CN115044504B - 一株粪肠球菌yz-1及其益生性应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，涉及一种益生菌，特别是指一株粪肠球菌YZ‑1及其益生性应用。该菌株从健康青年人肠道粪便样本中分离得到，其保藏编号为CCTCC M 2022312，分类名为Enterococcus faecalisYZ‑1，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年3月25日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。上述粪肠球菌YZ‑1分离株生长条件不严苛，抗逆性优良，能在高酸、高胆盐环境下生存，无毒、无害、安全性较好；同时该菌株可有效抑制常见肠道致病菌的繁殖，并具有降低胆固醇、清除自由基、抗癌和抗炎等能力，而且具有治疗肝脏炎症和纤维化及糖尿病的潜力，是一株具有开发价值的益生菌菌株。

Description

一株粪肠球菌YZ-1及其益生性应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种益生菌，特别是指一株粪肠球菌YZ-1及其益生性应用。

背景技术

健康的人体内存在大量有益的菌群，这些菌群相互制约，共同维持体内的微生态平衡。而抗生素的滥用会杀死体内正常的有益细菌，改变微生物区系组成，引起菌群失调，增加感染的机会，甚至导致更严重的后果。抗生素的使用会影响宿主肠道内微生物所调节的代谢物的活性，而微生物产生的代谢物可以保护肠道上皮细胞的完整性并且维持肠道的免疫应答。抗生素使用后微生物种群多样性和群落结构的改变会导致其易于受到病原菌侵袭，从而引起艰难梭菌等致病菌感染，进一步引发腹泻或严重结肠炎，抗生素的滥用已成为引起肠道菌群失调的重要原因。鼠李糖乳杆菌能通过调节肠道微生物的多样性和群落构成，抑制致病微生物生长，从而改善菌群结构并促进宿主健康。在改善人类肠道菌群失调有关的研究中，促使人们越发重视抗生素的替代品或替代方法，如益生菌、益生元和合生元等。因此，探索与研究改善肠道菌群失衡的方法具有宝贵的经济价值。

随着生活水平和消费水平的提高，人们的健康饮食观念在不断增强。为了增强自身免疫力，益生菌等产品也得到了更多的认可。世界卫生组织对于益生菌的定义是：益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖***内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥对肠道有益作用的活性有益微生物的总称；益生菌制剂通常是由一种乳酸菌或多种乳酸菌复配组成的活菌制剂，被摄入后可以起到调节肠道菌群、促进肠道健康、增强免疫力和抑制腹泻等多种功效。

粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，是人和动物肠道内主要菌群之一，作为一种益生菌，其在生物医学中得到了广泛应用。动物实验表明粪肠球菌制备成微生物制剂可改善肠道内微生态平衡，防治动物肠道菌丛区系紊乱；粪肠球菌也能增强巨嗜细胞的活性，促进动物的免疫反应，提高抗体水平；粪肠球菌在动物肠道内可形成生物薄膜附着于动物肠道粘膜上，形成乳酸菌屏障，抵御外来病菌病毒及霉菌毒素等的侵袭；粪肠球菌还能够产生多种抗菌物质，抑制动物体内常见的致病菌。

但是近年来的研究表明部分粪肠球菌中具有毒力基因，且由于抗生素的长期和大量不规范的使用，出现了许多耐药的粪肠球菌；因此，部分粪肠球菌菌株可能导致严重的感染。目前，具有益生性功能且能够运用于人类临床治疗的粪肠球菌较少，需要更多的菌株分离和功能验证实验。人源益生菌对人体更具有亲和性，不易被人体免疫***所排斥，有利于其在肠道定殖，发挥益生功能。而为了保证益生菌能够在肠道内定殖，并发挥益生功能，该益生菌需要有良好的胃肠液耐受能力，才能保证其在胃肠道仍具有一定的活菌数，为了寻找能在人体内充分发挥粪肠球菌的功能的菌株，本课题组进行了大量的菌株筛选实验。

发明内容

为实现上述目的，本发明公布了一株粪肠球菌YZ-1及其益生性应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

本申请通过从人体粪便中进行菌株的分离培养和筛选，检测其人体胃肠液适应性、抗生素耐药性、人体益生性等，通过一系列体内和体外实验，发现一株能够降低胆固醇、清除自由基、抗癌和抗炎，而且具有治疗肝脏炎症和纤维化及糖尿病的潜力的益生菌菌株粪肠球菌YZ-1。

