CN113913334A - 一株粪肠球菌ef-za1107-06及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一株粪肠球菌EF‑ZA1107‑06及其应用，所述菌株于2021年9月1日，在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)保藏，保藏编号为GDMCCNo:61910。经过一系列安全性实验证明该菌株安全无毒，耐受胃肠道消化能力较强、自凝聚能力高、抑菌能力较强、具有优异的降胆固醇活性、抗氧化活性以及抗癌活性，可在制备肠道抑菌药物、饲料和功能食品中应用。

Description

一株粪肠球菌EF-ZA1107-06及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株婴儿肠道源的粪肠球菌EF-ZA1107-06及其在制备抑制肠道致病菌药物、饲料添加剂和功能性食品中的应用。
背景技术
随着生活水平和消费水平的提高，人们的健康饮食观念在不断增强。，人们更加注重增强自身免疫力，益生菌等产品也得到了更多的认可。FAO/WHO对益生菌的定义是：益生菌是活的微生物，当给予足够的量时，会给宿主带来健康益处。益生菌制剂通常是由一种乳酸菌或多种乳酸菌复配组成的活菌制剂，被摄入后可以起到调节肠道菌群、促进肠道健康、增强免疫力和抑制腹泻等多种功效。
粪肠球菌是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，是一种肠道原驻菌，经常应用于各种传统发酵产品，是传统发酵制品中的优势微生物种群。粪肠球菌在生长过程中可以产生细菌素、有机酸等抑菌物质，抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见致病菌的生长。此外，其在降胆固醇、改善炎症反应、调节肠道菌群、增强免疫等方面也表现出了一定的益生性，被应用于医学、饲料、食品等领域。目前，粪肠球菌普遍应用于饲料，在饲料中添加粪肠球菌，可以调节宿主胃肠道微生态***，增强畜禽的免疫力，提高抗病能力，改善生产性能，提高饲料利用率。
人源益生菌更具有亲和性，不易被人体免疫***所排斥，有利于其在肠道定殖，发挥益生功能。因此，从婴儿肠道中分离筛选到一株粪肠球菌，研究其安全性和益生性对粪肠球菌的开发利用更具有潜力和价值。肠球菌一方面具有明显的有益健康的作用，并且某些菌株具有安全使用的悠久历史，另一方面，肠球菌是一种条件性病原体，且菌株之间存在差异性，因此，安全无毒是益生性粪肠球菌筛选的首要的重要因素。菌株需具有良好的胃肠液耐受能力，保证其在胃肠道仍具有一定的活菌数，使其能够在肠道内定殖，并发挥益生功能。
目前，具有降胆固醇活性和抗癌活性的粪肠球菌较少，本发明提供一株婴儿肠道源的安全无毒、胃肠液耐受能力较强、具有高效降胆固醇能力和抗癌活性的粪肠球菌EF-ZA1107-06，为具有降胆固醇、抗癌功效的功能性食品、饲料的生产提供新的优良菌株。同时，该菌株具有良好的抑菌能力和抗氧化能力，可在制备抑制肠道致病菌药物、饲料添加剂和功能性食品中应用。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的分离自广州市健康1月龄婴儿粪便的益生性粪肠球菌 EF-ZA1107-06及其应用。
在本发明的第一方面，提供一株粪肠球菌EF-ZA1107-06。
在本发明的第二方面，提供所述的粪肠球菌EF-ZA1107-06的安全性评价，其中包括菌株的硝基还原酶实验、氨基脱羧酶实验、吲哚实验、溶血性实验、抗生素敏感性实验、质粒提取实验、动物急性经口毒理实验，实验证明粪肠球菌EF-ZA1107-06硝基还原酶实验阴性、氨基脱羧酶实验阴性、吲哚实验阴性、不溶血，该菌株对氧氟沙星、头孢唑林、头孢呋辛、四环素、青霉素、氯霉素、万古霉素敏感，不含有质粒，对小鼠无急性毒性作用，该菌株安全无毒。
在本发明的第三方面，提供所述的粪肠球菌EF-ZA1107-06菌株在人工模拟胃肠液环境下的耐受能力。进行体外模拟消化实验，模拟益生菌被摄入后，经过人体口腔和胃肠道。将该菌株暴露于人工模拟唾液10min后存活率为97.3％，将其继续暴露于人工模拟胃液2h 后存活率为79.4％，随后，再将其继续暴露于人工模拟肠液3h后存活率为67.2％。本发明菌株对胃肠液有较强的耐受能力。
在本发明的第四方面，提供所述的粪肠球菌EF-ZA1107-06菌株的疏水性和自凝聚力。培养1h时，EF-ZA1107-06的疏水性为17.74％，培养24h时，自凝聚力达到96.0％。
