CN110893193B - 乳双歧杆菌bl-99的新应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了乳双歧杆菌BL‑99的新应用。具体地，本发明提供了一种乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)BL‑99在制备用于促进肠道消化的组合物中的应用，所述乳双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.15650。本发明发现该菌株单菌即具有促进肠道消化的功效，能够促进肠道蠕动，增加胃蛋白酶排出量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一株乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)在制备用于促进肠道消化的组合物中的应用，所述乳双歧杆菌的保藏编号为CGMCCNo.15650。
背景技术
在生活节奏日益加快的今天，不规律的饮食，频繁的商务出差，不够充足的睡眠，以及不可避免地饮酒都严重伤害了人体消化***。而消化***的失衡则更多会带来一系列的肠道问题：便秘、腹泻、腹痛、肠鸣、排气……而如果肠道蠕动变慢，粪便滞留在肠道内不能及时排出，粪便在肠道内产生有害物质，严重影响人体健康。调查结果显示，在790名亚裔女性中，37.4％的女性受便秘困扰。
研究表明，摄入益生菌能够缩短结肠运载时间，同时对调节肠道菌群，改善受试者胃肠道紊乱具有一定帮助。而结肠运载时间可定义为食物通过吞咽、消化、吸收和***所需要的时间。胃肠道的健康及患病有时与结肠运载时间相关。结肠运载缓慢即代表了便秘等症状。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种乳双歧杆菌BL-99的新用途。
本发明提供了一种乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，本发明中命名为BL-99。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)；保藏编号为CGMCC No.15650。本发明提供的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，其具有耐胃酸和耐肠液性能，在pH2.5的胃酸液中处理30min时活菌存活率62％以上，处理2小时活菌存活率61％以上；在pH6.8的小肠液中处理2小时活菌存活率70％以上。
本发明的研究发现，乳双歧杆菌BL-99(即保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌)菌株单菌即具有促进肠道消化的功效，能够促进肠道蠕动，增加胃蛋白酶排出量。
从而，本发明提供了乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)在制备用于促进肠道消化的组合物中的应用，所述乳双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.15650。
根据本发明的具体实施方案，所述乳双歧杆菌以固态或液态菌制剂的形式用于制备所述组合物。
根据本发明的具体实施方案，所述组合物可以包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
根据本发明的具体实施方案，所述组合物可使用于动物或是人类。所述组合物还可以包括所属领域中的常规用料组分。例如，对于药物组合物，可包括适量的辅料，所述辅料可以为赋型剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂等。对于食品组合物，本发明的乳双歧杆菌可以按照现有技术中含乳双歧杆菌的食品进行生产，所述组合物可以根据受施予者的需要，而采用不同形态。例如，粉剂、锭剂、造粒、微胶囊、液体制剂等。
根据本发明的具体实施方案，所述组合物是用于促进肠道蠕动。具体应用时，所述乳双歧杆菌的应用量为1.0×103CFU～1.0×1011CFU/天，或者以菌体的重量计为0.001μg～100mg/天。优选地，所述乳双歧杆菌的应用量为108CFU～1010CFU/天，或者以菌体的重量计为0.01μg～10mg/天。
根据本发明的具体实施方案，所述组合物是用于增加胃蛋白酶排出量。具体应用时，所述乳双歧杆菌的应用量为1.0×103CFU～1.0×1011CFU/天，或者以菌体的重量计为0.001μg～100mg/天。优选地，所述乳双歧杆菌的应用量为108CFU～1010CFU/天，或者以菌体的重量计为0.01μg～10mg/天。
在本发明的一具体实施方案中，所述组合物为食品组合物，所述食品可以为发酵乳制品(例如发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料等)、乳酪、含乳饮料、固体饮料或乳粉。
综上所述，本发明提供了乳双歧杆菌BL-99的新用途，该菌具有促进肠道消化的功效，能够促进肠道蠕动，增加胃蛋白酶排出量，可以用于制备具有促进肠道消化功效的食品、药物及饲料等，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1显示乳双歧杆菌BL-99对墨汁推进率(％)的影响。
图2显示乳双歧杆菌BL-99对大鼠胃液量的影响。
图3显示乳双歧杆菌BL-99对大鼠胃蛋白酶活性的影响。