一株粪肠球菌（Enterococcus faecalis）YZ-1，其保藏编号为CCTCC M 2022312，分类名为Enterococcus faecalisYZ-1，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年3月25日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

该菌的生化特性鉴定结果。具体的，发明人发现该菌对诺氟沙星、万古霉素和大环内酯类抗生素呈中等敏感，对常用抗生素(青霉素类、头孢菌素类、四环素类、美罗培南等)敏感；该粪肠球菌能够抵抗胃液的酸性环境(例如pH2.5～4.5的人工胃液环境下，该菌株存活状况良好)；该粪肠球菌还能够抵抗肠道中的胆汁盐环境(例如在0.03～0.3％的胆汁盐浓度下，该菌存活状态良好)。

需要说明的是，本申请所述的“抗生素敏感”是指菌株对该抗生素的抵抗力弱，在微量的施药条件下，即可影响该菌株的正常生长。根据本发明的实施例，所述粪肠球菌对青霉素类、头孢菌素类、大环内脂类、四环素类、碳青霉烯类以及氯霉素抗生素敏感。

根据本发明的实施例，所述头孢菌素类包括选自头孢哌酮、头孢唑啉、头孢呋辛钠的至少之一；所述喹诺酮类为诺氟沙星；所述大环内脂类包括选自红霉素、克拉霉素、阿奇霉素的至少之一；所述β-内酰胺类为氨曲南；所述四环素类为四环素；所述糖肽类为万古霉素；所述碳青霉烯类为美洛培南。

另外关于本发明的粪肠球菌的安全性高。具体表现在以下方面：没有溶血性；耐药基因的转移水平低；不影响动物如小鼠的正常存活及体重增长。

粪肠球菌YZ-1对肠道致病菌的抑制作用，所述肠道致病菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和白色念珠菌(Candida albicans)。

进一步，本申请的粪肠球菌YZ-1的液态培养物在应用于制备抗炎的医药品的用途。该液态培养物实质上是菌株的次级代谢产物；该医药品呈供口服投药的剂型或呈供局部投药的剂型。

上述粪肠球菌YZ-1在制备降低胆固醇的药品中的应用。

上述的粪肠球菌YZ-1在制备降低血糖的药品中的应用。

上述的粪肠球菌YZ-1在制备降低肝脏炎症和/或纤维化相关的炎性因子的药品中的应用。

上述的粪肠球菌YZ-1在制备高效清除自由基的药物中的应用。

上述的粪肠球菌YZ-1在制备抗人乳腺癌细胞MDA-MB-231的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本申请新发现了一株人源、耐强酸的粪肠球菌YZ-1，该菌株在pH 2.5条件下，本发明粪肠球菌在酸性条件下处理3h活菌数几乎不变，市售粪肠球菌活菌数在酸性条件下处理3h后，活菌数较初始活菌数下降了约8倍，这将为相关疾病的治疗提供一种新的选择。

2、本发明粪肠球菌相比较市售粪肠球菌活菌数高，本发明粪肠球菌具有较高的耐胆盐特性，其的胆固醇清除率高达65.36±0.25%，即培养基中653.6μg/mL胆固醇被降解。粪肠球菌YZ-1的上清液、菌悬液和裂解液对DPPH自由基的清除率分别为82.19%～94.37%、86.72%～95.38%、56.73%～58.32%，在最高浓度(2×10⁸CFU/mL)下，YZ-1菌悬液对DPPH的清除率高达95.38%。

3、粪肠球菌YZ-1不同菌体浓度的上清液或其裂解液或其灭活菌体对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用。随着菌浓度不断增加，YZ-1各组分对癌细胞的抑制率逐渐增大，6×10⁷CFU/mL的灭活菌体对人乳腺癌细胞MDA-MB-231抑制率高达82.32±0.25%。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为粪肠球菌YZ-1在pH2.5-4.5表现稳定的结果图。

图2为粪肠球菌YZ-1在胆盐浓度为0.03%-0.3%的人工肠液表现稳定的结果图。

图3为人类PBMCs细胞被不同处理的培养滤液后所测得的IL-10浓度（pg/mL），其中正常对照组表示未经任何处理的细胞；正对照组表示被处理以200ng/mL的植物血球凝集素(phytohemagglutinin ,PHA)的细胞；实验组表示被处理以30g/L的粪肠球菌YZ-1的培养滤液的细胞。