在本发明的第五方面，提供所述的粪肠球菌EF-ZA1107-06菌悬液或上清液对致病菌的抑制作用，粪肠球菌EF-ZA1107-06上清液的抑菌效果明显强于菌悬液，其上清液对大肠杆菌ATCC25922的抑菌圈直径(mm)为20.5，对沙门氏菌ATCC14028的抑菌圈直径(mm) 为16.7，对铜绿假单胞菌ATCC27853的抑菌圈直径(mm)为15.0，对白色念珠菌SC5314 的抑菌圈直径(mm)为15.3，对单增李斯特菌CMCC54002的抑菌圈直径(mm)为17.3，对金黄色葡萄球菌ATCC12592的抑菌圈直径(mm)为16.7。
在本发明的第六方面，提供所述的粪肠球菌EF-ZA1107-06的降胆固醇活性， EF-ZA1107-06的胆固醇清除率高达44.29％，即培养基中442.9μg/mL胆固醇被降解。
在本发明的第七方面，提供所述的粪肠球菌EF-ZA1107-06不同菌体浓度的上清液或其裂解液或其菌悬液的抗氧化能力，EF-ZA1107-06上清液、菌悬液和裂解液对DPPH自由基的清除率分别为79.38％～91.70％、84.40％～93.16％、52.51％～55.94％。
在本发明的第八方面，提供所述的粪肠球菌EF-ZA1107-06不同菌体浓度的上清液或其裂解液或其灭活菌体对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用。随着菌浓度不断增加， EF-ZA1107-07各组分对癌细胞的抑制率逐渐增大，5×107CFU/mL的灭活菌体对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制率高达71.22％。
本发明的菌株EF-ZA1107-06来源于广州市健康的1月龄婴儿粪便，经过16SrDNA测序鉴定结果可得，该菌株属于粪肠球菌属。经过一系列安全性实验证明该菌株安全无毒，耐受胃肠道消化能力较强、自凝聚能力高、抑菌能力较强、具有优异的降胆固醇活性、抗氧化活性以及抗癌活性，可在制备抑制肠道致病菌药物、饲料添加剂和功能性食品中应用。
保藏说明
菌种名称：粪肠球菌
拉丁名：Enterococcus faecalis
菌株编号：EF-ZA1107-06。
保藏机构：广东省微生物菌种保藏中心。
地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所。
保藏日期：2021年9月1日。
保藏中心登记入册编号：GDMCC No:61910。
附图说明
图1实施例1粪肠球菌EF-ZA1107-06菌株在MRS固体培养基上的菌落形态图。
图2实施例1粪肠球菌EF-ZA1107-06菌株革兰氏染色镜检图。
图3粪肠球菌EF-ZA1107-06菌株的***进化树图。
图4实施例2粪肠球菌EF-ZA1107-06菌株硝基还原酶实验结果图，左一试管为空白对照实验，中间试管为加入大肠杆菌ATCC25922的对照组，右一试管为加入粪肠球菌 EF-ZA1107-06的实验组。
图5实施例2粪肠球菌EF-ZA1107-06菌株氨基酸脱羧酶实验结果图；a:赖氨酸；b:鸟氨酸；c：精氨酸。
图6实施例2粪肠球菌EF-ZA1107-06菌株吲哚实验结果图，左一试管为加入粪肠球菌 EF-ZA1107-06菌株的实验组，中间试管为加入大肠杆菌ATCC25922的阳性对照的实验组，右一试管为空白对照。
图7实施例2粪肠球菌EF-ZA1107-06菌株溶血实验结果图。
图8实施例2粪肠球菌EF-ZA1107-06菌株质粒提取实验结果图。
图9实施例3胆固醇标准曲线。
图10实施例3粪肠球菌EF-ZA1107-06和鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469的总胆固醇清除能力实验结果图。
图11实施例3粪肠球菌EF-ZA1107-06和鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469的DPPH自由基清除实验结果图；a):上清液；b):裂解液；c):菌悬液。
图12实施例3不同浓度的粪肠球菌EF-ZA1107-06处理后的人正常肝细胞LO2的存活率。
图13实施例3粪肠球菌EF-A1107-06对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用。
注：图10、11、13中不同字母表示各组存在显著差异(p＜0.05)。
具体实施方式
