。
表5 肉鸡转群后死亡率统计
由表5可知,实施例1~2组的存活率均达到100%;与对比照组相比,对比例1组制备的混菌发酵黄芪微生态制剂使存活率提高了1.8%,对比例2组制备的混菌发酵甘草微生态制剂使存活率提高了4.2%。由此可见,植物提取物与混菌之间产生协同作用,提高禽畜的抗应激性。而对比例3组的存活率也低于实施例1~3组,由此可见,本发明通过将黄芪和甘草一起进行提取,黄芪和甘草可以协同作用,提高禽畜的抗应激性。
试验例3:促消化试验
选用体重基本一致的健康21日龄爱拔益加(AA)混合雏鸡84只,随机分为7个处理,每个处理6个重复,每个重复2只鸡。对照组饲喂基础饲粮(见表4),试验组在对照组的基础上分别添加1.0%的实施例1~3组和对比例1~3组制备的微生物制剂。另设内源空白对照组,预饲期饲喂对照组日粮,正式期禁食24 h,收集48 h内源***物,用于计算真实代谢率。采用集粪瓶全收粪尿法,预试期7 d,正试期3 d,正试期每天喂料量约为预试期采食量的平均值*0.8(保证不剩料),每天准确记录采食量,及时更换集粪瓶。
代谢试验结束后,分别将3 d所收集的***物充分混合均匀,置于烘箱中65℃烘至恒重,在室温条件下回潮24 h,粉碎制成风干样,用于测定粪便中的干物质(DM)、粗脂肪(EE)、粗灰分(CA)、粗蛋白(CP)和总能(GE),测定方法依照AOAC(1990)进行,所得结果见表6。
表6 肉鸡养分真实利用率
表6为营养物质转化率的情况,通过检测粪便中的营养物质,可以看出动物机体消化吸收的营养物质的情况,继而可以判断出动物的消化状况。由表5可以看出,与对照组和对比例1~3组相比,实施例1~3组的消化情况良好,肉鸡的EE、CP和GE的真实利用率显著提高,CA的真实利用率降低,有机物利用率提高。由此可知,本发明通过将黄芪和甘草一起进行协同提取,利用黄芪-甘草和益生菌的协同增效作用,提高禽畜对营养物质的消化利用效率。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种混菌发酵微生物制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将麸皮、豆粕和玉米粉分别粉碎过筛,所述麸皮、豆粕和玉米粉的质量比为1:1:1,然后与蒸馏水混合,调节pH为6.7~7.0,灭菌后得到固体培养基,所述固体培养基的含水量占固体培养基总质量的40~50%;
(2)将黄芪和甘草分别粉碎后按照(1~3):1的质量比混合得到混合物,然后进行超声细胞破碎,将得到的滤液进行浓缩,得到植物提取物;所述超声细胞破碎为:混合物与蒸馏水按照1:8的料液比混合,进行超声细胞破碎1h,过滤后,滤渣再按照1:6的料液比与蒸馏水混合,进行超声细胞破碎40min,过滤,合并滤液;
(3)向步骤(1)得到的固体培养基中添加步骤(2)得到的植物提取物,混合均匀后,接种混菌发酵液进行发酵,所述混菌发酵液由植物乳杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液按1:1的质量比混合得到,发酵完成得到的发酵物;所述固体培养基与植物提取物的质量比为(10~20):1;所述固体培养基和混菌发酵液的质量比为2:1;所述植物乳杆菌发酵液是由植物乳杆菌通过MRS培养基37℃静置培养24h得到;所述植物乳杆菌发酵液中植物乳杆菌的含量≥1.0×109cfu/g;所述枯草芽孢杆菌发酵液是由枯草芽孢杆菌通过LB培养基37℃150-180r/min震荡培养24h得到;所枯草芽孢杆菌发酵液中枯草芽孢杆菌的含量≥1.0×109cfu/g;
(4)将发酵物干燥直至含水量为8-12wt%,得到混菌发酵微生物制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,滤液浓缩至:50℃下测得,相对密度为1.15~1.25。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述发酵的温度为37-39℃,发酵的时间为5d。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的保藏号为CICC21809;所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的保藏号为CICC24713。
5.由权利要求1~4任一项所述的制备方法得到的混菌发酵微生物制剂。
6.权利要求5所述的混菌发酵微生物制剂在如下1)~3)至少一项中的应用:
1)提高鸡的消化能力和胃肠道健康;
2)提高鸡的免疫力;
3)提高鸡的抗应激能力。
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220930 |
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