图4为人类PBMCs细胞被不同处理的培养滤液后所测得的TGF-β浓度（pg/mL），其中正常对照组表示未经任何处理的细胞；实验组表示被处理以30g/L的粪肠球菌YZ-1的培养滤液的细胞。

图5为实验所用胆固醇的标准曲线图。

图6为粪肠球菌YZ-1对高脂模型大鼠空腹血糖的影响。

图7为粪肠球菌YZ-1对高脂模型大鼠空腹血清胰岛素的影响。

图8为粪肠球菌YZ-1对高脂模型大鼠的血清白介素1-β（IL-1β）的影响。

图9为粪肠球菌YZ-1对高脂模型大鼠的血清单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1)的影响。

图10为不同浓度粪肠球菌YZ-1对人正常肝细胞LO₂抑制率变化图。

图11为不同浓度粪肠球菌YZ-1对人乳腺癌细胞MDA-MB-231抑制率变化图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

粪肠球菌的分离纯化和鉴定

（1）样本的采集与处理

将采集到的健康青年人的新鲜粪便挑取5-10g，装入EP管中并转移至4℃的冷藏箱中待用。在无菌操作台中将厌氧保存的粪便样1g，转移至装有9mL的无菌生理盐水中并至均匀，依次进行10倍的梯度稀释至1×10^-6，用移液枪吸取1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6共3个梯度的稀释液各100μL于MRS琼脂培养基中，每个稀释度3个平板。

MRS琼脂培养基

蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，吐温-80，1mL/L，磷酸氢二钾2g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂粉20g/L，加超纯水至1L，调pH到6.0-6.4。121℃，高压蒸汽灭菌20min。

（2）菌株分离与纯化

取100μL上述梯度稀释过的混悬液用涂布棒快速均匀涂布到MRS琼脂培养基中，用封口膜封口，放入厌氧罐中，厌氧罐中放入一包产气厌氧袋，保证无氧环境。37℃培养24h。

挑取上述琼脂培养基上的典型菌落，接种到装有5mL的MRS液体培养基的厌氧管中，37℃培养24h。固体和液体MRS培养基反复接种5次。

MRS液体培养基

蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，吐温-80 1mL/L，磷酸氢二钾2g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，加超纯水至1L，调pH到6.0-6.4。121℃，高压蒸汽灭菌20min。

对最后一次培养的菌液进行保种，分别取300μL的甘油（50%，v/v）和700μL的菌液，装入保种管，编号，放入-80℃冻存，以备后续实验使用。

（3）菌株YZ-1的鉴定

PCR扩增16S rRNA 基因

扩增模板的获得。另取1mL的上述最后一次培养得到的菌株的菌液于1.5mL的EP管中，10000 g转速离心1min，弃去培养基，加入1mL的灭菌超纯水，重悬，再次10000 g转速离心1min，弃去上清液，重复3遍，最后加入0.2mmol/L的溶菌酶1mL，重悬，在振荡器上振荡20min，得到用于PCR扩增的模板。

PCR体系为50μL，其中Mix为25μL，模板为1μL，引物27F为1μL（10 μM），引物1492R为1μL（10 μM），ddH₂O为22μL。

所用引物为27F（5’-agagtttgatcctggctca-3’），SEQ ID NO：2和1492R（5’-ggttaccttgttacgactt-3’），SEQ ID NO：3。扩增片段长度约1500bp。

PCR条件，DNA双链在95℃，5min的条件下预变性；95℃，30s变性；55℃，30s，退火；72℃，70s，延伸，并循环27次，最后72℃下保持10min。

琼脂糖凝胶电泳

称取0.8g琼脂糖溶于80mL的1*TAE溶液中，微波炉加热2min溶解后，加入8μL核酸染料；注胶凝固后，每个点样孔加样3-5μL；于220V电压下运行10min；胶板在UV下观察图像，挑选条带清晰的PCR产物送北京擎科生物科技有限公司进行测序。

基因序列分析鉴定

经北京擎科生物科技有限公司测序，得到菌株YZ-1的16S rRNA基因序列如SEQ IDNO.1所示，并采用BLAST分析工具(blast.ncbi.nlm.nih.gov)与GenBank/EMBL/DDBJ数据库比对，经分析鉴定，菌株YZ-1为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）。