本发明提供一株安全无毒、具有益生活性的粪肠球菌EF-ZA1107-06，具体而言，本发明涉及一株婴儿肠道源的耐受胃肠道环境、具有抑菌能力、降胆固醇活性、抗氧化活性以及抗癌活性的粪肠球菌。为了更好的理解本发明，下面结合具体的实施例，对本发明进行详细的阐述和说明，但本发明要求保护范围并不局限于以下具体实施例所示范围。
以下实施例所使用的培养基配方为：
MRS肉汤培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)：
取酪蛋白酶消化物10g、牛肉膏粉10g、酵母膏粉4g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁(Mg SO4·7H2O)0.2g、硫酸锰(Mn SO4·4H2O)0.05g、磷酸氢二钾2g、葡萄糖20g、吐温801.08g，加蒸馏水1000mL，溶解后，调pH至5.7±0.2。121℃灭菌15min。
MRS固体培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)：
取蛋白胨10g、牛肉膏粉5g、酵母膏粉4g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵2g、硫酸镁(Mg SO4·7H2O)0.2g、硫酸锰(Mn SO4·4H2O)0.05g、琼脂15g，加蒸馏水1000mL，溶解后，调pH至6.2±0.2，121℃灭菌15min。
硝基还原酶检测培养基：
取细菌学蛋白胨1g，硝酸钾0.1g，加蒸馏水100mL，溶解后，调节培养基pH值至7.4，分装，121℃高压灭菌15min。
氨基脱羧酶诱导培养基：
向100mL MRS肉汤培养基中加入0.005％质量分数的5-磷酸吡哆醛，混合均匀，分装，分别加入0.1％质量分数的赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸，121℃高压灭菌15min。
氨基脱羧酶鉴定培养基(BASM)：
取胰蛋白胨5g、酵母膏5g、牛肉膏5g、NaCl 2.5g、葡萄糖0.5g、吐温80 1g、碳酸钙0.1g、硫酸亚铁0.04g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.2g、柠檬酸铵2g、硫胺素0.01g、磷酸氢二钾2g、5-磷酸吡哆醛0.05g、溴甲酚紫0.06g、琼脂20g，加蒸馏水1000mL，溶解后，调PH为5.3，121℃灭菌10min，待稍微冷却后分装，分别加入1％赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸，摇匀。
蛋白胨水培养基：
取细菌学蛋白胨1g、氯化钠0.5g，添加蒸馏水100mL，溶解后，调pH至7.8，121℃灭菌15min。
LB琼脂培养基：
取蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖1g，酵母膏粉5g，加蒸馏水1000mL，溶解后，调 pH至7.0±0.2，121℃灭菌15min。
实施例1：菌株的筛选与鉴定
用无菌的一次性粪便采集杯收集广州市爱弥儿月子中心一月龄内健康婴儿的粪便，样品于4h内在生理盐水中梯度稀释107倍，将样品稀释液涂布于MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h。根据菌落大小、形态等特征选取单菌落在MRS固体培养基上划线培养3次以上，获得一株分离纯化的菌株，将该菌株命名为EF-ZA1107-06。该菌株的菌落形态图见图1，菌落形态特征为中间凸起，呈白色或乳白色且不透明，表面光滑有光泽，边缘较整齐，菌落直径约为0.5～1.0mm。
为鉴定菌株，先用显微镜观察革兰氏染色后的菌体形态，结果如图2所示，结合过氧化氢酶、接触酶、产气和糖发酵等生理生化反应，可以初步判断该菌株为粪肠球菌。通过16S rDNA测序进行分子生物学鉴定，16S rDNA测序结果表明，EF-ZA1107-06菌株为粪肠球菌。该菌株16S rDNA序列参见SEQ NO.1。将分离纯化后的粪肠球菌EF-ZA1107-06 菌株保存至30％甘油中，-20℃下冻存。
实施例2：粪肠球菌EF-ZA1107-06的安全性评价
将-20℃冰箱中冻存的菌株，接种于MRS肉汤培养基中，连续2次活化，得到种子发酵液，以体积比为3:100的比例，将种子发酵液接入MRS肉汤培养基中，37℃过夜培养得到菌株发酵液。
2.1硝基还原酶活性检测