图4显示乳双歧杆菌BL-99对大鼠胃蛋白酶排出量的影响。
专利程序的微生物保存：
本发明的乳双歧杆菌BL-99：
保藏日期：2018年04月26日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏编号：CGMCC No.15650；
分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。除非另有说明，本发明中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。
本发明的各实施例中，实验数据表示为Mean±S.E.M.数据采用PRISM version5.0(GraphPad,San Diego,CA,USA)进行统计。组间差异采用one-way ANOVA跟随Tukery’smultiple comparison test的方法进行统计。P<0.05时具有显著的统计学差异。
实施例1：乳双歧杆菌BL-99及其性能测定
本发明的乳双歧杆菌BL-99，来自上海交大昂立股份有限公司，是自婴儿肠道中分离得到的。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)；保藏编号为CGMCC No.15650。
1.乳双歧杆菌BL-99的分类学特征
理化试验结果：
16S rRNA基因序列测序结果(SEQ ID No.1)：
2.乳双歧杆菌BL-99的人工胃液、肠液耐受性
双歧杆菌为通常不抗酸的菌属。本实施例中，测试了本发明的乳双歧杆菌BL-99的人工胃液、肠液耐受性，同时以目前领域中公认耐酸性能极好、可以通过胃肠道存活的乳双歧杆菌
作为对比。
测试方法：将乳双歧杆菌BL-99菌株于MRS液体培养基中37℃培养16小时后，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体。
将待测菌株分别在人工胃液、人工小肠液中培养，37℃处理0、30min、2h后进行活菌计数分析，以存活率评价菌株的耐酸及耐肠液性能。存活率＝(处理后的活菌数/0时刻活菌数)×100％。
菌株在人工胃酸(pH2.5)中的存活率检测结果如表1所示，BB-12在人工胃酸(pH2.5)中处理30min时活菌存活率7.04％，处理2小时活菌存活率仅1.64％；而本发明的乳双歧杆菌BL-99在人工胃酸(pH2.5)中处理30min时活菌存活率62.60％，处理2小时活菌存活率61.83％。表明本发明的乳双歧杆菌BL-99具有优异的耐胃酸能力，能较为顺利地通过胃到达肠道发挥益生作用。
表1、菌株在人工胃酸(pH2.5)中的存活率
菌株在人工小肠液(pH6.8)中的存活率检测结果参见表2。数据显示，BB-12在人工小肠液(pH6.8)中处理2小时活菌存活率仅28.95％；而本发明的乳双歧杆菌BL-99在人工小肠液(pH6.8)中处理2小时活菌存活率70.23％。表明本发明的乳双歧杆菌BL-99具有优异的耐肠液能力，可以在肠道内存活并定殖。
表2、菌株在人工小肠液(pH6.8)中的存活率
3.乳双歧杆菌BL-99的的毒力实验及安全性检测
将本发明的乳双歧杆菌BL-99接种于BBL液体培养基中，36±1℃厌氧培养48±2小时，计数培养液中乳双歧杆菌BL-99活菌数为3.7×108cfu/mL，将培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20.0mL/kg BW给受试小鼠连续灌胃3天，观察7天。试验设培养基原液和5倍浓缩液对照组。试验结果表明：乳双歧杆菌BL-99的BBL培养物原液和5倍浓缩液组与各自对照组相比，对小鼠体重增长的影响无统计学意义(p＞0.05)，同时未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。
采用SN/T 1944-2007《动物及其制品中细菌耐药性的测定》方法，评估乳双歧杆菌BL-99的抗生素敏感性能。评价结果显示，乳双歧杆菌BL-99对氨苄西林Ampicillin、青霉素G PenicillinG、红霉素Erythromycin、氯霉素Chloramphenicol、克林霉素Clindamycin、万古霉素Vancomycin和四环素Tetracycline等敏感。符合欧洲食品安全委员会(EuropeanFood Safety Authority)对食用细菌耐药性评价规范中的要求。乳双歧杆菌BL-99不含外源抗生素耐药基因，食用安全。
实施例2：小肠运动试验
98只健康SPF级BABL/c小鼠，体重18-20g，由北京华阜康生物科技有限责任公司提供。饲养于中国疾病预防控制中心动物房：维持室温(25±2℃)，相对湿度(55±2)％，12h/12h光照，自由进食和饮水。按照体重，利用随机数字，分为7组，每组14只，使用苦味酸编号，普通饲料常规饲养，分组安排如表3所示。
表3、分组安排
| 分组 | 受试物 | 人体每日剂量(CFU/天) |
| 对照组 | PBS | -- |
| 模型组 | PBS | -- |
| BL-99极低剂量组 | BL-99乳双歧杆菌 | 1×10<sup>6</sup> |
| BL-99低剂量组 | BL-99乳双歧杆菌 | 1×10<sup>7</sup> |
| BL-99中剂量组 | BL-99乳双歧杆菌 | 1×10<sup>8</sup> |
| BL-99高剂量组 | BL-99乳双歧杆菌 | 1×10<sup>9</sup> |
| BL-99极高剂量组 | BL-99乳双歧杆菌 | 1×10<sup>10</sup> |