菌落和菌体形态

菌落呈淡黄色，圆形，边缘整齐，稍***。菌形检查结果为革兰氏阳性，卵圆形球菌，大多数成双或短链状排列。

该菌生理生化反应特性

生化鉴定出现葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、松三糖和山梨醇的阳性反应，***胶糖、蜜二糖、接触媒的阴性反应。

实施例2

菌株耐酸耐胆盐研究

待检菌株的培养

MRS液体培养基用于粪肠球菌分离菌株YZ-1及市售粪肠球菌菌株的培养。按配方准确称取，加蒸馏水并搅拌混匀，调节pH为6.2，121℃灭菌20min。取2%接种量将粪肠球菌接种到灭菌的MRS液体培养基中，37℃进行厌氧培养。

人工胃液和肠液制备方法

人工胃液：取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000mL，即得。

人工肠液，即磷酸盐缓冲液(含胰酶，pH6.8)：取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8；另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两溶液混合后，加水稀释至1000mL，即得。

具体实验过程如下所述：

胃肠存活实验

在人工胃液和人工肠液中，考察pH、胆汁盐浓度和处理时间对粪肠球菌的存活率影响。考虑到胃液在平常状态处于约pH值为2.5的状态，本研究同时检测了市售粪肠球菌在pH值为2.5的状态下的存活情况；考虑到胆汁在平常状态处于约0.2%的状态，本研究同时检测了市售粪肠球菌在极端胆汁浓度为约0.3%的状态下的存活情况。实验结果如下：

表1：耐酸性实验结果

备注：本发明粪肠球菌：EF；市售粪肠球菌：MEF。

如表1及图1所示，粪肠球菌表现出良好的模拟胃液耐受性。3h内本发明粪肠球菌在pH2.5-4.5都表现出稳定的活性。在pH 2.5条件下，本发明粪肠球菌在酸性条件下处理3h活菌数几乎不变，市售粪肠球菌活菌数在酸性条件下处理3h后，活菌数较初始活菌数下降了约8倍。由此证明，本发明粪肠球菌相比较市售粪肠球菌活菌数高，本发明粪肠球菌具有较高的耐酸性。

表2耐胆盐性实验结果

备注：本发明粪肠球菌：EF；市售粪肠球菌：MEF。

如表2及图2结果显示，胆盐浓度为0.03%和0.1%的人工肠液中，对粪肠球菌的存活率影响不大；当胆盐浓度提高到0.2%时，菌体存活率随着处理时间的推移缓慢降低；当胆盐浓度为0.3%时，1h后粪肠球菌仍有约50%以上的存活率。这些结果均表明粪肠球菌具备良好的耐胆盐特性。而市售粪肠球菌活菌数在0.3%胆盐条件下处理3h后，活菌数较初始活菌数下降趋势明显高于本发明粪肠球菌。由此证明，本发明粪肠球菌相比较市售粪肠球菌活菌数高，本发明粪肠球菌具有较高的耐胆盐特性。

实施例3

粪肠球菌菌株安全性研究

耐药性分析

采用药敏纸片扩散法进行。将新鲜培养的粪肠球菌，以生理盐水稀释到10⁷CFU/mL，均匀涂布于MRS琼脂培养基上，室温放置3-5min后放置药敏纸片，纸片圆心间距不少于24mm，纸片边缘距离琼脂边缘不少于15mm。倒置培养于37℃培养箱，24h测量抑菌环直径。通过纸片扩散法测定粪肠球菌株及其第30代菌株耐药性，结果如下表3所示。

表3粪肠球菌耐药性结果

注：R＝耐药；I＝中介；S＝敏感；-：无抑菌圈；

表4粪肠球菌传代30代株耐药性结果

注：R＝耐药；I＝中介；S＝敏感；-：无抑菌圈；

由上述耐药性结果可见，粪肠球菌和粪肠球菌-3对大部分常见的几乎全部的抗生素均表现出敏感性及中度敏感性。粪肠球菌和粪肠球菌-30的耐药性结果一致，表明传代过程对粪肠球菌的耐药性未造成影响。由此证明，本发明粪肠球菌抗生素转移风险低，菌株安全性高。

毒力因子分析

对粪肠球菌进行溶血素、生物膜形成采用文献报道方法进行测定，动物体内安全性评价，按现行版药典方法进行。

(1)通过对菌株进行质粒提取，此菌株不含有质粒，表明耐药基因的转移水平低，菌株安全性高。

(2)溶血素检测

细菌分泌的溶血素可造成红细胞溶解或其他组织损伤。溶血素的产生，主要与cylA、cylB等毒力基因相关。本发明粪肠球菌菌落周围无溶血环，对照菌株有轻微溶血环，金黄色葡萄球菌周围有明显溶血环。结果显示，本发明粪肠球菌菌株溶血实验阴性，菌株无溶血性，安全性高。