将经MRS肉汤培养基过夜培养的粪肠球菌EF-ZA1107-06以及阳性对照菌株大肠杆菌ATCC25922按3％(v/v)的接种量分别接种于硝基还原酶检测培养基中，以未接种菌株的硝基还原酶检测培养基为空白对照，37℃恒温培养48～96h，依次向培养基中加入α-萘胺和对氨基苯磺酸溶液，混匀，观察培养基颜色的变化。培养基变为红色则代表硝基还原酶检测结果为阳性，否则为阴性。结果如图4所示，粪肠球菌EF-ZA1107-06硝基还原酶结果为阴性，即粪肠球菌EF-ZA1107-06在增殖代谢过程中不产生具有活性的硝基还原酶，不会将硝酸盐还原成亚硝酸盐。
2.2氨基脱羧酶活性检测
将过夜培养的粪肠球菌EF-ZA1107-06发酵液按1％(v/v)的接种量分别接种于诱导培养基，同时以大肠杆菌ATCC25922作为阳性对照菌株，以鼠李糖乳杆菌ATCC7469(LGG)作为阴性对照菌株，37℃培养20-24h，按照同样的方法转接6次后，将过夜培养的菌株发酵液混合均匀，分别吸取100μL菌液均匀涂布于BASM培养基上，37℃培养4天，观察培养基颜色。鉴定培养基呈黄色为阴性，呈紫色为阳性。结果如图5所示，粪肠球菌 EF-ZA1107-06氨基脱羧酶结果为阴性，即该菌株不产生氨基脱羧酶。
2.3吲哚实验
将过夜培养的粪肠球菌EF-ZA1107-06发酵液以及阳性对照菌株大肠杆菌ATCC25922 液按按3％(v/v)接种量接种于蛋白胨水培养基中，同时设置空白对照，37℃恒温培养72h，加入吲哚试剂8～10滴，观察液面颜色变化。结果如图6所示，Escherichia coliATCC25922 培养基的液面为玫瑰红色，结果为阳性，而EF-ZA1007-06培养基的液面为黄色，结果为阴性，说明EF-ZA1107-06在增殖过程中不产生色氨酸酶。
2.4溶血实验
在无菌条件下，挑取粪肠球菌EF-ZA1107-06，在哥伦比亚血琼脂平板上划线，37℃恒温培养48h，观察菌落周围有无明显的溶血圈。结果如图7所示，粪肠球菌EF-ZA1107-06周围无明显溶血圈形成，即该菌株不会对人体造成溶血伤害。
2.5抗生素敏感性实验
取过夜培养的粪肠球菌EF-ZA1107-06发酵液，调浓度约为2×108CFU/mL，取100μL均匀涂布于MRS固体培养基上，待菌液被充分吸收后，放置抗生素药敏片，室温放置20min，37℃恒温培养24h。药敏片包括氧氟沙星、头孢唑林、头孢呋辛、四环素、氯霉素、青霉素和万古霉素，每种药敏纸片做3个平行。用直尺测量抑菌圈直径。同时选用金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003作为药敏实验的质控菌株。菌株对各种抗生素的敏感性根据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定的相关标准(见表1)判断。药敏纸片实验结果如表2所示，粪肠球菌EF-ZA1107-06对七种抗生素的敏感性都很高。
表1药敏纸片含量及抗药性判断标准
Figure BDA0003313202480000071
表2药敏纸片实验结果
Figure BDA0003313202480000072
2.6质粒提取实验
取1.5mL过夜培养的粪肠球菌EF-ZA1107-06发酵液，根据碧云天质粒小提试剂盒的说明提取细菌质粒，将所得液体进行琼脂糖凝胶电泳，以大肠杆菌ATCC25922作为阳性对照。取试剂盒所提取的液体5μL，加入1μL 6×Loading Buffer，吹吸均匀，点样于琼脂糖凝胶。电泳液为1×TBE电泳缓冲液，电压设定为150V，工作时间40min。待电泳结束后，利用图像记录分析***分析琼脂糖凝胶上的迁移距离。上述琼脂糖凝胶为取2g琼脂糖，加入1×TBE电泳缓冲液100mL，加热煮沸至液体透明，加入5μLGoldview核酸染料，冷却至60℃后，倒入电泳槽，冷却凝固。电泳结果如图8所示，粪肠球菌EF-ZA1107-06所在泳道未出现条带，表明粪肠球菌EF-ZA1107-06不含有质粒，耐药基因不会转移到人基因组上。
2.7小鼠急性经口毒性试验
取SPF级KM小鼠20只，雌雄各半，体重为18～22g。实验采用限量法，只设10.0g/kg体重一个剂量组。实验前动物禁食6h，不限制饮水。取对数生长期的粪肠球菌EF-ZA1107-06发酵液用生理盐水调浓度为3×108CFU/mL，空腹灌胃1次，灌胃容量为20.0mL/kg体重，灌胃后继续禁食1h，观察并记录动物的体重、中毒表现、死亡数和死亡时间，观察期为 14天。实验结果见表3，结果表明含有粪肠球菌EF-ZA1107-06的口服液对雌雄性KM小鼠急性经口毒性LD50＞10.0g/kg体重，属于实际无毒级，对小鼠不具备急性毒性作用。