适应性喂养3天后开始正式实验。
以灌胃的方式给予受试样品，每天灌胃一次，灌胃体积20ml/kg，对照组与模型组灌胃给予PBS，干预时间30天。
在实验期内，动物表征正常，精神及活动状况良好，每日给予受试物后未出现任何不良反应。由表4体重数据可以看出，实验周期内，各组动物体重并未出现显著差异(p＞0.05)。
表4、乳双歧杆菌BL-99对小鼠体重的影响(g)
图1显示乳双歧杆菌BL-99对墨汁推进率(％)的影响。如图1所示，与对照组比较，模型组小鼠墨汁推进率显著低于对照组(p＜0.05)，说明成功建立小鼠小肠蠕动一致模型。与模型组比较，BL-99益生菌极低剂量组(1×106CFU/天)、低剂量组(1×107CFU/天)和高剂量组(1×108CFU/天)小鼠的墨汁推进率显著高于模型对照组(p＜0.05)，实验结果阳性。表明极低剂量组(1×106CFU/天)、低剂量组(1×107CFU/天)和高剂量组(1×108CFU/天)BL-99可促进小鼠肠道运动。
实施例3：BL-99与大鼠消化酶试验
221只健康SPF级SD大鼠，体重180-220g，由北京华阜康生物科技有限责任公司提供。饲养于中国疾病预防控制中心动物房：维持室温(25±2℃)，相对湿度(55±2)％，12h/12h光照，自由进食和饮水。按照体重，利用随机数字，分为17组，每组13只，使用苦味酸编号，普通饲料常规饲养，分组安排如表3所示。适应性喂养3天后开始正式实验。
使用苦味酸对大鼠进行分组编号后，分别于给予受试物第0周、第1周、第2周、第3周、第4周称重，计算大鼠灌胃量。每周称重大鼠饲料，计算大鼠摄食量。以灌胃的方式给予受试样品，每天灌胃一次，灌胃体积20ml/kg，对照组与模型组灌胃给予PBS，干预时间30天。
使用2.0mm玻璃管，加入新鲜蛋清，置于沸水中3～5秒，至蛋清变白，取出后吸水纸吸干管壁水分，选取无气泡的蛋白管备用。蛋白管于实验前新鲜制作。大鼠末次干预后，于消化酶测定实验前禁食不禁水24小时。使用脱毛膏涂抹于大鼠腹部，去除大鼠胸骨下约4x4cm毛发。采用吸入式麻醉方法麻醉大鼠，腹部朝上置于实验台上，使用碘伏对大鼠腹部皮肤进行消毒。无菌剪刀剪开大鼠胸骨下约1cm处皮肤，暴露大鼠胸腔及胃部，开口约1～2cm，无菌镊子找出大鼠胃部与十二指肠连接处(即大鼠幽门)，使用手术缝合线将大鼠幽门结扎。幽门结扎3小时后，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉处死大鼠，解剖，取出大鼠胃部并将胃液收集于离心管内，测定单位时间内胃液量。
取胃液1ml放入50ml三角烧瓶中，加入0.05mol/l盐酸溶液15ml摇匀，放入新鲜制作的蛋白管两根。塞好瓶口，37℃恒温箱中孵育24小时。计算蛋白酶活性和胃蛋白酶排出量。
胃蛋白酶活性单位(μ/mL)＝(四端蛋白管透明部分长度均值)2×16；
胃蛋白酶排出量(μ/h)＝胃蛋白酶活性×每小时胃液量。
3.1体重增重、摄食量和食物利用率
干预后结果如表5显示，BL-99中剂量组(1×108CFU/天)体重总增重及总摄食量显著低于对照组(p＜0.05)，其他各组在总增重、总摄食量及总食物利用率指标并无显著差异。
表5、乳双歧杆菌BL-99对小鼠总增重、总摄食量、总食物利用率的影响(g)
3.2消化酶
结果如图2所示，与对照组比较，BL-99中剂量组(1×108CFU/天)、BL-99高剂量组(1×109CFU/天)胃液量显著高于对照组(p＜0.05)。
如图3所示，与对照组比较，各实验组胃蛋白酶活性无显著性差异(p＞0.05)。
如图4所示，与对照组比较，BL-99中剂量组(1×108CFU/天)胃蛋白酶排出量显著高于对照组(p＜0.05)。
以上结果表明中、高剂量BL-99乳双歧杆菌一定程度上改善了小鼠胃肠道消化能力，促进胃液分泌。
序列表
<110> 内蒙古伊利实业集团股份有限公司
<120> 乳双歧杆菌BL-99的新应用
<130> GAI19CN2035
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1398
<212> DNA
<213> 乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)
<400> 1
gctcccccac aagggtcggg ccaccggctt cgggtgctac ccactttcat gacttgacgg 60
gcggtgtgta caaggcccgg gaacgcattc accgcggcgt tgctgatccg cgattactag 120
cgactccgcc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc gaactgagac cggttttcag 180
cgatccgccc cacgtcaccg tgtcgcaccg cgttgtaccg gccattgtag catgcgtgaa 240
gccctggacg taaggggcat gatgatctga cgtcatcccc accttcctcc gagttgaccc 300
cggcggtccc acatgagttc ccggcatcac ccgctggcaa catgcggcga gggttgcgct 360
cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacgaccat gcaccacctg 420