(3)动物体内安全性评价

小鼠灌胃后，健康状况良好，与生理盐水组比较，小鼠活动状况无差异，毛发状态

均正常。记录灌胃前后小鼠体重情况如表5所示。

表5灌胃前后小鼠体重变化

结果可见，各组小鼠体重均增加，两组体重变化差异不大(两组差别无统计学意义，p>0.05)。

实施例4

粪肠球菌YZ-1的益生活性研究

将-20℃冰箱中冻存的菌株，接种于MRS琼脂培养基中，连续2次活化，得到种子发酵液。以体积比为3:100的比例，将种子发酵液接入MRS液体培养基中，37℃过夜培养得到菌株发酵液。

（1）抑制致病菌实验

革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌ATCC12592、单增李斯特菌CMCC54002)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC14028、铜绿假单胞菌ATCC27853)和真菌(白色念珠菌SC5314)作为指示菌株。取适量指示菌(约10⁸CFU/mL)加入LB琼脂培养基中，使菌的终浓度约为10⁶CFU/mL，摇匀，倾注平板，培养基凝固后，打孔，分别注入粪肠球菌YZ-1上清液和菌悬液150μL，风干孔内液体，37℃培养24h，测量抑菌圈的直径。上述上清液为过夜培养的粪肠球菌YZ-1的发酵液离心(8000r/min, 5min)取上清液，经0.22μm滤膜过滤。上述菌悬液为过夜培养的粪肠球菌YZ-1的发酵液离心(8000r/min，5min)，取菌体重悬于无菌生理盐水中。按上述相同方法测定鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469(LGG)的抑菌能力。

表6为粪肠球菌YZ-1和LGG对六种指示菌的抑制能力(mm)

注：同行中字母不同代表差异显著(p＜0.05)。

结果如表6所示，粪肠球菌YZ-1和鼠李糖乳杆菌LGG都具有良好的抑菌效果，且YZ-1上清液对大肠杆菌的抑制效果强于LGG上清液。

（2）培养滤液的体外抗炎活性试验

人类PBMCs细胞的制备

20至25岁的健康人类志愿者是来自于郑州大学药学院的在校学生。

对健康人类志愿者进行血液的抽取，并以柠檬酸葡萄糖(ACD)溶液作为抗凝血剂。接着添加至离心管中，并于4℃下以720g转速密度-梯度离心30分钟，然后收集淋巴细胞层。之后用红血球溶解缓冲溶液来溶解红血球，于4℃下以3000rpm转速离心10分钟，以除去残留的红血球。由此所得到的人类PBMCs细胞，用含有10％FBS的RPMI 1640培养基来调整细胞浓度至4×10⁶细胞/mL备用。

粪肠球菌YZ-1液态培养物的制备

首先将粪肠球菌YZ-1接种至MRS液体培养基中，并于37℃下进行培养约24小时，所形成的培养物被使用作为接种源。然后将菌株的接种源分别以约为1-3％(v/v)的接种量接种至添加有5-30％牛奶、1-10％大豆粉以及3％的葡萄糖-麦芽糊精的混合物的MRS液体培养基中，并于37℃下培养24小时。之后，于约3000-6000rpm下离心60分钟使菌体沉淀，然后收集上清液并进行加热灭菌处理，由此得到粪肠球菌YZ-1的液态培养物。

在进行下面的实验前，先将粪肠球菌YZ-1的培养滤液进行喷雾干燥处理，然后用适量的RPMI 1640培养基溶解并将浓度调整为30g/L。

对人类PBMCs细胞进行YZ-1培养滤液的处理

首先将上面所得到的人类PBMCs细胞分成3组，包括1个正常对照组、1个正对照组以及1个实验组。将各组细胞分别以1×10⁵细胞/孔的数量培养于含有0.2 mL的RPMI 1640培养基（添加有10％FBS以及1％盘尼西林-链霉素）的96孔培养盘中，并在培养箱(37℃，5％CO₂)中培养48小时。