表3受试物对小鼠急性经口毒性试验结果
Figure BDA0003313202480000081
实施例3：粪肠球菌EF-ZA1107-06的益生活性研究
将-20℃冰箱中冻存的菌株，接种于MRS肉汤培养基中，连续2次活化，得到种子发酵液。以体积比为3:100的比例，将种子发酵液接入MRS液体培养基中，37℃过夜培养得到菌株发酵液。
3.1人工模拟胃肠道耐受性实验
取过夜培养的粪肠球菌EF-ZA1107-06的发酵液，于8000r/min条件下离心5min，用无菌PBS缓冲溶液(pH 7.4)洗涤3次，用无菌生理盐水重悬。将菌悬液按照10％(v/v) 的接种量接种于人工模拟唾液中，37℃恒温培养10min，培养0min和10min时取样，计活菌数。并将取样后的剩余培养液离心(8000r/min，5min)，用无菌PBS缓冲溶液(pH 7.4)重悬并离心(8000r/min,5min)，重复2次，取菌泥重悬于人工模拟胃液中，37℃恒温培养2h后取样，计活菌数。将取样后的剩余培养液离心(8000r/min,5min)，用无菌 PBS缓冲溶液(pH 7.4)重悬并离心，重复2次，取菌泥，重悬于人工模拟肠液中，在3h 时取样，计活菌数。并以LGG作为对照菌株。存活率＝[logCFU(Nt)/logCFU(N0)]×100％, 其中，N0为暴露在人工模拟唾液0min时的活菌数，Nt为菌株暴露在人工模拟唾液10min、暴露在人工模拟胃液中2h和暴露在人工模拟肠液中3h时的活菌数。其中，人工模拟唾液的配制为：称取0.071g磷酸氢二钠、0.006g磷酸二氢钾和0.24g氯化钠，加入少量蒸馏水完全溶解，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节溶液pH为6.75，加入0.027gα-淀粉酶，用蒸馏水定容至30mL，过0.22μm滤膜除菌备用。人工模拟胃液的配制为：称取0.88g 氯化钠，用少量蒸馏水溶解，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节溶液pH为3，按照5g/L 浓度加入胃蛋白酶，用蒸馏水定容至30mL，溶解后，过0.22μm滤膜除菌备用。人工模拟肠液的制备为：称取0.27g磷酸二氢钾，量取少量蒸馏水溶解，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节溶液pH为6.8，按照0.1g/L的比例加入胰蛋白酶，用蒸馏水定容至30mL，过 0.22μm滤膜除菌备用。结果如表4所示，粪肠球菌EF-ZA1107-06和LGG暴露于人工唾液后，均保持了超过90％的存活率，且EF-ZA1107-06的存活率显著高于LGG(p＜0.05)，两株菌连续暴露于人工唾液10min、人工胃液2h、人工肠液3h后，其存活率仍在65％以上，说明本发明的粪肠球菌EF-ZA1107-06对人工胃肠液具有较好的耐受性，可以到达肠道发挥其益生功效。
表4粪肠球菌EF-ZA1107-06和LGG在人工模拟胃肠液中的存活率(％)
Figure BDA0003313202480000091
注：同列中字母不同代表差异显著(p＜0.05)。
3.2粪肠球菌EF-ZA1107-06疏水性能测试
取过夜培养的粪肠球菌发酵液进行离心(8000r/min，10min)，用无菌PBS缓冲溶液(pH 7.4)重悬并离心，重复2次，取菌泥用PBS溶液重悬，调菌悬液OD600值为0.5±0.02。取3mL菌悬液与1mL二甲苯混合，旋涡震荡2min，室温下静置，分别静置0.5h、1h后取水相测定OD600值，A0为混合前的OD600值。疏水性＝[(A0-At)/A0]×100％。用上述相同的方法测定鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469(LGG)的疏水性。结果如表5所示，静置0.5h时，粪肠球菌EF-ZA1107-06的疏水性高于LGG。
表5粪肠球菌EF-ZA1107-06和LGG的疏水性(％)
Figure BDA0003313202480000092
注：同行中字母不同代表差异显著(p＜0.05)。
3.3粪肠球菌EF-ZA1107-06自凝聚能力测试