tgaaccggcc ccgaagggaa accgtgtctc cacggcgatc cggcacatgt caagcccagg 480
taaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc gccgcttgtg cgggcccccg 540
tcaatttctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcgggatgc ttaacgcgtt 600
ggctccgaca cgggacccgt ggaaagggcc ccacatccag catccaccgt ttacggcgtg 660
gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag cgtcagtgac 720
ggcccagaga cctgccttcg ccattggtgt tcttcccgat atctacacat tccaccgtta 780
caccgggaat tccagtctcc cctaccgcac tccagcccgc ccgtacccgg cgcagatcca 840
ccgttaggcg atggactttc acaccggacg cgacgaaccg cctacgagcc ctttacgccc 900
aataaatccg gataacgctc gcaccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960
cggtgcttat tcgaacaatc cactcaacac ggccgaaacc gtgccttgcc cttgaacaaa 1020
agcggtttac aacccgaagg cctccatccc gcacgcggcg tcgctgcatc aggcttgcgc 1080
ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgta tctcagtccc 1140
aatgtggccg gtcaccctct caggccggct acccgtcaac gccttggtgg gccatcaccc 1200
cgccaacaag ctgataggac gcgaccccat cccatgccgc aaaagcattt cccaccccac 1260
catgcgatgg agcggagcat ccggtattac cacccgtttc caggagctat tccggtgcac 1320
agggcaggtt ggtcacgcat tactcacccg ttcgccactc tcaccccgac agcaagctgc 1380
cagggatccc gttcgact 1398
Claims (11)
1.一种乳双歧杆菌 (Bifidobacterium lactis)在制备用于促进肠道消化的组合物中的应用，所述乳双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No. 15650。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述乳双歧杆菌以固态或液态菌制剂的形式用于制备所述组合物。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述组合物是用于促进肠道蠕动。
5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述组合物是用于增加胃蛋白酶排出量。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其中，所述组合物为食品组合物。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述食品为发酵乳制品。
8.根据权利要求6所述的应用，其中，所述食品为乳酪。
9.根据权利要求6所述的应用，其中，所述食品为含乳饮料。
10.根据权利要求6所述的应用，其中，所述食品为固体饮料。
11.根据权利要求6所述的应用，其中，所述食品为乳粉。
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| 双歧杆菌BB12对便秘大鼠的通便作用及对胃肠激素的调节;田颖等;《食品科学》;20151215;第13卷(第13期);204-208 * |
| 双歧杆菌BB-12的功能特性及研究进展;陈晨等;《高师理科学刊》;20160430;第36卷(第04期);43-45 * |
| 益生菌对断奶鼠消化酶活力、肠道运动性及粘膜形态的影响;刘飞等;《食品工业科技》;20210319;第42卷(第16期);353-360 * |
| 益生菌的功能活性及其分子机理探究的研究进展;刘齐等;《中国酿造》;20140115;第33卷(第01期);14-19 * |
| 直投式乳酸菌剂对便秘模型小鼠肠道功能的影响;邹华军等;《食品与发酵科技》;20131025;第49卷(第05期);26-29+102 * |
| 长双歧杆菌BBMN68对便秘模型小鼠的通便作用;丁圣等;《食品科学》;20110215;第32卷(第03期);195-198 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110893193A (zh) | 2020-03-20 |
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