接着将实验组的培养基更换以添加有30g/L粪肠球菌YZ-1培养滤液的RPMI 1640培养基。正对照组的培养基被更换以添加有200ng/mL的植物血球凝集素的RPMI 1640培养基，而正常对照组的培养基则被更换以无添加的RPMI 1640培养基。

各组细胞在培养箱(37℃，5％CO₂)中培养48小时后，将所形成的培养物于3000rpm下离心10分钟，取上清液进行下面的分析。

IL-10的浓度测定方法

有关正常对照组、正对照组以及实验组的上清液的IL-10浓度测定是使用IL-10ELISA试剂盒进行。各组所测得的吸光值分别根据预先以具有不同已知浓度的IL-10标准品相对于它们自身的吸光值所作出的标准曲线换算成其浓度(pg/mL)。

TGF-β的浓度测定方法

有关正常对照组以及实验组的上清液的TGF-β浓度测定是使用TGF-βELISA试剂盒进行。各组所测得的吸光值分别根据预先以具有不同已知浓度的TGF-β标准品相对于它们自身的吸光值所作出的标准曲线换算成其浓度(pg/mL)。

IL-10的浓度测定结果

人类PBMCs细胞用粪肠球菌YZ-1的培养滤液处理后所测得的IL-10浓度（图3）。从图3可见，与正常对照组相比，实验组的IL-10浓度有明显的升高并且显著高于正对照组的浓度，表明培养滤液能够有效地活化人类PBMCs细胞而刺激其分泌IL-10。

TGF-β的浓度测定结果

人类PBMCs细胞用粪肠球菌YZ-1的培养滤液处理后所测得的TGF-β浓度（图4）。从图4可见，与正常对照组相较下，实验组的TGF-β浓度有显著的升高，培养滤液能够有效地活化人类PBMCs细胞而刺激其分泌TGF-β。

培养滤液可有效地刺激人类PBMCs细胞分泌IL-10以及TGF-β，进而通过免疫调节来达到优异的抗炎作用。因此认为粪肠球菌YZ-1的培养滤液具有发展成为抗炎药物的高潜力，而被预期可供应用于治疗发炎性障碍。

（3）总胆固醇清除实验

采用总胆固醇测试盒测定胆固醇标准曲线。用蒸馏水将胆固醇标准液(2mg/mL)分别稀释至2、1.6、1.2、0.8、0.4、0.2mg/mL，精确吸取各个浓度的稀释液2.5μL加入96孔板，加入250μL工作液，混匀，置于37℃培养箱孵育10min，测定510nm波长下的吸光度值，每个浓度做3次平行。用软件Excel绘制胆固醇标准曲线（图5）。取过夜培养的YZ-1发酵液按5%(v/v)的接种量接种到5mL 1mg/mL的胆固醇培养基中，摇均，同时设置空白组(不接菌的胆固醇培养基)，37℃培养24h。离心(8000r/min，5min) 取上清液2.5μL加入96孔板，加入250μL工作液，混匀，置于37℃培养箱孵育10min，测定510nm处的吸光度值，带入胆固醇标准曲线方程，计算上清液的胆固醇浓度(C)。总胆固醇清除率＝[(C空-C样)/C空)]×100%。胆固醇培养基为：取0.05g胆固醇用少量无水乙醇加热溶解，加入50mL的MRS液体培养基中，摇匀，配成终浓度为1mg/mL的胆固醇培养基，121℃高压灭菌15min。

用上述相同的方法测定鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469(LGG)的总胆固醇清除能力，在最高浓度(2×10⁸CFU/mL) 下，YZ-1的胆固醇清除率高达(65.36±0.25)%，即培养基中653.6μg/mL胆固醇被降解，与LGG相当。在低菌液浓度下，YZ-1的降胆固醇能力强于LGG。说明粪肠球菌YZ-1具有高效的降胆固醇能力。降低血清中的胆固醇浓度有利于预防动脉硬化和高血压等心血管疾病，本发明菌株可应用于具有降胆固醇作用的功能性食品的研发。

（4）降糖功能体内评价试验

将32只约200克体重的雌性SD大鼠分别随机分四组，一组给与正常维持饲料，三组给予高脂饲料（胆固醇1%，猪油10%，0.2%胆酸盐，10%蛋黄粉）。三组高脂饲料组，在喂食一周后，一组隔天经口给予10⁹CFU粪肠球菌YZ-1菌液，一组隔天给予生理盐水，一组在实验终止前三周隔天给予20mg/kg体重的辛伐他丁，共五周终止实验，检测大鼠空腹血清的血糖和胰岛素水平，来评价粪肠球菌YZ-1对代谢紊乱模型的预防干预效果。