取过夜培养的粪肠球菌发酵液进行离心(8000r/min，10min)，用无菌PBS缓冲溶液(pH 7.4)重悬并离心，重复2次，取菌泥用PBS溶液重悬，旋涡震荡，室温下静置，分别静置0、2、6、20、24h后吸取上层清液液测定OD600值，自凝聚能力＝[(A0-At)/A0]×100％。其中，At为放置t h后的OD600值，A0为静置0h的OD600值。用上述相同的方法测定鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469(LGG)的自凝聚能力。结果如表6所示，静置24h时，粪肠球菌EF-ZA1107-06的自凝聚力可达(96.0±1.7)％，具有良好的自凝聚能力。
表6粪肠球菌EF-ZA1107-06和LGG的自凝聚力(％)
Figure BDA0003313202480000101
注：同行中字母不同代表差异显著(p＜0.05)
3.4抑制致病菌实验
革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌ATCC12592、单增李斯特菌CMCC54002)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC14028、铜绿假单胞菌ATCC27853)和真菌 (白色念珠菌SC5314)作为指示菌株。取适量指示菌(约108CFU/mL)加入LB琼脂培养基中，使菌的终浓度约为106CFU/mL，摇匀，倾注平板，培养基凝固后，打孔，分别注入粪肠球菌EF-ZA1107-06上清液和菌悬液150μL，风干孔内液体，37℃培养24h，测量抑菌圈的直径。上述上清液为过夜培养的粪肠球菌EF-ZA1107-06的发酵液离心(8000r/min, 5min)取上清液，经0.22μm滤膜过滤。上述菌悬液为过夜培养的粪肠球菌EF-ZA1107-06 的发酵液离心(8000r/min，5min)，取菌体重悬于无菌生理盐水中。按上述相同方法测定鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469(LGG)的抑菌能力。结果如表7所示，粪肠球菌 EF-ZA1107-06和鼠李糖乳杆菌LGG都具有良好的抑菌效果，且EF-ZA1107-06上清液对大肠杆菌的抑制效果强于LGG上清液。粪肠球菌EF-ZA1107-06可应用于饲料添加剂，抑制动物肠道内致病菌的繁殖，提高动物的抗病能力，有助于增加畜禽动物养殖的经济效益。
表7粪肠球菌EF-ZA1107-06和LGG对六种指示菌的抑制能力(mm)
Figure BDA0003313202480000102
Figure BDA0003313202480000111
注：同行中字母不同代表差异显著(p＜0.05)。
3.5总胆固醇清除实验
采用总胆固醇测试盒测定胆固醇标准曲线。用蒸馏水将胆固醇标准液(2mg/mL)分别稀释至2、1.6、1.2、0.8、0.4、0.2mg/mL，精确吸取各个浓度的稀释液2.5μL加入96 孔板，加入250μL工作液，混匀，置于37℃培养箱孵育10min，测定510nm波长下的吸光度值，每个浓度做3次平行。用软件Origin 8.0绘制胆固醇标准曲线，见图9。取过夜培养的EF-ZA1107-06发酵液按5％(v/v)的接种量接种到5mL 1mg/mL的胆固醇培养基中，摇均，同时设置空白组(不接菌的胆固醇培养基)，37℃培养24h。离心(8000r/min，5min) 取上清液2.5μL加入96孔板，加入250μL工作液，混匀，置于37℃培养箱孵育10min，测定510nm处的吸光度值，带入胆固醇标准曲线方程，计算上清液的胆固醇浓度(C)。总胆固醇清除率＝[(C空-C样)/C空)]×100％。上述胆固醇培养基为：取0.05g胆固醇用少量无水乙醇加热溶解，加入50mL MRS液体培养基中，摇匀，配成终浓度为1mg/mL的胆固醇培养基，121℃高压灭菌15min。用上述相同的方法测定鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469(LGG)的总胆固醇清除能力。结果如图10所示，在最高浓度(2×108CFU/mL) 下，EF-ZA1107-06的胆固醇清除率高达(44.29±0.30)％，即培养基中442.9μg/mL胆固醇被降解，与LGG相当。在低菌液浓度下，EF-ZA1107-06的降胆固醇能力强于LGG。说明粪肠球菌EF-ZA1107-06具有高效的降胆固醇能力。降低血清中的胆固醇浓度有利于预防动脉硬化和高血压等心血管疾病，本发明菌株可应用于具有降胆固醇作用的功能性食品的研发。
3.6DPPH自由基清除实验
用无菌生理盐水把过夜培养的粪肠球菌EF-ZA1107-06发酵液分别稀释至2×108、1×108、 5×107、2×107CFU/mL，分别测定这4个稀释度的细胞裂解液、上清液和菌悬液的DPPH自由基清除能力。取2mL待测样品和2mL DPPH乙醇溶液，混匀，暗反应40min，同时设置对照组(用无水乙醇代替样品溶液)和空白组(用无水乙醇代替DPPH溶液)，测定517 nm波长处的吸光值。自由基清除率＝[1-(A样-A空/A对)]×100％。上述DPPH为0.2mmol/L 的DPPH，取0.0078gDPPH用无水乙醇定容至100mL。上述上清液为该浓度下的发酵液离心(8000r/min，5min)取上清液，经0.22μm滤膜过滤。上述菌悬液为该浓度下的发酵液离心(8000r/min,5min)，取菌体重悬于无菌生理盐水中。上述细胞裂解液是该浓度下的菌液经细胞超声破碎仪处理30min(800W，15s，15s)后，离心(8000r/min,5min) 取上清液，经0.22μm滤膜过滤。用上述相同的方法测定鼠李糖乳杆菌LGG的DPPH自由基清除能力。结果如图11所示，粪肠球菌EF-ZA1107-06上清液、菌悬液和裂解液对DPPH 自由基的清除率分别为79.38％～91.70％、84.40％～93.16％、52.51％～55.94％，在同一浓度下，EF-ZA1107-06的菌悬液和裂解液对DPPH自由基的清除能力都强于LGG。菌体浓度越高，DPPH清除率越高，在最高浓度(2×108CFU/mL)下，EF-ZA1107-06菌悬液对DPPH 的清除率高达93.16％。
3.7抗癌活性细胞实验
以胎牛血清：双抗：DMEM培养基＝1:0.1:9的比例配制DMEM完全培养基。对人正常肝细胞LO2和人乳腺癌细胞MDA-MB-231进行复苏和传代。
EF-ZA1107-06样品溶液的制备：取3份EF-ZA1107-06的发酵液，一份置于121℃下高温处理15min，离心(8000r/min，5min)，用无菌PBS重悬制得灭活菌体组；一份超声破碎15min(800W，9s，9s)，离心，上清液用0.22μm滤膜过滤制得裂解液组；一份离心(8000r/min，5min)取上清液用0.22μm滤膜过滤制得上清液组。各组样品用DMEM 完全培养基稀释成不同浓度。
将培养好的LO2细胞消化、离心，将细胞密度调为80000个/mL，加到96孔板，每孔100μL。放入37℃、5％CO2培养箱中培养24h。待细胞覆盖面积达85％左右后，吸弃旧培养基，每孔加入100μLEF-ZA1107-06样品溶液，放入37℃、5％CO2培养箱中培养24h。每个浓度设置3个平行对照，以DMEM完全培养基代替样品作为空白对照。培养结束后，采用MTT法检测细胞存活率，结果如图12所示，EF-ZA1107-06对LO2细胞的安全浓度是 2×104～5×107CFU/mL。因此，选取该浓度测定EF-ZA1107-06对癌细胞增殖的抑制作用。用0.25％胰酶消化MDA-MB-231细胞，离心(1200r/min，5min)，将细胞稀释为80000 个/mL，每孔100μL加入到96孔板中，放置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。待细胞覆盖面积达85％左右时，吸弃旧培养基，用PBS洗涤3次，每孔加入2×104～5×107CFU/mL 的EF-ZA1107-06样品溶液100μL作为处理组，以DMEM完全培养基代替样品作为空白对照组，以5-氟尿嘧啶(5-FU)代替样品作为阳性对照组，37℃培养48h。采用MTT法测定癌细胞的存活率，并计算EF-ZA1107-06对癌细胞抑制率。癌细胞抑制率＝[1-(A处理组/A空白组)]×100％。结果如图13所示，5×107CFU/mL的灭活菌体对人乳腺癌细胞MDA-MB-231 抑制率高达(71.22±0.72)％，显著高于5-FU。结果表明粪肠球菌EF-ZA1107-06具有较好的抗癌活性，在生产具有抗癌作用的功能性食品上，具有较大的潜在应用价值。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一株粪肠球菌EF-ZA1107-06及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1417
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catgcagtcg aacgcttctt tcctcccgag tgcttgcact caattggaaa gaggagtggc 60
ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctac ccatcagagg gggataacac ttggaaacag 120