粪肠球菌YZ-1对大鼠空腹血糖和血胰岛素有降低功能。图6显示粪肠球菌YZ-1对高脂模型大鼠空腹血糖的影响。粪肠球菌YZ-1干预组（YZ-1干预组）和辛伐他汀干预组（药物干预组）的血糖平均含量为2.80±0.56 mmol/L和2.71±0.45 mmol/L，均显著低于高脂模型组4.89±0.32 mmol/L；高脂模型组的血糖平均含量为4.89±0.32 mmol/L，显著高于正常对照组2.56±0.27 mmol/L。

粪肠球菌YZ-1对高脂模型大鼠空腹血清胰岛素的影响（图7）。粪肠球菌YZ-1组（YZ-1干预组）和辛伐他汀干预组（药物干预组）的血清胰岛素平均含量为28.23±2.02 mU/L和38.25±1.98 mU/L，均显著低于高脂模型组48.25±1.78 mU/L；高脂模型组的血清胰岛素平均含量为48.25±1.78 mU/L，显著高于正常对照组23.12±2.86 mU/L。

上述结果表明，粪肠球菌YZ-1菌株具有显著降低血糖和血清胰岛素的作用，和辛伐他汀有相似的降低血糖功效。脂代谢紊乱如高甘油三酯和高游离脂肪酸血症等与胰岛素抵抗密切相关。胰岛素抵抗使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗易导致代谢综合征和2型糖尿病。粪肠球菌YZ-1菌株具有降血脂的作用，从而减轻胰岛素抵抗，导致血糖和血清胰岛素的降低。

（5）降低肝脏炎症和肝脏纤维化相关炎性因子体内评价

粪肠球菌YZ-1对高脂模型大鼠的血清白介素1-β(IL-1β)的影响（图8）。粪肠球菌YZ-1干预组和辛伐他汀干预组的血清IL-1β平均含量为14 .32±2.08pg/mL和16 .76±1.25 pg/mL，均显著低于高脂模型组25.32±2.12 pg/mL；高脂模型组的血清IL-1β平均含量为25.32±2.12 pg/mL，显著高于正常对照组18.23±2.56 pg/mL。

粪肠球菌YZ-1对高脂模型大鼠的血清单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1)的影响（图9）。粪肠球菌YZ-1干预组的血清MCP-1平均含量为489.98±98.23 pg/mL，显著低于高脂模型组860.56±65.22 pg/mL；辛伐他汀干预组的血清MCP-1平均含量为712.59±48.34 pg/mL，与高脂模型组860.56±65.22 pg/mL无显著差异；高脂模型组的血清MCP-1平均含量为860.56±65.22 pg/mL，显著高于正常对照组486.12±56.23 pg/mL（p<0.001）。

上述结果表明，粪肠球菌YZ-1菌株具有显著降低血清IL-1β和MCP-1炎性因子的作用，比辛伐他汀有更强的降低血清炎性因子的功效。肝脏纤维化是各种原因导致的肝损伤持续发展的最终结局，MCP-l是组织损伤修复中重要的巨噬细胞趋化因子，其在肝脏损伤及修复中起着重要作用。IL-1β是另一个致纤维化的重要炎症细胞，是前炎症反应的主要诱导剂，它可以通过协同其他炎性因子如TNF-α，并促进其他炎性因子的表达加强炎性反应程度。总之，MCP-l和IL-1β是肝脏纤维化的重要炎症因子。粪肠球菌YZ-1显著降低血清IL-1β和MCP-1炎性因子的含量，从而减少肝脏炎症和肝脏纤维化的发生。

（6）DPPH自由基清除实验

用无菌生理盐水把过夜培养的粪肠球菌YZ-1发酵液分别稀释至5×10⁷、1×10⁷、5×10⁶、1×10⁶ CFU/mL，分别测定这4个稀释度的细胞裂解液、上清液和菌悬液的DPPH自由基清除能力。取2mL待测样品和2mLDPPH乙醇溶液，混匀，暗反应40min，同时设置对照组(用无水乙醇代替样品溶液)和空白组(用无水乙醇代替DPPH溶液)，测定517 nm波长处的吸光值。自由基清除率＝[1-(A样-A空/A对)]×100%。上述DPPH为0.2mmol/L的DPPH，取0.0078gDPPH用无水乙醇定容100mL。上述上清液为该浓度下的发酵液离心(8000r/min，5min)取上清液，经0.22μm滤膜过滤。上述菌悬液为该浓度下的发酵液离心(8000r/min ,5min)，取菌体重悬于无菌生理盐水中。上述细胞裂解液是该浓度下的菌液经细胞超声破碎仪处理30min(800W，15s，15s)后，离心(8000r/min,5min) 取上清液，经0.22μm滤膜过滤。用上述相同的方法测定鼠李糖乳杆菌LGG的DPPH自由基清除能力。结果显示，粪肠球菌YZ-1上清液、菌悬液和裂解液对DPPH自由基的清除率分别为82.19%～94.37%、86.72%～95.38%、56.73%～58.32%，在同一浓度下，YZ-1的菌悬液和裂解液对DPPH自由基的清除能力都强于LGG。菌体浓度越高，DPPH清除率越高，在最高浓度(5×10⁷CFU/mL)下，YZ-1菌悬液对DPPH的清除率高达95.38%。

（7）抗癌活性细胞实验

以胎牛血清：双抗：DMEM培养基＝1:0.1:9的比例配制DMEM完全培养基。对人正常肝细胞LO₂和人乳腺癌细胞MDA-MB-231进行复苏和传代。

YZ-1样品溶液的制备：取3份YZ-1的发酵液，一份置于121℃下高温处理15min，离心(8000r/min，5min)，用无菌PBS重悬制得灭活菌体组；一份超声破碎15min(800W，9s，9s)，离心，上清液用0.22μm滤膜过滤制得裂解液组；一份离心(8000r/min，5min)取上清液用0.22μm滤膜过滤制得上清液组。各组样品用DMEM完全培养基稀释成不同浓度。

将培养好的LO₂细胞消化、离心，将细胞密度调为80000个/mL，加到96孔板，每孔100μL。放入37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。待细胞覆盖面积达85%左右后，吸弃旧培养基，每孔加入100μL的YZ-1样品溶液，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。每个浓度设置3个平行对照，以DMEM完全培养基代替样品作为空白对照。培养结束后，采用MTT法检测细胞存活率，结果（图10）显示YZ-1对LO₂细胞的安全浓度是3×10⁴～6×10⁷CFU/mL。因此，选取该浓度测定YZ-1对癌细胞增殖的抑制作用。用0.25%胰酶消化MDA-MB-231细胞，离心(1200r/min，5min)，将细胞稀释为80000个/mL，每孔100μL加入到96孔板中，放置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。待细胞覆盖面积达85%左右时，吸弃旧培养基，用PBS洗涤3次，每孔加入3×10⁴～6×10⁷CFU/mL的YZ-1样品溶液100μL作为处理组，以DMEM完全培养基代替样品作为空白对照组，以5-氟尿嘧啶(5-FU)代替样品作为阳性对照组，37℃培养48h。采用MTT法测定癌细胞的存活率，并计算YZ-1对癌细胞抑制率。癌细胞抑制率＝[1-(A处理组/A空白组)]×100%。结果（图11）显示，6×10⁷CFU/mL的灭活菌体对人乳腺癌细胞MDA-MB-231抑制率高达82.32±0.25%，显著高于5-FU。结果表明粪肠球菌YZ-1有较好的抗癌活性，在生产具有抗癌作用的功能性食品上，具有较大的潜在应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 郑州大学

河南远止生物技术有限公司

<120> 一株粪肠球菌YZ-1及其益生性应用

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<212> DNA

<213> 粪肠球菌(Enterococcus faecalis)

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gaaagaggag tggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctacccatca gagggggata 120

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Claims (5)

1.一株粪肠球菌（Enterococcus faecalis）YZ-1，其保藏编号为CCTCC M 2022312，分类名为Enterococcus faecalisYZ-1，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年3月25日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

2.权利要求1所述的粪肠球菌YZ-1在制备降低胆固醇的药品中的应用。

3.权利要求1所述的粪肠球菌YZ-1在制备降低血糖的药品中的应用。

4.权利要求1所述的粪肠球菌YZ-1在制备降低肝脏炎症和/或纤维化相关的炎性因子的药品中的应用。

5.权利要求1所述的粪肠球菌YZ-1在制备抗人乳腺癌细胞MDA-MB-231的药物中的应用。