gtgctaatac cgcataacag tttatgccgc atggcataag agtgaaaggc gctttcgggt 180
gtcgctgatg gatggacccg cggtgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240
ccacgatgca tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 300
gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttcggcaatg gacgaaagtc tgaccgagca 360
acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat cgtaaaactc tgttgttaga gaagaacaag 420
gacgttagta actgaacgtc ccctgacggt atctaaccag aaagccacgg ctaactacgt 480
gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc 540
gagcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat 600
tggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaa 660
tgcgtagata tatggaggaa caccagtggc gaaggcggct ctctggtctg taactgacgc 720
tgaggctcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780
cgatgagtgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg ctgcagcaaa cgcattaagc 840
actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960
atcctttgac cactctagag atagagcttt cccttcgggg acaaagtgac aggtggtgca 1020
tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tattgttagt tgccatcatt tagttgggca ctctagcgag actgccggtg acaaaccgga 1140
ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200
caatgggaag tacaacgagt cgctagaccg cgaggtcatg caaatctctt aaagcttctc 1260
tcagttcgga ttgcaggctg caactcgcct gcatgaagcc ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320
atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga 1380
gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta acctttt 1417

Claims (4)

1.一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)EF-ZA1107-06，其特征在于，所述菌株于2021年9月1日，在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)保藏，保藏编号为GDMCC No:61910。
2.权利要求1所述的粪肠球菌在制备抑制肠道致病菌药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肠道致病菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和白色念珠菌(Candida albicans)。
4.权利要求1所述的粪肠球菌在饲料添加剂、功能性食品中的应用。
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